Implementace laboratorní

medicíny do systému

vzdělávání na Univerzitě

Palackého v Olomouci

reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0088

Základy histochemie

a imunohistochemie

Metodické základy patologie

Histochemie Histologická metoda, při které prokazujeme ve vzorku tkáně

pomocí chemické reakce přítomnost různých látek.

Histochemie

Průkazy anorganických iontů a sloučenin

Perlsova reakce

PAS reakce

Feulgenova reakce

Průkaz lipidů a sacharidů

Katalytická histochemie

Afinitní histochemie

Imunohistochemie

Lektinová histochemie

In situ hybridizace

Histochemie Průkazy anorganických iontů a sloučenin

Diagnosticky významné je prokazování určitých látek v těle ať už v případě soudního lékařství (zde např. kvůli otravám – As, Pb, Hg, Ag) nebo v patologii kvůli odchylkám od norem výskytu látek (Ca, Fe, Zn, Al).

Ca přebývá v těle v rozpustné, nerozpustné, ionizované i neionizované formě. Prokazuje se např. ionizovaný díky barvení HE modře v alkalické reakci (pH > 9).

Fe3+ se prokazuje pomocí Perlsovy reakce (viz níže), Fe2+ s modrým zbarvením pomocí Turnbull blue.

Zn jako součást inzulinu, či jako kofaktor mnohých enzymů se prokazuje pomocí zinconu s modrým výsledkem, dithizonem s červeným výsledkem.

Histochemie

Histochemie Perlsova reakce

Perlsova reakce slouží k odlišení lipofuscinu, hematoidinu a hematinu, které jsou

Perls negativní. Tato reakce se používá k průkazu hemosiderinu. Hemosiderin je

zásobní forma železa, která je uložena ve formě depositů v buňkách zvaných

siderofágy. Siderofágy (makrofágy) jsou fagocytující buňky, které pohlcují

počkozené nebo staré erytrocyty. A právě reakcí mezi železnatými a železitými

ionty obsaženými v hemosiderinu a žlutou krevní solí v erytrocytech vzniká

modrá sraženina tzv. Berlínská modř.

Klinická aplikace:

– diagnóza u pacientů s chorobami, při kterých se nadměrně ukládá železo

(např. hemochromatóza)

Metodika barvení

– řez tkání je inkubován ve směsi ferokyanidu draselného a kyseliny

chlorovodíková

– výsledek: nerozpustné tmavě modré precipitáty ferokyanidu železitého

Složení barvícího roztoku: ferokyanid draselný, destilovaná voda, kyselina

chlorovodíková (2%).

Řezy se umístí na 30 minut do barvícího roztoku při teplotě 60°C. Poté jsou řezy

vyjmuty z barvícího roztoku a dobarveny jádrovou červení nebo hematoxylinem.

Histochemie

Slezina: Perlsova reakce (M. Špaček)

Histochemie Histochemie anorganických látek

Průkaz vápníku dle Kossy

dusičnan stříbrný + Ca+ světlo černé sraženiny

využití: hyperkalcémie poškození parenchymu orgánů (ledviny)

Histochemie

Ionty

• Vápník

– např. depozita ionizovaného vápníku lze barvit

hematoxylinem modře

• Zinek

– v molekule insulinu

– lze barvit zinconem(modře) či dithizonem(červeně)

Histochemie

Cukry

• Cukry jsou prokazovány PAS reakcí (periodic acid-Schiff)

ta je založena na oxidaci kyselinou jodistou→aldehydové skupiny ty potom reagují se Schiffovým reagens (jako ve Feulgenově reakci)

→výsledkem je sloučenina mající červeno-fialovou barvu

PAS-pozitivnílátky:

– polysacharidy (glykogen)

– glykosaminoglykany /mukopolysacharidy/ (hyaluronová kys., chondroitinsulfát)

– proteoglykany

– glykoproteiny (thyreoglobulin, kolagen)

– glykolipidy (lipofuscin)

Klinická aplikace:

– biopsie od pacientůs různými střádavými chorobami (glykogenózy, mukopolysacharidózy)

Histochemie PAS reakce

PAS (Periodic Acid Schiff) reakce je založena na oxidační reakci kyseliny jodisté (HIO4) na 1,2-glykolové skupiny, které jsou přítomné na glukózových zbytcích. Vznikají aldehydové skupiny, které reagují s činidlem (Schiffovým reagens) za vzniku nové komplexní sloučeniny, která má purpurovou barvu.

Struktury které lze touto metodou detekovat, označujeme jako PAS pozitivní (př. glykogen v játrech)

Metodika barvení

Složení Schiffova reagens

pararosanilin

absolutní alkohol

destilovaná voda

pyrosiřičitan sodný

koncentrovaná kyselina chlorovodíková

dithioničitan sodný

Tkáňový řez se oxiduje v 1% kyselině jodisté po dobu 10 minut. Poté je vyjmut opláchnut ve vodě a následuje barvení Schiffovým reagens po dobu 10-ti minut. Nakonec se řez opláchne v destilované vodě a dobarví hematoxylinem (10 minut).

Bestův karmín se používá jako metoda průkazu glykogenu v místě s příliš vysokou koncentrací, kde PAS metoda není přehledná.

Histochemie

Tlusté střevo: PAS (M. Špaček)

Histochemie

Tlusté střevo: PAS (M. Špaček)

Histochemie

Histochemie RNA

Organely obsahující RNA se barví bazickými barvivy tj. např.: toluidinovou modří, metylenovou modří

RNA však není jedinou bazofilní látkou ve tkáních, proto je nezbytné kontrolní preparát inkubovat s ribonukleázou

DNA - Feulgenova reakce

Jedná se o reakci, která prokazuje přítomnost DNA. Spočívá v hydrolýze DNA pomocí kyseliny chlorovodíkové, kde se v tomto procesu odštěpí purinové báze od monosacharidu a odhalí se tak aldehydové skupiny na deoxyribóze. Poté, podobně jako u průkazu polysacharidů, reagují aldehydové skupiny s Schiffovým reagens za vzniku nerozpustné červené sraženiny.

Metoda se používá například v patologii v nádorové diagnostice, kde se určuje polyploidie buněk.

Histochemie

Průkaz lipidů

Lipidy se prokazují na zmražených řezech ponořených do alkoholů s roztokem barviva. Tím bývá často Sudan III a IV (červené) a Sudanová čerň (černé), dále olejová červeň nebo nilská modř (rozlišení kyselých a neutrálních lipidů). Vždy se musí tuky zachovat ve tkáni. Jako fixační prostředek používáme Bakerovu tekutinu (voda, formol, chlorid vápenatý)-redukuje solubilitu nepolárních lipidů. Fixace možná i oxidem osmičelým. Vznikají nerozpustné černé sraženiny lipidů a oxidu osmičelého. Provést před zpracováním tkání parafínovou technikou, protože tkáň nesmí přijít do styku s organickými rozpouštědly (benzen, xylen).

Průkaz fosfolipidů – barvíme luxolovou modří – metoda vhodná pro znázornění myelinové pochvy nervových vláken.

Histochemie Katalytická histochemie

Základní princip: Enzym reaguje se substrátem, který přemění na konečný produkt. Tento produkt je posléze přeměněn na barevnou sloučeninu (vizualizační reakce).

Využívá se toho ke značení protilátek nebo hybridizačních sond i k detekci metabolických procesů v buňce. Dopad do patologie a soudního lékařství.

Při všech těchto postupech se musí zachovat 4 základní pravidla pro uskutečnění katalytické histochemie:

Přesnost – při zachování morfologie sledovaných buněk či tkání nesmí produkt difundovat a je vázán na strukturách s předpokládaným výskytem enzymu.

Specifita – konečný produkt musí být výsledkem aktivity pouze jednoho enzymu. Toto se ověřuje na kontrolních řezech bez substrátu, kdy se nesmí objevit barevný produkt.

Reprodukovatelnost – pokus se může zopakovat bez významných odchylek.

Validita – při manipulaci s tkání nesmí být enzym ztracen, jeho distribuce a aktivita je zachovaná. Pro zachování funkcí enzymu nesmí být preparát postfixován!

Histochemie

Katalytická histochemie Enzymy jsou katalyzátory většiny biochemických reakcí

Užívá se zpravidla fixace zmražením

Princip:

– První reakce (histochemická): enzym+ substrát→reakční produkt

– Druhá reakce: vizualizace reakčního produktu

Vždy nutnost kontrolních řezů

Katalytická histochemie –vizualizační reakce precipitace s kationty kovů

– vznik barevné nerozpustné soli Pb, Co

simultánní azokopulace

– produkt (naftol) se převede na azobarvivo

indigogenní reakce

– štěpení na indoxyl a jeho oxidace na indigo

tetrazoliová metoda

– redukce tetrazoliové soli na barevný formazan

spřažená peroxidázová reakce

– oxidace DAB

Histochemie Katalytická histochemie -příklady Gomoriho průkaz kyselé fosfatázy

– řez tkání+ substrát štěpený enzymem (např. glycerofosfát sodný)

– uvolnění fosfátových iontů

– jejich zachycení dusičnanem olovnatým

– výsledek: elektrodenzní precipitát

Peroxidáza

– tkáňové řezy jsou inkubovány v roztoku obsahujícím peroxid vodíku a DAB (diaminoazobenzidin)

– DAB je v přítomnosti peroxidázy oxidován

– výsledek: nerozpustné černé (hnědé) elektrodenzní precipitáty

Klinická aplikace:

– diagnostika leukémií (detekce peroxidázové aktivity v krevních buňkách)

Peroxidáza se rovněž užívá ke značení v imunohistochemii a ISH

Histochemie

Z. Lojda

Histochemie Afinitní histochemie

Jeden z novějších postupů, který je stále více

využíván jak ve výzkumu, tak v diagnostice.

Umožňuje prokázat v cílové tkáni velmi nepatrná

množství látek.

Lze rozdělit:

1) Imunohistochemii (viz dále)

2) Lektinovou histochemii (viz dále)

3) Hybridizaci in situ (viz jiný seminář)

Histochemie

Lektinová histochemie

Lektiny jsou především rostlinné proteiny (glyko-

proteiny), kterých se využívá například k určování

krevních skupin, k mitogenní stimulaci lymfocytů či

normálních buněk. Váží se vysoce specificky na

sacharidové části makromolekul.

Imunohistochemie

Tento postup využívá základního principu interakce antigen – protilátka, kdy protilátky přisedají afinitně na cílový antigen, proti kterému byly vyprodukovány.

Monoklonální protilátky jsou produkovány hybridomy, polyklonální protilátky různými živočišnými druhy.

Protilátky:

– sérové proteiny známé jako imunoglobuliny

– jsou vytvářeny plazmatickými buňkami

– v imunohistochemii nejčastěji používáme třídu IgG

Imunohistochemie

Protilátky musí být označené, aby došlo k vizualizaci místa interakce a průkazu antigenů.

Využívá se dvou základních metod:

Přímá reakce – v tomto případě nasedají primární protilátky, které jsou značené, na antigen. Označí tak místo interakce, avšak nevýhodou je nízká citlivost a nutnost použít zvýšené množství protilátek.

Nepřímá reakce – zamezuje nevýhodám přímé reakce, když primární protilátka přisedá na svůj antigen a s použitím sekundární protilátky tyto nasedají na protilátky primární. Sekundární protilátky jsou značené a může jich na primární přisednout mnohem více – tím se zvyšuje citlivost detekovatelné reakce.

Imunohistochemie

Imunohistochemie

Mezi markery (značky), které se používají k vizuali-zaci reakce, patří:

fluorochromy – pro zviditelnění reakce ve fluorescen-čním mikroskopu

molekulární komplexy – např. ABC – často užívaný komplex k amplifikaci signálu nepřímé metody

autoradiografie – protilátky nesou radioaktivní látky, které vysílají záření na fotografickou emulzi

enzymy – využívá se katalytické histochemie; protilátka nesoucí enzym přisedá na antigen a po dodání substrátu jej enzym přemění na barevný produkt.

Imunohistochemie

Imunohistochemie

Imunohistochemie

Imunohistochemie

Monoklonální protilátky

• Monoklonální protilátky jsou „klonované“ protilátky, které jsou všechny

zaměřené proti stejnému epitopu – jsou tedy mimořádně specifické

• Aktivované B-buňky produkují směs protilátek zaměřených proti různým epitopům

• Aktivovaná B-buňka má jen omezenou životnost a sama se nemnoží

• Jak můžeme selektovat jeden klon B-buněk a prodloužit buněčnou linii?

Imunohistochemie

Imunohistochemie

Imunohistochemie

Imunohistochemie

Imunohistochemie Fluorochromy

• Fluorochromy jsou látky schopné absorpce záření ve formě UV či viditel-ného světla

• tato absorpce zapříčiní excitaci elektronů v molekule barviva

• při následném přechodu zpět na energeticky nižší hladinu dojde k emisi záření o jiné vlnové délce

• fluorochromy: FITC (fluoresceinisothiocyanát), rhodamine (TRITC), DAPI atd.

Imunohistochemie Fluochromy – FITC

Na+/K+ ATPáza v bazolaterálním labyrintu proximálních a distálních ledvinných

tubulů

Imunohistochemie

Kůže: Melanocyty a Langerhansovy buňky (M.Špaček)

Imunohistochemie

Pankreas: L. ostrůvky – insulin (M. Špaček)

Imunohistochemie

Pankreas: L. ostrůvky somatostatin v D buňkách (M. Špaček)

Imunohistochemie

Kyselý neurofilamentový protein v neuronech (M. Špaček)

Imunohistochemie

MUDr. M. Špaček