Laboratorio de Análisis Instrumental

Sesión: 1

“Análisis cualitativo y cuantitativo de aminoácidos

utilizando derivatización pre-columna con o-ftaldialdehído

(OPA) y separación por HPLC en fase reversa”

Integrantes: Alvaro Zevallos 20084799

Fabiola Bravo 20092302

Lorena Veliz 20084662

Fecha de realización del experimento: 18/09/12

Fecha de entrega del informe: 03/10/12

Lima, 3 octubre del 2012

I .Introducción:

En este laboratorio se trabajó con o-ftaldialdehido (OPA) para la derivatización pre-columna

de una muestra (mezcla de aminoácidos). Esta técnica permitió el posterior análisis por

cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) de la composición de aminoácidos

presentes.

La cromatografía es un método de separación físico, en donde los componentes que van a

ser separados se distribuyen entre dos fases, una estacionaria y otra móvil. En HPLC, la

fase móvil es un disolvente líquido que contiene a la muestra como una mezcla de solutos.

La forma de separación de esta cromatografía se puede dividir en 5 modos de

funcionamiento: cromatografía líquido-sólido, cromatografía líquido-líquido, cromatografía de

fase ligada, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía por exclusión de tamaño. El

modo que se elija dependerá de las propiedades del analito; en nuestro caso, al trabajar con

aminoácidos, se recurrió a la cromatografía de fase ligada para la separación, la cual es un

tipo de cromatografía de reparto de alta resolución.

Existen dos tipos de variaciones; de fase normal (fase estacionaria más polar que fase

móvil) y de fase reversa (fase estacionaria menos polar que fase móvil, los componentes

más polares aparecen primero y una disminución de la polaridad de la fase móvil disminuye

el tiempo de elución).

Debido que las fases móviles pueden ser químicamente activas, los componentes del

equipo deben de estar hechos de materiales resistentes a posibles ataques de dicha fase

(por lo general están hechas de acero inoxidable pasivadas con HNO3 6M).

- Tratamiento de la muestra:

Ciertos analitos no pueden ser detectados de manera directa debido a que presentan poco o

ninguna absorción en el rango UV-Vis en el caso de un detector DAD. Por ello, se recurre a

la derivatización pre o post-columna para detectarlos. Asimismo, la derivatización permite en

ciertos casos un análisis más detallado y una separación más adecuada. En el caso de pre-

columna, la derivatización se realiza antes del análisis y se considera los cambios químicos

de la muestra. En post-columna, la derivatización se efectúa después de la elución de la

muestra y antes de que llegue al detector. Un método más adecuado, al tratar con

aminoácidos, es la derivatización pre-columna con o-ftaldehido (OPA), lo cual ofrece

sensibilidad (pero derivados poco estables). Este método se utiliza para fase reversa y se

obtiene como derivados alquil-isoindoles

- Válvulas de inyección

Estos contienen cámaras de volumen conocido (loop). Estas válvulas tienen dos tipos de

posiciones, posición de llenado y posición de inyección. En la primera, el analito se introduce

al loop con una microjeringa, mientras que la fase móvil pasa directamente a la columna. En

la posición de inyección, la fase móvil arrastra al analito hasta la columna.

- Columnas

Están hechas generalmente de acero inoxidable, tienen una longitud entre 3 y 25 mm y un

diámetro entre 2 y 5mm. El empaquetamiento de la columna suele ser de partículas porosas

uniformes, esféricas o irregulares que tienen diámetros entre 3 y 10μm. Para evitar el rápido

deterioro de la columna, se coloca un dispositivo previo a la columna (pre columna), el cual

retira posibles partículas de gran tamaño que puedan obstruirla.

- Sistema de bombeo

Debido al uso de altas presiones, las bombas utilizadas deben de proporcionar un flujo

aceptable de eluyente. Los sistemas de bombeo deben de estar hechos de un material

inerte frente a los disolventes empleados y suministrar un flujo de eluyente libre de

pulsaciones en el margen de 0.1 y 10ml/min con una presión del 0.5%. Además, deben de

poder generar presiones superiores a 6psi.

- Detector

El detector depende de la naturaleza del analito (los más usados se basan en la absorción

de UV o visible). Este debe de tener un volumen muerto bajo para reducir el engrosamiento

dela banda adicional de la columna. Además, debe de tener un tamaño pequeño y ser

compatible con el flujo de líquido. Uno de los detectores UV-Vis usados en cromatografía

líquida es el detector de arreglo de diodos en el cual se irradia la luz a una celda que

contiene al fluido en movimiento. Este detector es del tipo multiplex y realiza la separación

de luz en el espacio por medio de dispersores de luz como prismas o rejillas y su detección

por medio de un arreglo de diodos.

Figura 1. Reacción de aminoácidos con alquiltiol y OPA.

II .Objetivo(s):

Hacerse familiar con el sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

en fase reversa.

Analizar cuantitativa y cualitativamente un conjunto dado de aminoácidos, empleando

para esto la técnica de derivatización pre-columna con OPA y su separación por

HPLC.

Entender el funcionamiento de la interfaz de control, así como las partes más

resaltantes del instrumento cromatográfico.

Conocer la utilidad de la información proporcionada en el espectro UV.

Estudiar el proceso e importancia de la derivatización en la preparación de las

muestras (para su análisis).

Analizar la composición de aminoácidos en la muestra preparada, por UV, luego de

su exitosa separación.

III .Parte experimental:

1. Materiales: 12 tubos para microcentrífuga de 1.5 mL; micropipetas ajustables hasta

1000, 200 y 20 µL; puntas para micropipeta (de tres distintos tamaños); una gradilla para

tubos de microcentrífuga; papel aluminio y papel toalla; marcador indeleble; y frasco para

desecho de solventes.

Figura 2. Detector de arreglo de diodos.

2. Reactivos:

Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos empleados (referidos a los L -

comercialmente accesibles).

Aminoácido P.M (g/mol)

Solubilidad (g/L)

Densidad (g/mL)

pH en solución

#CAS

Asparagina 150.14 22 (20°C) 0.530 4.0 - 5.5 5794-13-8Acido aspártico 133.10 4 (20°C) 0.430 2.5 - 3.5 56-84-8

Acido glutámico 147.13 11.1 (25°C) 0.460 3.0 - 3.5 56-86-0

Alanina 89.09 166.5 (25°C) 0.660 5.5 - 6.5 56-41-7Fenilalanina 165.19 27 (20°C) 0.580 5.4 - 6.0 63-91-2

Metionina 149.20 48 (20°C) 0.550 5.0 - 7.0 63-68-3

Serina 105.09 364 (20°C) 0.570 5.0 - 6.0 56-45-1Disponible en: http://www.fichasdeseguridad.com.

Tabla 2. Propiedades fisicoquímicas de los reactivos y solventes empleados.

Reactivo P.M (g/mol)

Solubilidad (g/L) Densidad (g/mL)

Toxicidad (mg/kg)

#CAS

O-ftaldehído 134.13 53 (20°C) 1.13 178 643-79-8Mercaptoetanol 78.13 Miscible (20°C) 1.12 98 60-24-2

Etanol (p.a) 46.07 Miscible (20°C) 0.793 6200 64-17-5Metanol (p.a) 32.04 Miscible (20°C) 0.792 5628 67-56-1

Cloroformo (p.a) 119.38 Miscible (20°C) 1.48 695 67-66-3Acetato de sodio 136.08 613 (20°C) 1.42 3530 6131-90-4

Di-sodiotetraborato 381.32 51.4 (20°C) 1.72 2660 1303-96-4Disponible en: http://www.fichasdeseguridad.com.

3. Instrumentos:

Mezclador tipo vórtex

Marca Thermolyne, modelo Mixer 16700

(Figura 1.)

El mezclador tipo vortex fue usado para la

primera agitación a temperatura ambiente en la

preparación de las muestras, luego de añadir

la solución OPA a la mezcla de aminoácidos.

El resultado fue la separación de las fases. La

agitación fue de aproximadamente 2 minutos

por muestra.

Figura 3. Mezclador tipo Vortex

Microcentrífuga de mesa

Marca Eppendof, modelo Centrifuge 5417C

(Figura 2.)

Una vez más, para separar completamente las

fases, se agito cada muestra, incluyendo la

muestra problema, en la microcentrifuga de

mesa por dos minutos.

Cromatógrafo HPLC

Marca Merck Hitachi; con inyector manual, Bomba cuaternaria y detector DAD. (Figura

3.)

El equipo de HPLC es el instrumento más importante en esta

experiencia. El cromatógrafo Merck-Hitachi usado lleva

acoplado una bomba cuaternaria y un detector de arreglo de

diodos (DAD). Dado que la correcta inyección de la muestra

podría definir el éxito o fracaso del experimento, el cromatógrafo

cuenta con una paleta de inyección la cual va rotando con cada

inserción de la muestra y mostrando diferentes entradas.

Se inyecta la muestra a través de una microjeringa de punta roma con capacidad para 100

µL, cubierta de vidrio y con un émbolo de acero. Se tomaron aproximadamente 60 µL de

cada muestra, y se debe tener en cuenta que la presencia de burbujas puede ocasionar

error en las mediciones, por lo cual es necesario evitarlas; además, dado que el “loop”, es

decir, el depósito en donde se coloca la muestra tiene una capacidad aproximada de 20 µL,

lo recomendable es inyectar el doble de su capacidad para lavar la tubería. La manija de

inyección se rota 45-60° desde su posición inicial (Figura 6.), esta posición se conoce como

“load” y es en la cual la fase móvil fluye desde la bomba cuaternaria a la columna. No toda la

fase móvil es retenida en la columna por lo que el “loop” también está conectado a un puerto

de desechos.

Una vez inyectada la muestra, se debe volver a la posición inicial, y rotar nuevamente la

manija de inyección, esto se conoce como la posición “inject”, y es en donde la muestra es

arrastrada por la fase móvil hacia la columna.

La columna empleada fue Merck RP-18 (fase reversa, octadecilsilano) de 125 mm de

longitud y 4,6 mm de diámetro. Los componentes de la muestra se retrasan

diferencialmente, dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase

Figura 4. Microcentrifuga de mesa

Figura 5. Cromatógrafo HPLC

estacionaria conforme pasan por la columna. Se utilizó una columna de fase reversa de

partícula esférica, en donde la fase estacionaria mantiene un carácter polar. Esta no

presentaba un sentido de flujo determinado y era monolítica, por lo que soportaba flujos

altos. Esta era de acero inoxidable y poseía filtros de acero poroso en su interior. Para

almacenar la columna, se colocan guarda columnas, del mismo material de acero

inoxidable, en los extremos de la misma, de manera manual y realizando un ajuste adicional

con llaves específicas.

Para comprobar si el comportamiento de la columna es el adecuado, se procede a revisar la

hoja de certificación de la misma, en donde se describe un método optimizado con rangos

de valores de asimetría de picos y número de platos esperados. Se especifica, también, los

cuidados que uno debe tener durante su manipulación y las condiciones de trabajo

adecuadas.

Como se ha mencionado antes, el detector utilizado fue en DAD, que permite captar las

señales de todos los λ’s a la vez ya que es sistema multiplex. El arreglo completo de un

sistema de HPLC se observa en la figura 6. Gracias al detector de diodos y al software

utilizado, los espectros obtenidos son tridimensionales y presentan 3 ejes: el eje de

absorbancias, el eje de longitud de onda y el del tiempo de retención, estos se pueden

observar en la figura 7, presentada a continuación.

Figura 6. Sistema HPLC, partes fundamentales.

Teniendo estas tres variables es posible fijar alguna de ellas, como por ejemplo la longitud

de onda, y obtener el cromatograma en base al tiempo de retencion y los espectros UV.

Además del sistema del equipo, es importante ajustar las condiciones adecuadas, en este

caso, se trabajo a una temperatura de 31.4°C. La presión fue ajustada a 1200 psi, sin

embargo, Se observó que cuando el solvente orgánico llegó a un valor entre 40 . El flujo

empleado fue de 1mL/min.

4. Procedimiento:

4.1 Preparación del Reactivo OPA:

Ya que el reactivo necesita un tiempo de 12 horas de preparación anticipada para su uso,

este fue entregado ya listo para trabajar. Fue preparado utilizando 27mg de reactivo OPA en

0.5 mL de etanol y se añadieron 5 mL de buffer de borato de sodio de 0.4M a pH de 9.5,

además, se agregaron 20 mL de mercaptoetanol.

4.2 Preparación de la solución estándar de Aminoácidos:

Esta solución también se nos dio preparada, para la cual se usaron 1 mg de L-aminoácidos,

estos fueron: asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, alanina, fenilalanina, metionina y

serina. A su vez, se disolvieron en 2 ml del buffer de borato mencionado anteriormente.

4.3 Curva de Calibración y Muestra Problema

Para determinar el contenido de aminoácidos en la muestra se realizó una curva patrón para

cada uno de los 7 aminoácidos utilizados. Esto se logra colocando diferentes volúmenes de

la mezcla de aminoácidos en 5 tubos diferentes de microcentrifuga. Los volúmenes

utilizados se indican en la tabla 3.

Figura 7. Cromatograma en tres dimensiones

Tabla 3. Reactivos añadidos en la preparación de cada muestra de aminoacidos.

Como se observa en la tabla 3, los volúmenes de solución estándar y buffer son distintos

para cada tubo. Además, una vez añadido el reactivo OPA se esperaron 2 minutos a

temperatura ambiente, luego de eso se añadieron 200 µL de cloroformo, y se agitaron (cada

uno por un tiempo de 2 minutos) en un Vortex. Una vez terminado, los tubos se colocaron en

una micro-centrifuga y se agitaron a máxima velocidad (8000 revoluciones por minuto) por 2

minutos. La muestra problema se trabajo de igual manera q los estándares anteriores.

Luego, se separó la mayor cantidad posible de la fase acuosa sobrenadante (si es posible

150 µL) y se colocaron en tubos limpios, los cuales se nombraron como se indica en la tabla

3. Una vez listos se tomaron aproximadamente 60 µL de cada muestra y se inyectaron en el

HPLC. Previamente, se lavó la columna con metanol para eliminar cualquier resto de la

solución anterior que haya podido quedar dentro de la columna.

4.4 Cromatografía

Se decidió que la secuencia de inyección de los estándares seria de la siguiente manera:

Tubo N°1, Tubo N°2, Tubo N°3, Muestra Problema, Tubo N°4, Tubo N°5.

Siguiendo la secuencia de inserción correcta que se describió anteriormente para el

cromatógrafo HPLC, uno a uno se inyectaron los estándares y fueron analizados por un

tiempo de aproximadamente 28 minutos cada uno.

La fase móvil era una mezcla de metanol y agua a pH 6 (buffer de acetato de sodio). La

proporción de metanol fue de 20% durante los dos primeros minutos y luego el contenido de

metanol en la fase móvil se fue incrementando por 16 minutos hasta llegar a 48% de

metanol, lo cual permitió eluir todos los aminoácidos menos polares. Luego se aplicó otro

gradiente (de 5 minutos) para volver al 20% de metanol y se esperaron otros 5 minutos para

estabilizar el sistema. Esto se volvió a repetir para cada injección.

Tubo N°1 Tubo N°2 Tubo N°3 Tubo N°4 Tubo N°5 Muestra

0 µL sol.

estándar

5 µL sol.

estándar

10 µL sol.

estándar

20 µL sol.

estándar

50 µL sol.

estándar

50 µL de la

muestra

50 µL buffer 45 µL buffer 40 µL buffer 30 µL buffer 0 µL buffer 0 µL buffer

200 µL de

OPA

200 µL de

OPA

200 µL de

OPA

200 µL de

OPA

200 µL de

OPA

200 µL de

OPA

500 µL de

cloroformo

500 µL de

cloroformo

500 µL de

cloroformo

500 µL de

cloroformo

500 µL de

cloroformo

500 µL de

cloroformo

IV .Resultados:

Se usó una mezcla de soluciones stock de aminoácidos cuyas concentraciones se muestran

en la tabla 4.

Se prepararon curvas de calibración de cinco puntos; el primer punto era el blanco, los tres

siguientes eran diluciones y el quinto era la mezcla sin diluir.

La proporción de concentraciones de los puntos 2, 3 y 4 con respecto al del punto 5 eran

respectivamente de 0,1/1; de 0,2/1 y de 0,4/1.

Tabla 4. Datos de la mezcla de soluciones stock de aminoácidos sin diluir.

Apartir de la información de la tabla 4 se puede deducir la de los demás puntos de las

curvas de calibración. Además, asumiendo que todas las injecciones fueron de 20 ul, y que

los aminoácidos fueron derivatizados completamente y se encontraban solo en la fase

acuosa, la masa total injectada con respecto a la masa total derivatizada se encuentra en la

misma proporción para cada aminoácido en cualquiera de los puntos (o número de tubo de

centrifuga).

Teniendo esto en cuenta se decidió realizar la abtención de las curvas de calibración de

A (área de integración )VsM (ug), donde M es la masa total del aminoácido que fue usada

para la preparación de las soluciones estándar, cuyo valor varía para cada punto. Se prefirió

realizar las curvas respecto a M ya que este valor era conocido, mientras que la masa de

aminoácidos injectada y la relación entre la concentración de la solución inicial y la acuosa

sobrenadante se desconocían.

Por otro lado el orden de elución

de lo aminoácidos se explica solo

por la diferencia en la estructura

de estas, teniendo en cuenta que

los aminoácidos más hidrofílicos

salieron primero por su mayor

afinidad a la fase móvil

(metanol/agua a pH 6), cuya

composición variaba durante el

proceso de separación

cromatográfica. Gráfico 1. Cromatograma de referencia.

ASP GLU ASN SER ALA MET PHEConcentración (mg /ml) 0,5 0,5 0,48 0,53 0,53 0,53 0,5Masa (ug) en 50ul 25 25 24 26,5 26,5 26,5 25

La identificación de los picos se realizó por comparación con el cromatograma de referencia

(Gráfico 1) proporcionado durante la práctica de laboratorio. Además, la figura 8 muestra las

estructuras de los aminoácidos según el orden de elución del Gráfico 1.

1o ASP 2o GLU 3o ASN

4o SER 5o ALA 6o MET 7o PHE

La información obtenida de la cromatografía se puede representar tridimensionalmente (la

intensidad de la señal detectada respecto al tiempo y la longitud de onda). En este caso se

obtuvo esta misma información de la muestra problema en el cromatograma bidimensional

λ (longitud de onda )VsRT (tiempo de retención )del Gráfico 2, donde la intensidad es

representada con una escala de colores. Además, el cromatograma

I ( intensidad )Vs RT ( tiempo deretención ) a 340 nm se muestra en el Gráfico 3 y es la sección

horizontal de la proyección tridimensional del cromatograma

λ (longitud de onda )Vs RT ( tiempode retención ).

Figura 8. Orden de elución de aminoácidos y sus estructuras.

Gráfico 2. Cromatograma de λ (longitud de onda )VsRT (tiempo de retención ).

Luego se prepararon las curvas de calibración A (área de integración )VsM (ug) para cada

aminoácido usando cinco puntos y aplicando una regresión lineal. Esto se logró usando las

áreas de integración (tabla 5) de los picos identificados anteriormente en los cromatogramas

I ( intensidad )Vs RT (tiempo deretención) obtenidos a 340 nm. El gráfico 4 muestra las curvas

de calibración para tres aminoácidos.

Tabla 5. Datos de las áreas de integración de los picos de cada aminoácido.

Tabla 6. Datos de las curvas de calibración para cada aminoácido.

Aminoácidos B A R2

ASP 72397 80886 0.996GLU 67847 72670 0.995ASN 5951.9 14723 0.972SER 27177 66179 0.977ALA 15196 57248 0.944MET 42500 48871 0.994PHE 52029 31122 0.998

Gráfico 3. Cromatograma de I ( intensidad )Vs RT ( tiempo deretención ).

Aminoácidos Tubo N°1 Tubo N°2 Tubo N°3 Tubo N°4 Tubo N°5 Muestra

ASP 15363 274880 480386 844533 1866127 14553

GLU 2780 253573 456083 791786 1742612 611120

ASN - 33998 53714 75018 153722 -

SER - 153929 259236 375604 766464 -

ALA 1660 129320 180574 206214 453045 152627

MET - 167407 305560 530041 1155980 455251

PHE - 159110 307240 585108 1315380 304930

La regresión lineal de las curvas de calibración permitió obtener la ecuación de la linea de

tendencia para cada aminoácido simbolizado por Y=BX+A de manera general. La tabla 6

muestra la información obtenida de estas curvas patrón.

0 5 10 15 20 25 300

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

f(x) = 42500.1898734177 x + 48870.8892405063R² = 0.994148223503028

f(x) = 15195.9027943635 x + 57247.5158227849R² = 0.943593281686545

f(x) = 27177.3632672558 x + 66178.5569620253R² = 0.976520281697809

SERLinear (SER)ALALinear (ALA)METLinear (MET)

Masa (ug)

Á

rea

Luego se compararon los tiempos de retención de los picos del cromatograma de la muestra

problema con los obtenidos en los cromatogramas de las soluciones estándar con el objetivo

de identificar los aminoácidos presentes y conocer el área de integración de los picos

identificados. A continuación se usaron los datos de las curvas patrón mostrados en la tabla

6 para cuantificar la cantidad de cada aminoácido presente en la muestra problema.

Tabla 7.Contenido de aminoácidos en la muestra problema.

Gráfico 4. Cromatograma de I ( intensidad )Vs RT ( tiempo deretención ).

GLU ALA MET PHE

Concentración (mg /ml) 0,16 0,13 0,19 0,11

Masa (ug) en 50ul 7,94 6,28 9,56 5,26

El cromatograma obtenido para el blanco se muestra a continuación:

Se ovtuvieron espectros UV-Vis a partir del cromatograma tridimensional cuendo se elegía

un solo tiempo de retensión. Por ejemplo, los espectros UV-Vis para los aminoácidos

fenilalanina y ácido glutámico se muestran en los gráficos 6a y 6b, y se observa que estos

poseen un perfil muy similar.

(a) (b)

V .Discusión:

Dado que los aminoácidos estudiados no presentan absorción apreciable en el rango UV-

Vis, fue necesario realizar la derivatización de estos con el objetico de que adquieran mayor

capacidad de absorción en el rango UV-Vis. El monitoreo de la absorbancia se realizó a

Gráfico 5. Cromatograma del punto uno, blanco.

Gráfico 6. espectros UV-Vis para la fenilalanina (a) y el ácido glutámico (b).

λmax= 340 nm debido a que los alquilisoindoles obtenidos luego de la derivatización

genralmente absorbían cerca de esta longitud de onda.

De los espectros UV-Vis obtenidos (dos de ellos se muestran en el Gráfico 6), se observó un

perfil similar en todos los casos. Esto se puede deber a que todos presentaban un mismo

grupo cromóforo (el grupo alquilisoindol).

El espectro del ácido aspártico presentó ciertas modificaciones en el patrón del espectro de

un alquilisoindol típico debido a que a ese tiempo de retención co-eluía una impureza de

naturaleza desconocida cuyo espectro de absorción fue observado en el blanco (Gráfico 5).

La fase esacionaria RP-18 utilizada presenta cadenas de octadecilo (apolares) unidas

covalentemente a la superficie de la silica particulada y estas explican el porqué los

compuestos apolares tienen una mayor tendencia a retenerse (Gráfico 1).

La separación en este tipo de columnas es por medio de una distribución del analito en la

fase móvil y en la fase estacionaria. El flujo de la fase móvil permite que los analitos se

muevan a lo largo de la columna. Dado que todos los aminoácidos han sido derivatizados, la

única interacción que los diferenciara será la correspondiente a la cadena R del aminoácido

(Figura 8). Los primeros aminoácidos en eluir fueron los polares ácidos como ácido

aspártico y el ácido glutámico; los siguientes fueron los polares no ionizables como

asparragina y la serina; luego salieró la alanina, que era la menos apolar de los apolares; y

finalmente salieron los más apolares, metionina y fenilalanina (Figura 8).

El gran rango de polaridad que caracteriza a los aminoácidos justifica la necesidad de usar

una fase móvil con gradiente de polaridad para lograr eluir todos los compuestos. El

incremneto de la apolaridad se observa con la subida de la linea azul del Gráfico 3. Además

la buena se paración de los picos observada en todos los cromatogramas (por ejemplo,

Gráfico 3) evidencia la eficacio del uso de una fase móvil variable.

Una forma directa de encontrar los tiempos de retención de los aminoácidos analizados es

mediante la inyección de estándares (bajo las mismas condiciones de separación

cromatográfica). Este infomación se obtuvo del cromatograma de referencia (Gráfico 1).

Sabiendo estos tiempos de retención fue posible asignar cada uno de los picos de los

cromatogramas obtenidos.

Por otro lado, algunos picos observados, como es el caso del ácido glutámico (Gráfico 3),

presentaban cierto ensanchamiento del pico hacia mayores tiempos de retención. Este

ensanchamiento puede explicarse con un equilibrio ácido–base en la solución; lo cual pudo

causar la presencia de dos especies en equilibrio que habrian producido el ensanchamiento

del pico.

Se observó que los valores de las áreas de integración (Tabla 5) de los aminoácidos

presentes en la muestra se encuentran dentro de rango de las obtenidas para las soluciones

estándar. Esto permitió que la aplicación de las ecuaciones de calibración (Tabla 6)

obtenidas no produsciera una fuente de error.

Las valores de altos de R2 mostrados en la Tabla 6 evidencia el alto grado de linealidad de

las curvas de calibración. Esta diferencia en la presición del ajuste se puede observar

fácilmente en la Gráfica 4, donde los puntos azules y rojos no se ajustan a su linea de

tendencia tan bien como los puntos verdes.

Además, la razón por la cual no todos los R2 están alrededor de 0.99 se explica por la

diferencia en estabilidad de los derivados obtenidos, los cuales puderon haberse

descompuesto antes de la injección. Este hecho sería una fuente de error presente en

diferente grado en cada curva de calibración.

Otras posibles fuentes de error que pudieron haberse generado en este experimento se

centran en errores de las mediciones de volumen y masa. El proceso de preparación de la

muestra requiere que todas las muestras analizadas hayan sido tratadas de manera similar

y por el mismo usuario, ya que diferencias en volúmenes medidos o adición de reactivos

pueden alterar las concentraciones de los analitos. La diferencia en los intervalos de dos

minutos que se debian esperar para que se complete la reacción de derivatización también

puede ser una fuente de error.

Por otro lado, la preparación de los bufferes y soluciones usadas en la fase móvil pueden

afectar la separación ya que varían la composición del eluyente. Asimismo, la columna

usada debe estar limpia y equilibrada adecuadamente para poder tener una buena

reproducibilidad en los ensayos. Por último, se debe mencionar la pureza de los estándares

usados ya que la presencia de otros compuestos puede interferir en el análisis produciendo

nuevos picos en el cromatograma o alterando los valores de masa medidos.

Con los experimentos realizados no se puede asegurar que los valores de concentración de

los aminoácidos en la muestra problema (Tabla 7) sean exactos. Para esto sería necesario

analizar una mezcla estándar diferente y con concentraciones conocidas y luego ver cuán

bien resulta el aplicar las ecuaciones de calibración (Tabla 6).

VI .Conclusiones:

El análisis de aminoácidos por HPLC-DAD requirió de un proceso de derivatización

con OPA previo, que permitiese mejorar las propiedades de absorción de estos al

formar alquilisoindoles que absorbiesen en el rango UV-Vis.

Se pudo realizar una separación cromatográfica eficiente de los aminoácidos

estudiados al aplicar HPLC de fase reversa en una columna Merck RP-18.

El gradiente de elución de fase móvil permitió la separación de los picos de los

aminoácidos; los cuales fueron detectados por un equipo de UV-VIS a 340 nm, ya

que absorben entre 200-400 nm.

Se pudieron construir curvas de calibración que presentaban una alta linealidad.

En la muestra desconocida solo se encontraron los aminoácidos ácido glutámico,

alanina, metionina y fenilalanina en concentraciones de 0.16 mg/ml, 0.13 mg/ml,

0.19 mg/ml y 0.11 mg/ml respectivamente.

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