FACULTAD DE CIENCIAS ESPECIALIZACIÓN EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

MODULO DE: INSTRUMENTACIÓN QUIMICA AVAMZADA II

Y METODOS DE SEPARACIÓN

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA DE AMINOACIDOS EN ORINA

PRESENTADO POR: HERNAN MAURICIO RIVERA ESCOBAR

PRESENTADO A: JAIME CASAS

Bogotá, agosto 12 de 2008

INTRODUCCIÓN Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cuali- y cuantitativa de aminoácidos. Aunque son métodos muy generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. Así, hay métodos de determinación de aminoácidos con el grupo amino libre (método de la ninhidrina), de aminoácidos con núcleos aromáticos (reacción xantoproteica), de los que poseen un grupo indólico (triptófano; reacción con el ácido glioxílico), un anillo fenólico (tirosina; reacción de Millon), de aminoácidos azufrados (cisteina; reacción con nitroprusiato sódico). En general, en todos los métodos, el aminoácido reacciona con otro compuesto formando derivados coloreados que se pueden determinar cualitativa o si es el caso cuantitativamente por espectroscopía visible. De todos los métodos mencionados anteriormente, el más general y utilizado es el de la reacción con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a nidrindantina. La nidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino está sustituido). Este método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los primeros estudios de la composición de las proteínas. En la actualidad ha sido desplazado por la cromatografía líquida de alta resolución, ya que esta última es más confiable para la cuantificación y tiene mayor sensibilidad si los aminoácidos se detectan por fluorescencia.

Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigue empleando para determinar fosfoaminoácidos, ya que de esta manera es posible identificar si una determinada fosfoproteína, se encuentra fosforilada en serina, treonina o tirosina. Para ello, la proteína debe degradarse hasta liberar los aminoácidos que la componen y luego estos se separan en una placa de gel de sílica. La placa se gira 90o y se desarrolla con un segundo sistema de solventes. Los fosfoaminoácidos pueden revelarse con un reactivo de ácido fosfomolíbdico para permitir su identificación. Los sistemas en los que las placas se desarrollan en ambas direcciones se conocen como TLC bidimensional.

Objetivo 1. Reconocer la técnica cromatográfica de capa fina como una técnica de separación empleada en bioquímica. La cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography”, en terminología inglesa), es una variante de la cromatografía en columna. Se basa en el principio del reparto entre dos fases.

En ésta se puede utilizar como soporte, cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc.) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilización de soportes hidrófobos facilita la separación de compuestos no polares, por ejemplo lípidos. En la CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la suspensión del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilización.

• Aplicación de la muestra En cromatografía, las muestras, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar la resolución (separación de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentración del compuesto o compuestos de interés en la muestra. Para soluciones concentradas bastará una cantidad muy pequeña, usualmente en microlitros, esto permite aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución de la placa cromatográfica. Para soluciones muy diluidas, deberá aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios µl) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de interés. En este caso conviene hacer la aplicación en pequeños volúmenes fraccionarios, no procediéndose a una nueva adición hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicación se haría muy grande, distando mucho de la situación ideal de concentración de la muestra en un solo punto de aplicación).

Figura 1. Aplicación de las muestras en la placa Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque o cámara cromatográfica) y uno de los extremos (el más próximo a la línea de aplicación) se sumerge en un disolvente apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo de la línea de aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte por capilaridad provocando un reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una vez que el solvente haya alcanzado un punto próximo al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se seca. Las manchas correspondientes a cada compuesto, si no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor de referencia. La detección de los compuestos una vez realizada la cromatografía se puede llevar a cabo en base a sus propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, haciéndolos reaccionar con reactivos específicos, radioisotópicamente, etc. La identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus referencias con los de patrones, de naturaleza química conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un método no destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado. Uno de los factores más críticos en este tipo de cromatografías es la elección de la fase móvil, que, básicamente, suele estar formada por una mezcla de un solvente orgánico con agua y algunas sustancias adicionales tales cómo ácidos, bases, agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de algunos compuestos. Además de en una sola

dirección, la CCF puede también realizarse bidimensionalmente. En este caso sólo se aplica una única muestra, que se dispone en uno de los vértices de la placa y se eluye dos veces, normalmente con solventes diferentes, y en direcciones perpendiculares.

• Ventajas de la CCF respecto a cromatografías alternativas 1. Una mayor resolución, obteniéndose por lo general manchas más pequeñas. 2. Una mayor velocidad de separación. 3. Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y disolventes. 4. Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperación es muy simple. La mayor resolución obtenida por CCF se debe a que pueden formarse partículas muy finas del soporte, por lo que la relación superficie/volumen es muy elevada, proporcionando una gran área superficial por unidad de longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra que se puede aplicar es mayor y la difusión es mucho menor. La ventaja respecto a la cromatografía en papel es que éste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad asociada a las fibras tiende a aumentar la difusión de las moléculas. Objetivo 2. Utilizar la cromatografía de capa fina para separar los aminoácidos presentes en una muestra problema. Para identificar los aminoácidos y carbohidratos presentes en la muestra de orina, se dispuso de placas grandes y pequeñas, comerciales y artesanales, tratadas con sílica y yeso (Ver foto 1) sobre las cuales se aplicó fluido biológico (orina), en una patrones de aminoácidos y en otras de carbohidratos.

Foto 1. Placas pequeñas artesanales (con sílica y yeso).

La tabla que se presenta a continuación (Tabla 1) esquematiza la distribución de las placas pequeñas artesanales, aminoácidos y solventes para cada una de las pruebas realizadas en el laboratorio.

NOMBRE SOLVENTE PLACA PRUEBA 1 PRUEBA 2 PRUEBA 3 Ninna S1* S1 S4* ppa1 Arg Ala Met Glu Val Alejandra S1 S1* S2 ppa Glut Ala ILe Tre Cis Prop Mauricio S1 S3 S3* ppa Lis Ser ILe Tre Val Prop Cit His Trp Yara S1 S1 S2

ppa Arg Lis Ala Met Iso Asp Glu Cis Val Tabla 1. Disposición de aminoácidos en placas para cromatografía en capa fina.

S1* Mezcla de Butanol – Ac. Acético – Agua (8:2:2) S1* Mezcla de Butanol – Ac. Acetico – Agua (60:20:20) S3* Mezcla de Butanol – Ac. Acetico – Agua (10:5:2) S4* Mezcla de Etanol –NH3 34% (7:3)

1 ppa (placa pequeña artesanal)

Patrones de aa

Patrones de CHO

De igual manera, para identificar los carbohidratos presentes en la muestra de orina, se dispuso de placas pequeña artesanales tratadas con silica y yeso sobre las cuales se aplicaron los carbohidratos, solvente y muestra. La tabla 2 resume dicho procedimiento.

NOMBRE SOLVENTE PLACA PRUEBA 4 Ninna S5* Ppa Maltosa Sacarosa Alejandra S5 Ppa Sacarosa Manosa Mauricio S5 Ppa Maltosa Glucosa Yara S5 Ppa Glucosa Ribosa

Tabla 2. Disposición de carbohidratos en placas para cromatografía en capa fina.

S5* Mezcla de Butanol – Ac. Acético- Éter etílico – Agua (9:6:3:1) En la tabla 3 se sintetiza la distribución de las placas grandes para la corrida 1 (corrida bidimensional) y la corrida 2 (corrida única).

Tipo de

corrida NOMBRE SOLVENTE PLACA PRUEBA 5

PGA2 Cis Gly Ser Met Fen 1 Ninna Mauricio

S1 PGC3 Lis ILe Glu Val His PGA Maltosa Sacarosa Maltosa Ribosa Glucosa Arabinosa 2 Alejandra

Yara S5*

PGC Maltosa Sacarosa Maltosa Ribosa Glucosa Arabinosa Tabla 3. Cromatografía de aminoácidos y carbohidratos en placa grande.

Luego se procedió a la preparación de los solventes tanto para cámaras pequeñas como para las grandes.

2 Placa grande artesanal 3 Placa grande comercial

Foto 2. Cámaras de cromatografía con su respectivo solvente.

Acto seguido, se realizó el montaje de las placas y luego se incubaron, (pequeñas artesanales y grandes comerciales y artesanales) en cámaras saturadas con el solventes. (Foto 3 y 4)

Foto 3. Placas pequeñas artesanales en

corrida.

Foto 4. Placas grandes artesanales y comerciales en corrida.

Terminado el tiempo de corrida se extrajeron las placas de las cámaras. (Ver foto 5). Se secaron, se rociaron con ninihidrina (aminoácidos) y orcinol (carbohidratos) para lograr revelar la corrida.

Foto 5. Placas pequeñas artesanales después de la corrida (proceso de secado)

En las reacciones que aparecen a continuación (Figura 2 y 3), se evidencian las funciones de la ninihidrina y el orcinol en el revelado de la cromatografía de aminoácidos y carbohidratos respectivamente.

Figura 2. Reacción de aminoácidos con ninihidrina.

Figura 3. Reacción de carbohidratos con orcinol. La formación de color se toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de color es indicativo de que no está presente. Aunque en la presente práctica se llevo a cabo la determinación cualitativa de aminoácidos (ausencia o presencia de dichos compuestos), las reacciones coloreadas pueden también ser utilizadas para la determinación cuantitativa de dichas biomoléculas.

Objetivo 3. Identificar los aminoácidos presentes en fluidos biológicos (orina) Para identificar los aminoácidos presentes en la muestra de orina se calentaron las placas sobre una plancha de calentamiento como se muestra en la foto 6. Al calentar el complejo nihinidrina-aminoacidos se evidencia la presencia patrones de aminoacidos y en la muestra por la formación de color sobre la placa (morado) a diferentes distancias de acuerdo al aminoácido. (Ver fotos 7, 8, 9 y 10).

Foto 6.

Foto 7.

Placa B. Treonina- Valina - Muestra Placa C. Triptófano – Muestra problema

Foto 8.

Placa 1. Arginina y Muestra problema (arginina presente) Placa 2. Alanina – Metionina - Muestra

Muestra

a

Patron

Foto 9.

Placa Grande Comercial aminoácidos Placa Grande Artesanal aminoácidos

Foto 10. Placa Grande Comercial aminoácidos

Foto 11. Placa Grande Comercial Carbohidratos

Foto 12. Placa Grande Artesanal de Carbohidratos

Objetivo 4. Comprobar, empleando los valores de referencia, la posible presencia de los aminoácidos separados.

Se observa una banda de arginina en la muestra, ubicada a la misma altura del patrón. (Ver foto 8). Al analizar la cromatografía en las placas grandes comerciales y artesanales se evidenció la calidad cromatográfica en las primeras (fotos 9,placa izquierda), se expresaron los aminoácidos elegidos según la tabla 2 tanto en los patrones como en la muestra de orina falseada para la cromatografía. A nivel de carbohidratos se observa una banda de glucosa en la muestra, pues está ubicada a la misma altura del patrón de ésta. (Ver foto 13).

Foto 13 Placa Grande Comercial

BIBLIOGRAFIA Jorrín J., Nieves M., Bárcena J. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina y detección mediante reacción con ninhidrina. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

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