UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

ESCUELA DE POSGRADO

CURSO

QUÌMICA Y BIOQUÍMICA AGROINDUSTRIAL

TEMA

CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES, PROTEÍNA POR

ESPECTROFOTOMETRIA Y TEOBROMINA POR RF-HPLC

ALUMNO:

REATEGUI DIAZ DARLYM

TAFUR PEREDA HANS JOAN

RIVERA ROJAS HUMBERTO HUGO

DOCENTE:

Dr. MANUEL RICARDO GUERRERO OCHOA

TINGO MARIA

2015

I. INTRODUCCION

La determinación de azúcares reductores, la obtención de aislados proteicos y el

análisis de teobromina mediante la técnica de HPLC se abordan en este trabajo. Con la

finalidad de afianzar nuestro aprendizaje y consolidar nuestros conocimientos teóricos,

siendo de suma importancia y trascendencia comprender los fundamentos para la

determinación de los temas antes mencionados.

El trabajo es de naturaleza experimental demostrativo y se desarrolló de la siguiente

manera: los azúcares reductores fue determinado por el método del 3,5-Dinitrisalicilico

(DNS) propuesto por Miller (1955), la cuantificación de proteínas se desarrolló por el

protocolos descrito por Lowry et al. (1951), ligeramente modificado usando una alta

concentración de la solución salina de cobre (Hartree, 1972). Y protocolo descrito por

Bradford (1976). Finalmente la teobromina Se determinó por cromatografía líquida de fase

reversa (FR-HPLC) propuesto por Carrillo (2013).

La práctica se desarrolló planteándose los siguientes objetivos:

Cuantificar azúcares reductores en muestra de plátano y hojas de zarzamora por el método

DNS.

Obtención de aislados proteicos a partir de torta de sachainchi (plukenetia volubilis) y

harina de semilla de huingo (crescentia cujete) y su cuantificación por los métodos de

Lowry y Bradford

Cuantificación de teobromina por FR-HPLC

II. MARCO TEORICO

2.1. Azúcares reductores

Definición: Los azúcares que contienen un grupo carbonilo libre se conocen como

azucares reductores. Todos los monosacáridos son azucares reductores. Los disacáridos son

azúcares reductores solo si contienen un grupo carbonilo libre. Los grupos carbonilo de la

glucosa y la fructosa intervienen ambos en el enlace glicosídico y, por tanto no están libres

para participar en otras reacciones. La maltosa, por otra parte, tiene un grupo carbonilo que

interviene en el enlace glicosídico, y el otro grupo carbonilo esta libre, por tanto la maltosa

es un azúcar reductor.

Importancia de los azúcares reductores en los alimentos. La reacción de Maillard

(técnicamente: glucosilación no enzimática de proteínas) se trata de un conjunto complejo

de reacciones químicas que se producen entre las proteínas y los azúcares reductores que se

dan al calentar (no es necesario que sea a temperaturas muy altas) los alimentos o mezclas

similares, como por ejemplo una pasta. Se trata básicamente de una especie de

caramelización de los alimentos, es la misma reacción la que colorea de marrón la costra de

la carne mientras se cocina al horno.

En 1916 Maillard (1878-1936) demostró que los pigmentos marrones y los

polímeros que ocurren durante la pirólisis (degradación química producida únicamente por

calor) se liberan después de la reacción previa de un grupo de aminoácidos con un grupo

carbonilo de azúcares. No fue sino hasta 1953 cuando se descubrió el mecanismo de las

complejas interacciones que se producen. La reacción de Maillard, también conocida como

'Pardeamiento no enzimático', es la responsable de muchos de los colores y sabores

existentes en todos los alimentos.

Factores que influyen en la Reacción de Maillard 1) Tipo de hidrato de carbono

2) Tipo de aminoácidos o proteína 3) Concentración de sustratos 4) Tiempo y temperatura de cocción

5) pH 6) Presencia de inhibidores 7) Actividad de agua Tipo de hidrato de carbono Los hidratos de

carbono se pueden clasificar según su estructura química en Monosacáridos, Disacáridos,

Polisacáridos

Inhibidores de la reacción de Maillard: Los inhibidores más comunes son los

sulfitos, metabisulfitos, bisulfitos y anhídrido sulfuroso. Actúan en la etapa de inducción retardando

la aparición de productos coloreados, pero no evitan la pérdida del valor biológico de los

aminoácidos. Su uso está limitado ya que produce efectos adversos a la salud.

Cuantificación de azúcares reductores por el método de DNS. Este

procedimiento se fundamenta en la reacción de los grupos reductores de los azúcares con el reactivo

oxidante ácido dinitrosalicílico (DNS). El reactivo consiste en una disolución formada por los

siguientes compuestos: ácido dinitrosalicílico (ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzóico), que actúa como

oxidante; Sal de Rochelle (tartrato sódico-potásico), que impide la disolución de oxígeno en el

reactivo y hidróxido sódico, que aporta el medio requerido para que se produzca la reacción redox.

De esta forma, el ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzóico se reduce, en presencia del grupo reductor de

la glucosa, formando el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, mientras que el grupo aldehído reductor se

oxida, para formar un grupo carboxílico. En este método analítico el DNS está en exceso frente a los

grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores

concentraciones de azúcares reductores provocan una mayor coloración de la muestra. Estas

diferencias de coloración pueden determinarse por espectrofotometría visible, a la longitud de onda

de máxima absorbancia de 540 nm.

2.2. Metilxantinas

La teofilina, la cafeína y la teobromina son tres alcaloides estrechamente

relacionados que se producen en plantas de amplia distribución geográfica. No menos de la

mitad de la población mundial consume té (que contiene cafeína y pequeñas cantidades de

teofilina y teobromina).

La cocoa y el chocolate, de las semillas de Theobroma cacao, contienen

teobromina y algo de cafeína. La Teobromina puede producir un síndrome de dependencia

el cual no está muy bien caracterizado. (Dependencia al Chocolate).

Teobromina: (C7H8N4O2, de nombre químico 3,7-dimetilxantina o 3,7-dihidro-

3,7-dimetil-1Hpurina-2,6-diona) es un alcaloide de la familia de las metilxantinas, familia que

incluye también a la teofilina y la cafeína. Es una sustancia incolora e inolora con un sabor

ligeramente amargo. Se encuentra presente en el árbol del cacao, y sus semillas, y por consiguiente

en los productos del cacao y sus derivados.

Toxicidad: La teobromina se encuentra en concentraciones altas en el

chocolate. En ensayos clínicos se han usado dosis de más de 1000 mg sin efectos dañinos,

aunque con pueden provocar molestias estomacales leves. Para tener efectos nocivos sobre

los humanos debe de ingerirse una gran cantidad de cacao.

Sin embargo, la teobromina es altamente tóxica para ciertos animales

domésticos, como perros y gatos. Una dosis pequeña de teobromina puede causarles

arritmias cardíacas y convulsiones, e incluso la muerte.

Fuente: La fuente principal de teobromina es el cacao, Theobroma cacao que

puede llegar a contener hasta 3% de teobromina

2.3. Proteínas

Las proteínas son sustancias complejas, formadas por la unión de ciertas

sustancias más simples llamadas aminoácidos, que los vegetales sintetizan a partir de los

nitratos y las sales amoniacales del suelo. Los animales herbívoros reciben sus proteínas de

las plantas; el hombre puede obtenerlas de las plantas o de los animales, pero las proteínas

de origen animal son de mayor valor nutritivo que las vegetales. Esto se debe a que, de los

aminoácidos que se conocen, que son veinticuatro, hay nueve que son imprescindibles para

la vida, y es en las proteínas animales donde éstas se encuentran en mayor cantidad.

Funciones: Las proteínas determinan la forma y la estructura de las células y

dirigen casi todos los procesos vitales. Las funciones de las proteínas son específicas de cada

una de ellas y permiten a las células mantener su integridad, defenderse de agentes externos,

reparar daños, controlar y regular funciones, etc. Todas las proteínas realizan su función de

la misma manera: por unión selectiva a moléculas. Las proteínas estructurales se agregan a

otras moléculas de la misma proteína para originar una estructura mayor. Sin embargo, otras

proteínas se unen a moléculas distintas: los anticuerpos a los antígenos específicos, la

hemoglobina al oxígeno, las enzimas a sus sustratos, los reguladores de la expresión génica

al ADN, las hormonas a sus receptores específicos, etc.

Propiedades:

Especificidad: Las propiedades de las proteínas dependen de la estructura

tridimensional en el medio acuoso, es decir, de los aminoácidos que se disponen en su

superficie, que son los que constituyen el centro activo; también de los aminoácidos que se

disponen hacia el interior, ya que son los que dan rigidez y forma a la proteína.

Cada proteína tiene una conformación según su estructura primaria. Así, un pequeño cambio

en la secuencia de aminoácidos provoca cambios en la estructura primaria, secundaria,

terciaria, y por tanto pérdida de la actividad biológica.

Solubilidad: Las proteínas globulares son solubles en agua, debido a que sus

radicales polares o hidrófilos se sitúan hacia el exterior, formando puentes de hidrógeno con

el agua, constituyendo una capa de solvatación. Esta solubilidad varía dependiendo del

tamaño, de la forma, de la disposición de los radicales y del pH.

Desnaturalización: Pérdida de la estructura tridimensional o conformación,

y por tanto también de la actividad biológica. Se produce al variar la temperatura, presión,

pH, electronegatividad, etc. Esto provoca la rotura de los puentes de hidrógeno que

mantienen las estructuras secundaria y terciaria, y las proteínas se convierten en fibras

insolubles en agua. Si las condiciones son suaves, el proceso es reversible, y si el cambio es

más drástico, es irreversible.

III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Lugar de la práctica:

La práctica se desarrolló en el Centro de Investigación para el Desarrollo

Biotecnológico de la Amazonia (CIDBAM), de la Universidad Nacional Agraria de la Selva

(UNAS); ubicada en el distrito de Rupa Rupa, provincia de Leoncio Prado, departamento de

Huánuco; a una altitud de 660 m.s.n.m. a 09°17’08” de Latitud Sur, a 75° 59’52” de Latitud

Oeste, con clima tropical húmedo y con una humedad relativa media de 84% y temperatura

media anual de 24ºC.

3.2. Materiales, equipos y reactivos:

Materiales:

Fiola de 100 mL

Tubos de ensayo de 10 mL

Tubos ependoff 2mL

Micropipetas de 100, 1000 y 5000 uL, marca Lasany.

Gradilla

Equipos:

Espectrofotometro uv-vis. Modelo Espectronic 20. Marca Thermo Scientific

HPLC Desgasificador. Modelo DGU-14A. Marca Shimatzu.

HPLC Bomba. Modelo LC-10AT. Marca Shimatzu.

HPLC Horno Columna. Modelo CTO-10AS. Marca Shimatzu.

HPLC Detector uv-vis. Modelo SPD-10AU. Marca Shimatzu.

HPLC Controlador de Sistema. Modelo SCL-10A. Marca Shimatzu.

Software HPLC Class-VP versión 6.3.

Homogenizador

Centrifuga modelo MIKRO 22R

Balanza analítica modelo ESJ-210-4, Marca Presición

Estufa modelo ODH6-9240A. Marca Tomos

Reactivos:

Glucosa anhidra, Scharlau

3,5-Dinitrosalicilico acid, Sigma Aldrich.

Phenol P.A. Merck

Bisulfito de sodio. Merck

Tartrato de sodio y potasio. Sigma Aldrich

Estándar de teobromina 99%, Sigma Aldrich

Agua destilada desionizada.

Metanol grado HPLC, Merck.

Ácido acético glacial, Merck.

Cloruro de sodio, Merck

Hidroxido de sodio, Merck

Etanol absoluto, Induquimica

Muestra biológica:

Pulpa de plátano manzano (Musa balbisiana)

Polvo de cacao (Theobroma cacao)

Torta de sachainchi (Plukenetia volubilis)

Harina de semilla de huito (Genipa americana)

3.3. Métodos

Cuantificación de azucares reductores: Se determinó por

espectrofotometría por el método del 3,5-Dinitrisalicilico (DNS) propuesto por Miller

(1955)

Cuantificación de teobromina: Se determinó por cromatografía líquida de

fase reversa (FR-HPLC) propuesto por Carrillo (2013), se utilizó como fase móvil agua,

metanol y ácido acético (80:24,9:0,1), la fase estacionaria fue una columna C18 de 5 um. El

análisis se realizó con una elución isocrática a un flujo de 1mL/min en un tiempo de 10 min.

Extracción y cuantificación de proteína: El método utilizado para la

obtención de aislados proteicos es el siguiente:

Preparación de la muestra

1. Deshidratar la muestra hasta una humedad final aproximada del 10%.

2. Moler hasta alcanzar un tamaño de partícula menor a 500 um.

3. Para 100 g de muestra seca, diluir en 1000 mL de éter de petróleo anhidro y dejar agitar

por al menos 16 h a temperatura ambiente, también puede utilizar hexano en una

relación 1:4 (p/v) y dejar agitando por el mismo tiempo a 4°C, con el objetivo de

desgrasar la muestra.

4. Filtrar la muestra para separar el solvente que arrastrará la fracción lipídica.

5. Secar la torta residual a 40°C por al menos 60 minutos o hasta evaporar el solvente

residual.

6. Almacenar en refrigeración (4°C) la harina desgrasada (HD), obtenida en bolsas de

polietileno de alta densidad selladas herméticamente, hasta su uso posterior.

Extracción de la proteína.

1. En un matraz de 1L pesar 50 g de Harina Desgrasada (HD).

2. Si para la extracción se considera necesaria la incorporación de NaCl, pesar la cantidad

adecuada para la muestra y añadir al matraz.

3. Añadir buffer o agua destilada en una relación solvente: harina adecuada para la materia

prima (mL/g).

4. Regular el pH de la solución utilizando NaOH o HCl, si fuera necesario en función de

la materia prima a utilizar.

5. Agitar utilizando un agitador magnético a una temperatura y tiempo adecuado para la

materia prima a ser utilizada.

6. Centrifugar a 6000 rpm por al menos 20 min a 4°C.

7. Guardar el sobrenadante (S1).

8. Repetir con el precipitado el proceso de extracción (Pasos 3 al 6).

9. Guardar el sobrenadante (S2).

10. Juntar ambos sobrenadantes (S1 y S2).

11. Filtrar utilizando papel Whatman de paso rápido y medir el volumen total.

*Tomar una alícuota de 100 uL y cuantificar la proteína soluble por el método de Lowry

et al. (1951) o Bradford (1976).

12. Regular el pH hasta alcanzar el punto isoeléctrico (pI) de la proteína utilizando NaOH

2M y HCl 2M.

13. Centrifugar a 6000 rpm por al menos 20 min a 4°C, para lograr la precipitación de la

proteína.

14. Adicionar agua destilada en una proporción 4 a 1 (v/v) con los precipitados.

15. Repetir los pasos 12 y 13.

16. Repetir los pasos 14 y 15, por al menos dos veces más con la finalidad de lavar la

proteína.

17. Eliminar el sobrenadante y juntar los precipitados.

18. Neutralizar la proteína obtenida utilizando NaOH 2M y HCl 2M.

19. Liofilizar.

20. El aislado proteico así obtenido almacenarlo a 4°C en bolsas de polietileno de alta

densidad herméticamente selladas.

Cuantificación de proteína por el método de Lowry.

Se utilizará el protocolo descrito por Lowry et al. (1951), ligeramente

modificado usando una alta concentración de la solución salina de cobre (Hartree, 1972).

1. Preparar los siguientes reactivos stock:

a. Solución A, 2% p/v de CuSO4.5H2O;

b. Solución B, 4% p/v de tartrato de sodio potasio; y la

c. Solución C, 3% p/v de Na2CO3 en una solución de NaOH 0.1 M.

2. Al momento del análisis preparar el reactivo D adicionando a 50 mL de reactivo C, 0.5

mL de reactivo B y 0.5 mL de reactivo A.

3. Preparar el reactivo E diluyendo reactivo de Folín-Ciocalteu (2N) con agua en una

proporción 1:2.

4. En un tubo de ensayo adicionar 0.5 mL de muestra convenientemente diluida con suero

fisiológico (0.9% NaCl).

5. Adicionar al tubo con muestra 2.5 mL de reactivo D.

6. Mezclar utilizando un vórtex y dejar reposar un tiempo de 20 min a temperatura

ambiente.

7. Adicionar 0.5 ml de reactivo E.

8. Mezclar utilizando un vórtex y dejar reposar un tiempo de 40 min a temperatura

ambiente.

9. Con un espectrofotómetro medir la absorbancia a 750 nm contra un blanco preparado

con suero fisiológico (0.9%).

Nota: La curva estándar se construirá ploteando la absorbancia medida a 750

nm de albumina de suero bovino (BSA) a diferentes concentraciones (0-0.5 mg/mL) tratadas

con el mismo procedimiento de la muestra.

Cuantificación de proteína por el método de Bradford. Se utilizará el

protocolo descrito por Bradford (1976):

1. Preparar el reactivo de bradford:

a. Disolver 100 mg de Azul Brillante de Comassie G-250 em 50 mL de etanol (95%).

b. Agregar 100 mL de ácido fosfórico (85%).

c. Enrasar la solución a 1 L.

d. Mezclar bien y filtrar con una bomba de vació utilizando papel Whatman de paso

lento por lo menos tres veces, para evitar la presencia de reactivo no disuelto en forma

de puntos.

e. Almacenar a 4°C hasta su uso.

2. En un tubo de ensayo adicionar 0.4 mL de muestra convenientemente diluida con suero

fisiológico (0.9% NaCl).

3. Adicionar al tubo con muestra 1.6 mL de reactivo de Bradford.

4. Mezclar utilizando un vórtex y dejar reposar un tiempo de al menos 5 min y menos de

1 h a temperatura ambiente.

Con un espectrofotómetro medir la absorbancia a 595 nm contra un

blanco preparado con suero fisiológico (0.9%).

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1. Cuantificación de azúcares reductores:

Determinación de la curva patrón

La curva patrón de glucosa, obtenida por regresión lineal entre los valores de

concentración de glucosa (g/L) versus la absorbancia, se muestra en la figura 1.

Skoog (1995) menciona que la ley de Beer es válida para una sustancia cuando la relación

concentración versus absorbancia es una línea recta, que pasa por el origen de los ejes

cartesianos, sin embargo a menudo en la práctica se observan desviaciones debidas a

diversos factores. Por lo tanto en base a esto podemos afirmar que para el caso de la glucosa

se cumple la ley de Beer por lo que obtuvimos un R2 = 0,9926 lo que indica que hay

linealidad entre concentración de glucosa y absorbancia. Si bien la recta no pasa por el origen

de los ejes cartesianos existe una desviación muy pequeña del orden de -0,088 lo cual

cumple con lo indicado por el mismo autor.

Figura 1. Curva patrón de glucosa

En el cuadro 1 se presenta los resultados de la evaluación de azúcares

reductores en pulpa de plátano manzano y hojas de zarzamora. Los resultados muestran

y = 0.4355x + 0.0888R² = 0.9926

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40

Ab

sorb

anci

a

Concentracion glucosa (g/L)

valores de azúcares reductores para la pulpa de plátano de 11,6% el cual difiere del reportado

por ITAL, (1985), quien encontró valores de azucares en plátano de 16,2% así mismo Davila,

(1992) reporta 14% de azúcares reductores al igual, Inga (2003) reporta 10,36%; estas

diferencias es posible se deban a los estados de madurez de la muestra evaluada tal como lo

menciona ITAL (1985). El contenido de almidón es mayor en los plátanos verdes los cuales

durante el proceso de maduración por efecto de las enzimas van transformándose en azucares

reductores por lo que el contenido de azucares reductores es mayor cuando mayor sea su

estado de madurez. El contenido de azucares reductores para el caso de la hoja de zarzamora

no fue detectado esto puede deberse que los valores de azucares presentes son muy bajos,

sin embargo esto se podría determinar por agregación de estándar como menciona (Soto,

2006)

Cuadro 01. Resultados de la cuantificación de azucares reductores en el plátano guayabo

Muestra Azucares reductores

(%)

Plátano manzano

Hoja de zarzamora

11,6

N.D.

4.2. Cuantificación de teobromina por RF-HPLC

Encendido y acondicionamiento de parámetros del RF-HPLC:

El acondicionamiento de los parámetros internos del RF-HPLC se realizó

utilizando el software Class-VP 6.3. Los cuales se muestran en el cuadro 2.

Cuadro 2. Parámetros del RF-HPLC para cuantificación de teobromina

Parámetro Medida

Temperatura horno 35 ºC

Flujo fase móvil 1 mL/min

Longitud de onda 270 nm

Sistema de elución Isocrático

Con los parámetros establecidos y luego de una limpieza de la columna con

metanol grado HPLC se creó la línea base eluyendo la fase móvil (Metanol 20% : agua 80%).

Los parámetros establecidos pueden variar dependiendo la fase móvil a utilizar como

menciona Alves, 2002.

Curva estándar de Teobromina:

En el cuadro 3 se muestra los resultados de los cálculos de volúmenes de agua

y stock (teobromina 100 uM), necesarios para preparar los estándares de teobromina a cinco

concentraciones diferentes.

Los valores de concentración de las soluciones pueden variar teniendo

siempre en cuenta no exceder los límites superior e inferior ya que ello puede conllevar a

pérdida de la linealidad de la curva patrón como menciona Skoog, 2005.

Cuadro 3. Preparación de estándares para curva patrón de teobromina

Estándar Stock 50 uM

Tb (uL) Agua (uL)

Volumen

Final (uL)

Concentració

n Tb (uM)

1 900 100 1000 5

2 800 200 1000 10

3 700 300 1000 15

4 600 400 1000 20

5 400 600 1000 30

En el cuadro 4 y figura 2 se muestran los resultados de las áreas encontradas

por cada solución estándar así como la curva patrón obtenida por regresión lineal entre los

valores de concentración de teobromina versus área de los picos cromatográficos de cada

solución estándar de teobromina.

En la figura 2 se puede observar dos curvas patrón esto se debe a que se tuvo

que corregir el mostrado en la figura 2 (a) ya que la ecuación no mostro linealidad al obtener

un R2 de 0,696 por lo que se descartó dos puntos hasta obtener el R2 de la figura 2 (b) esto

es posible que suceda por error de medición de volúmenes al preparar las disoluciones de

estándares.

Cuadro 4. Resultados de integración de áreas de las soluciones estándar de teobromina

Estándar Concentració

n (uM) TR (min) Área

1 5 4,02 78479

2 10 4,02 116407

3 15 4,017 93524

4 20 4,012 105531

5 30 4,013 150054

Figura 2. Curva patrón de teobromina

y = 2345x + 71279R² = 0.696

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

0 10 20 30 40

Are

a

Concentracón Tb (uM)(a)

y = 1760.8x + 69035R² = 0.9844

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 5 10 15 20 25

Are

a

Concentracón Tb (uM)(b)

En la figura 3 se muestra el cromatograma obtenido de la corrida

cromatografica por RF-HPLC de extracto de polvo de cacao. Aquí se puede observar

diferentes picos cromatográficos que corresponden a cada componente de la muestra en la

cual se puede identificar teobromina por comparación del tiempo de retención al del estándar

corrido en la curva patrón (Ramírez, 2014)

Podemos además notar que el pico de teobromina esta sobre montado con

otro componente esto se debe a que los solventes de fase móvil no son los adecuados como

lo menciona (Cruz, 2015) quien indica que el agua debe ser acidificada con ácido acético al

0,1%

Figura 3. Cromatograma de extracto de polvo de cacao para cuantificación de teobromina

En el cuadro 5 se presenta el resultado de cuantificación de teobromina en

polvo de cacao. El valor encontrado (0,539 g/100g) es menor a los obtenidos por Carrillo,

2013 (0,77%) y Cruz, 2015 (0,61%) esto puede deberse al proceso de extracción de la

muestra que en nuestro caso solo se utilizó agua a diferencia de los autores mencionados que

utilizaron fase móvil como solvente de extracción.

El valor encontrado pueden ser discutidos en dos puntos de vista: en primer

lugar en el aspecto tecnológico, ya que éste compuesto junto con los polifenoles son

responsables de la amargura y la astringencia del chocolate producido (Efraim et al., 2011).

Teobromina

El otro aspecto es el efecto de la teobromina en el cuerpo humano, éste no

tiene el efecto estimulante, sobre el sistema nerviosos central como la cafeína, debido a que

su acción sobre este sistema es muy débil o casi inexistente, pero puede actuar como un

vasodilatador, relajante muscular, diurético y reductor de la presión arterial (.Van den

Bogaard y otros, 2010; Mitchell et al., 2011).

Cuadro 5. Concentración de teobromina en polvo de cacao

Muestra Área Teobromina (g/100 g)

Polvo de Cacao 91056 0,539

4.3. Cuantificación de proteína por los métodos de Lowry y Bradford

Curva patrón: En la figura 4 se presenta el grafico de dispersión y la

ecuación de regresión lineal de la concentración de albumina de suero bovino (0,1-0,6

mg/mL).

Skoog (1995) menciona que la ley de Beer es válida para una sustancia

cuando la relación concentración versus absorbancia es una línea recta, que pasa por el

origen de los ejes cartesianos, sin embargo a menudo en la práctica se observan desviaciones

debidas a diversos factores. Por lo tanto en base a esto podemos notar que para el caso de la

albumina de suero bovino no cumple la segunda condición por lo que a pesar que obtuvimos

obtuvimos un R2 = 0,9626 la recta está lejos de cruzar por el origen de coordenadas lo que

nos revelaría que no cumple con la ley de Beer.

Para comprobar ajustamos la curva patrón a pasar por el origen de

coordenadas en la cual podemos notar que la ecuación posee correlación negativa

(R2=-0,312) como se muestra en la figura 5. Estos resultados puede deberse a un error en la

preparación del blanco ya que el objetivo de éste es calibrar el equipo que a concentración

cero la absorbancia también sea cero.

Figura 4. Curva patrón de albumina de suero bovino

Figura 5. Curva patrón de albumina de suero bovino ajustada al origen de coordenadas

En el cuadro 6 se muestras los valores de absorbancia obtenidas por

extracción en diferentes medios (con y sin NaCl) de proteínas de harina de huingo a

diluciones de 50 y 100 .

El cuadro nos revela errores de lectura debido a la ineficiente preparación de

las disoluciones o puede también ser una deficiente rotulación de las mismas ya que para

cumplir la ley de Beer (mayores concentraciones deberá existir mayor absorbancia), sin

y = 1.0009x + 0.4485

R² = 0.9626

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Ab

sorb

anci

a

Concentración albumina de suero bovino (mg/mL)

y = 2.0359x

R² = -0.312

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Ab

sorb

anci

a

Concentración de Albumina de suero bovino (mg/mL)

embargo el cuadro indica a una menor dilución (mayor concentración) existe menor

absorbancia.

El contenido de proteína obtenido resulta ser negativo estos se debe a la

ineficiente preparación de las soluciones para preparar la curva patrón como se indicó

anteriormente.

Cuadro 6. Resultados de absorbancia de proteínas de Huingo obtenidas en medios con y sin

NaCl y a diferentes diluciones

Muestra Repetición Dilución Abs Proteína (mg/mL)

Huingo (con NaCl)

r1 50

0,061 -0,3872

r2 0,065 -0,3832

r1 100

0,116 -0,3322

r2 0,123 -0,3253

Huingo (sin NaCl)

r1 50

0,11 -0,3382

r2 0,111 -0,3372

r1 100

0,198 -0,2503

r2 0,184 -0,2643

En el cuadro 7 se muestras los valores de absorbancia obtenidas por

extracción en diferentes medios (con y sin NaCl) de proteínas de torta de sachainchi a

diluciones de 50 y 100 .

Al igual que en el caso anterior el cuadro nos revela errores de lectura debido

a la ineficiente preparación de las disoluciones o puede también ser una deficiente rotulación

de las mismas ya que para cumplir la ley de Beer (mayores concentraciones deberá existir

mayor absorbancia), sin embargo el cuadro indica a una menor dilución (mayor

concentración) existe menor absorbancia.

El contenido de proteína obtenido resulta ser negativo por los motivos indicados en

el caso anterior.

Cuadro 7. Resultados de absorbancia de proteínas de torta de sachainchi obtenidas en medios

con y sin NaCl y a diferentes diluciones

Muestra Repetición Dilución Abs Proteína (mg/mL).

Torta de sachainchi (con NaCl)

r1 100

0,024 -0,424

r2 0,028 -0,420

r1 200

0,039 -0,409

r2 0,043 -0,405

Torta de sachainchi (sin NaCl)

r1 100

0,011 -0,437

r2 0,014 -0,434

r1 200

0,024 -0,424

r2 0,02 -0,428

V. CONCLUSIONES

El contenido de azucares reductores en pulpa de plátano manzano fue de 11,6 %

No se logró determinar los contenidos de proteína por ninguno de los métodos (lowry y

Bradford) en torta de sachainchi y harina de semilla de huingo.

El contenido de teobromina en polvo de cacao fue de 0,539%

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Miller, R.H. (1955) Instrumentation. Analysis Chemical, 27(2), 41a-44a.

Doi:10.1021/ac60098a744.

2. Skoog, West, Holler and Chrouch (2005) Fundamentos de química analitica 8va

edición Mexico

3. Carrillo, L., J. Londoño y A. Gil. 2013. Comparison of polyphenol, methylxanthines

and antioxidant activity in Theobroma cacao beans from different cocoa-growing areas

in Colombia. Int. J. Food Sci. Technol. 60, 1-8.

4. Cruz, J. F. M., Leite, P. B., Soares, S. E., & Bispo, E. da S. (2015). Bioactive

compounds in different cocoa (Theobroma cacao, L) cultivars during fermentation.

Food Sci. Technol (Campinas), 35(2), 279–284. doi:10.1590/1678-457x.6541

5. Efraim, P., Alves, A. B., & Jardim, D. C. P. (2011). Polifenóis em cacau e derivados:

teores, fatores de variação e efeitos na saúde. Brazilian Journal of Food Technology,

14(3), 181-201. http://dx.doi.org/10.4260/ BJFT2011140300023.

6. Van den Bogaard, B., Draijer, R., Westerhof, B. E., Van den Meiracker, A. H., Van

Montfrans, G. A., & Van den Born, B. J. (2010). Effects on peripheral and central

blood pressure of cocoa with natural or high-dose theobromine: a randomized, double-

blind crossover trial. Hypertension, 56(5), 839-846. http://dx.doi.org/10.1161/

HYPERTENSIONAHA.110.158139. PMid:20823377

7. Instituto Tecnologico de alimentos (ITAL) 1985. Bananas. Serie de frutas tropicales

Nº 3 2da edición. Campinas. Brasil. 302 p

8. Davila, T.R. 1992. Elaboración de helados saborizados con pulpa de plátano maduro.

Tesis para optar Título de ingeniero Facultad de Industrias Alimentarias Universidad

Nacional Agraria de la Selva Tingo Maria 83 p

9. Inga, C.R. 2003. Determinación del momento de la cosecha del plátano var Guayabo

(musa balbisiana) en Tingo María. Tesis para optar Título de ingeniero Facultad de

Industrias Alimentarias Universidad Nacional Agraria de la Selva Tingo Maria 118 p

10. Alves, A. B., & Bragagnolo, N. (2002). Determinação simultânea de teobromina,

teofilina e cafeína em chás por cromatografia líquida de alta eficiência. Rev. Bras.

Cienc. Farm., 38(2), 237–243. doi:10.1590/s1516-93322002000200013

11. Ramírez Sulvarán, J. A., Sigarroa Rieche, A. K., & Del Valle Vargas, R. A. (2014).

Characterization of Cocoa (Theobroma cacao L.) Farming Systems in the Norte de

Santander Department and Assessment of Their Sustainability. Revista Facultad

Nacional de Agronomía, 67(1), 7177–7187. doi:10.15446/rfnam.v67n1.42635

12. Soto Pérez, R. (2006). Fundamentos del espectrofotómetro de absorción atómica para

la experiencia educativa de instrumentación avanzada.