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Impiego del lavaggio bronco-alveolare (BAL) per la diagnosi delle sindromi respiratorie del bovino e studio della
farmacosensibilità degli isolati attraverso la determinazione della minima concentrazione inibente (MIC)
Bano Luca1, Schiavon Eliana2, Catania Salvatore2, Berto Giacomo1, Mottaran Davide2,
Bizzarri Davide3, Valla Giorgio3
1 Laboratorio di Batteriologia Speciale, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie – Treviso
2 Laboratorio di Diagnostica Clinica, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Padova
3 CEVA Salute Animale, Agrate Brianza, Milano
Corte Benedettina, 11 Novembre 2015
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
Liquido di lavaggio raccolto dalle vie
respiratorie profonde
Esecuzione: introduzione di catetere rino-
tracheo-bronchiale
Cos’è il lavaggio bronco-alveolare (BAL)?
Lunghezza (cm)
Ø interno (mm)
Ø esterno (mm)
Fisiologica(ml)
Aspirato(ml)
Vacca da latte 240 3 11 60 3-10
Vitellone 200 2 8 60 3-10
Vitello 150 2 8 30 2-5
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
Perché usare lavaggio bronco-alveolare come matrice diagnostica di BRD?
Rispetto al tampone nasale:
1. Assente o ridotto livello di contaminazione microbica inquinante
(mancano terreni selettivi per Pasteurellacee)
2. Fornisce informazioni diagnostiche sui patogeni batterici presenti
nelle vie aeree profonde
3. Consente di ottenere informazioni sulla farmacosensibilità di specie
batteriche responsabili d’infezione delle vie aeree profonde (quelle
in cavità nasale potrebbero non essere responsabili della clinica)
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
MATERIALI E METODI
1. CAMPIONAMENTO• Tampone nasale• Organi (trattamento?)
2. ESAME BATTERIOLOGICO• Identificazione biochimica
3. TEST DI FARMACOSENSIBILITA’• Antibiogramma
1. CAMPIONAMENTO• Lavaggio bronco-alveolare
2. ESAME BATTTERIOLOGICO• MALDI TOF MS: identificazione
rapida e attendibile anche di specie difficili da id. con bioch
3. TEST DI FARMACOSENSIBILITA’• MIC in brodo
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— Materiali e metodi (2) —
N° gruppi N° soggetti
Vitellone da carne 22 66
Vacca da latte 15 50
Vitelli a carne bianca 8 29
Bovini a duplice attitudine 4 8
TOT. 49 153
CAMPIONAMENTO
Soggetti sintomatici: 3-4 per gruppo/allevamento
Non trattati, non vaccinati con vaccino vivo da < 30 gg
Gennaio/giugno 2015
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
N° gruppi N° soggetti
Frisona italiana 19 68
Charolaise 10 30
Limousine 5 18
Charolaise X Saler 1 3
Aubrac 1 1
Garonnaise 3 6
Blanc bleu belge X FI 3 6
Bruna 1 3
Pezzata rossa 2 5
Piemontese 1 3
Altri incroci 3 10
TOT. 49 153
— Materiali e metodi (3) —RAZZE BOVINE CAMPIONATE
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— Materiali e metodi (4) —ACCERTAMENTI DIAGNOSTICI SU BAL
Virus: IBR, BVD, RSVB, BRCoV
Ricerca micoplasmi: esame colturale (IZS PD)
Batteriologico:
• terreni non selettivi (AS, AC)
• da 51 soggetti eseguito parallelamente il tampone nasale
P. multocida, M. haemolytica, H. somniDeterminazione della minima concentrazione inibente (MIC) (IZS TV)
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MIC
1 ceppo per specie microbica e per partita
30 P. multocida, 15 M. haemolytica, 10 H. somni
Metodo: microdiluizione in brodo (CLSI VET01-A4, 2013)
Break-points: CLSI VET01-S2, 2013
— Materiali e metodi (5) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
Molecole:
• Betalattamine: penicillina, amoxicillina, ceftiofur
• Aminoglicosidi: streptomicina
• Tetracicline: tetraciclina
• Macrolidi: tilmicosina
• Fluorchinolonici: enrofloxacina
• Amfenicoli: florfenicolo
• Sulfamidici: sulfametossazolo + trimethoprim
— Materiali e metodi (6) —
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RISULTATI
ESAME VIROLOGICO
Gruppi con almeno un positivo per virus: 26/49 (53%)
Soggetti positivi: 47/153 (30,7%)
N° gruppi
positivi (%)
N° soggetti
positivi (%)
Vacca da
latte (%)
Vitellone
(%)
Duplice
attitudine
Vit. carne
bianca (%)
IBR 2 (4,7) 3 (2,2) - 3 (4,5)* - -
BVD 10 (18,8) 14 (9,2) 3 (6) b 4 (6) a - 7 (24,3)b
BRCoV 16 (30,2) 26 (16,9) 13 (26) 7 (10,6) c 1 5 (17,2)
RSVB 6 (11,3) 11 (7,1) 5 (10) 5 (7,5) d - 1 (3,8)
*: charolais; a: 2 limousine, 1 charolais, 1 garronaise; b: frisona italiana; c: 6 charolais, 1 frisona italiana; d: 4 charolais, 1 charolais x saler.
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
RICERCA MICOPLASMI
Gruppi con almeno un positivo per Mycoplasma spp.: 33/49 (67,3%)
Soggetti positivi: 92/153 (60%)
N° gruppi
positivi (%)
N° soggetti
positivi (%)
N° Vacche
da latte (%)
Vitelloni
(%)
Vit. carne
bianca (%)
M. bovis 29 (59) 61 (39,8) 13 (26) 36 (54,5) 9 (31)
M. dispar 6 (12,2) 9 (5,8) 5 (10) 2 (3) 2 (6,9)
M. bovirh. 12 (24,4) 24 (15,6) 8 (16) 12 (18) 3 (10)
Sporadici isolamenti di: M. arginini (4 gruppi), M. alkalescens (3 gruppi)
4/61 positivi solo a M. bovis
3/9 positivi solo a M. dispar
— Risultati (2) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
ESAME BATTERIOLOGICO — Risultati (3) —
Gruppi con almeno un positivo per PM, MH, HS: 45/49 (91%)
Soggetti positivi per PM, MH, HS: 93/153 (60,7%)
N° gruppi
positivi (%)
N° soggetti
positivi (%)
N° Vacche
da latte (%)
N° Vitelloni
(%)
Vit. carne
bianca (%)
Pm 30 (61,2) 68 (44,4) 23 (46) 29 (44) 13 (44,8)
Mh 15 (30,6) 29 (19) 4 (8) 18 (28) 7 (24)
Hs 10 (20) 20 (13) 4 (8) 12 (18) 2 (6,8)
Altre specie: Trueperella pyogenes (6), Bibersteinia trehalosi (3), Branhamella ovis
Polimicrobismo (9), Bacillus spp.; Enterococcus spp., E. coli, muffe
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ESAME BATTERIOLOGICO – BAL vs TAMPONE NASALE— Risultati (4) —
BAL T. nas Concordanza
PM 28 16 12
MH 13 15 9
HS 12 3 3
Concordanza assoluta per patogeni primari sugli stessi soggetti: 13/42
Polimicrobismo: 1 (BAL) vs 14 (T. nasale)
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— Risultati (4) —RISULTATI AGGREGATI (gruppi)
16
14
5
3
3
3
2
1
1
1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
V+B+M
B+M
V
Trueperella pyog.
B
M
B+V
M+V
B. trehalosi/H. parainfluenzae
NEG
V: positivo almeno a 1 agente virale indagatoM: positivo a M. bovis e/o M. disparB: positivo a P. muotocida e/o M. haemolytica e/o H. somni
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
Penicillina
PM MH HS
MIC 50 0,032 0,063 ≤ 0,032
MIC 90 0,063 0,5 (I) ≤ 0,032
% S 93,3 80 100
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (4) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
Amoxicillina
PM MH HS
MIC 50 0,125 0,125 ≤ 0,032
MIC 90 0,125 0,125 ≤ 0,032
% S 93,3 100 100
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (5) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
5
10
15
20
25
30
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
Ceftiofur
PM MH HS
MIC 50 ≤ 0,016 ≤ 0,016 0,063
MIC 90 ≤ 0,016 0,032 0,063
% S 100 100 100
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (6) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
≤ 0,016
0,032 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
Enrofloxacina
PM MH HS
MIC 50 ≤ 0,016 0,032 0,032
MIC 90 1 (I) 0,25 0,063
% S 93,3 100 100
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (7) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
Florfenicolo
PM MH HS
MIC 50 0,25 1 0,25
MIC 90 0,5 2 0,5
% S 100 100 100
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (8) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 > 256
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
Streptomicina
PM MH HS
MIC 50 16 (I) > 256 32
MIC 90 > 256 > 256 32
% S 46,6 13,3 0
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (9) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
2
4
6
8
10
12
≤ 0,125
0,25 0,5 1 2 4 8 16 > 32
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
Tetraciclina
PM MH HS
MIC 50 0,25 0,5 0,5
MIC 90 8 8 2
% S 70 86,6 90
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (10) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
Tilmicosina
PM MH HS
MIC 50 8 16 32
MIC 90 ≥ 128 ≥ 128 64
% S 60 40 0
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (11) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
0
2
4
6
8
10
12
14
P. multocida
M. haemolytica
H. somni
PM MH HS
MIC 50 0,125 ≤ 0,063 0,125
MIC 90 0,5 ≤ 0,063 0,125
% S 96,6 100 100
N°
cep
pi
µg/ml
— Risultati (12) —Sulfametossazolo + Trimethoprim
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
Discussione e conclusioni
La BRD si conferma una malattia poli fattoriale
Il BRCoV è l’agente virale più frequente nelle forme respiratorie del
bovino
BVD è prevalente nelle pezzate nere (vacca da latte e vitelli carne
bianca)
BAL vs TAMPONE: scarsa concordanza. BAL più sensibile per H.
somni (12 vs 3)
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
Farmaci di vecchia generazione (penicilline, FFC, SXT) si
confermano sostanzialmente ancora efficaci «in vitro» (…uso
razionale del farmaco)
Tilmicosina: in vitro scarsa efficacia sul MH e HS…altro
meccanismo?
— Discussione (2) —
L u c a B a n o – C o r t e B e n e d e t t i n a , 1 1 N o v e m b r e 2 0 1 5
Tilmicosinaaccumulo nei neutrofili (40 X siero)
Apoptosi di neutrofili infetti da MH*
Riduzione «in vivo» di fattori pro-
infiammatori (LTB4)*
Riduzione «in vitro» della produzione di PGE da macrofagi
alv. e COX2*
+
Scarso danno tissutale e infiammazione
autolimitante
Miglioramento della sintomatologia
clinica
*effetto osservato anche con eritromicina, claritromicina, azitromicina, tulatromicinama non con antibiotici di altre famiglie