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Informe de prácticas estivales Developmental Biology of the inner ear Developmental Biology Research Group
Progenitors and mechanisms of neurosensory cell specification. The making of hearing: the origin of otic neurons and
hair cells.
2013
Ester Moya. Grupo de Biología del Desarrollo
1 de enero de 2013
[INFORME DE PRÁCTICAS ESTIVALES
DEVELOPMENTAL BIOLOGY OF THE INNER EAR ]
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GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA DEL DESARROLLO CEXS-UPF (PRBB)
Developmental Biology Research Group
Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona (PRBB).
1. Breve descripción de la institución o Centro donde se produce la estancia.
El PRBB, el Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona se ubica en Barcelona, junto al
hospital del mar. Se trata de un parque de investigación que reúne a 7 centros
independientes centrados en el ámbito de la salud humana y la investigación
biomédica (IMIM, CREAL, CEXS-UPF, CRG, CMRB, FPM y el IBE-UPF-CSIC).
2. Breve descripción del grupo o clínico concreto donde se realiza la tarea
asignada.
El grupo se compone de Gina Abelló (MECO postdoc.), Ivan Vachkov (MICINN
postdoct.), Jelena Petrovic. (FPI PhD), y Fernando Giráldez como PI.
El grupo estudia el origen de las neuronas óticas y de las células ciliadas del oído
interno.
3. Nombre y cargo de la persona responsable de la estancia (tutor).
Fernando Giráldez Ordaz, profesor titular de Biología del Desarrollo del Departamento
de Ciencias Experimentales y de la Salud (CEXS), de la Universidad Pompeu Fabra de
Barcelona. Líder de equipo del grupo de Biología del Desarrollo del CEXS (PRBB).
Miembro de ANEP, ANECA (España), FCT (Portugal), MEC y el CSIC. Referee de FONCYT
(Argentina), Welcome Foundation, National Science Foundation (USA), BBSRC UK),
Human Frontier (HFSO) y otras agencias. Referee para Nature, Development,
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Developmental Biology, Intl. J. Dev Biol., Mechanisms of Development, Developmental
Dynamics, Journal of Neuroscience y PLoS ONE entre otras. Examinador externo para
las universidades de Nottingham y Lisboa Umea University. Miembro internacional de
las sociedades: SENC-IBRO, SfN, SEBBM-FEBS, BSDB, SDB. Miembro fundador de la
Sociedad española de Biología del Saesarrollo (SEBD) y de la sociedad Biofísica
española (SBE).
4. Tiempo transcurrido durante la estancia: fecha de inico y de término.
Desde el 1 de septiembre de 2013 hasta el 30 de septiembre de 2013.
5. Horas aproximadas dedicadas a la tarea encomendada durante la estancia
(redordad que también ha de figurar en el informe del tutor).
De 9:00 a.m a 17:00 p.m (aprox.)
6. Breve descripción del proyecto de investigación del proyecto de investigación
o de la actividad realizada.
El estudio se centra en caracterizar los genes principales que regulan el desarrollo
embrionario del oído interno. Para ello utilizan como modelo animal de estudio al
pollo en los días embrionarios E3-E7.
Sabemos que Sox2 otorga competencia neuronal en la placoda ótica. Más tarde,
durante el desarrollo embrionario, la expresión de Neurogenin1 induce la
neurogénesis. La actividad de Neurogenein 1, junto con la de Notch, Neuro D y Neuro
M ocasiona la delaminación de algunas células del epitelio de la placoda ótica y su
diferenciación a neuronas. Por otro lado, la expresión de Notch junto a la se Sox 2
ocasiona la génesis de dominios prosensoriales en los que, posteriormente, junto a la
expresión de Atoh1, se conseguirá la diferenciación de las células ciliadas.
Delta.
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Los dominios neurosensoriales aparecen como respuesta de la inducción lateral que
ocasiona Jagged1-Notch, hecho que permite que Sox2 siga expresándose manteniendo
dicha competencia sensorial en estos dominios.
El objetivo principal del grupo es el de descubrir cuáles son los mecanismos que
regulan la expresión de Atoh1 (suficiente para inducir la producción de células ciliadas
en el oído interno) en los precursores sensoriales y en la diferenciación de dichas
células ciliadas.
Se pretende discernir cuáles son los mecanismos que conectan la función de Sox2 y de
Notch durante el desarrollo neuronal, ótico y sensorial.
Se ha comprobado como Jag1 es el ligando que activa la vía Notch en las fases iniciales
del desarrollo del oído interno. Dicha interacción mantiene la expresión de Sox2 e
inhibe la de Atoh1, permitiendo la auto-renovación de los precursores celulares antes
de la diferenciación.
En la imagen observamos que Sox2 promueve la expresión del gen proneural Neurogenin 1 en el dominio neurosensorial en estadios iniciales del desarrollo, ocasionando la delaminación y diferenciación de las neuronas óticas. Sox2 también es el factor causante del mantenimiento de la competencia sensorial en el dominio nerosensorial, este hecho permitirá que, posteiormente en el desarrollo, con la expresión de Atoh1, se consiga la diferenciación de las células ciliadas del oído interno.
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Sin embargo, en las fases tardías de dicho desarrollo Delta 1 pasa a ser el ligando que
activa la vía Notch y Atoh 1 deja de estar inhibido permitiendo la diferenciación de las
neuronas y de las células ciliadas.
Estos resultados han hecho pensar al grupo que Delta1 puede ser el factor causante de
la restricción del dominio neurosensorial donde Atoh1 causará la diferenciación de las
células ciliadas.
Siendo Notch el mismo receptor para Jag1 y Delta1, la pregunta principal que el grupo
se ha venido planteando y a la resolución de la cual están encaminando sus
investigaciones es qué causa este efecto diferencial en la activación de Notch por estos
dos ligandos, cuáles son las señales moleculares que ocurren por debajo del nivel de
Notch y Atoh que son capaces de causar un efecto tan diferente.
7. Aportación concreta y propia del estudiante al proyecto o la actividad.
·Durante mi estancia me incorporé al proyecto que está realizando la estudiante de
doctorado Jelena Petrovic en la regulación de la vía Notch, cooperé con ella para
definir el perfil de expresión de Jag2 durante el desarrollo del oído interno del pollo.
Este hecho me hizo tener un grado de responsabilidad mayor, ya que de mis
experimentos también dependía que las conclusiones a las que se llegara
posteriormente fueran correctas.
Mi tarea consistía en realizar hibridaciones in situ para detectar la expresión del ARN
mensajero de Jag2 y Delta1 en diferentes estadios del desarrollo, y ver si este hecho
condicionaba la disposición o morfología de las células ciliadas.
Para poder observar dichos cambios realizamos inmunohistoquímicas contra MyoVIIa
(una proteína presente específicamente en este tipo celular).
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8. Descripción de los conocimientos o las habilidades adquiridas durante la
estancia.
En primer lugar aprendí a realizar la disección de embriones de pollo a E2,E3, E4, E5, E6
y E7. En algunos de ellos realizaríamos estudios sobre todo el embrión (whole mount) o
únicamente en el área donde aparece la vesícula ótica en el caso de que fueran muy
grandes (E5-E7). También partimos de muestras de estos mismos estadios para realizar
las mismas técnicas en secciones.
Después de separar a los embriones de los anejos embrionarios y diseccionarlos, en el
caso de ser necesario, se incluían todos ellos en tubos con PFA (paraformaldehido)
para fijarlos y evitar la degradación de sus proteínas. Posteriormente, se realizaban
lavados con PBST (medio con detergente Tween) para eliminar el PFA, y se incluían en
concentraciones crecientes de metanol hasta llegar al 100%.
Algunos de ellos se guardaban en esta solución a -20ºC para estudios posteriores y
otros seguían un protocolo de rehidratación, inclusión en sacarosa (como medio de
crioprotección) y subsiguientemente inclusión en gelatina para realizar moldes,
congelar en isopentano y cortar con el criostato.
De las muestras se obtenían cortes alternos, esto quiere decir que una de las láminas
iría destinada a realizar una inmunohistoquímica y la siguiente (muestra prácticamente
idéntica), sería destinada a realizar una hibridación in situ (ISH).
·La inmunohistoquímica consiste en la detección de una proteína mediante un
anticuerpo primario específico que la reconoce y un anticuerpo secundario que
incorpora una enzima que es capaz de transformar su sustrato en un producto visible o
en su defecto, un fluorocromo.
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Para la realización de las inmunohistoquímicas lavábamos con PBST los cortes,
bloqueábamos con serum de caballo o de cabra (para evitar uniones inespecíficas del
anticuerpo) y poníamos a incubar durante toda la noche con el anticuerpo primario
contra MyoVIIa (una proteína específica de las células ciliadas del oído interno.
Durante el segundo día volvíamos a lavar con PBST y dejábamos incubar con el
anticuerpo secundario. Tras ello, retirábamos el anticuerpo secundario de la muestra y
repetíamos la operación de lavar con PBST, aplicábamos el colorante DAPI (un agente
intercalante del DNA capaz de teñir los núcleos celulares) y montábamos en mowiol,
manteniendo a los cortes siempre en condiciones de oscuridad.
El resultado de la técnica podía ser observado en los cortes bajo el microscopio de
fluorescencia con el que podíamos observar las proteínas específicas de células ciliadas
que habíamos marcado como MyoVIIa.
·Una hibridación in situ (ISH) es una técnica que consiste en la detección de la
expresión de un ácido nucleico (DNA o RNA), mediante la hibridación con su secuencia
complementaria linearizada.
·Para la realización de la ISH primero había que linearizarse las sondas específicas
de DNA que utilizábamos durante el proceso: en este caso, Jag2 y Delta1.
Como lo que deseábamos era detectar la expresión de RNA de dichos genes,
realizábamos un protocolo para transcribir las sondas a ARN y hacer que
incorporaran uridina marcada con digoxigenina durante el proceso de
transcripción. Después precipitábamos la sonda y lavábamos con etanol para
purificarla y evitar su degradación.
Para comprobar que efectivamente la sonda se había linearizado precisábamos
de la realización de un gel de agarosa. Este proceso requería del seguimiento de
otro protocolo específico de preparación, que también aprendí a realizar.
Jag2 DNAlin
y RNA
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Posteriormente, realizábamos diversos lavados con las distintas soluciones de
prehibridación, lavábamos con TBST y TBST con un 10% de serum de cabra para aplicar
tras ello un anticuerpo contra la digoxigenina que llevaba conjugada la enzima
fosfatasa alcalina.
La fosfatasa alcalina era capaz de dar lugar a una reacción donde sus productos podían
ser detectados colorimétricamente. En pasos subsiguientes aplicábamos dichos
sustratos y detectábamos la actividad de la enzima.
Cuando la vesícula ótica se observaba con claridad procedíamos a parar la reacción
quitando los sustratos de la enzima, lavábamos con PBST y dejábamos en sacarosa al
15% durante toda la noche.
9. Descripción de otros aspectos positivos de la estancia.
Durante el transcurso de mi estancia fui aprendiendo poco a poco a realizar
inmunohistoquímicas, primero acompañada de mi supervisora Gina Abelló y más tarde
de manera autónoma, el punto que considero clave en mi aprendizaje.
Gina me ha transmitido la experiencia que ha ido adquiriendo durante su desarrollo
profesional en el laboratorio y ha hecho que sea consciente de la necesidad de ser
riguroso y metódico en el laboratorio. Es un ejemplo de buenas prácticas a realizar en
el entorno experimental y le estoy muy agradecida.
Gina también ha sido la promotora de que comience a comunicarme en catalán.
Gracias a ella también he adquirido una gran soltura con el idioma.
Durante mi estancia tuvo lugar el día de puertas abiertas del PRBB (Open Day).
Durante esta jornada el PRBB abría sus puertas a los visitantes y los diferentes
laboratorios organizaban visitas, talleres, conferencias y otras actividades. Pude
enseñar el laboratorio a los grupos que desearon explorarlo, realicé exposiciones
orales y expliqué a un público muy heterogéneo cuál era nuestra actividad en dicho
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espacio. Ha sido una experiencia muy positiva también a este nivel ya que me ha
hecho aprender adaptarme a un público con diferentes niveles culturales, desde niños
de primaria a profesores de institutos. Ha sido fantástico poder transmitir mi pasión
por la ciencia y hacer que también otros puedan llegar a sentirla.
PRBB, Open Day 5 de Octubre de 2013.
10. Valoración (positiva o negativa) de la estancia.
Ha sido una experiencia académicamente muy positiva. El grupo liderado por Fernando
Giráldez es un grupo puntero en investigación en Biología del Desarrollo. Junto con la
larga trayectoria de Fernando Giráldez en el área, he tenido la oportunidad de
desenvolverme en un entorno que me ha permitido enriquecerme de conocimiento en
un área muy específica de la que de otro modo, estoy segura que desconocería.
El laboratorio es un espacio compartido por tres grupos de investigación relacionados
entre sí por el objetivo común de la biología del desarrollo, lo que hace que sea un
espacio idóneo para el intercambio de ideas y el aprendizaje. Los miembros de los
diferentes grupos son, además, de diferentes nacionalidades, lo que me ha permitido
integrarme en un entorno multicultural. Ello ha conllevado que mejore mi nivel de
inglés y de catalán.
El PRBB fomenta que la actividad de cooperación entre sus miembros no finalice al
acabar la jornada laboral, por ello organiza actividades deportivas que pueden
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disfrutar todos sus miembros, eso crea en el laboratorio un entorno muy positivo de
deportividad, hábitos de vida saludables y compañerismo que me ha hecho
aficionarme al deporte. Este ha sido el motivo de que siga en contacto con algunos
miembros del grupo.
11. Quién gestionó la estancia (AECS o iniciativa propia)
La estancia ha sido gestionada de manera autónoma después de cursar la asignatura
de Biología del Desarrollo durante el 2º año de Biología Humana en la UPF. Tras haber
obtenido la calificación de excelente en dicha asignatura me puse en contacto con el
responsable de la misma para organizar una estancia estival en el laboratorio del
grupo, ya que ello me permitiría seguir progresando en dicho campo de estudio.
El interés en el campo de la neurociencia obtenido de la experiencia previa en otro de
la UA hizo que me decidiera por este proyecto para realizar mis prácticas, que
finalmente han contribuido mucho a mi formación académica.
