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Ester Moya Boix Informe de prácticas estivales GRUPO DE NEUROBIOLOGÍA DE LA VISIÓN Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología UNIVERSIDAD DE ALICANTE
2013
Ester Moya Boix Informe de Prácticas: Grupo de neurobiología de la Universidad de
Alicante 24/10/2013
Informe de Prácticas: Grupo de neurobiología de la Universidad de Alicante
Ester Moya Boix
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GRUPO DE NEUROBIOLOGÍA DE LA VISIÓN
Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología
UNIVERSIDAD DE ALICANTE
1. Breve descripción de la institución o Centro donde se produce la estancia.
El departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, está adscrito a la Facultad de
Ciencias de la Universidad de Alicante, localizada en el campus de San Vicente del
Raspeig. El departamento incluye profesores de las áreas de conocimiento de
Fisiología, Genética, Microbiología y Biología Celular.
2. Breve descripción del grupo o clínico concreto donde se realiza la tarea asignada.
El Grupo de Neurobiología de la Universidad de Alicante comprende a un abanico de
profesores de las áreas de conocimiento de: Anatomía, Biología Celular, Farmacología,
Fisiología y Genética.
El grupo tiene una larga trayectoria en el estudio morfoestructural y fisiológico de la
retina. Desde sus inicios ha estado centrado en el estudio de enfermedades
neurodegenerativas como la retinosis pigmentaria, retinopatía diabética, glaucoma y
degeneración macular entre otros. Para ello emplean a la rata y al ratón como modelo
de estudio.
También realizan ensayos de neuroprotección y viabilidad celular con líneas celulares
de fotorreceptores, células ganglionares y células madre (Müller cells).
Más recientemente han incorporado estudios de neovascularización corneal.
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3. Nombre y cargo de la persona responsable de la estancia (tutor). Nicolás Cuenca Navarro y Pedro Lax Zapata, ambos profesores titulares del
departamento de Fisiología, Genética y Microbiología de la Universidad de Alicante.
4. Tiempo transcurrido durante la estancia: fecha de inicio y de término.
Desde el día 1 de julio de 2013, hasta el día 31 de julio de 2013.
5. Horas aproximadas dedicadas a la tarea encomendada durante la estancia
(recordad que también han de figurar en el informe del tutor).
120 horas (9:00- 15:00).
6. Breve descripción del proyecto de investigación o de la actividad desarrollada.
El grupo sigue una línea general de trabajo que consiste en evaluar el efecto
terapéutico o perjudicial que tienen diferentes fármacos y sustancias en la
degeneración retiniana (alcohol, endocannabinoides, rotenona, TUDCA –ácido
taurodeoxicólico-, proinsulina, safranal...).
En la actualidad, en el grupo se solapan diferentes proyectos enfocados todos ellos a
esta línea de investigación, incluyendo algunos otros referentes a la prevención de la
neovascularización corneal.
Durante mi estancia participé más activamente en un proyecto destinado a
caracterizar el efecto neuroprotector del agonista cannabinoide HU210 en la
degeneración retinal. Dicho compuesto es un análogo del 9-tetrahydrocannabinol
(THC), el componente psicoactivo mayoritario de la marihuana.
Para ello se utilizó un modelo animal de rata con la mutación P23H. Estos animales
tienen mutaciones en el gen de la rodopsina (Rho), ocasionando un plegamiento
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erróneo de la proteína y su retención en el retículo endoplasmático de los
fotorreceptores llevando a su apoptosis.
El modelo animal simula un modelo humano de retinitis pigmentosa (RP), enfermedad
neurodegenerativa que ocasiona una pérdida de la visión en condiciones de baja
iluminación y pérdida de la visión periférica, llevando a una pérdida total de la visión.
Se partió de dos grupos de animales: un grupo formado por individuos de 30, 60 y 90
días a los que se les administraron 100 g/kg delHU210 3 veces a la semana desde P24
a P90 y un grupo control a los que se le administró la misma cantidad de suero salino
en el mismo período.
Posteriormente, se realizaron análisis electrorretinográficos de dichos animales a P30,
P60 y P90 con los que se procedió a valorar la funcionalidad de dicha estructura y a
determinar cómo el HU210 aminoraba el avance inexorable de la enfermedad en las
ratas tratadas. Una estimación indirecta de la apoptosis celular.
Tras esto, los animales fueron sacrificados para extraer las retinas.
Los ojos se fijaron en formaldehido y se crioprotegieron con concentraciones
crecientes de sacarosa. Después, se realizó la disección de los ojos para extraer la
retina, se embebieron en OCT y se congelaron en N2 para realizar cortes de 16mm en el
criostato.
A continuación, se realizaron inmunohistoquímicas sobre los cortes con tinción
Hoechst para observar los núcleos celulares y realizar un análisis morfométrico de la
retina. Se realizó un contaje celular de fotorreceptores a distancias de of 0.5, 1.5, 2.5,
and 3.5 mm desde el nervio óptico hasta la ora serrata, y se determinó el grosor de la
ONL (outer nuclear layer, capa de la retina donde se sitúan los núcleos de los
fotorreceptores) cada 0.5 mm desde el nervio óptico hasta la ora serrata.
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7. Aportación propia del estudiante al proyecto o la actividad.
Tuve la oportunidad de aprender de primera mano la realización de un
electrorretinograma de ratas P23H, modelo de retinosis pigmentaria y de la realización
de las pruebas optomotoras de evaluación de la función visual general a ratones de
diferentes edades.
Ayudé en la puesta en marcha del equipo de electrorretinografía, ya que cambiamos el
lugar de ubicación del set y aprendí a colocar de manera adecuada los electrodos y a
realizar un registro.
De manera adyacente tuve una gran curiosidad por conocer la manera de evaluar la
visión general de los roedores mediante el test optomotor, ya que el análisis
electrorretinográfico nos da señales de que la estructura de la retina es correcta y
funcional, pero no nos informa del estado de la conexión de dicha estructura con el
encéfalo.
Así mismo tuve la oportunidad de discutir futuras líneas de investigación con los
responsables del área y de plantear mis dudas y sugerencias sobre los experimentos
realizados.
8. Descripción de los conocimientos y habilidades adquiridas durante la
estancia.
·De manera paralela al conocimiento práctico que aprendí en el laboratorio, también
aprendí las fórmulas básicas para la redacción de un artículo científico y la manera
correcta de responder a los reviewers.
·Con respecto al trabajo práctico, aprendí cómo realizar inmunohistoquímicas con
tejidos procedentes de retina, y cuáles son las tinciones más comúnmente utilizadas
para observar las diferentes poblaciones celulares (Transducina,recoverina, bassoon,
calbindin…).
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·También aprendí las bases para realización de una electrorretinografía. Esta técnica es
un método que permite medir la respuesta eléctrica de los fotorreceptores de la
retina. De este modo podemos estimar la funcionalidad de dicha estructura y la
velocidad del avance de su deterioro.
El ERG se realiza bajo una luz roja poco intensa a P30, P60 and P90, tras adaptar a los
animales a la oscuridad durante toda la noche.
Los animales se anestesian y se les dilatan las pupilas con tropicamida. A continuación,
se coloca un electrodo (hilo de nylon recubierto de plata) en cada ojo y se inserta una
aguja de platino bajo la piel de la frente de la rata, electrodo que servirá de referencia.
También se ubica un electrodo de oro en la boca del animal que sirve como toma de
tierra. Después, se mete a las ratas en una caja de Faraday y en condiciones de estricta
oscuridad se les estimula con unos flashes de luz a intensidades crecientes. La señal
recibida pasa por un preamplificador y un amplificador hasta que llega al ordenador
donde se registran los datos. Finalmente, se miden las amplitudes de las ondas a y b
(claves para evaluar la función visual) y se fijan los umbrales como la mínima
intensidad requerida para alcanzar una amplitud de 10 mV. Dichas ondas
corresponden al estímulo eléctrico al atravesar las diferentes capas de la retina. Varían
según la especie y existe una desensibilización en presencia de luz, por ello los
experimentos se realizan en condiciones escotópicas (de baja intensidad luminosa).
Ejemplo de un experimento en el cual participé el año anterior. En realizábamos un ERG en ratas P23H control y tratadas con TUDCA. En las ratas tratadas observábamos como la respuesta de las ratas tratadas era siempre mayor, ya que el TUDCA demostró ser un compuesto capaz de frenar la aopoptosis de los receptores en la RP.
Equipo de electrorretinografía realizado
manualmente por el profesorado.
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·Pude aprender los fundamentos de la técnica de corte al criostato.
· Aprendí a realizar cultivos celulares (contaje de células para estudios de viabilidad
celular mediante la cámara de Niubauer, estudios de proliferación y apoptosis…)
· Tuve la oportunidad de aprender a hacer un test optomotor en ratones. Este sistema
permite evaluar la conexión nerviosa entre la retina y el córtex. Ofrece una estimación
de la agudeza visual y de la sensibilidad al contraste.
El aparato consiste en una caja compuesta por cuatro monitores que posee una
cámara de infrarrojos en su cubierta. En el interior existe un pedestal donde se
posiciona al animal de estudio. Los monitores muestran rayas verticales negras y
blancas. Podemos variar las condiciones experimentales cambiando el tiempo de
exposición, la velocidad a la que se mueven las rayas por los monitores y la diferencia
de contraste que existe entre ellas. Las rayas se mueven en una dirección y el
experimentador, viendo al animal por la cámara, decide si éste rota hacia la izquierda o
hacia la derecha. Si el movimiento de las rayas coincide con el del ratón el programa lo
interpreta como un acierto. De cada 10 presentaciones, 8 deben ser correctas para que
se interprete que el umbral de visión del animal está por encima del que estamos
testando. Así podemos estimar su umbral de visión.
·Cuando existe algún donante en el hospital de Alicante, se extraen las córneas de los
ojos de éste, y el resto del globo ocular es cedido a la facultad para su estudio según la
historia clínica del paciente, así que tuve la oportunidad de ver cómo se disecciona un
globo ocular humano.
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9. Descripción de otros aspectos positivos durante la estancia.
La estancia me ha sorprendido gratamente ya que, al contrario de lo que pensaba, el
trabajo en el laboratorio no es una actividad monótona y pasiva sino que requiere que
el personal se mantenga activo y alerta durante toda la jornada. Además, es una labor
precisa de pensamiento analítico, crítico y de mucha creatividad.
El trabajo en el laboratorio no acaba donde lo hacen sus paredes sino que abarca
mucho más. Es una labor que demanda investigación autónoma tanto al aprendiz
como al tutor porque en este ámbito todos nos movemos en el sesgo de lo
desconocido. Requiere de iniciativa y de curiosidad, ya que el conocimiento no está
marcado por ningún parámetro, ninguna nota, ni ningún libro, el límite lo marca la
propia curiosidad.
Tanto el profesorado como los alumnos de doctorado y el resto de estudiantes en
prácticas han sido muy participativos. Y entre todos hemos compartido documentos,
buscado información sobre el tema de estudio, planteado y resuelto dudas.
La neurofisiología de la visión es un tema muy extenso, que abarca muchas áreas.
Habiendo participado en esta actividad me he dado cuenta del gran número de
personas implicadas en mejorar nuestro conocimiento del tema y del trabajo tan duro
que realizan tanto los jefes de equipo buscando subvenciones y racionalizando medios,
como el trabajo incansable de los estudiantes de doctorado en sacar adelante las
publicaciones.
Además he aprendido como es la realidad de un entorno científico con un bajo
presupuesto. Cual es el esfuerzo y el grado de implicación de las personas que se
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empeñan en avanzar en ciencia en un entorno poco favorecido económicamente.
Ejemplarmente, el equipamiento de electrorretinografía ha sido construido
manualmente por uno de los miembros del profesorado utilizando material cotidiano
como lámparas, papel de aluminio, bombillas, diodos led…
Este hecho hace que cuando puedes formar parte de equipos de investigación con más
medios, valores realmente la originalidad para seguir creando conocimiento de otros
grupos que aparentemente no poseen tanto prestigio.
10. Valoración (positiva o negativa) de la estancia.
Ha sido una actividad muy positiva tanto a nivel académico como personal.
En lo referente al área académica me ha permitido ponerme en contacto con la
realidad de un laboratorio.
Conocer de primera mano y no en situaciones simuladas dicha actividad permite
obtener una visión totalmente novedosa a la que ya poseía.
El intercambio libre de ideas, el diálogo y el hecho de que las personas siempre estén
dispuestas y expectantes a escuchar nuevos puntos de vista han sido algunos de los
puntos fuertes de mi estancia.
La estancia también me ha permitido asistir a la defensa de trabajo de grado y de
máster. Ello me ha dado la oportunidad de aventurarme en una que no tardaré en
experimentar, la cual cosa ha hecho que me fije en pequeños detalles que marcan una
gran diferencia en el resultado final de dichas exposiciones. El orden en el trabajo, la
claridad de la exposición, las referencias que más se citan durante esta, el ser
coherente a la trayectoria que ha ido siguiendo el grupo...
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11. Quién gestionó la estancia (AECS o iniciativa propia)
La estancia fue una iniciativa propia. Mis estudios previos en la Universidad de Alicante
me permitieron conocer al profesorado de dicha universidad. Mi interés en
neurociencia me hizo buscar grupos relacionados con este tema hasta que finalmente
encontré al grupo liderado por el Dr. Nicolás Cuenca.
Posteriormente, me puse en contacto con el equipo y organizamos mi estancia en el
centro para el mes de julio de 2013.
