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ISSN 373 - 580 X
Bol. Soc. Argent. Bot. 30 (1-2): 43-49. 1994
INDUCCION-REPRESION DE LA ACTIVIDAD CELULOLITICA EN NECTRIA
CATAUNENSIS (ASCOMYCOTINA)
Por ALEJANDRO G. PARDO* Y FLAVIA FORCHIASSIN**
Summary Induction-repression of thecellulolyticactivityofNectrla catalinensis.The production of cellulolyticenzymes by Nectria catalinensis was Investigated. Shake cultures gave better yields of endoglucanase ascompared tostationary cultures, although exoglucanase andp-glucosidase could be measured only in the lastsituation. The production of endoglucanase was induced by the presence of crystalline cellulose (probably bya soluble product of cellulose hydrolysis) and inhibited by the presence of glucose in the culture medium.
cíe perteneciente al orden Hypocreales, que vivesobre troncos muertos de Gleditsia triacanthos (Limaet al., 1988). El hecho de crecer sobre madera yestudios preliminares (método de sreening parahongos celulolíticos, Mercuri, 1987) 'mostraron supotencial actividad celulolítica. El objetivo de 'este
trabajo fue obtener una primera aproximación so¬bre la producción del sistema celulolítico de Nectriacatalinensis in vitro.
INTRODUCCION
La importancia del estudio de la degradación decelulosa reside en el hecho de que este material, elcompuesto más abundante de la naturaleza, com¬ponente principal de las paredes celulares de losvegetales, es lenta y difícilmente degradado. Ladegradación de celulosa implica por parte de losorganismos celulolíticos, la producción de un siste¬ma enzimático múltiple, exocelular, capaz de des¬organizar la estructura cristalina del polímero ehidrolizarlo hasta unidades de glucosa. Las celu-lasas son un sistema multienzimático constituidobásicamente por tres grupos de enzimas: 1- Endo-glucanasas (1,4-p-D-glucan 4-glucanohidrolasas),que actúan al azar sobre la cadena celulósica yproducen una disminución del grado de poli¬merización. 2- Exoglucanasas, representadas pordos grupos:1,4-p-D-glucan celobiohidrolasas y 1,4-P-D-glucan glucohidrolasas, que liberan respecti¬vamente celobiosa o glucosa a partir de extremosno reductores. 3- Celobiasas (p-D-glucósido glu¬cohidrolasas), pertenecientes al grupo más ampliode las p-glucosidasas, que clivan al dímerocelobiosa en dos glucosas. Todas las celulasasfúngicas estudiadas contienen una multiplicidadde componentes enzimáticos (isoenzimas) (Wood yGarcía-Campayo, 1990; Coughlan, 1985). El núme¬ro real de componentes depende dé la cepa y de laforma en que ésta ha sido cultivada (Wood y García-CampayO, op. cit.). Nectria catalinensis es una espe-
MATERIALES Y METODOS
Organismo: Nectria catalinensis Lima. BAFC30700. Los cultivos se mantuvieron a 5°C en medioAPG (agar-papa-glucosado). Medios de cultivo: Me¬dio de cultivo basal: S04Mg.7H20, 0,5 g; P04H,K,0,5g; P04HK2-, 0,6 g; Cl2Ca, 0,11 g; S04Cu.5H20, 0,4mg; Cl2Mn.4H20, 0,09 mg; BO(H2, 0,07 mg;Mo04Na2, 0,02 mg; Cl3Fe, 1 mg; Cl2Zn, 10 mg;tiamina, 0,1 mg; tween 80, 2 ml; agua bidestiladahasta 11.
Fuentes de carbono: Glucosa (G) y/o celulosacristalina (CC); en concentraciones variables, segúnse indica en cada experiencia.
Fuentes de nitrógeno: Urea (U), 0,5 g/1 o
asparagina (A), 4 g/1; ambas a una concentraciónde 0,75 g de N/l.
El medio de cultivo basal y la fuente de carbono.fueron autoclavados a 121° C y 1,2 atm., por 20minutos.
La fuente de nitrógeno fue esterilizada separada¬mente por filtración a través de membrana denitrocelulosa y adicionada en condiciones estériles.Todas las drogas utilizadas fueron de grado analíti¬co. Los cultivos se llevaron a cabo en erlenmeyers de125 mi, con 50 mi de medio en el caso de cultivos en
agitación o 25 rrü de medio en el caso de .cultivos
* Becario CONICET.** Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Ciudad Univer¬sitaria, Pabellón II,4o piso.1428Buenos Aires, Argentina. Investiga¬dor CONICET.
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estáticos. La incubación tuvo lugar en cámara de agua bidestilada) y se leyó la absorbancia a 430 nm.cultivo New Brunswick G-27 a 23°C y agitación Se utilizó como estándar p-nitrofenol lmM en bufferrotativa constante de125 rpm, en el caso de cultivos acetato de sodio 0,1 M, pH = 4,8.en agitación. Para cultivos estáticos, excepto la últi- Unidad de actividad: La unidad de actividadma, se mantuvieron todas las demás condiciones de enzimática (U. E.) se define como la cantidad deincubación. La cosecha del micelio fue realizada en enzima requerida para liberar Inmol de p-los días prefijados en el caso de las curvas de creci- nitrofenol/min., en las condiciones del ensayo.miento y al vigésimo día de cultivo para los demás Todos los resultados presentados en este trabajóexperimentos. El micelio fue cosechado por filtración son el promedio de tres experimentos realizados pora presión reducida en embudo Buchner a través de triplicado, con un error estándar menor al 5%.papel de filtro.El micelioosólidosde cultivo (miceliomás celulosa cristalina no degradada al día de cose- RESULTADOS Y DISCUSIONcha), retenidos fueron lavados con agua bidestilada,secados en estufa a 70°C durante 18 hs., pesados, Crecimiento y producción enzimática en los medios demolidos y guardados a -20°C. Los sobrenadantes de cultivo CC (0,8%)-G (0,2%)-U y CC (0,8%)-G (0,2%)-
cultivo (Sn) fueron guardados a -20°C.Estimación del crecimiento: Se utilizó como
estimador el contenido de proteínasdel micelio. Para Como una primera aproximación para inducir laello se tomaron 100 mg de micelio o sólidos de síntesis del sistema celulolítico de N. catalinensis encultivo, según el caso, y fueron hidrolizados durante cultivo se utilizaron dos medios que contenían celu-30 minutos a 100°C con NaOH 1N. Las muestras se losa cristalina (CC), 0,8%, como fuente de C*ecentrifugaron durante 20 minutos a 1000 xg y las inductor del sistema enzimático; glucosa (G), 0,2%,proteínas extraídas fueron dosadas, en el como fuente de C para permitir el crecimiento delsobrenadante, por el método de Bradford (1976), hongo hasta una cierta biomasa crítica, capaz luegoutilizando seroalbúmina bovina (BSA),1 mg/ml en de ser inducida a producir celulasas y prea (U) oNaOH 1N, como estándar. asparagina (A), como fuentes de N- En las figs.1 y-2
Medición de las actividades enzimáticas: En todos los se muestran los resultados. Puede observarse que encasos se utilizaron alícuotas de los sobrenadantes de ambos medios de cultivo el máximo crecimiento secultivo como fuente de enzima.
,-í
obtuvo alrededor del día veinte, así como los máxi-Endo-p-D-l,4-glucanasa: Se mezclaron 400 pl de mos de producción de proteínas extracelulares y
carboximetil celulosa (CMC) (5 mg/ml en buffer endoglucanasa. El medio que contenía urea comoacetato de sodio 0,1 M, pH = 4,8) con 100 pl deSn de fuente de N fue mejor para la producción -decultivo y se incubaron 30 min. a 37°C. Se midieron endoglucanasa (fig. 1), mientras que el medio queazúcares reductores por el método de Somogyi- contenía asparagina permitió una mayor producciónNelson (Somogyi, 1952; Nelson, 1944) utilizando de proteínas extracelulares y biomasa (fig. 2). Se
ensayaron además lasactividades de exoglucanasa yExo-[5-D-l,4-glucanasa: Se mezclaron 800 pl de P-glucosidasa pero no fueron detectadas en estos
CC (10 mg/mlen buffer acetato desodio 0,1 M, pH = medios. Debido a esto se cultivóa N. cataliniensis en el4,8) con 200 pl de Sn de cultivo y se incubó la mezcla medio CC(0,8%)-G(0,2%)-U en condiciones estáticas2 hs a 38°C. Luego se centrifugaron los tubos a (fig. 3). En este caso se detectó actividad delOOOxg durante 20 min., se descartó el pellet de CC y exoglucanasa y P-glucosidasa pero la actividaden el Sn se midieron azúcares reductores por el méto- • endoglucanasa fue inferior a la obtenida en el mismodo de Somogyi-Nelson (Somogyi, op. cit.; Nelson, medio en condiciones de agitación. Una posible ex-op. cit.), utilizando glucosa1mg/mi como estándar, plicación a estos resultados es que en condiciones de
Unidad deactividad:en ambos casos la unidad de agitación constante las partículas de celulosa se en¬actividad enzimática (U. E.) es la cantidad de enzima cuentranensuspensión y las hifas fúngicasen íntimorequerida para liberar, en las-condiciones del ensayo, contacto con ellas; por lo tanto las enzimas del com-1 nmol/min. de azúcar reductor, expresado como piejo celulasa se encontrarían adsorbidas en la
interfase hifa-partícula de celulosa y por ello en su'P-glucosidasa:Se mezclaron 900 plde p-nitrofenil- mayoría quedarían retenidas en los sólidos de culti-
p-D-l,4-glucopiranósido (0,2 mg/ml en buffer vo durante la filtración; en el caso de laacetato de sodio 0,1 M, pH = 4,8) con 100 pl deSn de endoglucanasa, ésta se habría podido medir en loscultivo y se incubó la mezcla1h a 50°C. La reacción sobrenadantes de los cultivos citados, por ser sinteti-se detuvo con el agregado de 2 mi de buffer Clark y zada en mayor cantidad que las otras dos enzimas.Lubs pH = 9,8 (50 mi deác. bórico 0,1 M en C1K 0,1M En cambio, en condiciones de cultivo estático, dadomás 40,8 mi de NaOH 0,1 N, y se lleva a 100 mi con que las celulosa precipita y las hifas del hongo per-
glucosa 1 mg/ml como estándar.
equivalente de glucosa.
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A. G. Pardo y F. Forchiassin, Nectria catalinensis
Proteína (ug/ml) U.E./ml60 60
50 50
/.40 40
/ + "+'•\ D
7ÿ30 30
+
20 20+
10 -B- 10
D±±0< 0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo(dfas)
Proteínas de micelio Proteínas de Sn.
Act. Endoglucanasa
Fig. 1.— Cinética de crecimiento (proteínas de micelio), de producción de proteínas extracelulares y de endoglucanasa enNectria catalinensis, creciendo en medio: celulosa cristalina (0,8%) - glucosa (0,2%) - urea. Incubación con agitación.
pared hifal, por ejemplo, la P-glucosidasa deSporotrichum pulverulentwn (Eriksson, 1978) y la deTrichoderma reesei (Jackson y Talburt, 1988).
El nivel más bajo deendoglucanasa observado encondiciones estáticas puede deberse a problemas enla aireación de los cultivos y por lo tanto limitaciónde 02, lo que influiría negativamente en la síntesis deendoglucanasa. Noseencontró variación respecto delas proteínas de micelio, entre las condiciones estáti¬casode agitación.Sin embargo,el contenido proteicode los sobrenadantes de cultivo fue mayor en condi¬ciones de cultivo estático, hecho que puede explicar¬se por lo expuesto anteriormente para las celulasas,
ya que serían éstas las que marcan la diferencia de .contenidode proteínasdelossobrenadantesentre lasdoscondiciones de cultivo. Por últimoobsérvese que
manecen cerca de la superficie del líquido, por ser el
02 un factor limitante en estas condiciones, no existi¬ría una estrecha interfase hifa-partícula de celulosa,como en el caso de agitación, y por lo tanto estaríafacilitada la difusión de lasenzimas celulolíticas parapoder degradar al polímero.
Actualmente se cree que al menos algunascelulasas fúngicas se encuentran unidas a la paredhifal ose hallanen una asociación estrecha con la hifafúngica, por ejemplo, contenidas en una matriz ovaina polisacarídica, rodeando a la hifa. Esto se hasugerido para el caso de hongos de pudrición blancay de pudrición blanda, los cuales degradan la celulo¬sa dentro de la madera sólo a una distancia limitadade las hifas (Markham y Bazin,1991). Existen citas deuna unión directa entre enzimas celulolíticas y la
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Proteína (ug/ml) U.E./ml300 14
o
12250
10200
8I150
I 6/ +.-+
100 T\4+ ÁD
502+
00< -&
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tierr>po(días)
-1— Proteínas de micelio
—iB- Act.Endoglucanasa
Proteínas de Sn.
Fig. 2.— Cinética de crecimiento (proteínas de micelio), de producción de proteínas extracelulares y de endoglucanasa enNectria catalinensis, creciendo en medio: celulosa cristalina (0>8%) - glucosa (0,2%) - asparagina. Incubación con agitación.
los máximos de producción enzimática, proteínas muestra dos cosas:1- Que la CC es capaz de inducirextracelulares y crecimiento de los cultivos estáticos la síntesis de endoglucanasa, ya que se observa unse dieron alrededor del vigésimo día. * aumento en los niveles de ésta al comparar los resul¬
tados obtenidos en un medio de cultivo sin CC
Efecto de la variación de la relación celulosa cristalina/glucosa (CC/G)
(G(l%)-U) con uno con CC (CC(0,2%)-G(0,8%)-U). .2- Que la glucosa actuaría como represor catabólicosobre la síntesis de endoglucanasa, ya que a medida
Con el objetivo de determinar la influencia de la que la concentración de G disminuye se detecta másrelación entre la concentración de celulosa cristalina actividad de endoglucanasa.y glucosa sobre la síntesis de endoglucanasa se culti¬vó a N. catalinensis en distintos medios de cultivo, en que la glucosa nosea un represor catabólico,sino quelos cuales se varió la relación entre las concentracio- a medida que disminuye la concentración de G delnes de CC y G; estos medios fueron los siguientes: medio aumenta la de CC que es el inductor de laCC(1%)-U, CC(0,8%)-G(0,2%)-U, CC(0,6%)-G(0,4%)- endoglucanasa y por lo tanto induce a ésta. Conside-U, CC(0,2%)-G(0,8%)-U, y G (1%)-U. Los resultados ramos que esto es falso, ya que en ninguno de losobtenidos (fig. 4) indican que a medida que aumenta medios que tenían celulosa ésta fue totalmente con-la concentración de celulosa cristalina en el medio de sumida hacia el final del período de crecimiento, ycultivo y por lo tanto disminuye la de glucosa,, la por lo tanto no fue factor limitante en la inducción,producción de endoglucanasa aumenta. Ésto de- sino que, si bien la celulosa actuó como inductor,
Podría argumentarse en contra de esta hipótesis
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Proteína (ug/ml) U.E./ml60 40
\ 3550
30
40/ 25V+}
/ +30 207
fA15¿X
20 -Q
/10
10 *6-5
A
1L2EOJ 00 5 10 15 20 25 30 35 •
-Tiempo(dias)
Prot. de mlc. Prot. de Sn. Act- Endo.
Act. Exo. Act. B-glu.
Fig.3.—Cinéticadecrecimiento(proteínasdemicelio),deproduccióndeproteínasextracelularesydeproducciónenzimática(actividad endoglucanasa, exoglucanasa y p-glucosidasa) de Nectria catalinensis, en medio CC-Glu-Urea. Incubación encondiciones estáticas.
1983), entre otros; aunque para el caso particular deTrichoderma reesei se ha comprobado que, depen¬diendo de la concentración, la celobiosa puede ac¬tuar como inductor ocomo represor de Ja síntesis decelulasas (Whitaker, 1971). Sternberg (op. cit.) deter¬minó que no se producen-celulasas cuando T. reeseicrece con celobiosa como fuente de C. Otrosdisacáridos han sido citados como inductores de-celulasas: lactosa (Mandeis, 1975) y soforosa(Sternberg y Mandeis, 1979; Loewenberg yChapman, 1977). Se ha demostrado además lainducción de endoglucanasa por tiocelobiosa enSchizophillum commune (Rho et ai, 1982) y de p-glucosidasa en Trichoderma reesei por metil-P-glucósidos (Sternberg y Mandeis, 1982). Respecto dela represión por catabolitos resultantesde la hidrólisisde celulosa se ha comprobado que glucosa ocelobiosa limitan oinhiben la producción deenzimascelulolíticas en Verticillum albo-atrum (Cooper y
además, la glucosa fue represor catabólico. Existenvarias pruebas experimentales con diversas especiescelulolíticas y es aceptado para hongos filamentososque la producción de celulasas es regulada porinducción y represión catabólica (Sternberg, 1976;Brown,1983; Ryu y Mandeis,1980;Canevascinietal,1979; Sternberg y Mandeis, 1982), siendo el inductorreal un producto soluble de la hidrólisis de la celulo¬sa. Esta última es el inductor primario y es insolubley por lo tanto no puede ser incorporada como tal alas células. De acuerdo con esta hipótesis se produci¬rían constitutivamente bajas cantidades de celulasasque-hidrolizarían una mínima porción de celulosa,cuyos productos detonarían el proceso de inducción.La inducción in vitro de celulasas por celobiosa se hacomprobado para diversos hongos: Trichoderma(Sternberg, op. cit.; Mandeis y Reese, 1960; Illanes yRossi, 1980), Sporotrichum termophile (Canevascini etal., op. cit.), Talaromyces emersonii (Moloney et al.,
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Proteína (ug/ml) U.E./ml300 60
250 50
200 40
150 30
+
100 20
X.+50 10
0 0'1.20 0.2 0.4 0.6 0.8
Celulosa cristalina (%)
i
~ Proteínas de micelio
-B_ Act; Endoglucanasa
Proteínas de Sn.
Fig. 4.— Crecimiento (proteínas de micelio), producción de proteínas extracelulares y actividad endoglucanasa de Nectriacatalinensis a los 20 días de incubación en condiciones de agitación y con urea como fuente de N, en función la variación delas concentraciones relativas de celulosa cristalina y glucosa presentes en el medio de cultivo.
Wood, 1973), Myrothecium verrucaria (Hulme y Nectria catalinensis produjo cierta cantidad, aunqueStranks, 1970; 1971), Trichoderma viride (Nisizawa et baja, de endoglucanasa. Esto está de acuerdo con elal., 1972), T. reesei (Sternberg y Mandeis, 1982), modelo de inducción-represión explicitado previa-Penicillium italicum (Santos et al., 1977), Sporotrichum mente; siendo esa cantidad de endoglucanasa medi-termophile (Canevascini et al, op. cit.).
Volviendo a los resultados experimentales, las éstas.proteínas extracelulares mostraron un comporta¬miento similar a la endogluconasa, ya que aumenta- CONCLUSIONESron a medida que el medio de cultivo fue más rico encelulosa cristalina y más pobre en glucosa; esto apo¬
da en el medio G(1%)-U el nivel basal constitutivo de
Se comprobó en Nectria catalinensis la capacidadya la idea de una mayor síntesisdeendoglucanasa en de producir el sistema enzimático celulolítico depen¬
diendo de las condiciones de cultivo.estas condiciones.. Un comportamiento inverso se observó en el caso
delas proteínas de micelio;consideramos que estose te de las condiciones de' agitación en el medio dedebe a que la glucosa es un hidrato de carbono más cultivo CC(0,8%)-G(0,2%)-U; sin embargo, la utiliza-fácilmente aprovechable que la celulosa cristalina y ción de este medio en cultivo estático permitió lapor lo tanto los medios más ricos en glucosa permi- detección de las actividades exoglucanasa y (3-tieron un mayor crecimiento del hongo. Cabe men- glucosidasa, además de la endoglucanasa, ló cual nodonar que en el medio de cultivo sin CC (G(l%)-U) fue posible en agitación. En cultivoestático existirían
El crecimiento de N. catalinensis fue independien-
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condiciones más favorables para la difusión de lasenzimas celulolíticas. Por otra parte, los niveles deendoglucanasa fueron más bajos en condiciones es¬táticas que en agitación, posiblemente debido a undéficit en el contenido de 02 del medio de cultivoestático.
Se comprobó para N. catalinensis la inducción deendoglucanasa por celulosa cristalina y su represiónpor glucosa.
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AGRADECIMIENTOS
Al CONICET, por la financiación parcial de este trabajo.
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