Embed Size (px)
Citation preview
Impact des procédés de fabrication des yogourts de type grec sur les communautés microbiennes durant
l’entreposage
Mémoire
Andréanne Moineau-Jean
Maîtrise en sciences et technologie des aliments
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Andréanne Moineau-Jean, 2017
Impact des procédés de fabrication des yogourts de type grec sur les communautés microbiennes durant
l’entreposage
Mémoire
Andréanne Moineau-Jean
Sous la direction de :
Denis Roy, directeur de recherche
Claude Champagne, codirecteur de recherche
iii
Résumé
Les yogourts de type grec sont devenus très populaires en Amérique du Nord au cours des dernières
années. Une étape de production supplémentaire est nécessaire pour augmenter la teneur en
protéines. Le procédé utilisé influence grandement la composition et les propriétés rhéologiques des
yogourts produits. Toutefois, très peu d’études ont analysé l’effet des procédés sur les différentes
communautés microbiennes des yogourts de type grec. Le but du projet était donc de comparer la
croissance et la survie de probiotiques et de contaminants microbiens ajoutés dans des yogourts de
type grec et un yogourt brassé régulier durant l’entreposage. Trois types de yogourt ont été produits;
yogourt grec par ultrafiltration du lait avant la fermentation, yogourt grec par centrifugation du caillé
après la fermentation, et yogourt brassé régulier. Dans un premier temps, les yogourts ont été
produits avec des cultures probiotiques (Bifidobacterium longum ssp. longum R0175 ou Lactobacillus
helveticus R0052). Les populations bactériennes et certaines propriétés physicochimiques des
yogourts ont ensuite été analysées durant l’entreposage à 4°C. Dans un deuxième temps, des
contaminants microbiens (Escherichia coli ATCC® BAA-1430™ ou Kluyveromyces marxianus
ATCC® 36907™) ont été ajoutés aux trois types de yogourt à la suite de la fermentation, puis
dénombrés durant l’entreposage à 4°C ou 8°C. Parmi les procédés testés, aucun n’a pu améliorer la
survie du probiotique B. longum R0175. Par contre, lorsqu’un probiotique plus résistant comme L.
helveticus R0052 est utilisé, les populations obtenues dans les yogourts de type grec frais sont
supérieures. De plus, un yogourt produit par centrifugation améliore la stabilité du probiotique durant
l’entreposage, alors qu’un yogourt produit par ultrafiltration amplifie la mortalité d’E. coli. Toutefois, la
croissance de la levure contaminante K. marxianus est également favorisée dans les yogourts de
type grec. Les procédés de fabrication ont donc une influence importante sur les populations
microbiennes.
iv
Abstract
Greek-style yogurt became very popular in North America in the past few years. To produce these
yogurts, an additional step is required to increase the protein content. Composition and rheological
properties of yogurt are greatly influenced by the production process applied. However, there is a
lack of knowledge about the impact of Greek-style yogurt production processes on microbial
communities. The aim of this project was to compare the growth and the survival of probiotic bacteria
and microbial contaminants added in Greek-style yogurts and regular stirred yogurt during storage.
Three kinds of yogurt were produced; Greek-style yogurt obtained by ultrafiltration of the milk prior to
fermentation, Greek-style yogurt obtained by centrifugation of the curd after fermentation, and regular
stirred yogurt. In a first series of experiments, yogurts were produced with probiotic cultures
(Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 or Lactobacillus helveticus R0052). Bacterial
populations and physicochemical properties of the products were analyzed during refrigerated
storage at 4°C. In a second series of experiments, microbial contaminants (Escherichia coli ATCC®
BAA-1430™ or Kluyveromyces marxianus ATCC® 36907™) were added to the three yogurt types
after fermentation, and their populations were followed during storage at 4°C or 8°C. None of the
processes tested could improve B. longum R0175 survival in yogurt. On the other hand, with a more
resistant probiotic species as L. helveticus R0052, fresh Greek-style products provided higher
populations than regular stirred yogurt. Moreover, Greek-style yogurt produced by centrifugation
improved probiotic stability during storage, while Greek-style yogurt produced by ultrafiltration is more
detrimental to E. coli. However, Greek-style products also improved the growth of the contaminating
yeast K. marxianus, in comparison with regular stirred yogurt. Therefore, production processes
greatly influence microbial populations in Greek-style yogurt.
v
Table des matières
Résumé .............................................................................................................................................................. iii
Abstract ............................................................................................................................................................... iv
Table des matières .............................................................................................................................................. v
Liste des tableaux ............................................................................................................................................... ix
Liste des figures ................................................................................................................................................... x
Liste des abréviations et des sigles ................................................................................................................... xii
Remerciements .................................................................................................................................................. xv
Avant-propos ................................................................................................................................................... xvii
Introduction générale .......................................................................................................................................... 1
Chapitre 1: État des connaissances ................................................................................................................... 4
1.1 Historique ................................................................................................................................................. 4
1.2 Les yogourts de type grec ........................................................................................................................ 4
1.2.1 Définition et composition ................................................................................................................... 4
1.2.2 Étapes de fabrication ........................................................................................................................ 5
1.2.2.1 Préparation du lait ...................................................................................................................... 7
1.2.2.1.1 Standardisation du lait ........................................................................................................ 7
1.2.2.1.2 Homogénéisation du lait ..................................................................................................... 7
1.2.2.1.3 Traitement thermique ......................................................................................................... 8
1.2.2.2 Inoculation des cultures lactiques et fermentation ..................................................................... 8
1.2.2.3 Refroidissement, brassage, lissage, mise en pot et entreposage .............................................. 9
1.3 Les cultures microbiennes utilisées dans le yogourt .............................................................................. 10
1.3.1 Les cultures lactiques ...................................................................................................................... 10
1.3.1.1 Croissance et fermentation ...................................................................................................... 10
1.3.1.2 Influence sur les propriétés sensorielles .................................................................................. 11
1.3.1.3 Activité antimicrobienne ........................................................................................................... 12
1.3.2 Les probiotiques .............................................................................................................................. 13
1.3.2.1 Définition .................................................................................................................................. 13
1.3.2.2 Croissance et survie ................................................................................................................ 13
1.3.2.2.1 La température ................................................................................................................. 14
1.3.2.2.2 Le pH ................................................................................................................................ 14
1.3.2.2.3 L’oxygène ......................................................................................................................... 15
1.3.2.2.4 Les nutriments .................................................................................................................. 16
1.3.2.3 Les bifidobactéries ................................................................................................................... 16
1.3.2.3.1 Bifidobacterium longum .................................................................................................... 17
vi
1.3.2.3.1.1 Bifidobacterium longum ssp. longum R0175 ............................................................. 17
1.3.2.4 Les lactobacilles ...................................................................................................................... 18
1.3.2.4.1 Lactobacillus helveticus .................................................................................................... 18
1.3.2.4.1.1 Lactobacillus helveticus R0052 ................................................................................. 19
1.4 Les contaminants microbiens associés au yogourt ................................................................................ 20
1.4.1 Les levures et moisissures .............................................................................................................. 20
1.4.1.1 Kluyveromyces marxianus ....................................................................................................... 21
1.4.2 Les bactéries pathogènes ............................................................................................................... 21
1.4.2.1 Escherichia coli O157: H7........................................................................................................ 22
1.5 Les protéines laitières ............................................................................................................................. 23
1.5.1 Description et propriétés physicochimiques .................................................................................... 23
1.5.2 Influence des protéines sur les propriétés physicochimiques du yogourt ....................................... 24
1.6 Les procédés de concentration des protéines ........................................................................................ 25
1.6.1 Concentration par ajout d’ingrédients laitiers .................................................................................. 25
1.6.1.1 Les poudres de lait écrémé...................................................................................................... 26
1.6.1.2 Les concentrés et isolats protéiques ........................................................................................ 27
1.6.2 Concentration par séparation .......................................................................................................... 28
1.6.2.1 L’égouttage .............................................................................................................................. 28
1.6.2.2 La centrifugation ...................................................................................................................... 29
1.6.2.3 L’ultrafiltration .......................................................................................................................... 30
Chapitre 2 : Problématique, but, hypothèse et objectifs .................................................................................... 33
2.1 Problématique ........................................................................................................................................ 33
2.2 But .......................................................................................................................................................... 33
2.3 Hypothèse .............................................................................................................................................. 33
2.4 Objectifs ................................................................................................................................................. 34
Chapitre 3: Impact of production processes on starter and probiotic bacteria in Greek-style yogurt during storage .............................................................................................................................................................. 35
3.1 Résumé .................................................................................................................................................. 36
3.2 Abstract .................................................................................................................................................. 37
3.3 Introduction ............................................................................................................................................. 38
3.4 Materials and methods ........................................................................................................................... 40
3.4.1 Microorganisms and media ............................................................................................................. 40
3.4.2 Milk preparation ............................................................................................................................... 40
3.4.3 Yogurt production for the smoothing process assays ..................................................................... 41
3.4.4 Yogurt production for Greek-style yogurt analyses ......................................................................... 42
3.4.4.1 Basic production steps for regular stirred yogurt and Greek-style yogurts............................... 42
vii
3.4.4.2 Production steps specific to yogurts containing Bifidobacterium longum subsp. longum R0175…............................................................................................................................................... 43
3.4.4.3 Production steps specific to yogurts containing Lactobacillus helveticus R0052 ..................... 43
3.4.5 Bacterial enumeration ..................................................................................................................... 44
3.4.5.1 Plating technique ..................................................................................................................... 44
3.4.5.2 Flow cytometry technique ........................................................................................................ 45
3.4.6 Compositional and physicochemical analyses ................................................................................ 46
3.4.7 Statistical analyses .......................................................................................................................... 47
3.5 Results ................................................................................................................................................... 49
3.5.1 Influence of dissolved oxygen and smoothing process on probiotics survival ................................. 49
3.5.2 Yogurt production ............................................................................................................................ 50
3.5.3 Yogurts made with the probiotic strain Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 .................. 51
3.5.3.1 Survival of Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 during storage .............................. 51
3.5.4. Yogurts made with the probiotic strain Lactobacillus helveticus R0052 ......................................... 53
3.5.4.1 Chemical attributes of yogurts ................................................................................................. 53
3.5.4.2 Survival of Lactobacillus helveticus R0052 during storage ...................................................... 55
3.5.4.3 Survival of Streptococcus thermophilus during storage ........................................................... 57
3.6 Discussion .............................................................................................................................................. 60
3.6.1 Influence of dissolved oxygen and smoothing process on probiotics survival ................................. 60
3.6.2 Production of Control, GS-UF and GS-CF probiotic yogurts ........................................................... 61
3.6.3 Survival of Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 during storage ..................................... 62
3.6.4 Chemical attributes of yogurts made with Lactobacillus helveticus R0052 ..................................... 63
3.6.5 Survival of Lactobacillus helveticus R0052 during storage ............................................................. 66
3.6.6. Survival of Streptococcus thermophilus during storage ................................................................. 67
3.7 Conclusion .............................................................................................................................................. 68
3.8 Acknowledgements ................................................................................................................................ 69
Chapitre 4: Fate of Escherichia coli and Kluyveromyces marxianus contaminants during storage of Greek-style yogurt produced by centrifugation or ultrafiltration ............................................................................................ 70
4.1 Résumé .................................................................................................................................................. 71
4.2 Abstract .................................................................................................................................................. 72
4.3 Introduction ............................................................................................................................................. 73
4.4 Materials and methods ........................................................................................................................... 76
4.4.1 Microorganisms and media ............................................................................................................. 76
4.4.2 Milk preparation ............................................................................................................................... 77
4.4.3 Yogurt production ............................................................................................................................ 77
4.4.4 Contamination with yeast and E. coli surrogate cultures ................................................................. 78
4.4.5 Comparison of the two Escherichia coli strains ............................................................................... 79
viii
4.4.6 Yogurt analyses .............................................................................................................................. 79
4.4.7 Statistical analyses .......................................................................................................................... 80
4.5 Results ................................................................................................................................................... 81
4.5.1 Fermentation process ..................................................................................................................... 81
4.5.2 Comparison of the two Escherichia coli strains ............................................................................... 82
4.5.3 Survival of Escherichia coli surrogate in yogurt ............................................................................... 83
4.5.4 Growth of Kluyveromyces marxianus in yogurt ............................................................................... 84
4.5.5 pH profiles during storage ............................................................................................................... 85
4.6 Discussion .............................................................................................................................................. 88
4.6.1 Fermentation profiles ...................................................................................................................... 88
4.6.2 Survival of Escherichia coli.............................................................................................................. 88
4.6.3 Growth of Kluyveromyces marxianus .............................................................................................. 89
4.7 Conclusion .............................................................................................................................................. 91
4.8 Acknowledgements ................................................................................................................................ 92
Conclusion générale ......................................................................................................................................... 93
Annexes ............................................................................................................................................................ 96
Annexe 1. Procédés de concentration en protéines par séparation du lait ou du caillé ............................... 96
Annexe 2. Mise au point du dénombrement sélectif des microorganismes et des méthodes de production des yogourts ................................................................................................................................................. 99
A2.1 Choix des milieux sélectifs ............................................................................................................... 99
A2.1.1 Essai de milieux de culture ....................................................................................................... 99
A2.1.1.1 Essai en bouillon ............................................................................................................. 100
A2.1.1.2 Essais en boites de Petri................................................................................................. 101
A2.1.2 Vérification de la sélectivité des milieux de culture................................................................. 103
A2.2 Choix du ferment et du taux d’inoculation ...................................................................................... 106
A2.2.1 Détermination du taux d’inoculation ....................................................................................... 106
A2.2.1.1 Essais de ratios St : Lb ................................................................................................... 106
A2.2.1.2 Essais de taux d’inoculation ............................................................................................ 108
A2.2.2 Essais de différents ferments ................................................................................................. 110
A2.3 Détermination des paramètres de centrifugation ........................................................................... 112
Bibliographie ................................................................................................................................................... 114
ix
Liste des tableaux
Tableau 1.1. Exigences requises selon la loi Canadienne pour la composition du yogourt. ............................... 4
Tableau 1.2. Composition générale des yogourts réguliers et des yogourts concentrés en protéines (type grec). ................................................................................................................................................................... 5
Tableau 1.3. Teneur moyenne en composants principaux du lait de vache ....................................................... 7
Tableau 1.4. Composés aromatiques ayant le plus d’influence sur les propriétés sensorielles du yogourt ...... 12
Tableau 1.5. Composition moyenne de la poudre de lait écrémé et de la poudre de lactosérum .................... 26
Tableau 1.6. Concentrés et isolats de protéines laitières principalement retrouvés sur le marché................... 27
Table 3.1. Treatments performed on regular stirred yogurt to test the impact of the smoothing process on probiotics survival ............................................................................................................................................. 41
Table 3.2. Selective media and incubation conditions used for the enumeration of the probiotic and starter bacterial strains in yogurt .................................................................................................................................. 44
Table 3.3. Relevant characteristics of the milk bases and the three yogurts produced for the comparative study of probiotic populations and physicochemical properties .................................................................................. 50
Table 3.4. Total nitrogen (Ntot) content, α-amino nitrogen (AAN) content and degree of hydrolysis (DH) in the regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C. ................................................................................................................................ 54
Table 3.5. Syneresis index (%) of the regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C ........................................................... 55
Table 4.1. Relevant characteristics of the milk bases and the three yogurts produced for the comparative study of the microbial contaminant populations .......................................................................................................... 78
Tableau A2.1. Liste des milieux sélectifs sélectionnés parmi la littérature pour l’énumération sélective des ferments, probiotiques et contaminants microbiens utilisés dans le projet ....................................................... 99
Tableau A2.2. Efficacité de milieux MRS supplémentés d’un agent sélectif à diverses concentrations pour générer des croissances sélectives de L. helveticus et L. bulgaricus ............................................................. 100
Tableau A2.3. Essais en Petri de divers milieux et conditions d’incubation pour le dénombrement sélectif de S. thermophilus (St), L. bulgaricus (Lb), B. longum (Bl), L. helveticus (Lh), K. marxianus (Km) et E. coli (Ec) ... 102
Tableau A2.4. Ferments commerciaux testés pour la fermentation de deux matrices laitières ...................... 110
Tableau A2.5. Paramètres de centrifugation retenus pour la production des yogourts de type grec centrifugés… ................................................................................................................................................... 112
x
Liste des figures
Figure 1.1. Schéma des étapes principales de fabrication du yogourt. .............................................................. 6
Figure 1.2. Taux d'incidence des sérotypes d'E. coli O157 et d'E. coli non-O157 déclarés à l'Agence de la Santé Publique du Canada ............................................................................................................................... 23
Figure 1.3. Liaison des protéines suite au traitement thermique ...................................................................... 24
Figure 1.4. Types de filtration par membrane utilisés dans l’industrie laitière ................................................... 30
Figure 3.1. Antibody specificity and positive labelling of Lactobacillus helveticus R0052 in yogurt ................. 46
Figure 3.2. Influence of the moment of probiotics inoculation and the smoothing process of regular stirred yogurt on the level of dissolved oxygen (a) and the viable counts of the probiotics Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 and Lactobacillus helveticus R0052 (b) during storage at 4°C. .................................... 49
Figure 3.3. pH profile and population of Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 in regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C ................................................................................................................................................................... 52
Figure 3.4. Sugar and organic acid profiles of the 4% protein milk (Milk 1), 10% protein milk (Milk 2), regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C ........................................................................................................................................ 53
Figure 3.5. Comparison of two methods for the enumeration of viable Lactobacillus helveticus R0052 in regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C. ....................................................................................................................................... 56
Figure 3.6. pH and populations of Streptococcus thermophilus from the YO-MIX® T11 yogurt cultures in regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C ................................................................................................................................. 58
Figure 4.1. Effect of the protein content of the milk matrix on the fermentation profiles of the starter bacteria Streptococcus thermophilus R0083 and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus HA-137 (100:1 ratio) at 42 °C ................................................................................................................................................................ 81
Figure 4.2. Comparison between a pathogenic Escherichia coli O157: H7 (ATCC® 43895™) strain and a non-pathogenic E. coli surrogate strain (ATCC® BAA-1430™) ............................................................................... 82
Figure 4.3. Population of Escherichia coli surrogate ATCC® BAA-1430™ in regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C and 8°C…. ............................................................................................................................................................... 83
Figure 4.4. Population of Kluyveromyces marxianus ATCC® 36907™ in regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4 °C and 8 °C.. ................................................................................................................................................................ 85
Figure 4.5. pH of the regular stirred yogurt (Control) and the Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF), which were contaminated with Escherichia coli surrogate ATCC® BAA-1430™, during storage at 4 °C and 8 °C ....................................................................................................................... 86
Figure 4.6. pH of the regular stirred yogurt (Control) and the Greek style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF), which were contaminated with Kluyveromyces marxianus ATCC® 36907™, during storage at 4 °C and 8 °C ....................................................................................................................... 87
Figure A1.1. Égouttage du caillé en sac de tissu sous l’effet de la gravité (a) ou par pressage (b) .................. 96
Figure A1.2. Exemple de centrifugeuse industrielle appelée « séparateur à buses » pouvant être utilisée pour concentrer le yogourt ........................................................................................................................................ 97
xi
Figure A1.3. Fonctionnement interne d’un séparateur à buses ........................................................................ 97
Figure A1.4. Exemple de système d’ultrafiltration pouvant servir à la concentration du lait ............................. 98
Figure A1.5. Fonctionnement interne d’une cartouche d’ultrafiltration. ............................................................. 98
Figure A2.1. Vérification de la sélectivité en Petri des milieux de culture et conditions d’incubation sélectionnés pour effectuer les dénombrements sélectifs dans les yogourts avec probiotiques ......................................... 104
Figure A2.2. Vérification de la sélectivité en Petri des milieux de culture sélectionnés pour effectuer les dénombrements sélectifs dans les yogourts avec contaminants microbiens .................................................. 105
Figure A2.3. Effet du ratio de St : Lb et du taux d’inoculation sur la durée de fermentation à 40°C d’un lait régulier à 4% de protéines .............................................................................................................................. 107
Figure A2.4. Effet du taux d’inoculation du ferment sur la durée de fermentation à 40°C d’un lait régulier à 4% de protéines et d’un lait ultrafiltré à 10% de protéines .................................................................................... 109
Figure A2.5. Profil de fermentation des différents ferments dans le lait régulier à 4% de protéines et dans le lait UF à 10% de protéines ................................................................................................................................... 111
xii
Liste des abréviations et des sigles
AAC/ AAFC: Agriculture et Agroalimentaire Canada/ Agriculture and Agri-Food Canada
AAN: Azote alpha-aminé/ Alpha-Amino Nitrogen
ACIA/ CFIA: Agence Canadienne d’Inspection des Aliments/ Canadian Food Inspection Agency
ATCC: American Type Culture Collection
B. bifidum: Bifidobacterium bifidum
B. cereus: Bacillus cereus
B. lactis: Bifidobacterium animalis ssp. lactis
B. longum: Bifidobacterium longum ssp. longum
Bl: Bifidobacterium longum ssp. longum
C. jejuni: Campylobacter jejuni
CaCn: Caséinate de calcium/ Calcium caseinate
CCIL/ CDIC: Centre Canadien d’Information Laitière/ Canadian Dairy Information Centre
CF: Centrifugé/ Centrifuged
CIP: Ciprofloxacine
CL: Clindamycine
CMI: Concentration minimale inhibitrice
CRDSH: Centre de Recherche et de Développement de Saint-Hyacinthe
Da: Dalton
DH: Degré d’hydrolyse/ Degree of hydrolysis
DO2: Oxygène dissous/ Dissolved oxygen
DRBC: Dichloran Rose-Bengal Chloramphénicol
E. coli: Escherichia coli
Ec: Escherichia coli
EPS: Exopolysaccharides
FACS: Fermentation Acquisition and Control System
FC: Cytométrie de flux/ Flow Cytometry
FCD: Cytométrie de flux – Cellules mortes/ Flow Cytometry – Dead cells
FCV: Cytométrie de flux – Cellules viables/ Flow Cytometry – Viable cells
FIL/ IDF: Fédération Internationale du Lait/ International Dairy Federation
FRQNT: Font de Recherche du Québec – Nature et Technologies
GRAS: Generally Recognized As Safe
GS: Style grec/ Greek-style
xiii
HPLC: Chromatographie en phase liquide à haute performance/ High-Performance Liquid Chromatography
HTP: Haute teneur en protéines
INAF: Institut sur la Nutrition et les Aliments Fonctionnels/ Institute of Nutrition and Functional Foods
ISO: International Organization for Standardization
K. marxianus: Kluyveromyces marxianus
KAN: Kanamycine
kDa: Kilo-Dalton
Km: Kluyveromyces marxianus
L. acidophilus: Lactobacillus acidophilus
L. bulgaricus: Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus
L. helveticus: Lactobacillus helveticus
L. paracasei: Lactobacillus paracasei ssp. paracasei
LAB: Bactéries lactiques/ Lactic Acid Bacteria
Lb: Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus
Lh: Lactobacillus helveticus
M. circinelloides: Mucor circinelloides
M17-L: M17 + Lactose
MAC: MacConkey
MAPAQ: Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec
MC: Caséine micellaire/ Micellar Casein
MPC: Concentré de protéines de lait/ Milk Protein Concentrate
MPI: Isolat de protéines de lait/ Milk Protein Isolate
MRS: de Man, Rogosa, Sharpe
MRS 5.2: de Man, Rogosa, Sharpe à pH 5.2
MRS-B: de Man, Rogosa, Sharpe + Sels biliaires
MRS-CIP: de Man, Rogosa, Sharpe + Ciprofloxacine
MRS-CL: de Man, Rogosa, Sharpe + Clindamycine
MRS-F: de Man, Rogosa, Sharpe + Fructose
MRS-KAN: de Man, Rogosa, Sharpe + Kanamycine
MRS-MUP: de Man, Rogosa, Sharpe + Mupirocine
MUP: Mupirocine de lithium/ Lithium Mupirocin
NaCn: Caséinate de sodium/ Sodium caseinate
NTot: Azote total/ Total Nitrogen
PBS: Tampon phosphate salin/ Phosphate Buffered Saline
pH: Potentiel hydrogène
xiv
PM: Poids moléculaire
Psi: Livre-force par pouce carré
RPM: Tour par minute/ Revolution Per Minute
SC/ HC: Santé Canada/ Health Canada
SEM: Erreur standard de la moyenne/ Standard Error of the Mean
S. thermophilus: Streptococcus thermophilus
St: Streptococcus thermophilus
S. Typhimurium: Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhimurium
TOS: Oligosaccharides trans-galactosylés./ Transgalactosylated oligosaccharides
TOS-MUP: Oligosaccharides trans-galactosylés + Mupirocine
TSB: Bouillon tryptone soja/ Tryptic Soy Broth
UF: Ultrafiltré/ Ultrafiltered
UFC/ CFU: Unités Formatrices de Colonies/ Colony Forming Units
WPC: Concentré de protéines de lactosérum/ Whey Protein Concentrate
WPI: Isolat de protéines de lactosérum/ Whey Protein Isolate
YM: Levure-moisissure/ Yeast-Mold
xv
Remerciements
Durant ma dernière année de baccalauréat à l’Université de Montréal, jamais je n’aurais pu imaginer
que le simple geste de m’inscrire au cours optionnel « microbiologie des aliments I », donné par
Claude P. Champagne, allait avoir des conséquences majeures sur ma vie. Dès le premier jour,
Claude m’a transmis sa passion contagieuse pour la microbiologie alimentaire, ce qui m’a ultimement
conduite à la maîtrise en sciences et technologie des aliments. Claude est donc la personne qui
mérite le plus grand Merci pour la réalisation de ce mémoire.
Ainsi, je tiens d’abord à remercier mon directeur Denis Roy et mon codirecteur Claude P.
Champagne pour m’avoir donné l’opportunité de mener un projet de recherche sous leur supervision.
Je suis extrêmement reconnaissante de l’intérêt, de la disponibilité et du soutien qu’ils m’ont accordé
tout au long de ma maîtrise. J’aimerais également remercier toutes les personnes ayant contribué à
la conception du projet, soit Gisèle Lapointe, Denis Roy, Claude P. Champagne, Évelyne
Guèvremont et Sylvie Gauthier.
Ensuite, je ne peux passer à côté de ma super équipe de recherche du Centre de Recherche et de
Développement de Saint-Hyacinthe (CRDSH) d’Agriculture et Agroalimentaire Canada. Merci à Yves
Raymond pour avoir été à la fois mon mentor et mon bras droit, et pour m’avoir supporté dans les
moments difficiles. C’est grâce à lui que j’ai pu mener à terme ce projet et obtenir autant de résultats.
Merci aussi à Marie-Josée Lemay pour son support et ses précieux conseils. Finalement merci à
Germaine Forkwa, ma coéquipière de tous les jours, toujours présente pour m’encourager et me
remonter le moral grâce à sa bonne humeur et ses nombreuses aventures rocambolesques.
Je remercie également toutes les autres personnes du CRDSH qui m’ont apporté du support
technique ou scientifique en cours de route : Sonia Lafleur, Gaétan Bélanger, Daniel St-Gelais,
Nancy Graveline, Annie Caron et Hélène Drolet.
xvi
Il ne faut pas non plus oublier l’Université Laval et le CRDSH qui m’ont permis de réaliser les cours et
les expérimentations nécessaires à l’obtention de mon diplôme de maîtrise. Un grand merci
également au Fonds de recherche du Québec - Nature et technologies (FRQNT) et Novalait, pour
avoir subventionné le projet et les bourses qui m’ont été remises. Puis, merci à Lallemand Solutions
santé (Montréal, Qc) et Aliments Ultima (Granby, Qc) pour avoir gracieusement fourni du matériel.
Je dois également faire une mention spéciale aux personnes de mon entourage rapproché. Les
longues heures de travail et de route, le stress et mes horaires chargés n’ont pas seulement eu des
répercussions sur moi, mais aussi sur ma famille, mes amis et tout particulièrement mon amoureux
Maxime qui était au premier plan de tout. C’est pourquoi j’apprécie grandement la patience que vous
avez tous eu envers moi et le soutien que vous m’avez apporté. En plus de signifier la réussite d’une
nouvelle étape dans ma vie scolaire et professionnelle, la finalisation de ce mémoire signifie
également que je vais ENFIN retrouver du temps pour avoir une vie sociale normale et passer du
temps de qualité avec les personnes qui me sont chères!
Merci à tous!
xvii
Avant-propos
Le projet a été supervisé à la direction par Denis Roy Ph.D., professeur titulaire à l’Université Laval,
et à la codirection par Claude P. Champagne Ph.D., chercheur scientifique à Agriculture et
Agroalimentaire Canada. Les expériences de laboratoire ont été menées au Centre de recherche et
de développement de Saint-Hyacinthe (CRDSH) d’Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC). Ce
mémoire est composé de quatre chapitres dont deux articles.
Le premier chapitre intitulé « États des connaissances » fait une revue de la littérature sur les sujets
touchés par les chapitres trois et quatre. Plus précisément, il porte sur la fabrication des yogourts et
leur composition, en faisant état des différences entre les yogourts réguliers et les yogourts de type
grec. Il porte également sur l’incorporation de cultures probiotiques et des facteurs influençant leur
croissance et leur survie dans le yogourt, tout en exposant des données récentes sur leurs bienfaits
pour la santé. La contamination microbienne du yogourt est ensuite abordée, avec un accent sur les
levures contaminantes et bactéries pathogènes, leur survie dans le yogourt et les problèmes
économiques et sociétaux associés. Le chapitre fait finalement état des différents procédés pouvant
être utilisés dans la fabrication des yogourts de type grec pour augmenter la teneur en protéines.
Pour finir, le fonctionnement des procédés et leurs impacts connus sur la composition, les propriétés
rhéologiques, physicochimiques et microbiologiques des yogourts y sont abordées.
Le deuxième chapitre intitulé « Problématique, but, hypothèse et objectifs » fait d’abord une
description de la problématique ayant mené à l’établissement du but général du projet de maîtrise. Il
établit ensuite l’hypothèse générale du projet en lien avec le contenu du chapitre 1, et présente
finalement, point par point, les objectifs de recherche.
Le troisième chapitre est intitulé « Impact of production processes on starter and probiotic bacteria in
Greek-style yogurt during storage ». Il s’agit d’un article rédigé en anglais. L’article est toujours en
processus de révision par les coauteurs et n’a donc pas encore été soumis à un journal. L’auteure de
ce mémoire, Andréanne Moineau-Jean, est également l’auteure principale de cet article. Elle a mené
les expériences au laboratoire pour produire les résultats et a rédigé l’intégral de l’article en anglais.
Les coauteurs sont Claude P. Champagne Ph.D. (CRDSH, Qc), Denis Roy Ph.D. (Université Laval,
xviii
Qc), Yves Raymond (CRDSH, Qc) et Gisèle Lapointe Ph.D, (University of Guelph, ON). Chacun des
coauteurs a contribué à la planification des expériences et à la bonification de l’article suite à la
première version rédigée par l’auteure principale. Yves Raymond a également contribué à la
réalisation des expériences au laboratoire. Le chapitre porte sur l’impact des procédés de fabrication
des yogourts de type grec sur les cultures probiotiques ajoutées. Deux types de yogourt grec et un
yogourt brassé régulier, supplémentés avec une souche probiotique (Bifidobacterium longum ssp.
longum R0175 ou Lactobacillus helveticus R0052), ont été produits pour l’étude. Les différences de
croissance et de survie des probiotiques et du ferment Streptococcus thermophilus durant
l’entreposage des trois types de yogourt y sont décrites. L’évolution de la teneur en azote, sucres et
acides, de même que celle des valeurs de pH et de synérèse durant l’entreposage des trois yogourts
est également montrée. De plus, l’impact sur les cultures probiotiques de la méthode de lissage
employée dans la fabrication des yogourts de ce chapitre a été analysé. Afin de s’adapter au format
du mémoire, le résumé du chapitre ainsi que les numéros de sections, tableaux et figures ont été
modifiés par rapport à la version article qui sera soumise à un journal pour publication. Les figures y
sont également présentées en couleur, contrairement à l’article où elles y seront présentées en
nuances de gris. Pour finir, des références aux annexes du mémoire, qui seront absentes de l’article,
ont été ajoutées dans le texte.
Le quatrième et dernier chapitre est intitulé « Fate of Escherichia coli and Kluyveromyces marxianus
contaminants during storage of Greek-style yogurt produced by centrifugation or ultrafiltration ». Il
s’agit d’un deuxième article rédigé en anglais. Cet article a été publié le 15 avril 2017 par la revue
« International Dairy Journal » (Doi : 10.1016/j.idairyj.2017.04.002). Andréanne Moineau-Jean en est
également l’auteure principale. Elle a mené les expériences au laboratoire pour produire les résultats
et a rédigé l’intégral de l’article en anglais. Les coauteurs sont Évelyne Guévremont Ph.D. (CRDSH,
Qc), Claude P. Champagne Ph.D. (CRDSH, Qc), Denis Roy Ph.D. (Université Laval, Qc), Yves
Raymond (CRDSH, Qc) et Gisèle Lapointe Ph.D. (University of Guelph). Chacun des coauteurs a
contribué à la planification des expériences et au perfectionnement de l’article suite à la première
version rédigée par l’auteure principale. Yves Raymond a également contribué à la réalisation des
expériences au laboratoire. Le chapitre porte sur l’impact des procédés de fabrication des yogourts
de type grec sur les contaminants microbiens. Deux types de yogourt grec et un yogourt brassé
régulier ont été produits, puis contaminés avec la bactérie Escherichia coli ou la levure
xix
Kluyveromyces marxianus. Les différences de croissance et de survie des contaminants dans les
trois types de yogourt y sont décrites. L’influence de la température de réfrigération sur les
populations des contaminants microbiens y est également décrite. La survie de la souche non
pathogène d’E. coli utilisée pour l’étude est également comparée à celle d’une souche pathogène
d’E. coli O157: H7. Comme pour le chapitre trois, des modifications ont été apportées à l’article
original pour s’adapter au format du mémoire. Le résumé du chapitre, le style des références, ainsi
que les numéros de sections, tableaux et figures ont été modifiés. Des couleurs ont été ajoutées aux
figures et des références aux annexes du mémoire, absentes de l’article original, ont été intégrées
dans le texte.
Finalement, le mémoire inclut deux annexes. La première complémente la revue de littérature en
apportant des supports visuels des procédés de concentration des protéines par séparation. La
deuxième annexe présente des expériences et résultats préliminaires aux chapitres 3 et 4 qui ont
permis de mettre au point les méthodes de dénombrements sélectifs des microorganismes utilisés
dans ces chapitres et les méthodes de production des yogourts.
1
Introduction générale
Depuis le début des années 2000, la production de yogourt au Canada ne cesse d’augmenter (CCIL,
2016b). La consommation des Canadiens a été estimée à près de 3 litres par habitant en 2016
(CCIL, 2016a). On retrouve aujourd’hui sur les tablettes des supermarchés une grande variété de
produits. Avec le souci grandissant des consommateurs à intégrer des aliments sains et naturels à
leur alimentation, les yogourts aux « effets santés », tels que les yogourts sans gras et les yogourts
probiotiques, suscitent un intérêt particulier. C’est sans doute pour la même raison que les yogourts
de type grec sont devenus très populaires en Amérique du Nord au cours des dernières années
(Wouters, 2012). Ces yogourts à haute teneur en protéines (HTP) ont l’avantage d’être nutritifs,
généralement faibles en gras et d’avoir une texture ferme et crémeuse sans qu’il ne soit nécessaire
d’ajouter d’agents gélifiants. Originaires du Moyen-Orient où ils sont appelés « Labneh », les
yogourts HTP sont aujourd’hui consommés un peu partout dans le monde, avec des appellations
différentes selon la région (Tamime & Robinson, 1999).
La méthode de production traditionnelle des yogourts HTP consiste à concentrer le caillé par
égouttage dans un sac de tissu, où le lactosérum est retiré sous l’effet de la gravité. Cette méthode
lente, pour laquelle il est difficile d’assurer une bonne salubrité, est principalement utilisée pour la
fabrication de yogourt concentré maison ou à petite échelle (Al-Kadamany et al., 2002; Tamime &
Robinson, 1999). Étant difficilement applicables au niveau industriel, de nouveaux procédés ont été
développés pour faciliter la production de ces yogourts. Ceux-ci peuvent être divisés en deux
catégories; les procédés d’ajout d’ingrédients et les procédés de séparation.
L’ajout d’ingrédients laitiers permet d’augmenter directement la concentration en protéines du lait
avant la fermentation. Des produits tels que la poudre de lait écrémée, la poudre de lactosérum, ainsi
que les concentrés et isolats protéiques dérivés du lait, peuvent être utilisés. Ayant des teneurs
différentes en protéines et en autres composants laitiers, tels que le lactose et les minéraux, ces
poudres influencent grandement la composition du yogourt produit (Huffman & De Barros Ferreira,
2011; O'Kennedy, 2011).
2
Les procédés de séparation permettent quant à eux d’augmenter la teneur en protéines du lait ou du
caillé en les concentrant via le retrait de certains composés. Les procédés les plus couramment
utilisés en industrie sont l’ultrafiltration et la centrifugation (Tamime & Robinson, 1999). La
centrifugation effectue une concentration du caillé par retrait du lactosérum sous l’effet de la force
centrifuge (Kilara & Chandan, 2013). L’ultrafiltration concentre plutôt certains composants du lait ou
du caillé par filtration forcée au travers d’une membrane (Tetra Pak, 2003). Différents composants du
lait peuvent ainsi être retenus ou perdus selon le type de séparation effectuée. Les procédés de
séparation influencent donc également la composition du yogourt produit.
Les études portant sur les yogourts de type grec et ses homologues ont démontré que le type de
procédé utilisé pour augmenter la concentration en protéines a non seulement une grande influence
sur la composition, mais également sur les propriétés physicochimiques, rhéologiques et sensorielles
du yogourt produit (Bong & Moraru, 2014; Ozer et al., 1998; Ozer et al., 1999a; Ozer et al., 1999b;
Yazici & Akgun, 2004).
L’étape de concentration en protéines requise lors de la fabrication des yogourts de type grec
représente un risque accru de contamination microbienne. Les levures et moisissures peuvent
aisément se développer dans le yogourt grâce à leur forte tolérance à l’acidité (Fleet, 1990;
Ledenbach & Marshall, 2010). Certaines bactéries pathogènes plus acido-résistantes peuvent même
y survivre durant l’entreposage (Cirone et al., 2013; Gulmez & Guven, 2003; Osaili et al., 2013;
Tirloni et al., 2015). Le yogourt n’est toutefois pas un milieu favorable pour tous les microorganismes.
En plus de l’effet bactériostatique du faible pH (Conner & Kotrola, 1995; Guraya et al., 1998; Nicolò
et al., 2011), les bactéries lactiques produisent des métabolites antibactériens qui permettent de
réduire la survie ou la croissance d’un grand nombre de microorganismes (Nassib et al., 2006; Qiuye
et al., 2016; Reis et al., 2012; Yang et al., 2012). Les conditions de production et la composition du
yogourt influencent également la croissance et la survie des contaminants microbiens (Tirloni et al.,
2015).
3
Les yogourts sont aussi couramment utilisés pour véhiculer des cultures probiotiques. Au Canada, un
aliment doit contenir un minimum de 1 milliard de cellules viables par portion jusqu’à la date de
péremption pour avoir la dénomination « probiotique » (ACIA, 2016; Santé Canada, 2009a, 2009b).
Plusieurs espèces de lactobacilles et de bifidobactéries survivent très bien à l’entreposage des
yogourts (Damin et al., 2008; Gilliland et al., 2002; Gueimonde et al., 2004). Comme pour les
contaminants microbiens, les conditions de production et la composition du yogourt influencent
grandement la croissance et la survie des probiotiques (Abe et al., 2009; Ostlie et al., 2005;
Prasanna et al., 2012a; Tripathi & Giri, 2014).
La majorité des études microbiologiques du yogourt ont été effectuées avec des produits réguliers
fermes ou brassés. Très peu d’études ont analysé l’effet des procédés de fabrication des yogourts de
type grec sur les différentes communautés microbiennes de ces yogourts. Puisque les populations
microbiennes du yogourt sont affectées par la composition de la matrice, et que la composition de la
matrice est à son tour affectée par les procédés de fabrication, des différences au niveau de la
croissance et de la survie des cultures probiotiques et des contaminants microbiens devraient être
observées entre les différents types de yogourt. Ce projet avait ainsi pour objectif de comparer deux
procédés de fabrication des yogourts de type grec (centrifugation et ultrafiltration) à une fabrication
classique de yogourt brassé, quant à leur impact sur les comptes de probiotiques et contaminants
microbiens durant l’entreposage.
4
Chapitre 1: État des connaissances
1.1 Historique
Les yogourts égouttés connus sous le nom de Labneh sont originaires du Moyen-Orient. Autrefois, le
yogourt produit était conservé dans des sacs faits de peau animale. Une partie du lactosérum était
alors absorbée par le sac puis évaporée, ce qui menait à la concentration du caillé. C’est ce qui est à
l’origine de l’égouttage en sac de tissu (Annexe 1), la méthode traditionnelle de production des
yogourts concentrés à haute teneur en protéines (HTP), encore utilisée aujourd’hui à petite échelle
(Tamime & Robinson, 1999). Les yogourts HTP sont maintenant consommés partout dans le monde.
Ils sont d’ailleurs mieux connus sous le nom de « yogourt de type grec » en Amérique du Nord.
Ceux-ci varient toutefois en nom et en composition selon la région d’origine.
1.2 Les yogourts de type grec
1.2.1 Définition et composition
Le yogourt est défini comme un lait fermenté par les bactéries lactiques Streptococcus thermophilus
et Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus contenues à un taux minimum de 107 UFC/g (CanLII,
2016; CAC, 2003). Le tableau 1.1 montre les exigences requises par la loi Canadienne pour la
composition du yogourt.
Tableau 1.1. Exigences requises selon la loi Canadienne pour la composition du yogourt.
Composant Quantité requise
Acide lactique > 0.7%
Solides non gras du lait > 9.5%
Protéines laitières > 3%
S. thermophilus et L. bulgaricus > 1.0 x 107 UFC/g
Tiré de CanLII (2016)
5
Un yogourt concentré est quant à lui défini comme étant un lait fermenté dont la teneur en protéines
a été augmentée à un minimum de 5.6% avant ou après la fermentation (CAC, 2003). Toutefois, il
n’existe aucune exigence légale au sujet des yogourts de type grec, ou tous autres types de yogourts
HTP, autant au Canada qu’aux États-Unis. Peu importe leur appellation, ceux-ci ont en commun
d’avoir une teneur nettement plus élevée en protéines qu’un yogourt ferme ou brassé régulier.
Généralement, les yogourts de type grec sont constitués d’environ 10% de protéines tandis qu’un
yogourt régulier en contient plutôt autour de 4%. Le tableau 1.2 montre un aperçu des principales
différences de composition entre les deux types de yogourt.
Tableau 1.2. Composition générale des yogourts réguliers et des yogourts concentrés en protéines (type
grec).
Composant Yogourt régulier Yogourt concentré
Protéines (%) 4 - 5 6 - 11 Solides totaux (%) 15 - 18 20 - 27 Gras (%) 0 - 3 0 - 12 Lactose (%) 7 - 8 3 - 9
(Kumar & Mishra, 2004; Ozer et al., 1999a; Tamime & Robinson, 1999)
La composition des yogourts de type grec varie grandement selon le procédé utilisé pour augmenter
la teneur en protéines et le type de matrice laitière de base (ex : lait écrémé vs entier, lait frais vs en
poudre, lait de vache vs autre animal, etc…).
1.2.2 Étapes de fabrication
Deux grandes catégories de yogourt régulier sont couramment fabriquées en industrie; les yogourts
fermes et les yogourts brassés (figure 1.1). Ces deux types de yogourt diffèrent principalement par
l’ordre des étapes de production (Tamime & Robinson, 1999).
6
Figure 1.1. Schéma des étapes principales de fabrication du yogourt. Les étapes de concentration en
protéines pouvant être utilisées dans la production des yogourts de type grec sont indiquées en pointillés.
Les yogourts de type grec peuvent être fabriqués en suivant l’une ou l’autre de ces voies. Il y aura
toutefois une étape supplémentaire requise pour augmenter la teneur en protéines du produit.
Standardisation
Homogénéisation
Traitement thermique
Refroidissement (42°C)
Inoculation
Mise en pot
Fermentation en pot (42°C)
Entreposage (4°C)
Mise en pot
Fermentation en cuve (42°C)
Refroidissement (20°C)
Entreposage (4°C)
Brassage et Lissage
Lait
Yogourt ferme
Yogourt brassé
Addition d’ingrédients laitiers▪ Poudres de lait▪ Poudre de lactosérum▪ Concentrés protéiques▪ Isolats protéiques
Concentration du cail lé▪ Égouttage▪ Centrifugation▪ Ultrafiltration
Concentration du lait▪ Ultrafiltration
7
1.2.2.1 Préparation du lait
1.2.2.1.1 Standardisation du lait
La composition du lait reçu à l’usine de transformation est très variable. En effet, de nombreux
facteurs relatifs à l’animal producteur et son environnement peuvent influencer la composition du lait
(Schwendel et al., 2015). Le tableau 1.3 montre la teneur moyenne des principaux composants du
lait de vache. Afin d’obtenir des produits identiques entre chaque lot de production, et de contrôler la
teneur en certains composants tels que le gras et les solides non gras, il est nécessaire de
standardiser la composition du lait (Tamime & Robinson, 1999). De nombreuses méthodes peuvent
être utilisées pour ajouter ou retirer des composants de manière contrôlée, telles que l’écrémage, la
filtration, l’évaporation, et l’ajout de poudre de lait, de concentrés protéiques, de sucre, de vitamines,
de minéraux ou de crème (Lapointe-Vignola, 2002).
Tableau 1.3. Teneur moyenne en composants principaux du lait de vache.
Composant Teneur (%)
Eau 87.5
Glucides 4.6
Matière grasse 3.7
Protéines 3.2
Minéraux 0.8
Tiré de Lapointe-Vignola (2002)
1.2.2.1.2 Homogénéisation du lait
L’étape d’homogénéisation permet principalement de réduire la taille des globules de gras pour
empêcher leur montée à la surface du lait, ce qui créerait une séparation de phase. Ce procédé rend
également le lait plus blanc et améliore la stabilité des protéines. Pour ce faire, le lait est propulsé au
travers d’une valve avec une certaine pression. Cela permet de faire éclater les globules de gras qui
se reforment par la suite en une multitude de globules de tailles inférieures (Lapointe-Vignola, 2002).
L’homogénéisation a ainsi une grande influence sur la texture du yogourt, en augmentant notamment
la viscosité, la consistance et la fermeté (Lanciotti et al., 2004; Patrignani et al., 2016). Des études
ont même démontré que l’homogénéisation du lait permet d’améliorer la croissance des ferments
8
lactiques (Lanciotti et al., 2004) et la survie des probiotiques durant l’entreposage du yogourt
(Patrignani et al., 2016; Ramona et al., 2015).
1.2.2.1.3 Traitement thermique
L’objectif premier du traitement thermique est de réduire la flore microbienne du lait. En effet, le lait
contient une grande quantité de microorganismes provenant de l’animal et de l’environnement.
Certains de ces microorganismes peuvent être pathogènes, alors que d’autres peuvent altérer le
goût du lait et des produits dérivés, ou interférer avec la croissance des ferments lactiques lors de la
fermentation (Tamime & Robinson, 1999). Une étape de traitement thermique est donc nécessaire
pour réduire au maximum cette flore microbienne.
Pour la production du yogourt, le traitement thermique vise également à agir sur les protéines
laitières pour améliorer la texture finale du produit fermenté (Remeuf et al., 2003). Pour avoir un
impact sur les protéines, un traitement thermique de température et de durée supérieure à ce qui est
appliqué pour la pasteurisation du lait de consommation est nécessaire. Le traitement thermique est
ainsi généralement de 30 minutes à 80-85°C ou de 5 minutes à 90-95°C (Robinson et al., 2007). De
telles températures causent la dénaturation des protéines sériques, ce qui permet d’augmenter le
nombre de liaisons entre les caséines et les protéines sériques, provoquant ainsi la formation d’un
gel de densité et viscosité supérieure. La capacité de rétention d’eau du gel est également
améliorée, ce qui réduit la synérèse durant l’entreposage. Toutefois, le traitement thermique peut
également causer une augmentation de la granulosité du gel, ce qui semble être directement liée à la
quantité de protéines sériques dénaturées (Remeuf et al., 2003; Robinson et al., 2007).
1.2.2.2 Inoculation des cultures lactiques et fermentation
Après la pasteurisation, le lait est refroidi jusqu’à la température de fermentation, puis les cultures
lactiques sont ajoutées. Comme le mentionne la définition du yogourt, le ferment doit être composé
des bactéries lactiques S. thermophilus et L. bulgaricus. Celles-ci doivent être inoculées à un taux
minimal total de 107 UFC/g, mais il n’y a toutefois aucune spécification du ratio requis entre les deux
9
souches (CanLII, 2016; CAC, 2003). Ces cultures lactiques peuvent être obtenues sous forme
congelée ou lyophilisée. Il est aussi possible d’ajouter des cultures probiotiques au même moment.
Le lait est ensuite incubé autour de 42°C pour permettre la fermentation (Robinson et al., 2007). À
cette température, les bactéries du ferment agissent en synergies pour dégrader le lactose en
glucose et galactose. Le galactose s’accumule généralement dans le milieu alors que le glucose est
transformé en acide lactique (De Vin et al., 2005; Svensson et al., 2007), causant ainsi l’acidification
du lait. Le gel commence à se former à un pH de 5.3 par l’agrégation des protéines. La fermentation
est arrêtée après 3-4 h lorsque le pH final désiré est atteint, soit autour de 4.6, le point isoélectrique
des caséines. C’est également à ce pH que la fermeté du gel atteint son maximum (Robinson et al.,
2007).
1.2.2.3 Refroidissement, brassage, lissage, mise en pot et entreposage
L’arrêt de la fermentation se fait par refroidissement afin de ralentir l’activité métabolique des
bactéries. En industrie, le refroidissement est majoritairement effectué en deux étapes. Le yogourt
est d’abord refroidi autour de 20°C, température à laquelle les manipulations subséquentes
occasionnent le moins de dommage au caillé. Le yogourt est ensuite refroidi à 4°C en chambre
réfrigérée (Tamime & Robinson, 1999).
Puisque la fermentation des yogourts brassés survient en cuve, une étape de brassage est
nécessaire pour homogénéiser après la fermentation. Le yogourt doit par la suite être pompé pour
être transféré dans les contenants d’entreposage, ce qui produit en même temps un lissage (Tamime
& Robinson, 1999). Finalement, les pots de yogourts sont entreposés au réfrigérateur jusqu’à
l’expédition.
Puisque le yogourt contient des cultures actives, l’entreposage à 4°C est important pour maintenir au
minimum l’activité métabolique bactérienne, et ainsi prolonger la durée de vie du produit. De plus, les
manipulations subséquentes au traitement thermique du lait durant la production amènent un risque
de post-contamination microbienne. L’entreposage du yogourt à 4°C sert donc également à prévenir
10
le développement de microorganismes contaminants pouvant altérer le produit ou causer des toxi-
infections alimentaires (Mataragas et al., 2011; Tirloni et al., 2015; Viljoen et al., 2003).
1.3 Les cultures microbiennes utilisées dans le yogourt
1.3.1 Les cultures lactiques
Les cultures lactiques sont des bactéries utilisées pour la fermentation du lait. Dans le cas du
yogourt, ce sont les espèces S. thermophilus et L. bulgaricus qui sont employées.
1.3.1.1 Croissance et fermentation
Les bactéries lactiques S. thermophilus et L. bulgaricus sont thermophiles, anaérobies facultatives et
homofermentaires (Vos et al., 2011). Elles fermentent donc le glucose en acide lactique via la voie
métabolique Embden-Meyerhof (Slattery et al., 2010). Elles agissent en protocoopération en
promouvant la croissance de l’une et de l’autre (Oliveira et al., 2012). Ayant un pH optimal de 6.5, le
streptocoque entame la fermentation et l’abaissement du pH, ce qui favorise la croissance du
lactobacille qui a un pH optimal de 5.8 (Beal et al., 1989). Également, via la protéolyse des protéines,
L. bulgaricus libère des peptides et acides aminés qui sont utilisés par S. thermophilus, puis ce
dernier produit du dioxyde de carbone et de l’acide formique qui stimule la croissance de L.
bulgaricus (Radke-Mitchell & Sandine, 1986).
L’espèce L. bulgaricus peut produire jusqu’à trois fois plus d’acide lactique que S. thermophilus
puisqu’elle est plus acido-tolérante. Cette bactérie est ainsi la principale cause de sur-acidification
des yogourts qui survient durant l’entreposage (Antunes et al., 2005; Tamime & Robinson, 1999). La
croissance de S. thermophilus durant la fermentation est toutefois plus importante que celle de L.
bulgaricus, faisant en sorte que cette espèce représente la population majeure du yogourt (Ozer &
Robinson, 1999). La plus haute proportion de S. thermophilus dans le produit fermenté est aussi le
reflet des pratiques modernes d’inoculation qui favorisent cette espèce au détriment du lactobacille
11
afin de réduire les problèmes de sur-acidification durant l’entreposage (Beal et al., 1989; Dave &
Shah, 1998; Xanthopoulos et al., 2001).
1.3.1.2 Influence sur les propriétés sensorielles
Les propriétés sensorielles d’un yogourt peuvent être définies par la texture, l’odeur et le goût. Ces
trois aspects peuvent être influencés par une multitude de facteurs, dont les cultures lactiques qui en
sont les principaux déterminants.
Les cultures lactiques agissent sur la texture d’abord en causant la précipitation des caséines et la
formation d’un gel à la suite de la production d’acide lactique par la fermentation du lactose.
Certaines cultures peuvent aussi produire des exopolysaccharides (EPS) à partir du lactose
(Escalante et al., 1998), ce qui modifie la texture du yogourt et affecte la viscosité, la fermeté et la
synérèse (Amatayakul et al., 2006; Wacher-Rodarte & Farres, 1993).
Les cultures lactiques ont également un rôle important dans le développement des saveurs et des
odeurs du yogourt. Durant la fermentation, le métabolisme du lactose, du lactate et du citrate mène à
la production de plusieurs arômes importants tels que le lactate (acide lactique), l’acétaldéhyde,
l’acétoine et le diacétyle (Cheng, 2010). Le tableau 1.4 montre les arômes retrouvés dans le yogourt
qui ont le plus d’impact sur les propriétés sensorielles. L’acétaldéhyde est le composé aromatique le
plus important puisqu’il confère l’arôme caractéristique du yogourt (Biliaderis et al., 1992). Ce
composé est produit majoritairement par L. bulgaricus lors de la fermentation (Antunes et al., 2005).
D’autres composés aromatiques tels que le diacétyle et l’acétoïne sont produits uniquement dans les
co-cultures de S. thermophilus et L. bulgaricus (Oliveira et al., 2009).
12
Tableau 1.4. Composés aromatiques ayant le plus d’influence sur les propriétés sensorielles du yogourt.
Composé aromatique Autres synonymes Description de l’odeur
Acétaldéhyde Éthanal Aldéhyde acétique Aldéhyde éthylique
Frais, vert, âcre, léger
Diacétyle Butane-2,3-dione Butadione
Beurre, crémeux, vanille
Acétone Propanone Diméthylcétone
2-propanone Propan-2-one
Béta-cétopropane
Sucré, fruité
Acétoïne 3-Hydroxybutanone Acétylméthylcarbinol
Beurre
Butanone 2-Butanone Ethylméthylcétone
Vernis, sucré, fruité
Tiré de Cheng (2010)
Les cultures lactiques peuvent également générer des arômes à partir des protéines, des peptides et
des acides aminés, ou encore à partir des lipides dans les yogourts faits de lait entier (Boelrijk et al.,
2003).
1.3.1.3 Activité antimicrobienne
Les cultures lactiques du ferment procurent un effet antimicrobien au yogourt via la production de
substances inhibitrices, telles que de l’acide lactique (Wang et al., 2015), des bactériocines
(Mohammed & Ijah, 2013; Yang et al., 2012), du peroxyde d’hydrogène (Dave & Shah, 1997b;
Tamime & Robinson, 1999) et des surfactants (Rodrigues et al., 2006). Elles peuvent également
nuire à la croissance des pathogènes simplement par leur importante biomasse qui accapare les
nutriments. En effet, en plus de leur nombre élevé au moment de l’inoculation, leur population peut
augmenter de plus de deux log UFC/g durant la fermentation et demeurer stable lors de
l’entreposage (Al-Kadamany et al., 2002; Canganella et al., 1998; Cutrim et al., 2016; Osaili et al.,
2013; Tirloni et al., 2015). L’effet antibactérien du yogourt envers plusieurs bactéries pathogènes
telles que Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella et Shigella, est d’ailleurs connu
depuis longtemps (Alm, 1983; Jasjit et al., 1979; Kotz et al., 1990; Rubin & Vaughan, 1979; Schaack
& Marth, 1988). L’ajout de bactéries lactiques, autres que les cultures du ferment, peut également
13
augmenter l’effet antibactérien du yogourt et même lui procurer un effet antifongique (Delavenne et
al., 2013; Reis et al., 2012).
1.3.2 Les probiotiques
1.3.2.1 Définition
Les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui confèrent un bénéfice santé à
l’hôte, lorsqu’administrés en quantité suffisante (Hill et al., 2014). L’incorporation de probiotiques
dans les aliments est un moyen de procurer un aspect fonctionnel à ceux-ci. Toutefois, pour obtenir
la dénomination « probiotique » ainsi qu’une allégation santé, les effets bioactifs doivent d’abord être
démontrés par des études cliniques. De plus, le gouvernement canadien exige que l’aliment
contienne un minimum de 1 milliard de cellules viables par portion, ainsi que le minimum de cellules
viables nécessaires pour obtenir l’effet bénéfique allégué, et ce tout au long de la durée
d’entreposage (ACIA, 2016; Santé Canada, 2009a, 2009b). Ce nombre minimal est justifié par le fait
que pour procurer un effet santé, les probiotiques doivent atteindre et coloniser l’intestin en nombre
suffisant. Ainsi, ils doivent d’abord survivre à la production du produit alimentaire dans lequel ils sont
incorporés, puis à son entreposage.
1.3.2.2 Croissance et survie
Plusieurs facteurs physicochimiques influencent la survie des probiotiques dans le yogourt. La
capacité des cultures probiotiques à survivre aux diverses conditions environnementales varie
toutefois d’une souche à l’autre puisque chacune possède ses propres conditions optimales et ses
propres limites de tolérance (Andriantsoanirina et al., 2013). Les cultures probiotiques sont
généralement incorporées dans le lait au même moment que les cultures lactiques du ferment. Elles
doivent donc résister aux étapes de fabrication, allant de la fermentation à l’entreposage du yogourt.
Dans le yogourt, les facteurs environnementaux ayant le plus d’influence sur les cultures
microbiennes sont la température, le pH et l’acidité, l’oxygène et les nutriments.
14
1.3.2.2.1 La température
La température à un impact important sur le métabolisme bactérien. Ce dernier atteint une vitesse
maximale à la température optimale de la souche. Une température trop basse peut ralentir l’activité
métabolique jusqu’à l’arrêt complet, alors qu’une température trop élevée peut mener à la
dénaturation des protéines de la cellule et causer la mort (Lacasse, 2002).
Traditionnellement, la température de fermentation du yogourt se situe autour de 42°C pour favoriser
l’activité métabolique des cultures du ferment (Robinson et al., 2007). Cela représente une moyenne
des températures optimales de croissance de S. thermophilus et L. bulgaricus qui peuvent varier
respectivement de 35°C à 42°C et 43°C à 46°C selon les souches (Beal et al., 1989; Radke-Mitchell
& Sandine, 1986). Des souches probiotiques thermophiles, qui sont résistantes et métaboliquement
actives à une telle température, peuvent être utilisées. Dans le cas où une souche probiotique
mésophile serait employée, la température de fermentation peut être abaissée autour de 40°C pour
ainsi améliorer sa survie sans trop ralentir le métabolisme de L. bulgaricus (Kailasapathy & Chin,
2000). Par contre, une température plus basse diminue l’activité métabolique des cultures du ferment
du yogourt, ce qui allonge la durée de la fermentation (Beal et al., 1989). La croissance et la survie
des probiotiques à différentes températures de fermentation varient grandement selon l’espèce et la
souche (Ostlie et al., 2005).
Dans le yogourt, les cultures probiotiques sont également confrontées aux températures de
réfrigération. Elles doivent ainsi résister à un changement important de température et à une longue
période d’entreposage à 4°C. La survie des souches probiotiques reste tout de même meilleure à
température de réfrigération qu’à température pièce (Gardiner et al., 2000).
1.3.2.2.2 Le pH
Les bactéries ont également un pH optimal et des seuils de tolérances qui influencent leur activité
métabolique. Les conditions de pH pour la croissance optimale de S. thermophilus et de L. bulgaricus
sont respectivement de 6.5 et 5.8 (Beal et al., 1989). Ainsi, le pH initial du lait, près de 6.6, favorise
initialement la croissance de S. thermophilus. Durant la fermentation, la production d’acide lactique
15
par les bactéries du ferment abaisse le pH du lait jusqu’à environ 4.5, rendant ainsi les conditions
plus favorables à L. bulgaricus en fin de fermentation. La baisse du pH peut même se poursuivre lors
de l’entreposage (Beal et al., 1989; Dave & Shah, 1998). Par ailleurs durant l’entreposage, les
lactobacilles peuvent généralement tolérer des valeurs de pH plus faibles que les bifidobactéries
mais, encore une fois, cela varie grandement selon les espèces et les souches (Andriantsoanirina et
al., 2013; Tripathi & Giri, 2014). De plus, l’acide lactique du yogourt a également un effet
antibactérien en lui-même, et peut être néfaste pour les probiotiques en affectant leur croissance et
leur activité métabolique (Amrane & Prigent, 1999; Reis et al., 2012; Wang et al., 2015).
1.3.2.2.3 L’oxygène
Les cultures probiotiques ont généralement des exigences réduites en oxygène puisqu’elles sont
majoritairement anaérobies facultatives, microaérophiles ou anaérobies strictes. Les deux premiers
types peuvent effectuer de la respiration cellulaire ou de la fermentation dépendamment de la
présence d’oxygène, alors que les bactéries anaérobies strictes ont uniquement un métabolisme
fermentatif (Lacasse, 2002).
L’oxygène peut également être néfaste pour plusieurs bactéries probiotiques, soit en affectant
directement les cellules, soit en étant dégradé en dérivés réactifs de l’oxygène tels que les radicaux
libres et les peroxydes (Dave & Shah, 1997b). Les bactéries anaérobies strictes, comme les
bifidobactéries, sont particulièrement sensibles à la présence d’oxygène puisqu’elles ne possèdent
pas les enzymes nécessaires pour dégrader les dérivés toxiques. La présence d’oxygène peut ainsi
mener à la mort des cellules. Au contraire, les lactobacilles tolèrent mieux l’oxygène que les
bifidobactéries puisqu’ils possèdent des enzymes pour dégrader les dérivés toxiques (Roy, 2005;
Talwalkar & Kailasapathy, 2004).
Dans le yogourt, de l’oxygène peut être incorporé lors de certaines étapes de fabrication comme le
brassage, mais également durant l’entreposage par perméation au travers des contenants (Damin et
al., 2008; Dave & Shah, 1997a). L’ajout d’antioxydant ou d’enzymes permettant la dégradation des
dérivés toxiques de l’oxygène peut améliorer la survie des probiotiques (Cruz et al., 2012a; Dave &
Shah, 1997a).
16
1.3.2.2.4 Les nutriments
Le lait n’est pas un milieu riche en nutriments facilement accessibles. Son glucide principal, le
lactose, ne peut être assimilé par toutes les bactéries. C’est pourquoi, les probiotiques utilisés dans
les produits laitiers fermentés sont principalement des bactéries lactiques ou des bifidobactéries qui
peuvent fermenter le lactose. De plus, le lait comporte très peu de peptides, d’acides aminés et
d’acides gras essentiels sous forme libre. Les bactéries doivent donc posséder des protéases ou des
lipases pour avoir une croissance abondante (Juillard et al., 1995). Ainsi, les cultures lactiques du
yogourt contribuent grandement à la libération de ces nutriments par l’hydrolyse des protéines du lait
lors de la fermentation (Beshkova et al., 1998). Ils deviennent alors disponibles pour alimenter la
croissance des probiotiques.
1.3.2.3 Les bifidobactéries
Les bifidobactéries font partie du microbiote intestinal humain. Elles représentent le groupe dominant
chez les nouveau-nés, mais leur population diminue avec l’âge (Favier et al., 2002; Harmsen et al.,
2000; Hopkins et al., 2001; Turroni et al., 2012). Ce sont des bacilles Gram positifs de forme
irrégulière, ayant majoritairement un métabolisme anaérobie strict. Ces bactéries sont mésophiles et
acido-tolérantes, mais croissent davantage en pH neutre. Toutes les espèces sont en mesure de
fermenter le glucose, le galactose et le fructose, et certaines peuvent aussi fermenter le lactose.
Cette fermentation se fait via une voie métabolique particulière appelée « Bifid shunt », où les
hexoses sont transformés principalement en acide lactique et en acide acétique (Bergey et al., 1984;
Gomes & Malcata, 1999; Leahy et al., 2005; Ventura et al., 2004). Les bifidobactéries sont tout de
même fastidieuses puisqu’elles ont des besoins spécifiques variables en certains nutriments et
facteurs de croissance (Gomes et al., 1998). Cet aspect peut ainsi rendre difficile leur incorporation
dans les aliments.
Parmi les souches acceptées par l’Agence Canadienne d’inspection des aliments (ACIA) pour leur
utilisation en tant que probiotique, on retrouve les espèces Bifidobacterium adolescentis, B. animalis
(Sous-espèces animalis et lactis), B. bifidum, B. breve et B. longum (sous-espèces infantis et
longum) (ACIA, 2016).
17
1.3.2.3.1 Bifidobacterium longum
L’espèce B. longum a été largement étudiée. Elle fait notamment partie des espèces de
bifidobactéries capables de fermenter le lactose (Audy et al., 2010; Champagne et al., 2009) ce qui
justifie son utilisation dans les produits laitiers. Plusieurs effets bénéfiques de l’espèce sur la santé
ont été démontrés. On retrouve parmi ceux-ci des bienfaits sur la santé intestinale, dont la réduction
des diarrhées causées par la prise d’antibiotique et la réduction de l’intolérance au lactose, des effets
préventifs du cancer, des effets modulateurs du système immunitaire, et des effets antimicrobiens
envers Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhimurium (Jiang et al., 1996; Orrhage et al.,
1994; Silva et al., 2004; Singh et al., 1997; Yasui et al., 1992). Les différents effets recensés chez
cette espèce peuvent toutefois varier selon la souche.
Dans le yogourt, la croissance de B. longum durant la fermentation et sa survie durant l’entreposage
varie grandement d’une étude à l’autre (Abe et al., 2009; Antunes et al., 2005; Gilliland et al., 2002;
Odamaki et al., 2011). Cette variation indique une grande sensibilité de l’espèce bactérienne aux
conditions environnementales, et suggère également des différences importantes entre les souches.
1.3.2.3.1.1 Bifidobacterium longum ssp. longum R0175
L’une des souches de B. longum documentées dans la littérature est B. longum ssp. longum R0175,
une souche d’origine humaine isolée par Lallemand Solutions Santé (Montréal, Qc). Plusieurs
propriétés modulatrices du système immunitaire lui ont été attribuées (Masotti et al., 2011; Qiuye et
al., 2016; Wagar et al., 2009). Des études in vivo chez des rats et des humains ont également révélé
plusieurs bienfaits sur la santé à la suite de l’ingestion de B. longum R0175 en combinaison avec la
souche Lactobacillus helveticus R0052. Ces études ont notamment démontré des effets modulateurs
du système immunitaire ainsi que des effets bénéfiques sur la santé gastro-intestinale, notamment
via le maintien de l’intégrité de la barrière et la réduction des symptômes gastro-intestinaux causés
par le stress. Des effets psychologiques ont même été prouvés, tels que l’amélioration de l’humeur,
la réduction du stress, et l’atténuation du développement de dépression post-infarctus (Arseneault-
Breard et al., 2012; Diop et al., 2008; Gilbert et al., 2013; Messaoudi et al., 2011).
18
1.3.2.4 Les lactobacilles
Les lactobacilles sont des bacilles Gram positifs anaérobie facultatifs, dont certains font partie du
microbiote intestinal humain. Ce sont des bactéries lactiques mésophiles ou thermophiles et acido-
tolérantes (Vos et al., 2011). Elles sont donc d’excellentes candidates pour la production de laits
fermentés. Certaines sont retrouvées naturellement dans le lait cru et contribuent ainsi à la
fabrication du yogourt maison, telles que L. bulgaricus et L. helveticus (Azadnia Parisa et al., 2011).
De plus, les lactobacilles possèdent des propriétés antimicrobiennes envers plusieurs bactéries
pathogènes ainsi que des propriétés antifongiques (Delavenne et al., 2013; Fooladi et al., 2014; Reis
et al., 2012).
1.3.2.4.1 Lactobacillus helveticus
L’espèce L. helveticus a été décrite pour la première fois en 1919 par Orla-Jensen après avoir été
isolée dans des environnements laitiers (Naser et al., 2006). Il s’agit d’une bactérie thermophile qui
possède une activité protéolytique importante. Son métabolisme fermentatif par voie
homofermentaire permet la conversion des hexoses en acide lactique via l’utilisation de la voie
métabolique Embden-Meyerhof. Toutefois, L. helveticus est une espèce bactérienne fastidieuse
puisqu’elle est auxotrophe pour plusieurs acides aminés, ce qui peut compliquer son incorporation
dans les aliments (Christensen & Steele, 2003; Christiansen et al., 2008; Morishita et al., 1981;
Slattery et al., 2010; Vos et al., 2011).
À cause de son activité protéolytique importante, L. helveticus est traditionnellement utilisée comme
ferment dans la fabrication des fromages suisses et italiens, ou pour ajouter de la saveur à d’autres
types de fromage (Drake et al., 1996; Gatti et al., 2004; Giraffa et al., 2000; Slattery et al., 2010;
Stiles & Holzapfel, 1997). Cette activité protéolytique favorise également la production de peptides
bioactifs, d’où l’intérêt d’utiliser cette bactérie comme probiotique. Cependant, des variations
génétiques entre les systèmes protéolytiques des différentes souches (Broadbent et al., 2011; Gatti
et al., 2004; Jensen et al., 2009; Sadat-Mekmene et al., 2011) font en sorte que les peptides produits
et leurs effets santé varient d’une souche à l’autre. Des peptides ayant des effets anticancer,
immunomodulateurs et antihypertenseurs ont notamment été isolés (Griffiths & Tellez, 2013;
Jauhiainen et al., 2005; Masotti et al., 2011).
19
1.3.2.4.1.1 Lactobacillus helveticus R0052
L’une des souches bien documentées est L. helveticus R0052 qui fut isolée en 1990 par Lallemand
Solutions Santé à partir d’un ferment lactique. La souche fut d’abord identifiée comme Lactobacillus
acidophilus en raison de leurs grandes ressemblances phénotypiques, biochimiques et génétiques.
Ce n’est qu’en 2006 qu’un article fut publié pour révéler l’erreur (Naser et al., 2006). Le séquençage
du génome de R0052 en 2012 a ensuite permis de confirmer certaines particularités génétiques
uniques à cette souche. La présence de gènes codants pour des protéines impliquées dans
l’adhésion à la muqueuse intestinale suggère la capacité de R0052 à persister dans le tractus
intestinal (Tompkins et al., 2012), un atout désirable pour un probiotique.
Plusieurs effets antimicrobiens de la souche L. helveticus R0052 ont déjà été découverts. Elle a entre
autres la capacité de réduire les impacts reliés à la présence d’E. coli O157: H7 dans l’intestin (Jandu
et al., 2009; Johnson-henry et al., 2007; Sherman et al., 2005), produire des substances inhibitrices
contre Staphylococcus aureus, et réduire l’invasion des cellules intestinales par Campylobacter jejuni
(Alemka et al., 2010; Sadowska et al., 2010; Wine et al., 2009). Des effets modulateurs sur le
système immunitaire ont également été observés (Easo et al., 2002; Qiuye et al., 2016; Wallace et
al., 2003).
Comme mentionné précédemment, des études in vivo ont démontré que l’administration de la
combinaison probiotique L. helveticus R0052 et B. longum R0175 procurent plusieurs effets
bénéfiques sur la santé. D’autres études in vivo ont également démontré les bienfaits de l’ingestion
de L. helveticus R0052 avec Lactobacillus rhamnosus R011, un produit probiotique commercialisé
sous le nom de Lacidofil®. La revue de Foster et al. (2011) fais état de la majorité de ces
nombreuses études qui ont démontré notamment des effets antimicrobiens contre plusieurs
pathogènes, des effets modulateurs du système immunitaire, ainsi que des effets bénéfiques sur la
santé gastro-intestinale et vaginale. Une étude plus récente a également démontré les effets
bénéfiques du produit probiotique pour la réduction des diarrhées associées à la prise d’antibiotique
(Evans et al., 2016).
20
1.4 Les contaminants microbiens associés au yogourt
Bien que des contrôles de qualité et de salubrité stricts soient mis en place par les industries
alimentaires, ces dernières ne sont pas entièrement à l’abri des contaminations microbiennes. Les
contaminants peuvent provenir de diverses sources telles que la matière première, les employés,
l’environnement de production, les équipements et les emballages. Les yogourts de type grec ont
notamment un risque de contamination accru dû aux manipulations supplémentaires requises pour
augmenter la teneur en protéines. Les problèmes de contamination peuvent engendrer des pertes
économiques importantes et représenter un danger pour la santé publique. Le gouvernement du
Canada estime que chaque année, 4 millions de Canadiens sont rendus malades par la
consommation d’aliments contaminés (ASPC, 2016). Le lait et les produits laitiers ont été la cause de
3.9% des cas de toxi-infections alimentaires déclarées au Québec au cours de l’année 2012-2013 et
de 3.7% au cours de l’année 2013-2014 (MAPAQ, 2013; 2014). Les principaux contaminants
microbiens associés aux yogourts sont les levures, les moisissures et les bactéries pathogènes.
1.4.1 Les levures et moisissures
Dans les produits laitiers fermentés comme les yogourts, les contaminants les plus susceptibles de
s’y développer sont les levures et moisissures étant donné leur forte tolérance à l’acidité (Fleet, 1990;
Ledenbach & Marshall, 2010). La température de fermentation est généralement trop élevée pour
permettre leur croissance (Salomskiene & Macioniene, 2009), mais certains organismes
psychrotrophes peuvent croître durant l’entreposage (Al-Kadamany et al., 2002; Kavas et al., 2006).
La plupart d’entre eux sont des agents altérants pouvant modifier l’apparence des produits et causer
des défauts de texture et de saveur. Bien qu’ils soient majoritairement inoffensifs pour la santé
(Benedict et al., 2016), des cas d’infections sont déjà survenus chez des personnes
immunodéprimées ayant consommé des produits laitiers contaminés (Gurgui et al., 2011; Pineda et
al., 2012). Toutefois, un seul cas d’éclosion de toxi-infections associées à la consommation de
yogourts contaminés par un mycète a été démontré dans la littérature. Il s’agit du cas des yogourts
de type grec de la compagnie américaine Chobani qui ont fait l’objet d’un rappel en 2013. Plus de
200 personnes avaient alors rapporté être tombées malade suite à la consommation de ces
21
yogourts. L’agent pathogène a été identifié comme étant la moisissure Mucor circinelloides. Cette
dernière peut notamment causer des problèmes gastro-intestinaux, ainsi que la mucormycose, une
infection fongique affectant principalement les personnes immunodéprimées (FDA, 2013; Lazar et
al., 2014; Lee et al., 2014).
1.4.1.1 Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces marxianus est une des levures fréquemment retrouvées dans les produits laitiers
fermentés (Canganella et al., 1998; Corsetti et al., 2001; Fasoli et al., 2015; Gadaga et al., 2001;
Giudici et al., 1996; Kavas et al., 2006; Tofalo et al., 2014; Vardjan et al., 2013; Viljoen et al., 2003).
Elle est d’ailleurs reconnue comme étant une espèce sécuritaire pour la consommation (GRAS), et
peut produire une grande variété de composés volatils aromatiques. Elle peut ainsi contribuer au
développement de la saveur de certains produits laitiers tels que les fromages, ou au contraire altérer
leur saveur par la production d’arômes indésirables (Fabre et al., 1995; Fasoli et al., 2015; Fonseca
et al., 2008; Salomskiene & Macioniene, 2009; Tofalo et al., 2014). Elle peut facilement détériorer les
yogourts grâce à son activité protéolytique importante, sa capacité à assimiler le lactose, sa
croissance rapide et sa capacité à croître aux températures de fermentation et de réfrigération
(Fonseca et al., 2008; Giudici et al., 1996; Lane et al., 2011; Naumova et al., 2012; Rubio-Texeira,
2006; Salomskiene & Macioniene, 2009; Viljoen et al., 2003).
1.4.2 Les bactéries pathogènes
Les bactéries pathogènes sont une préoccupation majeure de l’industrie alimentaire. On retrouve
notamment 19 souches bactériennes parmi les 30 pathogènes responsables de la majorité des cas
de toxi-infections alimentaires au Canada (Thomas et al., 2015; Thomas et al., 2013). Les normes
Canadiennes acceptent un maximum de deux échantillons sur cinq contaminés de 10 à 100
coliformes en usine, et d’une concentration en coliformes maximale de 100 UFC/g de produit en
magasin (CanLII, 2016). Ici, les coliformes jouent un rôle d’indicateur de contamination fécale. De
plus, aucun pathogène, toxine microbienne, substance inhibitrice ou autre contaminant ne doit être
retrouvé dans les produits (CanLII, 2016). Les principales bactéries pathogènes associées à la
22
contamination de produits laitiers sont E. coli O157: H7, Salmonella spp., C. jejuni, Yersinia
enterocolitica, Clostridium botulinum, Staphylococcus spp. et Bacillus cereus (FDA, 2009).
Les yogourts sont toutefois des aliments moins à risque de contamination par les bactéries
pathogènes, notamment grâce à l’effet antimicrobien des cultures lactiques et au faible pH qui ne
sont pas favorables à leur croissance. Des études ont d’ailleurs démontré que les faibles valeurs de
pH ont un effet bactériostatique sur E. coli O157: H7, S. Typhimurium, Shigella flexneri et la forme
végétative de B. cereus (Conner & Kotrola, 1995; Glass et al., 1992; Guraya et al., 1998; Kotz et al.,
1990; Nicolò et al., 2011). Néanmoins, la quantité de cellules nécessaire pour générer une pathologie
peut être très faible pour certaines souches pathogènes (FDA, 2012). Il est donc d’intérêt de
caractériser l’effet des yogourts sur la stabilité des pathogènes durant l’entreposage.
1.4.2.1 Escherichia coli O157: H7
La souche E. coli O157: H7 est un pathogène alimentaire important. Cette bactérie est estimée être
la cause d’environ 73 000 cas de toxi-infections par année aux États-Unis (Rangel et al., 2005) et
d’environ 12 800 cas au Canada (ASPC, 2016). La figure 1.2 démontre le taux d’incidence
d’infections causées par des souches pathogènes d’E. coli au pays au courant des dernières années.
La souche entérohémorragique E. coli O157: H7 cause notamment des désordres gastro-intestinaux,
mais plus sérieusement, des colites hémorragiques et le syndrome hémolytique urémique (Rangel et
al., 2005). Fait préoccupant, cette souche pathogène semble avoir une bonne tolérance à l’acidité et
serait capable de croître entre des pH de 4.5 à 9.0 à 37°C (Benjamin & Datta, 1995; Brudzinski &
Harrison, 1998; Conner & Kotrola, 1995; Dlamini & Buys, 2009; Glass et al., 1992; Guraya et al.,
1998; Jyhshiun et al., 1996; Kim et al., 2015; Large et al., 2005). Son habileté à survivre dans le
yogourt a notamment été démontrée par plusieurs études (Arican & Andic, 2011; Cutrim et al., 2016;
Evrendilek, 2007; Osaili et al., 2013). Une éclosion de cas d’empoisonnements par suite de la
consommation de yogourts contaminés par E. coli O157: H7 est d’ailleurs survenue en Angleterre en
1991 (Morgan et al., 1993).
23
Figure 1.2. Taux d'incidence des sérotypes d'E. coli O157 et d'E. coli non-O157 déclarés à l'Agence de la
Santé Publique du Canada. Tiré de (ASPC, 2017).
1.5 Les protéines laitières
1.5.1 Description et propriétés physicochimiques
Comme mentionné précédemment, le lait est composé de deux types de protéines; les caséines
(±80%) et les protéines sériques (±20%). Les caséines sont des protéines linéaires de structure
secondaire. Elles ne sont donc pas dénaturées sous l’effet de la chaleur. Elles s’associent toutefois
entre elles par des ponts de phosphate de calcium pour former une structure tridimensionnelle
appelée micelle de caséines (Tamime & Robinson, 1999). L’acidification du lait durant la fermentation
cause la dissolution du phosphate de calcium, qui favorise le passage de la phase colloïdale
(micelle) à la phase soluble. Cette dissolution mène à la désagrégation des micelles, puis à la
précipitation et à la coagulation des caséines, formant ainsi un gel. Au point isoélectrique des
caséines, qui se situe autour du pH 4.6, tout le phosphate de calcium se trouve sous forme soluble
(Lapointe-Vignola, 2002).
24
Les protéines sériques sont quant à elles des protéines globulaires de structure tertiaire. Elles
peuvent ainsi être dénaturées lors d’un traitement thermique supérieur à 75°C. À plus de 90°C, des
ponts disulfures permettent la liaison de la protéine sérique β-lactoglobuline à la caséine κ (figure
1.3), ce qui augmente le volume des micelles de caséines et la viscosité du lait (Lapointe-Vignola,
2002; Mottar et al., 1989).
Figure 1.3. Liaison des protéines suite au traitement thermique. Tiré de (Lapointe-Vignola, 2002).
En plus de procurer un apport nutritionnel supérieur, la teneur élevée en protéines des yogourts de
type grec a plusieurs effets. Elle modifie notamment les propriétés physicochimiques du yogourt, et
peut affecter les cultures microbiennes ainsi que les propriétés sensorielles.
1.5.2 Influence des protéines sur les propriétés physicochimiques du yogourt
Les protéines laitières ont une grande influence sur les propriétés physicochimiques du yogourt.
D’abord, les liaisons entre protéines régissent la viscosité et la force du gel (Tamime & Robinson,
1999). Ainsi, une densité en protéines plus élevée augmente la quantité de liaisons protéiques, ce
qui donne un yogourt plus visqueux et plus ferme (Harwalkar & Miloslav, 1986; Kilara & Chandan,
2013).
25
Les caséines, avec les minéraux et le citrate, sont les principaux régisseurs du pouvoir tampon d’un
produit laitier (Li & Corredig, 2014; Lucey et al., 1993; Salaun et al., 2005). Une concentration élevée
de ces constituants augmente ainsi le pouvoir tampon. Dans le cas d’un yogourt, un pouvoir tampon
élevé signifie qu’une plus grande quantité d’acide lactique doit être produite par les bactéries
lactiques pour abaisser le pH. Cela peut se traduire par une fermentation plus longue pour atteindre
un pH final de 4.6, et par un ralentissement de la baisse de pH qui survient normalement durant
l’entreposage des yogourts (Kilara & Chandan, 2013).
Les protéines ont aussi un impact sur la synérèse, définie comme l’expulsion du lactosérum à la
surface du yogourt. L’augmentation des solides totaux, et par le fait même des protéines, permet de
réduire la synérèse. En effet, le lactosérum du gel est retenu dans les pores formés par les
associations de chaînes de caséines. L’augmentation de la concentration en protéines permet
d’augmenter la densité de la matrice par des associations protéiques plus nombreuses et plus
serrées. Cela entraîne une meilleure capacité de rétention du lactosérum (Amatayakul et al., 2006;
Harwalkar & Miloslav, 1986).
1.6 Les procédés de concentration des protéines
Pour obtenir un yogourt HTP, une étape de concentration des protéines est requise. Cela peut être
fait par ajout d’ingrédients laitiers ou par la séparation physique des composants.
1.6.1 Concentration par ajout d’ingrédients laitiers
La teneur en protéines du lait peut d’abord être augmentée à l’étape de la standardisation par ajout
d’ingrédients laitiers en poudre. Deux grandes catégories de produits peuvent être utilisées. D’abord,
les poudres entières à faible taux protéique qui ne nécessitent pas de procédé de séparation majeur
avant séchage, telles que les poudres de lait écrémé et de lactosérum. Ensuite, les poudres à plus
forte teneur en protéines nécessitant des procédés de séparation plus complexes, telles que les
concentrés et isolats de protéines.
26
1.6.1.1 Les poudres de lait écrémé
La poudre de lait écrémé est traditionnellement utilisée pour standardiser les bases laitières
destinées à la fabrication du yogourt. Elle a une teneur en protéines se situant autour de 35%
(tableau 1.5). Comme son nom l’indique, celle-ci est produite par séchage de lait écrémé. L’ajout de
poudre de lait écrémé entraîne ainsi une augmentation proportionnelle de la concentration de tous
les constituants du lait, à l’exception de l’eau et du gras (O'Kennedy, 2011; Ozer et al., 1999a). Ainsi,
l’ajout de cette poudre mène à une augmentation du pouvoir tampon puisque la teneur en minéraux
et protéines augmente (voir explication à la section 1.5.2). Le temps de fermentation requis pour
atteindre le pH final allonge donc avec le niveau de poudre de lait ajouté (Damin et al., 2009).
Toutefois, à concentration protéique égale, la viscosité et la force du gel d’un yogourt enrichi avec de
la poudre de lait écrémé sont inférieures à celles de yogourts obtenus par séparation physique du
liquide, comme par ultrafiltration et égouttage (Ozer et al., 1999a). L’utilisation de quantité importante
de poudre de lait écrémé peut également causer des problèmes de sur-acidification durant
l’entreposage à cause de la forte teneur en lactose, et mener au développement d’arrière-goûts
poudreux (Karam et al., 2013; Tamime & Robinson, 1999).
Tableau 1.5. Composition moyenne de la poudre de lait écrémé et de la poudre de lactosérum.
Composant Poudre de lait
écrémé Poudre de
lactosérum doux Poudre de
lactosérum acide
Protéines (%) 36 12.8 12.3 Lactose (%) 51 69 66 Gras (%) 1 1.3 1.0 Calcium (%) 1.3 0.7 2.2
(Huffman & De Barros Ferreira, 2011; Lapointe-Vignola, 2002)
La poudre de lactosérum peut également être utilisée pour standardiser le lait. Deux types de
lactosérum peuvent être obtenus en fonction de la méthode utilisée pour coaguler le lait. Le premier
est le lactosérum doux qui résulte de l’utilisation de présure (ex : fromages et caséine-présure), et le
deuxième est le lactosérum acide qui dérive de l’acidification du lait (ex : fromage cottage, yogourt de
type grec, caséines acides). La composition de la poudre de lactosérum peut ainsi grandement varier
en fonction de son origine (Tableau 1.5) (Huffman & De Barros Ferreira, 2011).
27
Quelques études ont comparé l’utilisation de la poudre de lait écrémé et de la poudre de lactosérum,
à relativement faible quantité (moins de 5% de protéines), pour la standardisation du lait destiné à la
production de yogourt (De Brabandere & De Baerdemaeker, 1999; González-Martínez et al., 2002).
Toutefois, on retrouve très peu d’informations quant à l’impact des différents types de poudres de
lactosérum sur le yogourt et encore moins sur l’utilisation de celles-ci en quantité importante. Leur
faible teneur en protéines et leur forte teneur en lactose pourraient expliquer le manque d’intérêt pour
ces poudres dans la fabrication de yogourt HTP.
1.6.1.2 Les concentrés et isolats protéiques
Des poudres de concentrés ou d’isolats de protéines laitières peuvent aussi être utilisées pour
enrichir le lait en protéines. Les isolats ont une teneur en protéines de 90% et plus, alors que celle
des concentrés varie sous les 90%. Différents procédés permettent de produire une grande variété
de produits. Le tableau 1.6 présente les principaux types de concentrés et d’isolats de protéines
laitières retrouvés sur le marché.
Tableau 1.6. Concentrés et isolats de protéines laitières principalement retrouvés sur le marché.
Produits de caséines Produits de lactosérum Produits de lait
▪ Caséine micellaire ou phosphocaséine (MC)
▪ Caséinate de sodium (NaCn)
▪ Caséinate de calcium (CaCn)
▪ Caséine acide ▪ Caséine présure
▪ Concentré de protéines de lactosérum (WPC)
▪ Isolat de protéines de lactosérum (WPI)
▪ Concentré de protéines de lait (MPC)
▪ Isolat de protéines de lait (MPI)
(Huffman & De Barros Ferreira, 2011; O'Kennedy, 2011)
De par les différents modes de production, ces ingrédients laitiers possèdent des teneurs variables
en composants du lait, ainsi que différents types de protéines. Chacune de ces poudres aura donc
un impact différent sur la composition du yogourt produit (Huffman & De Barros Ferreira, 2011;
O'Kennedy, 2011).
28
Certaines poudres peuvent ainsi causer une augmentation du pouvoir tampon menant à une
réduction de la vitesse d’acidification durant la fermentation, alors que d’autres peuvent faire l’effet
inverse (Peng et al., 2009). La composition des poudres influence également les propriétés
texturales et rhéologiques du yogourt. De façon générale, ces propriétés semblent tout de même être
améliorées lorsque des poudres protéiques sont utilisées pour standardiser le lait plutôt que de la
poudre de lait écrémé (Marafon et al., 2011; Peng et al., 2009; Unal & Akalin, 2013). Plusieurs
poudres protéiques semblent également améliorer la croissance et la survie des cultures lactiques et
des probiotiques dans le yogourt (Akalin et al., 2007; Antunes et al., 2005; Bury et al., 1998; Dave &
Shah, 1998; Gomes & Malcata, 1999; Prasanna et al., 2012a; Unal & Akalin, 2013).
La majorité des études portant sur l’utilisation des poudres protéiques dans le yogourt ont toutefois
été faites avec des yogourts réguliers. Il y a donc très peu d’information quant à l’utilisation de celles-
ci en proportions plus importantes pour la fabrication de yogourt HTP. Certaines études suggèrent
qu’une forte quantité de poudres protéiques pourraient causer des défauts de saveur et des défauts
de texture comparativement aux procédés de concentration par séparation (Bong & Moraru, 2014;
Unal & Akalin, 2013).
1.6.2 Concentration par séparation
La concentration en protéines peut aussi être effectuée par des procédés de séparation physique.
Ceux-ci visent à retirer une partie de l’eau contenue dans le lait avant l’inoculation des ferments, ou
une partie du lactosérum du caillé après la fermentation. Trois principaux procédés sont utilisés pour
la fabrication des yogourts HTP; l’égouttage, la centrifugation et l’ultrafiltration.
1.6.2.1 L’égouttage
L’égouttage est la méthode traditionnelle. Le caillé résultant de la fermentation est mis dans un sac
de tissus de type coton-fromage. Le sac est ensuite suspendu pour laisser le lactosérum s’écouler
sous l’influence de la force gravitationnelle, ou pressé pour accélérer l’écoulement (Annexe 1). Ce
procédé donne un yogourt concentré en protéines avec d’excellentes propriétés de viscosité et de
fermeté. Toutefois, la perte de résidus dans les sacs et la durée requise pour atteindre un taux
29
protéique près de 10% (12 à 48h), font en sorte que cette méthode n’est pas rentable pour une
production à grande échelle (Kilara & Chandan, 2013; Ozer & Robinson, 1999; Ozer et al., 1999a).
De plus, il s’agit d’une technique pour laquelle il est difficile d’assurer un niveau d’hygiène élevé, ce
qui augmente les risques de contamination, notamment par les levures (Al-Kadamany et al., 2002;
Kavas et al., 2006). D’autres méthodes mieux adaptées à la production industrielle ont donc été
développées, telles que la centrifugation et l’ultrafiltration.
1.6.2.2 La centrifugation
La centrifugation est appliquée sur le caillé après la fermentation et permet de retirer une partie du
lactosérum sous l’effet de la force centrifuge. Pour se faire, une centrifugeuse de type « spray-
nozzle » est utilisée (Annexe 1), suivant la même technique que pour la fabrication des fromages
frais de type quarg (Kilara & Chandan, 2013).
Une étape de thermisation supplémentaire peut également être effectuée avant la centrifugation.
Cela permet de dénaturer davantage de protéines sériques pour qu’une quantité supérieure se lie
avec les caséines, réduisant ainsi la perte de protéines dans le lactosérum lors de la centrifugation
(Robinson, 2012; Tamime, 2008). Toutefois, un tel chauffage peut affecter négativement la viabilité
des cultures bactériennes, notamment celle des probiotiques.
La centrifugation est une méthode de production très efficace et facile d’emplois en industrie. Elle
génère cependant du lactosérum acide, un sous-produit problématique pour l’environnement qui est
également généré lors de la fabrication de certains fromages (Prazeres et al., 2012). La popularité
des yogourts de types grec a mené à une génération grandissante de ce co-produit problématique
(Elliott, 2013). La récupération et la valorisation du lactosérum acide font présentement l’objet de plus
en plus d’études (Chandrapala et al., 2016; Uduwerella et al., 2017).
30
1.6.2.3 L’ultrafiltration
Quatre types de filtration par membranes peuvent être utilisés dans l’industrie laitière selon le besoin.
La figure 1.4 résume les caractéristiques de chacun de ces types. L’ultrafiltration, qui permet une
concentration des macromolécules par le retrait d’eau, de certains ions, de minéraux et de sucres
(Tetra Pak, 2003), est le type de filtration utilisée pour produire les yogourts HTP.
Figure 1.4. Types de filtration par membrane utilisés dans l’industrie laitière. Tiré de (Tetra Pak, 2003).
31
L’ultrafiltration peut être appliquée sur le lait ou sur le caillé après la fermentation. Elle s’effectue au
travers d’une membrane possédant des pores de 10-1-10-2 µm, à une pression transmembranaire
variant de 1 à 10 bar (Tetra Pak, 2003). Le type de système le plus couramment utilisé est
l’ultrafiltration tangentielle avec des membranes pouvant retenir des constituants de poids
moléculaire de 10 kDa et plus (Annexe 1). Cela permet ainsi une forte rétention des protéines
laitières qui, mis à part de certaines protéoses-peptones, ont des poids moléculaires nettement
supérieurs à 10 KDa (Brazuelo et al., 1995; Rinaldoni et al., 2009a; Rinaldoni et al., 2009b). Les
globules de gras, vitamines liposolubles, bactéries, levures et moisissures (si présentes) sont aussi
retenus par la membrane (Tetra Pak, 2003). Le poids moléculaire des glucides étant beaucoup plus
faible que la taille des pores, le lactose devrait être perdu avec le lactosérum. Toutefois, la rétention
du lactose dépend des conditions d’opération. À forte pression et faible taux de recirculation,
l’encrassement de la membrane est supérieur, ce qui retient davantage le lactose. Les minéraux sont
quant à eux répartis entre le rétentat et le filtrat selon leur charge et leurs associations. Il y a
notamment une concentration du calcium colloïdal et du fer dans le rétentat (Brazuelo et al., 1995;
Rinaldoni et al., 2009a).
Étant donné la différence de composition entre un lait régulier et un lait ultrafiltré, les yogourts
résultant d’une ultrafiltration effectuée sur le lait avant la fermentation et ceux résultant d’une
ultrafiltration effectuée sur le yogourt après la fermentation ont des propriétés physicochimiques
différentes. Ainsi, avec une concentration supérieure en protéines et en minéraux, le lait ultrafiltré a
un pouvoir tampon plus élevé que le lait régulier (Li & Corredig, 2014; Lucey et al., 1993). Les
yogourts faits de lait ultrafiltré ont quant à eux une viscosité plus élevée et un gel plus ferme que les
yogourts faits de lait régulier (Kilara & Chandan, 2013). Par contre, un yogourt produit par
ultrafiltration ayant une concentration en solides totaux de 16% et plus (soit plus de 11.8% de
protéines) a tendance à présenter des défauts de texture et de goût (Biliaderis et al., 1992).
Plusieurs différences entre l’ultrafiltration appliquée sur le lait écrémé avant la fermentation et sur le
caillé après fermentation ont été observées. Durant l’ultrafiltration du caillé, les bactéries du ferment
sont concentrées. Les comptes finaux de S. thermophilus sont ainsi supérieurs à ceux obtenus
lorsque l’ultrafiltration est effectuée sur le lait avant l’inoculation des cultures. Toutefois, les comptes
finaux de L. bulgaricus sont similaires dans les deux cas (Ozer & Robinson, 1999). Par ailleurs, les
32
temps de génération des cultures sont plus courts lorsqu’elles croissent dans un lait préalablement
concentré (Brazuelo et al., 1995). Les propriétés sensorielles globales du yogourt sont quant à elles
supérieures lorsque l’ultrafiltration est effectuée sur le caillé, notamment parce que le niveau
d’acétaldéhyde y est plus élevé (Ozer & Robinson, 1999) et que le niveau d’acide lactique y est plus
faible (Kilara & Chandan, 2013). Au niveau des propriétés physicochimiques, Ozer et al. (1999a) ont
observé qu’un yogourt issu de l’ultrafiltration du lait a une viscosité similaire à celle d’un yogourt
produit par égouttage, alors que la viscosité d’un yogourt résultant de l’ultrafiltration du caillé est
nettement inférieure. Toutefois, aucune différence significative n’a été observée au niveau de la force
du gel des yogourts issus des deux techniques d’ultrafiltration.
33
Chapitre 2 : Problématique, but, hypothèse et
objectifs
2.1 Problématique
La majorité des études qui portent sur la croissance et la survie des microorganismes dans le
yogourt ont été effectuées avec des yogourts réguliers fermes ou brassés. D’un autre côté, les
études portant sur les yogourts de type grec comparent davantage l’impact des procédés de
fabrication sur les propriétés rhéologiques et sensorielles des yogourts. Ainsi, très peu d’études ont
analysé l’effet des procédés de production sur les différentes communautés microbiennes des
yogourts de type grec, telles que les cultures lactiques, les probiotiques et les contaminants
microbiens.
2.2 But
Comparer deux procédés de fabrication de yogourt de type grec (centrifugation et ultrafiltration) à
une fabrication classique de yogourt brassé, quant à leur impact sur les comptes de probiotiques, de
ferments et de contaminants microbiens potentiels durant l’entreposage.
2.3 Hypothèse
L’utilisation de l’ultrafiltration ou de la centrifugation pour la production des yogourts de type grec
permettra d’obtenir des produits au pouvoir tampon élevé, et par le fait même, ayant des populations
plus élevées et plus stables de cultures lactiques et probiotiques, mais améliorera également la
survie des contaminants microbiens fongiques et bactériens durant l’entreposage, comparativement
à un yogourt brassé régulier.
34
2.4 Objectifs
1) Produire trois types de yogourt par trois procédés de fabrication distincts :
a. Yogourt de type grec par ultrafiltration du lait (GS-UF)
b. Yogourt de type grec par centrifugation du caillé (GS-CF)
c. Yogourt brassé régulier (Contrôle).
2) Suivre les populations des cultures lactiques du ferment et de deux souches probiotiques
lors de la fabrication et de l’entreposage des trois types de yogourt.
3) Suivre les populations de deux contaminants microbiens potentiels dans les trois types de
yogourt durant l’entreposage.
4) Analyser la composition et les propriétés physicochimiques des yogourts en début et fin
d’entreposage.
35
Chapitre 3: Impact of production processes on
starter and probiotic bacteria in Greek-style yogurt
during storage
Andréanne Moineau-Jean 1,2, Claude P. Champagne 2,3, Denis Roy 1,2, Yves Raymond 3, Gisèle
LaPointe 2,4
1 Department of Food Science, Pavillon Paul-Comtois, Office 1312, 2425 rue de l’Agriculture, Laval University,
Quebec City, QC, G1V 0A6, Canada
2 Institute of Nutrition and Functional Foods (INAF), Pavillon des Services, 2440 Hochelaga Blvd, Laval
University, Quebec City, QC, G1V 0A6, Canada
3 Saint-Hyacinthe Research and Development Centre, Agriculture and Agri-food Canada (AAFC), 3600
Casavant Blvd West, Saint-Hyacinthe, QC, J2S 8E3, Canada
4 Department of Food Science, 50 Stone Road East, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada
Corresponding Author: Dr. Claude P. Champagne Saint-Hyacinthe Research and Development Center Agriculture and Agri-Food Canada 3600 Casavant Blvd West, Saint-Hyacinthe, Qc J2S 8E3, Canada Phone number: 450-768-9611 [email protected]
Key words: ultrafiltration, centrifugation, high protein content, probiotics, Greek-style yogurt
36
3.1 Résumé
Durant la production des yogourts de type grec, plusieurs procédés peuvent être utilisés pour
augmenter la teneur en protéines du lait ou du caillé. Toutefois, il y a une méconnaissance de
l’impact de ces procédés sur la survie des bactéries probiotiques. Le but de cette étude était de
comparer les populations des ferments lactiques et des souches probiotiques Bifidobacterium
longum ssp. longum R0175 et Lactobacillus helveticus R0052 lors de la fabrication et de
l’entreposage de yogourts de type grec produits par centrifugation (GS-CF) ou ultrafiltration (GS-UF),
à un yogourt brassé régulier. Des dénombrements bactériens (UFC et cytométrie de flux) ainsi que
des analyses physicochimiques (oxygène dissous, pH, sucres, acides, fractions azotées et synérèse)
ont été effectués durant l’entreposage à 4°C. Les produits grecs frais (GS-UF et GS-CF) avaient des
comptes de L. helveticus R0052 et S. thermophilus de 3 à 7 fois supérieurs au produit Contrôle. La
matrice du yogourt grec fabriqué par centrifugation (GS-CF) a également permis d’obtenir une
meilleure stabilité du probiotique R0052 durant l’entreposage. Toutefois, aucun des procédés testés
n’a pu améliorer la survie de B. longum R0175. Des différences de composition ont également été
observées entre les trois types de yogourt durant l’entreposage. Les teneurs les plus élevées en
lactose et en acide citrique ont été obtenues dans le yogourt Contrôle, alors que les plus faibles ont
été obtenues dans le yogourt GS-UF. L’effet inverse a été observé avec l’acide lactique et l’azote
alpha-aminé. La teneur en galactose était supérieure dans le yogourt GS-UF tandis qu’elle était
identique entre les yogourts GS-CF et Contrôle. Les teneurs en glucose étaient pour leur part
identiques dans les trois types de yogourt.
37
3.2 Abstract
During production of Greek-style yogurt, several processes can be used to increase the protein
content of the milk or the curd. However, knowledge is lacking on how these processes impact the
survival of probiotic bacteria. The aim of this study was to compare populations of yogurt starters and
probiotic strains of Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 and Lactobacillus helveticus R0052
during manufacture and storage of Greek-style yogurt produced by centrifugation (GS-CF) or
ultrafiltration (GS-UF), to a regular stirred yogurt. Bacterial counts (CFU and flow cytometry) and
physicochemical analyses (dissolved oxygen, pH, acids, sugars, nitrogenous fractions and syneresis)
were made during storage at 4°C. Fresh Greek-style products (GS-UF and GS-CF) had between 3 to
7 times higher counts of L. helveticus R0052 and S. thermophilus than the Control. The matrix of the
Greek-style yogurt produced by centrifugation (GS-CF) allowed a better stability of the probiotic
strains R0052 during storage. However, none of the production processes studied could improve the
viability of B. longum R0175. Differences of composition were also observed between the three
yogurt types during storage. The highest lactose and citric acid contents were obtained in the Control
yogurt while the lowest were obtained in the GS-UF yogurt. The opposite effect was observed for
lactic acid and alpha amino-acid contents. Galactose content was higher in the GS-UF product while
it was the same between the GS-CF and Control products. Nevertheless, glucose contents were
identical between the three yogurt types.
38
3.3 Introduction
High protein yogurts are consumed worldwide, with differences of composition and denominations,
depending on the place of origin. These strained yogurts are best known as Greek-style yogurts in
North America and are characterized by protein content usually around 9% to 10%. Their creamy
texture and their natural, nutritive and low-fat claims have made them very popular in the past few
years (Wouters, 2012). Traditionally, the total solids content of these yogurts was increased by
straining in a cloth bag. Concentration of the curd can now be realized more efficiently by
centrifugation (Tamime & Robinson, 2007). Other techniques, such as addition of dry milk ingredients
or ultrafiltration of milk preceding fermentation, can also be used to increase the protein content. The
method used for Greek-style yogurt production will define the composition of the final product (Ozer
et al., 1999a; Ozer et al., 1999b).
Yogurts containing probiotic bacteria are also quite popular in Europe and North America. Probiotic
bacteria are added to enhance the healthiness of the yogurt. To have a bioactive impact on the host,
it is considered that, in most cases, a minimal number of living probiotic cells must be able to reach
the intestine. No universal number of probiotic cells guarantee efficacy. However, some regulatory
agencies require that a billion cells per portion must be present in the food product (Hill et al., 2014;
Santé Canada, 2009a), even at the best-before date (CFIA, 2016). Thus, probiotics must survive
during the production and storage of the carrier product. Fermentation conditions, yogurt composition
and storage temperature, are three factors known to have an impact on cell survival (Abe et al., 2009;
Akalin et al., 2007; Champagne et al., 2005). However, microbiological studies of Greek-style yogurt
containing probiotics are not frequent and little is known about the influence of this yogurt type on the
growth and survival of probiotic bacteria during manufacture and storage.
Probiotics added to yogurt are generally lactobacilli and bifidobacteria. This study examined cultures
of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 as probiotic
adjuncts in Greek-style yogurt. These species often utilize as probiotic are recognized for their health
attributes. Several studies even demonstrated beneficial effects from the consumption of those two
specific strains in combination (Arseneault-Breard et al., 2012; Diop et al., 2008; Gilbert et al., 2013;
Messaoudi et al., 2011; Ten Bruggencate et al., 2015).
39
Studies on the species B. longum reported positive effects on health related to antibiotic-associated
diarrhea, lactose intolerance, infections, cancer and immune system modulation (Leahy et al., 2005;
Masotti et al., 2011; Wagar et al., 2009). The species L. helveticus is a lactic acid bacterium (LAB)
often utilizes as probiotic in yogurt, as well as in the production of several kinds of cheeses ( Drake et
al., 1996; Gatti et al., 2004; Giraffa et al., 2000; Slattery et al., 2010; Stiles & Holzapfel, 1997). This
probiotic produces bioactive peptides from milk proteins because of its high proteolytic activity
(Griffiths & Tellez, 2013; Savijoki et al., 2006). Several strains have been found to produce peptides
with immunomodulatory, anti-cancer, calcium binding, and antihypertensive activities (Griffiths &
Tellez, 2013; Jauhiainen et al., 2005; Masotti et al., 2011; Taverniti & Guglielmetti, 2012). The strain
L. helveticus R0052, also has antimicrobial properties (Griffiths & Tellez, 2013; Jandu et al., 2009;
Johnson-henry et al., 2007; Wine et al., 2009).
Studies about survival of probiotic bacteria in yogurt have been done mostly with regular stirred or set
yogurt. Therefore, data on the effect of protein concentration and production processes of Greek-
style yogurt on viable counts during storage are still unknown. The addition of whey proteins or
caseins in several forms is known to promote the growth and viability of some LAB and bifidobacteria
as B. longum (Akalin et al., 2007; Antunes et al., 2005; Bury et al., 1998; Dave & Shah, 1998; Gomes
& Malcata, 1999; Ibrahim & Bezkorovainy, 1994; Kailasapathy & Supriadi, 1996; Prasanna et al.,
2012a; Qingli et al., 2013). Moreover, the increased buffering capacity of milk containing higher
protein content (Li & Corredig, 2014; Lucey et al., 1993; Salaun et al., 2005), contributes to
maintaining higher pH values in a fermented dairy product (Kailasapathy & Supriadi, 1996). Thus,
knowledge about milk proteins suggests that Greek-style yogurts produced by centrifugation or
ultrafiltration could improve probiotic bacteria survival and stability in comparison with regular stirred
yogurt. The aim of this study was to compare the fate of two probiotic bacterial strains (B. longum
R0175 and L. helveticus R0052) in two Greek-style yogurts, resulting from ultrafiltration or
centrifugation, and in a regular stirred yogurt at the end of fermentation and during storage.
40
3.4 Materials and methods
3.4.1 Microorganisms and media
Two probiotic bacterial strains, B. longum R0175 and L. helveticus R0052, were used for this study.
The cultures were obtained freeze-dried from Lallemand Health Solutions (Montreal, QC, Canada)
and stored at 4°C. Their populations were determined individually by the pour plate technique in BD
Difco™ MRS agar (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) with 72 h incubation at 37°C in an
anaerobic chamber. Precisely, dried cultures were rehydrated 1:10 in a 37°C-preheated broth made
of BD Bacto™ Peptone (BD Diagnostic Systems), Tween® 80 (Sigma-Aldrich Canada Co., Oakville,
ON, Canada), sodium ascorbate (Sigma-Aldrich Canada Co) and L-cysteine (Sigma-Aldrich Canada
Co). A homogenization was carried out at 27,000 rpm for 30 seconds with an Omni THQ
Homogenizer (Omni International, Kennesaw, GA, USA), followed by incubation at 37°C for 15 min.
Ten-fold dilutions were made in 1% peptone water, the first one being homogenized again.
A commercial mix of slime-producing yogurt cultures was used as a starter (see culture selection in
Appendix 2). The YO-MIX® T11 yogurt cultures was obtained freeze-dried from DuPont Nutrition &
Health (Mississauga, ON, Canada). The populations were determined by the pour plate technique
following the same method used for the probiotic strains. BD Difco™ M17 agar (BD Diagnostic
Systems, Sparks, MD, USA) was used for the enumeration of Streptococcus thermophilus. MRS
agar, in which glucose was substituted by fructose as carbon sources, was used for the enumeration
of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. The plates were incubated at 37°C for 48 h in aerobic
condition for the S. thermophilus and at 45°C for 48 h in an anaerobic chamber for L. bulgaricus (see
development of selective methods in Appendix 2).
3.4.2 Milk preparation
A low heat cow skim milk powder (Dairytown Processing Ltd, Studholm, NB, Canada) was rehydrated
in a pilot plant facility to prepare two different milk solutions. The first solution was prepared to obtain
a 4.0% protein content (Milk 1) and was stored overnight at 4°C. For the second solution, skim milk
powder was rehydrated to obtain a 3.1% protein content. The 3.1% solution was then pasteurized
41
(75°C for 18 seconds) and ultrafiltrated (50°C, 30 psi, 4-6 m/s) to obtain a final solution with 10.6%
protein content (Milk 2). A precautionary pasteurization step was carried out prior to ultrafiltration to
ensure microbiological quality of the milk, as the batch process applied during ultrafiltration could
have allowed limited bacterial growth. The ultrafiltration system was equipped with 50-PM Romicon
Hollow Fiber Cartriges (Koch Membrane Systems, Wilmington, MA, USA) with a 50,000 Da cut-off.
Both milk solutions were finally stored at -20°C in 4-L plastic buckets for use in subsequent
experiments. The protein contents of the milk solutions were confirmed with a MilkoScan™ FT-120
Analyzer (Foss, Hilleroed, Denmarke) and a Vario Max Cube Analyzer (Elementar, Langenselbold,
Germany).
The buffering capacity of the milk solutions was obtained by measuring the amount of 0.1 N HCl
required to reduce the initial pH level of the sample to pH 4.0. Three repetitions of the analyses were
made for each milk solution.
3.4.3 Yogurt production for the smoothing process assays
To measure the impact of the mechanical smoothing process on the probiotics survival during
storage, three regular stirred yogurts exposed to different treatments were produced for each
probiotic strain. The treatments consisted in different combinations of inoculation moment and
smoothing step (Table 3.1).
Table 3.1. Treatments performed on regular stirred yogurt to test the impact of the smoothing process on
probiotics survival.
Yogurt Treatment description
A Starter and probiotic inoculation → Fermentation → Storage B Starter and probiotic inoculation → Fermentation → Smoothing → Storage C Starter inoculation → Fermentation → Smoothing → Probiotic inoculation → Storage
More specifically, 3 L of 4.0% protein milk was thawed at 4°C and heat treated (90°C, 10 min) in an
autoclave operated in isotherm program. The milk was then cooled to 40°C and separated in three
sanitized plastic buckets into 1 L fractions. The starter was directly added to the milk solutions with an
42
inoculation rate of 3 x 107 CFU/mL (count based on S. thermophilus). For yogurts A and B, one
probiotic strain (B. longum R0175 or L. helveticus R0052) was added simultaneously with the starter
at a concentration of 1 x 107 CFU/mL. Fermentation was performed at 40°C in a Fermentation
Acquisition and Control System (FACS) (Agriculture and Agri-Food Canada, Saint-Hyacinthe, QC,
Canada) that allows continuous measurements of temperature and pH. Cooling to 18°C was initiated
to stop the fermentation when the pH values had dropped to approximately 4.7. Yogurt A was
immediately separated into 100-mL plastic containers and stored at 4°C for 16 days.
Yogurts B and C were first smoothed with a two-speed hand-held blender (KitchenAid, Mississauga,
ON, Canada) equipped with a sanitized removable 8-inches blending arm having a fixed blade. The
blender was operated at maximum speed for 30 seconds during which circular movements were
carried out to reach all portions of the curd. One probiotic strain (B. longum R0175 or L. helveticus
R0052) was slowly incorporated to yogurt C with a sterile spoon in a concentration of 1 x 107
CFU/mL. Yogurts were finally separated into 100-mL plastic containers and stored at 4°C for 16
days.
Four samplings were made during the 16 days of storage at 4°C. For each sampling, a 100-mL
container was opened and three analyses were carried out; the pH, the level of dissolved oxygen
(DO2) and the viable counts of probiotic bacteria. The DO2 level in the yogurt gel was measured with
an YSI Model 85 Handheld Oxygen, Conductivity, Salinity, and Temperature System (Yellow Springs,
OH, USA). The pH level was measured with a portable pH-meter (Oakton Instruments, Vernon Hills,
IL, USA) equipped with a Fisher Scientific™ Accumet™ refillable glass pH electrode (Fisher
Scientific, Ottawa, ON, Canada). Viable counts were carried out as described in section 3.4.5.1.
3.4.4 Yogurt production for Greek-style yogurt analyses
3.4.4.1 Basic production steps for regular stirred yogurt and Greek-style yogurts
Both milk solutions (9 L of Milk 1 and 3 L of Milk 2) were thawed at 4°C and heat treated (90°C, 10
min) in an autoclave operated in isotherm program. After heat treatment, the milk solutions were
cooled to 40°C and separated in sanitized plastic buckets into 3 L fractions. The starter and one
43
probiotic strain (B. longum R0175 or L. helveticus R0052) were directly added to the milk solutions
with inoculation rates of 3 x 107 CFU/mL for the starter (count based on S. thermophilus), and 1 x 107
CFU/mL for the probiotics (see selection of inoculation rates in Appendix 2). The fermentation was
performed at 40°C in the FACS. When the pH values had dropped to approximately 4.7, cooling to
18°C was initiated. At the end, two types of yogurt were obtained; regular stirred yogurt (Control) and
Greek-style ultrafiltered yogurt (GS-UF).
A portion of 6 L of the Control yogurt was distributed in 1-L polypropylene bottles to be centrifuged at
8000 x g for 15 min at 18°C (Beckman Coulter Avanti™ J-20XPI centrifuge with a JLA 8.100 rotor).
The concentrated curds were pooled and the whey was used to adjust the protein concentration at
10% (see development of centrifugation method in Appendix 2). The Greek-style centrifuged yogurt
(GS-CF) was then obtained.
3.4.4.2 Production steps specific to yogurts containing Bifidobacterium longum subsp.
longum R0175
For yogurts containing B. longum R0175, preliminary experiments (data not shown), where the three
yogurt types were produced using the same methodology as described in section 3.4.4.1, showed a
fast decrease of the probiotic counts during storage which could potentially be linked to pH.
Consequently, for the yogurts containing B. longum R0175, the pH was adjusted to 4.65 ± 0.05 with
a 25% lactic acid solution. The purpose of this step was to obtain uniform pH values between
products at the beginning of the storage, as the pH is known to affect probiotics viability during
storage (Lankaputhra et al., 1996). They were then mixed with a sterile spoon, separated into 100 mL
samples in small plastic containers and stored in a 4°C refrigerated room. Probiotic counts were
followed during storage only until 14 days as the same preliminary experiments showed that CFUs
were too low to have accurate counts exceeding that storage period. For the same reason,
compositional and sensory analyses were not conducted on yogurts containing B. longum R0175.
3.4.4.3 Production steps specific to yogurts containing Lactobacillus helveticus R0052
For yogurts containing L. helveticus R0052, a different approach was taken. The pH was not adjusted
to have a real picture of the direct impact of processes on pH, bacterial cultures, metabolites and
44
aromas of yogurts. Moreover, as sensory analyses were being performed on yogurts containing L.
helveticus R0052, an industrial smoothing step was added to limit breakdown of the texture. Then,
when the temperature of the yogurts reached 18°C during the cooling step, smoothing was carried
out on 3 L batches of products. The blended yogurts were then separated into 100 mL samples in
small plastic containers and stored at 4°C for 44 days.
3.4.5 Bacterial enumeration
3.4.5.1 Plating technique
For bacterial enumeration, 11 g of samples were taken from the 100-mL cups after a gentle mixing of
the yogurt curd with a sterile spoon. The sample was put in a Fisherbrand™ Lab Blender
polyethylene bag (Ottawa, ON, Canada) and 1% peptone-citrate trisodium buffer (99 mL) was added.
The sample was homogenized (1 min, 230 rpm) in a Stomacher® 400 Circulator (Seward, Worthing,
UK). Ten-fold dilutions were done in 1% peptone water and 1 mL of the appropriate dilutions was
plated using the pour plate method. The first dilution was homogenized at 27,000 rpm for 30 seconds
with an Omni THQ Homogenizer (Omni International, Kennesaw, GA, USA). The conditions used for
selective enumeration of each bacterial strain are presented in Table 3.2. The development of the
selective enumeration methods is presented in Appendix 2.
Table 3.2. Selective media and incubation conditions used for the enumeration of the probiotic and starter
bacterial strains in yogurt.
Strain Selective
media Temperature Time
Air conditions
B. longum R0175 MRS-MUP 37°C 48h Anaerobic
L. helveticus R0052 MRS-CL 45°C 48h Anaerobic
L. bulgaricus from YO-MIX® T11 MRS-F 45°C 48h Aerobic
S. thermophilus from YO-MIX® T11 M17-L 42°C 48h Aerobic
BD Difco™ MRS agar (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA)
BD Difco™ M17 agar (BD Diagnostics)
MRS-F = Homemade MRS agar with fructose as sugar (Tabasco et al., 2007)
MUP = Mupirocin lithium salt 0.1% (Sigma-Aldrich Canada Co., Oakville, ON, Canada)
CL = Clindamycin hydrochloride 0.01% (Sigma-Aldrich Canada Co.)
45
3.4.5.2 Flow cytometry technique
Enumeration of L. helveticus R0052 was also carried out by flow cytometry using the Live/Dead
BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA) as described in Raymond
and Champagne (2015). A specific antibody labelling for the probiotic strain L. helveticus R0052 was
graciously provided by Lallemand Health Solutions. Another antibody labelling for B. longum R0175
was also provided. However, preliminary analysis showed problems isolating the strain properly in
yogurt. Thus, flow cytometry analyses were only performed on products containing L. helveticus
R0052.
Briefly, the homogenized samples were diluted in phosphate buffered saline (PBS) + Tween 20 at 2
g/L, to obtain a bacterial concentration between 5 x 105 bacteria/mL and 5 x 106 bacteria/mL, and
passed through a Full Flow™ Filter 10 µm (Varion, Cary, NC, USA). The sample (200 µL) was first
mixed with 1 µL of the species-specific polyclonal antibody (1 mg protein/mL solution, Lallemand
Health Solution) and incubated at room temperature for 30 min. Then, 40 µL of the sample was
mixed with 160 µL of PBS + Tween 20, and 1 µL of a second layer antibody (goat anti-rabbit F(ab')2
IgG fragment Alexa Fluor®647 conjugated 1 mg/mL, Life Technologies/ Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, USA), and incubated in obscurity for 30 minutes at room temperature. The sample
was diluted again in PBS (100 µL in 900 µL), colored by adding 1.5 µL of each SYTO 9 and
Propidium iodide from Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, OR,
USA), and incubated in obscurity for 15 min. Each sample was run twice on an Accuri C6 flow
cytometers (Becton Dickinson, Mississauga, ON, CA). Samples were run at slow speed for 2 minutes
with the following threshold filter applied: FL4 (675/25) at 3200 and FL1 (530/30) at 1000. For
samples without antibody labelling, FL1 at 1000 and FL3 (620/10) at 1000 were used. A control of
Live and Dead cells marked with and without the antibody was made to determine the zone of
interest and to confirm the positive marking of the bacterial strain R0052. A yogurt sample without the
probiotic was also analyzed to confirm the specificity of the antibody (Figure 3.1). For analysis on a
SSC-H vs FL4-H graph, a first region of interest (gate D, presence of particles marked with the
antibody) was applied on a FL3 vs FL1 graph, on which the region of interest to live and dead cells
were created (gate A: Live bacteria and gate B: Dead bacteria).
46
Figure 3.1. Antibody specificity and positive labelling of Lactobacillus helveticus R0052 in yogurt. Gate D:
antibody labelled R0052, A: Live cells of L. helveticus R0052, and B: Dead cells of L. helveticus R0052.
3.4.6 Compositional and physicochemical analyses
The pH level was measured with two systems. The in-house FACS equipped with red rod
Radiometer analytical pH electrodes (Hach, London, ON, Canada) was used during the
fermentations and a portable pH-meter (Oakton Instruments) equipped with a Fisher Scientific™
Accumet™ refillable glass pH electrode (Fisher Scientific) was used after fermentation and during
storage.
The sugars, acids and ethanol contents of milks and yogurts were dosed by HPLC (Waters 1525
pump and Waters 717-plus auto sampler, Milford, MA, USA). The following conditions were applied:
A 20 µL injection on a separation column ICE-Ion 300 (Transgenomic, Omaha, NE, USA), kept at
80°C; mobile phase of 0.02 N H2SO4 injected at 0.4 mL/min; RI detector (Waters 2414, Milford, MA,
USA) at 40°C coupled with a PDA detector (Waters 2998, Milford, MA, USA) at a wavelength of 208
nm. To do the extraction, 8 g of the sample was mixed with 1 mL of 36% Trichloroacetic acid and 30
μL of 5% sodium azide, incubated overnight at 37°C, and centrifuged at 10 000 x g for 20 min at
37°C (Beckman Coulter Avanti™ J-20XPI centrifuge with a JLA 10.5 rotor). Supernatants went
through a second 37°C incubation of two hours and a second centrifugation with the same
parameters. Supernatants were finally filtered on a Millipore filter (Millex-HV, Bedford, MA, USA) of
0.45 μm in a GSLC vial.
47
Total nitrogen (Ntot) was ascertained with a Vario Max Cube Analyzer (Elementar, Langenselbold,
Germany). Protein content was calculated by the conversion of the total nitrogen content using a
nitrogen conversion factor of 6.38 attributed for milk proteins (FAO, 2003). The level of alpha amino-
nitrogen (AAN) and degree of hydrolysis (DH) were measured by titration with a formaldehyde
solution ACS reagent, 37 wt. % in H2O (Sigma-Aldrich® Canada Co) adjusted to pH 9.0 with Sodium
Hydroxide, DILUT-IT® Analytical Concentrate, 0.1 N, J.T.Baker® (VWR International, Montreal, Qc,
Canada) following USP 23- NF18 (1995) protocol. Briefly, 5 mL of the sample was diluted in 20 mL of
water and adjusted to pH 7.0. Then, 10 mL of formaldehyde was added and the sample was titrated
with the sodium hydroxide to a final pH of 9.0. A solution of glycine 20 mg NA/100 mL was used as
standard to verify the titration. The AAN levels were calculated fallowing the equation of the same
protocol. The DH was calculated fallowing the equation of the formol titration protocol of Navarrete
del Toro and García-Carreño (2001).
The syneresis index was measured following the method of Harwalkar and Miloslav (1986) with
modifications. 25 g of sample was centrifuge at 210 x g for 20 minutes at 4°C (Thermo
Scientific™ Sorvall™ ST 40 Centrifuge with a Tx-750 rotor). The whey extracted was weighted and
the syneresis index was calculated using the equation of the protocol.
3.4.7 Statistical analyses
The study was separated in three experimental designs. The first one consisted of regular stirred
yogurt produced to determine the impact of the smoothing process on the probiotic strains B. longum
R0175 and L. helveticus R0052 for 16 days of storage (design #1). The two others consisted of
regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts (GS-UF and GS-CF) produced to determine
the impact of the protein concentration processes on the probiotic strain B. longum R0175 for 14
days of storage (design #2), and on the probiotic strain L. helveticus R0052, the starter S.
thermophilus and physicochemical properties for 44 days of storage (design #3).
A split-plot design was used to compare the influence of the production processes and days of
storage on B. longum R0175 and S. thermophilus counts in yogurt. The three processes were
considered as the main plot and the days of storage as the subplot factor. A split-split-plot design was
48
used to compare the enumeration method and the influence of the production processes and days of
storage on L. helveticus counts in yogurt. The three processes were considered as the main plot, the
two enumeration methods as the sub-plot, and the days of storage as the sub-sub-plot factor.
ANOVA and least squares means analyses with a probability threshold of 0.05 were performed on
data from the previously described designs to compare the effects of the several factors on the
microbial counts, using SAS software (Toronto, ON, Canada).
For the statistical analyses of the smoothing process assays (dissolved oxygen and bacterial counts),
one-way ANOVA was carried out with “Product” as parameter, using SigmaPlot software (Systat
Software Inc., San Jose CA, USA). For the analyses of the chemical compounds (sugars, acids,
amino compounds) and syneresis, two-way ANOVA was carried out with “Time” and “Product” as the
parameters, using SigmaPlot software as well.
49
3.5 Results
3.5.1 Influence of dissolved oxygen and smoothing process on probiotics survival
Since probiotics may be sensitive to oxygen during storage (Talwalkar & Kailasapathy, 2004), it was
first verified if the smoothing method was introducing oxygen into the yogurt curd. Treatment A, which
had no smoothing step (Table 3.1), was the one that gave the lowest (p < 0.05) initial DO2 level
(Figure 3.2a). No significant difference (p > 0.05) was observed between initial DO2 levels of the
smoothed yogurts B and C. Because of the high variability between the DO2 values obtained with the
reading equipment, no significant effect (p > 0.05) of probiotic strain on DO2 levels was observed.
With Treatment A, there was a constant increase of DO2 during storage of approximately 51% in
yogurts containing R0175 and 41% in those containing R0052. With treatments B and C, level of DO2
slightly decreased during the first day of storage, and became higher at day 16, for both probiotic
yogurts.
Figure 3.2. Influence of the moment of probiotics inoculation and the smoothing process of regular stirred
yogurt on the level of dissolved oxygen (a) and the viable counts of the probiotics Bifidobacterium longum
subsp. longum R0175 and Lactobacillus helveticus R0052 (b) during storage at 4°C. Treatments A, B and C
are described in Table 3.1. In graphic a, day 0.5 corresponds to the end of production (after fermentation and
smoothing). In graphic b, day 0 constitutes the inoculated counts in milk matrices, while day 0.5 represents
those in the fresh yogurts after production. For a given day of storage, different letters indicate that the values
are significantly different (p < 0.05). Error bars represent standard errors of the means.
b) Probiotics counts
Storage (days)
0 4 8 12 16
Bacte
ria
l C
ount (L
og C
FU
/g)
0
2
4
6
8
R0175 A
R0175 B
R0175 C
R0052 A
R0052 B
R0052 C
a) Dissolved oxygen level
Storage (days)
0 4 8 12 16
Dis
solv
ed o
xygen level (%
)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
R0175 A
R0175 B
R0175 C
R0052 A
R0052 B
R0052 C
a
a a
a
a
b
b
b
b
ba
a
aa
ab
a a a
ab
b
b
c
c
a
a
a
d
c
b
50
For the yogurts containing B. longum R0175, there was a 6 Log CFU/g decrease over storage in all
three products, regardless the treatment applied (Figure 3.2b). The colonies obtained on day 16 were
at the limit of having accurate counts. For the yogurts containing L. helveticus R0052, the probiotic
populations were still stable after 16 days of storage. In addition, the pH profile (data not shown) was
not affected by the smoothing treatment performed or the probiotic strain used. pH values all went
from 4.6-4.7 at the end of the production to 4.3 after 16 days of storage.
Since the viability of L. helveticus R0052 during storage of the Control yogurt was not negatively
affected by the smoothing process when the probiotic had been added to the milk at the beginning of
the fermentation, it was decided to inoculate the probiotics in milk for all the subsequent
manufactures of Control, GS-CF and GS-UF yogurts.
3.5.2 Yogurt production
Some properties of the milk solutions and yogurts produced are presented in Table 3.3.
Table 3.3. Relevant characteristics of the milk bases and the three yogurts produced for the comparative study
of probiotic populations and physicochemical properties.
Product Protein
content (%) 1 pH level 2
Buffering capacity (mol HCl /100 mL milk)
Average fermentation time (hours) 3
Milk 1 4.0 ± 0.01 6.75 ± 0.01 0.008 ± 0.00 5.5 ± 0.02 Milk 2 10.6 ± 0.02 6.86 ± 0.01 0.016 ± 0.00 9.5 ± 0.00
Control yogurt 4 4.1 ± 0.03 4.66 ± 0.01 GS-CF yogurt 4 10.3 ± 0.09 4.66 ± 0.01 GS-UF yogurt 4 11.0 ± 0.02 4.73 ± 0.01
1 Protein content was calculated by converting the total nitrogen content as described in section 3.4.6. 2 The pH readings of milk were taken at 40°C at the beginning of fermentation. The pH of yogurt was taken just prior the
smoothing step, when the product was at 18°C. 3 The average fermentation time represents the time required to reach a pH of 4.7 at 40°C. 4 The Control and the GS-CF yogurts were obtained from the fermentation of Milk 1, while the GS-UF yogurt resulted from
the fermentation of Milk 2.
The fermentation time was longer in the Milk 2, which had higher protein content resulting from
ultrafiltration, and higher buffering capacity than Milk 1 (Table 3.3).
51
3.5.3 Yogurts made with the probiotic strain Bifidobacterium longum subsp. longum
R0175
3.5.3.1 Survival of Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 during storage
Plating technic was used to follow B. longum R0175 viable counts during storage at 4°C. For all three
fresh yogurt types, B. longum populations were lower (p < 0.05) than the initial amount inoculated to
the milk solutions (Figure 3.3). The counts continued to rapidly decline during the storage period, and
became too low for accurate readings after 14 days. Therefore, the counts dropped for more than 5
Log CFU/g over 14 days of storage. During the first week, the probiotic population of the GS-UF
yogurt declined slightly faster (p < 0.05) than in the Control. However, there was no difference (p >
0.05) between the Control yogurt and the GS-CF yogurt for all the storage period. Finally, at day 14,
there was no longer any difference (p > 0.05) in the probiotic counts between the three products.
Since viable counts of B. longum were already very low after 14 days of storage, yogurts
supplemented with B. longum R0175 were not further analyzed for microbiological or for
physicochemical analyses (syneresis, AAN, sugar and acid metabolites).
52
Figure 3.3. pH profile and population of Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 in regular stirred yogurt
(Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at
4°C. Values at day 0 constitute the inoculated counts in milk matrices, while values at day 1 represent those in
the fresh yogurts. For a given day of storage, capital letters indicate if the CFU values are significantly different
(p < 0.05), and lowercase letters indicate if the pH values are significantly different (p < 0.05). Error bars
represent Standard Error of the Means (SEM).
At the beginning of storage (day 1), the GS-UF yogurt had higher (p < 0.05) pH values than the two
other yogurt types, with a difference of 0.2 units. During the storage period, pH level remained stable
between 4.5 and 4.6 in the GS-UF yogurt (Figure 3.3). In the Control and GS-CF yogurts, the pH
level had a decrease of 0.5 units during the 14 days of storage. The pH values of the GS-CF yogurt
were slightly lower (p < 0.05) than the Control at days 4 and 7, but were similar (p > 0.05) for all the
other sampling times.
CFU B. longum R0175 and pH during storage
Storage (days)0 5 10 15
Ba
cte
ria
l C
ou
nt (L
og
CF
U/g
)
0
2
4
6
Control CFU
GS-CF CFU
GS-UF CFU
pH
4,2
4,4
4,6
4,8
5,0
Control pH
GS-CF pH
GS-UF pH
AA
ABB
A
B
B
A
A
ABB
A
c
aa
aa a
b b
b
b
c
A
b
53
3.5.4. Yogurts made with the probiotic strain Lactobacillus helveticus R0052
3.5.4.1 Chemical attributes of yogurts
Yogurts containing the probiotic strain L. helveticus R0052 were stored for up to 44 days. The sugar
and acid profiles were analyzed in the initial milk solutions (day 0) and in the three yogurts containing
L. helveticus at the beginning (day 3) and at the end (day 38) of storage at 4°C (Figure 3.4).
Figure 3.4. Sugar and organic acid profiles of the 4% protein milk (Milk 1), 10% protein milk (Milk 2), regular
stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF)
during storage at 4°C. All products contained the probiotic strain Lactobacillus helveticus R0052. For each day
of storage, letters indicate if the concentrations are significantly different (p < 0.05) between each yogurt. Error
bars represent Standard Error of the Means (SEM).
Ethanol content was also measured but was not detected in any product (data not shown). Some
significant differences were found between products for the acetic acid content. However, the
concentrations detected were so low that there was no consistent trend during storage. Glucose
concentrations were similar in all three products (Figure 3.4) and did not change over time (p > 0.05).
However, statistical analyses revealed significant differences (p < 0.05) between yogurt types for
lactose, galactose, lactic acid and citric acid concentrations.
Lactose
Co
ncen
tra
tio
n (
g/L
)
0
10
20
30
40
50
60Glucose Galactose
Lactic acid
Day 0 (milks) Day 3 Day 38
Co
ncen
tra
tio
n (
g/L
)
0
5
10
15
20
Citric acid
Day 0 (milks) Day 3 Day 38
Acetic acid
Day 0 (milks) Day 3 Day 38
Control / Milk 1
GS-CF / Milk 1
GS-UF / Milk 2
200
a a
aa
a
bb
b
b
c
c
c
a
a a
a
b
bb
b
c
c c c
a a a a a a a aa a
a a
a a a
a
a a ab b
ab a b a b c a b b
54
Lactose concentration was 12 g/L higher in the Milk 1 than in the Milk 2 (Figure 3.4). In all products,
the assimilation of lactose corresponded to the production of lactic acid and galactose. Fermentation
of Milk 2 resulted in a 28 g/L reduction in lactose, while lactic acid and galactose content in the GS-
UF yogurt had an increase of 14 g/L and 12 g/L respectively (Figure 3.4). Fermentation of Milk 1
resulted in a 14 g/L reduction of lactose only, with parallel increases of 7 g/L of galactose and 7 g/L of
lactic acid in the Control yogurt. Lactose assimilation and lactic acid production in the GS-CF product
were slightly more important than those of the Control at days 3 and 38 (Figure 3.4). Moreover,
substrates and metabolites data from the GS-CF yogurt were much closer to those of the Control
than were those of the GS-UF products. During storage, there were further significant (p < 0.05)
changes in metabolites concentrations. The patterns were similar in all products.
The amount of total nitrogen (Ntot), α-amino nitrogen (AAN) and degree of hydrolysis (DH) were also
analyzed (Table 3.4). There were marked differences (p < 0.05) of Ntot values between Milk solutions
prior to fermentation. Significant increases in Ntot (p < 0.05) were noted between day 0 and day 3 for
the Greek-style yogurts.
Table 3.4. Total nitrogen (Ntot) content, α-amino nitrogen (AAN) content and degree of hydrolysis (DH) in the
regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-
UF) during storage at 4°C. All products contained the probiotic strain Lactobacillus helveticus R0052.
Ntot (g/L) AAN (g/L) DH (%)
Milk 1 6.20 ± 0.02 A 0.49 ± 0.00 A 2.24 ± 0.01 A Control yogurt
Day 3 6.40 ± 0.04 a 0.74 ± 0.01 a 3.33 ± 0.08 a Day 38 6.40 ± 0.04 a 0.78 ± 0.02 a 3.53 ± 0.08 a
GS-CF yogurt Day 3 16.20 ± 0.15 b 1.28 ± 0.11 b 2.27 ± 0.17 b Day 38 16.20 ± 0.15 b 1.36 ± 0.03 b 2.40 ± 0.03 b
Milk 2 16.70 ± 0.03 B 1.17 ± 0.01 B 2.01 ± 0.02 A GS-UF yogurt
Day 3 17.30 ± 0.04 c 1.45 ± 0.02 c 2.40 ± 0.03 b Day 38 17.30 ± 0.04 c 1.50 ± 0.02 c 2.48 ± 0.04 b
Values with the same letters are not significantly different (p > 0.05).
Capital letters are comparing values between the two milk solutions. Lowercase letters are comparing values between the
three yogurt types after 3 days (blue) and 38 days (orange) of storage.
Statistical results for the effect of time for each product are not presented.
55
The AAN levels differed between Milk solutions prior to fermentation (Table 3.4). The results were
influenced by the processing method and fermentation. Fresh products (day 3) had significantly
higher (p < 0.05) AAN values than the originating milks. Indeed, the highest increase in AAN levels
between original milk and fresh fermented products (day 3) was noted in the GS-CF product. The
AAN increases during storage (day 3 to day 38) were not statistically significant (p > 0.05) for any of
the products.
The DH levels differed between Control and Greek-style yogurts, and were highest (p < 0.05) in the
Control (Table 3.4). However, there was no significant (p > 0.05) storage effect on any products.
Finally, the syneresis was also measured at the beginning and at the end of the storage (Table 3.5).
It was superior (p < 0.05) in the Control yogurt than in the Greek-style yogurts. There were no
significant changes (p > 0.05) in the syneresis measurements during storage for any product, and
there was no interaction between storage time and product.
Table 3.5. Syneresis index (%) of the regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by
centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C. All products contained the probiotic
strain Lactobacillus helveticus R0052.
Control GS-CF GS-UF
Day 3 17.1 a 2.0 b 3.9 b
Day 38 17.2 a 0.8 b 1.8 b
Values that are followed by different letters are statistically different (p < 0.05).
Letters are comparing the effect of products and time.
3.5.4.2 Survival of Lactobacillus helveticus R0052 during storage
Two enumeration techniques were used and compared to follow L. helveticus R0052 viable counts
during storage at 4°C. With the plating technique (CFU), there was a significant increase (p < 0.05) in
counts during manufacture of yogurts (Figure 3.5). Between the inoculation step and the first
sampling after 24 h of storage, the probiotic counts increased by 0.3, 0.9 and 1.2 Log CFU/g in the
Control, GS-CF and GS-UF yogurt, respectively. Growth in Milk 1 was much lower than in Milk 2,
56
which could partially be linked to the shorter incubation time (Table 3.3). The CFU values of L.
helveticus in the GS-CF were 4 times higher than in the Control but 2 times lower than in the GS-UF.
The L. helveticus CFU population of the GS-UF yogurt remained relatively stable over the first 16
days of storage, but then suffered a 2.2 Log CFU/g decline until day 44 (Figure 3.5). The CFU counts
in the Control yogurt had a similar profile, with a decline phase that rather happened after day 31,
with a 1.1 Log CFU/g drop. The population in the GS-CF yogurt remained relatively stable during all
the storage period, with a slightly drop of 0.6 Log CFU/g between days 16 and 44. At the end of the
storage, the CFU values of L. helveticus in the GS-CF yogurt were 15 times higher than in the
Control and 18 times higher than in the GS-UF.
Figure 3.5. Comparison of two methods for the enumeration of viable Lactobacillus helveticus R0052 in
regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-
UF) during storage at 4°C. Values at day 0 constitute the inoculated counts in milk matrices, while values at
day 1 represent those in the fresh yogurts. The solid lines represent the counts obtained by plating with
selective media (CFU) and the dash lines represent those obtained by flow cytometry for viable cells (FCV).
For each day of storage, different letters indicate significantly different counts (p < 0.05) in the three yogurts
and between the enumeration methods. Error bars represent Standard Error of the Means (SEM).
CFU L. helveticus R0052 during storage
Storage (days)
0 10 20 30 40 50
Bacte
rial C
ou
nt (L
og
CF
U/g
or
FC
v/g
)
6
7
8
Control CFU
GS-CF CFU
GS-UF CFU
Control FCv
GS-CF FCv
GS-UF FCv
a
b
c
a
a
bb
c
c
c b
d
ab
bc
a
ab
bc
c
d
a
ab
a
ab
a
b
c
d
a
b
a
b
a
b
57
With the use of various fluorescent dyes, flow cytometry (FC) allows the estimation of viable (FCV) or
dead (FCD) cell counts. The FCV counts remained stable in all three yogurt types over the 44 days of
storage (Figure 3.5). There was no significant difference (p > 0.05) between the Greek-style yogurts
viable counts. Both increased slightly more than 1 Log FCV/g between the inoculation step and the
first sampling at day 1. The viable counts in the Control yogurt had an increase of 0.8 Log FCV/g
during the production, and remained lower (p < 0.05) than the Greek-style yogurts during storage.
The levels of FCD (data not shown) were significantly (p < 0.05) affected by the process. The Control
yogurt contained on the average 27% of dead cells while the GS-CF and GS-UF contained
respectively 19% and 11% of FCD. As for FCV counts, FCD counts remained stable during storage
with no significant (p > 0.05) effect of time.
Some differences were then obtained in the viable probiotic counts between the two enumeration
methods (Figure 3.5). Within the Control yogurt, the counts obtained with the two methods were all
significantly different (p < 0.05), with exceptions for days 16 and 31. For the GS-UF yogurt, there was
no significant difference (p > 0.05) between the counts obtained by the two methods at the beginning
of the storage until day 16. Then, all the other samplings gave lower (p < 0.05) counts with the CFU
method. Within the GS-CF yogurt, the counts followed two similar trends during all the storage
period, resulting in non-significant differences (p > 0.05) between the two methods for all the storage
period except for days 31 and 44.
3.5.4.3 Survival of Streptococcus thermophilus during storage
Because of a lack of time, lactic cultures counts were carried out only in the products containing the
probiotic strain L. helveticus R0052. This choice was made because of the preliminary results
discussed in section 3.4.4.2 showing that it was not of economic interest to follow B. longum R0175
counts more than 14 days, in regards of the important loss of viability. However, other preliminary
tests (data not shown) indicated that the concentration of L. bulgaricus in the mix starter was at least
6 Logs lower than the one of S. thermophilus. Moreover, none of the culture media tested for L.
bulgaricus enumeration was selective enough to obtain accurate counts of L. bulgaricus in the
presence of L. helveticus in concentration of 6 logs and more (see Annexe 2 for selective media
selection). Thus, only S. thermophilus counts were assessed during storage of the products
containing the probiotic strain L. helveticus R0052 (Figure 3.6).
58
Figure 3.6. pH and populations of Streptococcus thermophilus from the YO-MIX® T11 yogurt cultures in
regular stirred yogurt (Control) and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-
UF) during storage at 4°C. Values at day 0 constitute the inoculated counts in milk matrices, while values at
day 1 represent those in the fresh yogurts. For a given day of storage, capital letters indicate if the CFU values
are significantly different (p < 0.05), and lowercase letters indicate if the pH values are significantly different (p
< 0.05). Error bars represent Standard Error of the Means (SEM).
Between the inoculation step and the first sampling at day 1, S. thermophilus counts showed an
increase between 1.7 and 2.0 Log CFU/g in the three yogurt types (Figure 3.6). Slightly higher (p <
0.05) growth was noted in the GS-UF yogurt than in the Control yogurt. The highest (p < 0.05) CFU
values were obtained in the GS-CF products. Subsequently, the S. thermophilus populations
remained stable over all the 44 days of storage, maintaining the significant differences between the
three yogurts CFU values.
After production, the pH level of the GS-UF yogurt was higher (p < 0.05) than in the other yogurt
types, with a difference of 0.2 pH units (Figure 3.6). As there was no adjustment of the pH level with
lactic acid in the yogurt containing L. helveticus R0052, the pH values of the GS-UF yogurt remained
higher than those of the two other products during all the storage period, and tended to stabilize
CFU S. thermophilus and pH during storage
Storage (days)
0 10 20 30 40 50
Bacte
rial count (L
og C
FU
/g)
6
7
8
9
10
Control CFU
GS-CF CFU
GS-UF CFU pH
4,2
4,4
4,6
4,8
5,0
Control pH
GS-CF pH
GS-UF pH
A
BC
A A A A A A
B B B B BB
C C C C C C
a
b
c
a
a
a
a
aa
ab
b
b
b
bb b
c
c
cc
cc
A
59
around 4.5. The pH profiles of the Control yogurt and GS-CF yogurt were similar but still significantly
different (p < 0.05) from each other, with an exception for day 31. The drop of pH during the first 8
days of storage was faster in the GS-CF product than the Control yogurt. Their pH values tended to
stabilize around 4.3 for the Control yogurt and around 4.25 for the GS-CF yogurt.
60
3.6 Discussion
3.6.1 Influence of dissolved oxygen and smoothing process on probiotics survival
To assess potential parameters of influence over the microbial counts during storage, the impact of
the smoothing process was examined. The increase of DO2 during storage after day 1 occurred in all
the products, suggesting the smoothing process does not affect the evolution of DO2 concentration
during storage. The oxygen increase is also consistent with the results of other studies, which
attributed the phenomenon to oxygen permeation through the plastic containers (Damin et al., 2008;
Dave & Shah, 1997b). Nevertheless, oxygen accumulation appears to have been higher in the
yogurts containing B. longum R0175 than in those containing L. helveticus R0052. Damin et al.
(2008) also observed higher oxygen accumulation with bifidobacteria rather than lactobacilli, which is
consistent with the different oxygen requirements of these probiotic species (Bergey et al., 1984;
Ventura et al., 2004; Vos et al., 2011). However, statistical analysis showed that the DO2 readings
obtained with the detector equipment were too variable to produce significant differences between
the two strains.
In the yogurts that went through treatments B and C, the DO2 level was higher at the beginning of the
storage than in the ones that went through treatment A. This implies that the hand mixer used for the
smoothing process increased considerably the level of DO2 in the products. However, there was a
quick decrease during the first day of storage. Other studies obtained similar results, with a drop of
the oxygen content after fermentation that they attributed to metabolic pathways of starter bacteria
that require dissolved oxygen (Damin et al., 2008; Dave & Shah, 1997b).
The similarity between the important decreases of B. longum counts during storage indicates the
presence of common negative factor(s) in all three yogurts. The variation in DO2 levels between the
three products suggests that only a small level of DO2 is needed to affect the cells or that other(s)
factor(s) had a higher negative impact on the cells. Presence of DO2 has been shown to reduce B.
longum viable counts during yogurt storage (Cruz et al., 2012a; Cruz et al., 2013; Cruz et al., 2012b).
However, the populations started to decrease during the fermentation, meaning other environmental
stresses also played a role in the loss of viability.
61
On the other hand, the smoothing process did not seem to have an impact on L. helveticus viability
since there was no significant difference between smoothed yogurts (B) and unsmoothed yogurts (A)
during storage. The slightly lower counts of L. helveticus R0052 observed in the yogurt C is in
accordance with the results of Hull et al. (1984) who shown that higher viable counts of probiotic
lactobacilli are obtained if the probiotic is added with the starter rather than directly in the yogurt curd
after fermentation. This also reflects the absence of incubation period to stimulate the growth, as the
probiotic was added after fermentation at 18°C, prior to the 4°C storage.
The results obtained in this section revealed that B. longum R0175 is highly sensitive to
environmental stresses. Because of that, composition analyses were carried out only with L.
helveticus yogurts. Nevertheless, further studies were made with B. longum R0175 to ascertain if the
same patterns would be noted for the viable counts in the Greek-style yogurts.
3.6.2 Production of Control, GS-UF and GS-CF probiotic yogurts
The higher buffering capacity of the 10.6% protein milk increased considerably the time required to
reach the final pH level of 4.8 during GS-UF yogurt production. Previous tests (results not shown)
revealed that the yogurt starter cultures were unable to acidify sufficiently the milk to reach a pH of
4.7, even with fermentation lasting over 15 hours. Indeed, the acidification rate started to slow down
below pH 5. This corresponds to the maximal buffering capacity of caseins, which are found in high
concentration in ultrafiltrated milk (Domagala, 2012; Moreno-Montoro et al., 2015; Salaun et al.,
2005).
The fermentation profiles of the milk solutions with the starter cultures + B. longum R0175 and with
the starter cultures + L. helveticus R0052 were almost identical. With the same probiotic strains,
Champagne et al. (2009) obtained identical fermentation times for both R0175 and R0052 strains in
pure and mixed cultures with S. thermophilus. Since viable counts (CFU) of probiotics were at least
10 times lower than those of S. thermophilus, neither probiotic strain presumably reached high
enough CFU to significantly influence the acidification of the milk.
62
3.6.3 Survival of Bifidobacterium longum subsp. longum R0175 during storage
Populations of B. longum R0175 drastically decreased during fermentation and storage in both
Greek-style yogurts and in the regular stirred yogurt. According to the literature, the growth of B.
longum during yogurt fermentation is variable, but it generally tends towards slow or absence of
growth (Abe et al., 2009; Antunes et al., 2005; Gilliland et al., 2002; Odamaki et al., 2011). The
viability losses of B. longum R0175 were therefore in line with the literature. However, enumeration
on selective media does not guarantee a population decline caused by cell mortality. Indeed, it is now
well known that degradation of environmental conditions and physical damages caused to the cells
can prevent them from forming colonies on agar plates, even if they are still alive. Those cells are
called viable but nonculturable cells (Pinto et al., 2015). Another enumeration technique such as flow
cytometry can differentiate the viable and dead cells populations. However, the labelled-antibody
specific for B. longum R0175 provided was not selective enough to use that technic in yogurt in
presence of other bacterial strains.
Stability in yogurt during storage is also variable between B. longum strains, and other strains than B.
longum R0175 have shown better stability (Abe et al., 2009; Gilliland et al., 2002). It was
hypothesized that B. longum R0175 viability should have been higher in Greek-style yogurt since
several studies shown positive impacts of proteins on growth and survival of this species (Antunes et
al., 2005;; Ibrahim & Bezkorovainy, 1994; Prasanna et al., 2012a). However, this did not occur under
the experimental conditions of this study.
The DO2 level can affect B. longum viability during storage (Talwalkar & Kailasapathy, 2004). The
yogurt starter L. bulgaricus is especially known to produce reactive oxygen species (ROS) in
presence of oxygen, which can be especially detrimental to strict anaerobic bacteria that do not have
antioxidant enzymes to decompose these compounds (Dave & Shah, 1997b; Tamime et al., 2007).
However, this cannot be invoked with conviction in this study because L. bulgaricus was not
enumerated during yogurt storage. The smoothing process did indeed affect DO2 levels in the
products. However as discussed previously, data collected were not sufficient to ascertain if the
viability of the strain was affected or not by this parameter during storage. Thus, other factors than
the DO2 level could have a greater impact on viable counts of the probiotic during storage.
63
Lactic acid is also known to have antibacterial activity (Reis et al., 2012; Wang et al., 2015). This last
aspect could explain the faster CFU decease observed in the GS-UF yogurt, where the longer
fermentation of the ultrafiltered milk allowed the LAB to convert a greater fraction of lactose into lactic
acid. However, it was noteworthy that the GS-UF yogurt had the highest pH value. Data from this
study therefore suggest that within a pH range of 4.6 to 4.3, undissociated lactic acid concentration
would have a greater detrimental effect on viability than pH itself.
The species B. longum is also extremely sensitive to temperature above its optimum one, which is
37°C (Leahy et al., 2005). Abe et al. (2009) showed that a fermentation temperature of 41°C
conducts to a reduced viability of B. longum in yogurt during storage. Thus, the prolonged exposure
of B. longum cells at the incubation temperature of 40°C could have contributed to a reduced growth
during the fermentation.
3.6.4 Chemical attributes of yogurts made with Lactobacillus helveticus R0052
The initial lactose concentrations of the milk solutions were different, and the GS-UF yogurt had a
lower concentration than did the Control and GS-CF products. This difference principally came from
the milk standardization step. For the ultrafiltration process, skim milk powder was rehydrated at a
3.1% protein level, a concentration that simulates fresh milk, which is typically composed of 3.2%
protein and approximately 5% lactose (Haug et al., 2007). Since lactose is not retained in the
concentrated fraction (retentate) during ultrafiltration, its concentration does not increase as for the
proteins. As a result, a proportional increase in the content of low molecular weight dissolved
substances, such as lactose, soluble minerals and non-protein nitrogen, is not observed in the
concentrated milk (Chapman et al., 1974; Li & Corredig, 2014). Moreover, lactose retention seems to
be variable according to the operating conditions of the ultrafiltration system (Brazuelo et al., 1995).
On the opposite, to produce Control and GS-CF yogurts, skim milk powder was rehydrated at a 4%
protein level to simulate enriched fresh milk. This higher initial protein enrichment level resulted in
higher concentrations of all non-fat solids, and thus, initial lactose content 20% higher than in the GS-
UF milk base. All these data are therefore in accordance with the average concentration found in cow
milk (Haug et al., 2007).
64
Regarding the regular stirred yogurt (Control), the amount and profiles of glucose, galactose and
acetic acid are in accordance with observations of other studies (Adhikari et al., 2002; Vénica et al.,
2014). Ethanol and acetic acid levels were negligible in the three yogurt types, which is consistent
with the homofermentative metabolism of the LAB used. Along with the lactose uptake, galactose
increased during storage while glucose remained stable. Unlike glucose, the galactose moiety of
lactose cannot be used by all bacteria as a carbon source. Utilization of lactose by most strains of S.
thermophilus comes with a release and accumulation of galactose in the media (Beal et al., 1989; De
Vin et al., 2005; Escalante et al., 1998; Oliveira et al., 2012). On the contrary, L. bulgaricus can use
galactose (Grobben et al., 1998; Xanthopoulos et al., 2001), but this uptake was not enough to
prevent an accumulation in the products. Moreover, some authors have seen that thermophilic LAB
tend to metabolize only the glucose moiety when lactose is abundant (De Vin et al., 2005; Svensson
et al., 2007). Lactose consumption and lactic acid production profiles during fermentation and storage
are also in accordance with the results of other studies (Adhikari et al., 2002; Beal et al., 1989;
Oliveira et al., 2012; Vénica et al., 2014). However, these studies obtained higher amount of lactic
acid at the end of the fermentation. This could be explained by the low population of L. bulgaricus
composing the starter culture mix used in this study, since this bacterium is known to highly
contribute to lactic acid production, even during storage after the cessation of growth. Indeed, yogurt
cultures currently using by food industries contain small amounts of L. bulgaricus to avoid problems
of excessive post acidification (Beal et al., 1989; Dave & Shah, 1998; Xanthopoulos et al., 2001).
Although this hypothesis cannot be confirmed with CFU data, since specific counts of L. bulgaricus
were not carried out in the finished products, the flow cytometry analyses confirmed that the counts in
lactobacilli found in the yogurts were essentially those of L. helveticus.
Furthermore, there were some differences in the extent of lactose utilization and metabolites
produced between the three yogurt types. Lactose concentration remained higher in the Control
yogurt than in the Greek-style yogurts during storage. This can be explained by the smaller
populations of bacteria in the regular stirred yogurt. The greater decrease of lactose and increase of
lactic acid in the GS-UF yogurt during fermentation and the first three days of storage were most
likely due to the longer fermentation time caused by the higher buffering capacity of the UF milk
matrix. As a result, higher populations of streptococci and probiotics were reached in the GS-UF
yogurt than in the Control. Ozer and Robinson (1999) also found higher acidity levels in products
65
fermented from concentrated milk than products that were concentrated after fermentation, reflecting
a higher acid production. Moreover, presence of casein fractions, which could have been
concentrated during ultrafiltration, has been found to increase the activity of enzymes related to sugar
metabolism of S. thermophilus and L. bulgaricus, and improve lactic acid production by S.
thermophilus cells (Qingli et al., 2014; Qingli et al., 2013). This can also explain the fastest decrease
in cell populations in GS-UF yogurt during storage.
The different protein content of the two milk solutions were reflected in the Ntot values obtained. The
increase in Ntot content between UF milk and GS-UF yogurt suggests a slight loss of moisture during
the fermentation and/or during the beginning of the storage.
The initial content of AAN, prior to fermentation, was higher in the 10.6% protein milk than the 4%
milk protein milk. This was unexpected because a phenomenon equivalent to what happened with
lactose should have occurred. Those results suggest that other nitrogenous compounds than
proteins, such as peptides and free amino acids, could have been concentrated during ultrafiltration
of the milk. The higher AAN levels observed in the Greek-style products suggest a more important
proteolysis than in regular yogurt. However, DH results showed that the proteolysis was more
important in the Control yogurt. Indeed, the AAN content of Greek-style products were small when
compared to the Ntot content, which is consistent with a lower proteolytic activity in these products.
The AAN concentrations obtained in the regular milk and the Control yogurt are consistent with the
results of another study that used L. helveticus R0052 (Champagne et al., 2009). Lactose and lactic
acid concentrations were found to be similar in Control and GS-CF yogurts. This should have
extended to AAN levels as well, but the concentration was higher in the GS-CF yogurt than in the
Control after 3 days of storage. The higher AAN content in the GS-CF yogurt could be linked to its
superior bacterial populations, resulting in a higher overall proteolytic activity (Shihata & Shah, 2000).
Regarding the syneresis, the results obtained from the Control yogurt were lower than the results
obtained by other studies that also used the centrifugation analytical method with regular stirred
yogurt (Amatayakul et al., 2006; González-Martínez et al., 2002; Mani-López et al., 2014). However,
highly variable values were obtained between the different yogurts of those same studies, ranging
between 23 % and 80 % depending on the total solids content of the yogurt and the bacterial cultures
66
used. Moreover, higher syneresis values were obtained in the Control yogurt than in the Greek-style
products. The increase of total milk solids or proteins and the presence of exopolysaccharides (EPS)
are known to reduce syneresis (Amatayakul et al., 2006; Wacher-Rodarte & Farres, 1993).
Consequently, the higher protein content of the Greek-style yogurts and their higher populations of
starter bacteria, which were slime-producing cultures, have probably highly contributed to the
syneresis reduction in those products. Furthermore, the stability of the syneresis values during
storage is in accordance with the results obtained by Mani-López et al. (2014).
It should be noted that the results of composition and syneresis obtained with L. helveticus yogurts
cannot be extrapolated to the yogurts containing B. longum as the two species have a different
metabolism. During milk fermentation, L. helveticus R0052 uses more lactose and produces more
lactic acid than B. longum R0175, even when combine with a S. thermophilus strain (Champagne et
al., 2009). Moreover, B. longum is known to produce EPS (Audy et al., 2010; López et al., 2012;
Prasanna et al., 2012b) which, as mentioned above, can affect the texture and then the syneresis
index.
3.6.5 Survival of Lactobacillus helveticus R0052 during storage
The longer fermentation time of the 10.6% protein milk enabled extended growth of L. helveticus
R0052, when compared to the 4% protein milk. This resulted in higher bacterial counts in the GS-UF
yogurt than in the Control at the end of production. The greatest buffering capacity and higher AAN
content could explain the improved growth of L. helveticus in the UF milk (Beshkova et al., 1998;
Shihata & Shah, 2000). The higher counts obtained at the end of the production in the GS-CF yogurt,
in comparison with the Control, were rather attributable to their concentration during centrifugation,
where the bacteria tend to remain in the curd (Nsabimana et al., 2005).
Looking at the CFU results, L. helveticus stability during storage was improved in the GS-CF yogurt.
However, the population of the GS-UF yogurt suffered an important decline after two weeks of
storage. The same pattern was later observed in the regular stirred yogurt after 4 weeks of storage.
On the contrary, flow cytometry showed good apparent viability (FCV) in all three yogurt types until
the end of the storage period. With FC, dead counts (FCD) are based on the loss of cytoplasmic
67
membrane integrity. However, the CFU and FCV results suggest that the apparent mortality linked to
the loss of cultivability (CFU) was not due to the loss of membrane integrity. Conditions in the GS-UF
and Control yogurts prevented cell growth on the selective media without affecting their apparent
viability in FC assays. Neither pH nor lactic acid concentration was the sole factor to affect stability
during storage, since the highest stability of L. helveticus was not registered in the product having the
highest pH or the lowest lactic acid concentration. Further data are therefore needed to explain the
higher stability of the probiotic strain in GS-CF yogurt. In the regular stirred yogurt, less lactic acid
was produced, the proteolytic activity was very small and there was no concentration process
applied. Thus, the cessation of growth in that yogurt was more likely due to a lack of nutrients able to
fulfill L. helveticus auxotrophies, such as peptide fractions and free amino acids (Christensen &
Steele, 2003; Qingli et al., 2011; Shihata & Shah, 2000).
3.6.6. Survival of Streptococcus thermophilus during storage
The increase of S. thermophilus biomass during fermentation is almost identical to another study that
used a starter culture originated from the same company (Mani-López et al., 2014). The slightly
higher counts obtained in the GS-UF yogurt, in comparison with the Control, are in accordance with
the results obtained by Ozer and Robinson (1999) who had higher and stable counts of S.
thermophilus and L. bulgaricus in a milk that had been concentrated by ultrafiltration. As it was the
case for L. helveticus, the higher counts of S. thermophilus in the 10.6% protein milk could be
associated with the longer fermentation and higher stimulatory factors content of the milk, since
casein fractions can improve S. thermophilus growth (Qingli et al., 2013; Qingli et al., 2011). The high
lactic acid level probably contributed to stopping S. thermophilus growth in the 10.6% protein milk
(Ozer & Robinson, 1999). Therefore, the higher counts were obtained in the GS-CF yogurt. The
difference between the counts in this yogurt and the Control one corresponds to the concentration
factor of the centrifugation step. After production, the S. thermophilus populations remained stable in
all three yogurt types during all the 44 days of storage, which is also consistent with other studies
(Damin et al., 2008; Gueimonde et al., 2004; Mani-López et al., 2014; Ozer & Robinson, 1999).
68
3.7 Conclusion
In conclusion, the processes used to increase the protein concentration of Greek-style yogurt
influence many attributes of the products, including the growth and the viability of probiotic bacteria.
Numerous environmental stresses occurring during Greek-style yogurt production seem to prevent
the viability improvement of more sensitive probiotic bacterial strains as B. longum R0175. On the
other hand, viable counts of more tolerant strains, such as L. helveticus R0052, can be increased
during Greek-style yogurt production. Moreover, concentration of the yogurt by centrifugation seems
to provide a more suitable matrix to enhance cell activity and growth of probiotic bacteria similar to L.
helveticus during storage. Further research would be necessary to understand the best stability of L.
helveticus in Greek-style yogurt produce by centrifugation, and to see if the data obtained with L.
helveticus R0052 can be extrapolated to other lactobacilli strains currently used as probiotics. Further
research will also be needed to ascertain if the better stability during storage in some Greek-style
products can be extended to a better survival through digestion.
69
3.8 Acknowledgements
This project was funded by Novalait and Fonds de recherche du Quebec – Nature et Technologie
(FRQNT). Yogurt starters were graciously provided by DuPont Nutrition & Health (Mississauga, ON,
Canada), while the probiotic strains and labelled antibodies were provided by Lallemand Health
Solutions (Montreal, QC, Canada). Aliments Ultima (Granby, Qc, Canada) kindly provided the
commercial plastic cups for yogurt storage. We also thank Marie-Josée Lemay, Gaétan Bélanger, Dr
Daniel St-Gelais, Annie Caron and Hélène Drolet, from Saint-Hyacinthe Research and Development
Center (Agriculture and Agri-Food Canada, Saint-Hyacinthe, Qc, Canada) for their technical advice,
contribution and assistance.
70
Chapitre 4: Fate of Escherichia coli and
Kluyveromyces marxianus contaminants during
storage of Greek-style yogurt produced by
centrifugation or ultrafiltration
Andréanne Moineau-Jean1,2, Evelyne Guévremont3, Claude P. Champagne2,3, Denis Roy1,2, Yves
Raymond3, Gisèle LaPointe2,4
1 Department of Food Science, Pavillon Paul-Comtois, Office 1312, 2425 rue de l’Agriculture, Laval University,
Quebec City, QC, G1V 0A6, Canada
2 Institute of Nutrition and Functional Foods (INAF), Pavillon des Services, 2440 Hochelaga Blvd, Laval
University, Quebec City, QC, G1V 0A6, Canada
3 Saint-Hyacinthe Research and Development Centre, Agriculture and Agri-food Canada (AAFC), 3600
Casavant Blvd West, Saint-Hyacinthe, QC, J2S 8E3, Canada
4 Department of Food Science, 50 Stone Road East, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada
Corresponding Author: Dr. Claude P. Champagne Saint-Hyacinthe Research and Development Center Agriculture and Agri-Food Canada 3600 Casavant Blvd West, Saint-Hyacinthe, Qc J2S 8E3, Canada Phone number: 450-773-1105 Email address: [email protected] Published in International Dairy Journal, 72, p. 36-43 DOI: 10.1016/j.idairyj.2017.04.002 Accepted: 4 April 2017 Available online: 14 April 2017
71
4.1 Résumé
La production des yogourts de type grec nécessite plus d’étapes que celle des yogourts réguliers, ce
qui augmente la possibilité de contamination par des microorganismes pathogènes ou altérants. Le
but de cette étude était de comparer la croissance et la survie de deux contaminants microbiens
(Escherichia coli et Kluyveromyces marxianus) dans deux yogourts de type grec produits par
centrifugation ou ultrafiltration, et dans un yogourt brassé régulier, durant l’entreposage. La souche
E. coli ATCC® BAA-1430™ s’est avérée être une souche de substitution adéquate dans le yogourt
pour la souche pathogène E. coli O157: H7. Le pouvoir tampon accru des yogourts de type grecs
produits par ultrafiltration du lait a mené à une diminution de la viabilité d’E. coli durant l’entreposage.
D’un autre côté, les yogourts de type grecs semblent promouvoir une croissance plus rapide de la
levure laitière K. marxianus durant l’entreposage à 4°C.
72
4.2 Abstract
The production of Greek-style yogurts requires more processing steps than traditional yogurt, which
increases the possibility of microbial contamination by pathogens or spoilage organisms. The aim of
this study was to compare the growth and survival of two microbial contaminants (Escherichia coli
and Kluyveromyces marxianus) in Greek-style yogurt produced by centrifugation or ultrafiltration,
compared to regular stirred yogurt, during storage. E. coli strain ATCC® BAA-1430™ was shown to
be a suitable surrogate for pathogenic O157: H7 in yogurt. The increased buffering capacity of the
Greek-style yogurts produced from ultrafiltered milk led to lower E. coli viability during storage. On the
other hand, the Greek-style yogurt seems to promote faster growth of the dairy yeast K. marxianus at
a storage temperature of 4°C.
73
4.3 Introduction
Greek-style yogurts, which have a creamy texture and are described as natural, nutritional and low in
fat, have become very popular in North America in the past few years (Wouters, 2012). Better known
as “Strained yogurt” in Europe and as “Labneh” in the Middle East, these yogurts are characterized
by high protein content, usually around 9% to 10%. Traditionally, the fermented curd was strained in
a cloth bag to increase the total solids content. Nowadays, concentration of the curd can be achieved
more efficiently by centrifugation. Protein content can also be increased by addition of milk
ingredients such as protein concentrates or by ultrafiltration of milk prior to fermentation. Composition
of the resulting yogurts will differ according to the method used to increase the protein content
(Nsabimana et al., 2005; Ozer et al., 1999a; Ozer et al., 1999b; Tamime & Robinson, 2007).
Unfortunately, the additional processing step that is required to reach the protein content desired for
Greek-style yogurt enhances the risk of microbial contamination during manufacturing.
There are data on the evolution of pathogens in traditional yogurt, which typically has a pH of 4.5 and
4% protein content. Thus, yogurt has long been known to have antibacterial effects against some
pathogenic bacteria such as Salmonella, Shigella, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli
(Alm, 1983; Jasjit et al., 1979; Kotz et al., 1990; Rubin & Vaughan, 1979; Schaack & Marth, 1988).
This antibacterial activity is mainly due to its acidic pH and lactic acid content, which is produced by
the lactic acid bacteria (LAB) used as a starter culture. LAB are known to produce many antibacterial
metabolites such as lactic acid and other organic acids, bacteriocins, diacetyl, acetaldehyde, ethanol,
and hydrogen peroxide (Fooladi et al., 2014; Mohammed & Ijah, 2013; Nassib et al., 2006). Their
considerable biomass allows them to outcompete undesirable microorganisms for nutrients and
space. Indeed, starter bacteria counts can increase by more than two Log CFU/g during fermentation
and remain stable during yogurt storage, even in the presence of microbial contaminants (Al-
Kadamany et al., 2002; Canganella et al., 1998; Cutrim et al., 2016; Osaili et al., 2013; Tirloni et al.,
2015). Furthermore, several studies reported that low pH has a bacteriostatic effect on several
pathogenic bacteria, such as E. coli O157: H7, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Shigella
flexneri, and vegetative cells of Bacillus cereus (Conner & Kotrola, 1995; Glass et al., 1992; Guraya
et al., 1998; Kotz et al., 1990; Nicolò et al., 2011). However, Kotz et al. (1990) concluded that both
low pH and the presence of LAB are required for yogurt to have bactericidal activity against E. coli.
74
Nonetheless, enterohemorrhagic E. coli O157: H7 seems to have a good tolerance to acidic
environments (Benjamin & Datta, 1995; Brudzinski & Harrison, 1998; Conner & Kotrola, 1995;
Dlamini & Buys, 2009; Guraya et al., 1998; Jyhshiun et al., 1996; Kim et al., 2015; Large et al., 2005).
Moreover, Glass et al. (1992) showed that E. coli O157: H7 is able to grow at pH levels between 4.5
and 9.0 at 37°C. An outbreak due to O157: H7 in England in 1991 was linked to contaminated
yogurts (Morgan et al., 1993). Its survival in yogurt was later confirmed by several studies (Arican &
Andic, 2011; Cutrim et al., 2016; Evrendilek, 2007; Osaili et al., 2013). This is a worrisome finding,
since E. coli O157: H7 is a major cause of hemorrhagic colitis and hemolytic-uremic syndrome. It is
estimated to cause about 73,000 illnesses each year in the United States (Rangel et al., 2005).
Therefore, it is important to examine how food processing can prevent the growth of acid-tolerant
pathogens or reduce their survival.
Yogurt is also subject to spoilage caused by acid-tolerant fungi (Fleet, 1990; Ledenbach & Marshall,
2010). Additionally, some of these organisms may pose a risk to consumer health. Indeed, invasive
infections in immunocompromised people have been linked to contamination of yogurt and other
dairy products with harmful fungi (Gurgui et al., 2011; Lazar et al., 2014; Pineda et al., 2012). In
2013, a major recall of Chobani brand Greek-style yogurts was issued in the United States because
the product was contaminated with a mold, which was identified as Mucor circinelloides. More than
200 people reported falling ill after consuming the contaminated yogurts (FDA, 2013; Lee et al.,
2014). Although most of the fungal contaminants are considered harmless to healthy people
(Benedict et al., 2016), they can still have major impacts on the sensory properties of food, which can
affect consumer acceptance and lead to considerable food losses and waste.
Yeasts in the genus Kluyveromyces are among the harmless fungi frequently found in fermented
dairy products (Canganella et al., 1998; Corsetti et al., 2001; Fasoli et al., 2015; Gadaga et al., 2001;
Giudici et al., 1996; Kavas et al., 2006; Tofalo et al., 2014; Vardjan et al., 2013; Viljoen et al., 2003).
With its rapid growth, metabolic diversity, high proteolytic activity and ability to metabolize lactose, the
species Kluyveromyces marxianus can easily cause yogurt spoilage (Fonseca et al., 2008; Giudici et
al., 1996; Lane et al., 2011; Naumova et al., 2012; Rubio-Texeira, 2006; Salomskiene & Macioniene,
2009; Viljoen et al., 2003). Moreover, this yeast has the capacity to grow at high (> 42°C) and low
(4°C) temperatures (Fonseca et al., 2008), which means that it can develop during the fermentation
75
process and during refrigerated storage. An important level of genetic polymorphism within the
species K. marxianus has produced major differences between strains in terms of metabolism. The
species can metabolize a wide variety of substrates and produce a wide variety of volatile aromatic
compounds, which can contribute positively or negatively to the development of flavors (Fabre et al.,
1995; Fasoli et al., 2015; Fonseca et al., 2008; Salomskiene & Macioniene, 2009; Tofalo et al., 2014;
Viljoen et al., 2003). Although this yeast is not a health concern, and several strains are generally
recognized as safe (GRAS) (Fonseca et al., 2008), it still raises economic concerns related to yogurt
quality and preservation.
The majority of the studies concerning the survival of microbial contaminants in yogurt have been
done with regular stirred or set yogurts. Moreover, most of the studies on Greek-style yogurt have
compared the impact of processing methods on the rheological and sensory properties of yogurt, but
very few studies have examined their effect on the microorganisms (Bong & Moraru, 2014; Kilara &
Chandan, 2013). With their greater nutritional value and their enhanced buffering capacity due to
their higher protein content, Greek-style yogurts produced by centrifugation and ultrafiltration could
potentially promote the growth of spoilage yeasts and be less detrimental to pathogenic bacteria
during storage than regular stirred yogurts. Thus, the aim of this study was to compare the growth
and survival of two microbial contaminants (E. coli and K. marxianus) in Greek-style yogurt produced
by centrifugation or ultrafiltration, compared to regular stirred yogurt, during storage.
76
4.4 Materials and methods
4.4.1 Microorganisms and media
Kluyveromyces marxianus (ATCC® 36907™), Escherichia coli O157: H7 (ATCC® 43895™), and one
non-pathogenic strain of Escherichia coli (ATCC® BAA-1430™) were used in this study. Freeze-dried
cultures were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA).
Stock cultures were prepared in a BHI-glycerol solution and stored at -80°C as described by
Champagne et al. (2014). Before use, the yeast stock culture was thawed and grown in BD Difco™
Yeast Mold broth (YM, BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) at 25°C for 24 h with agitation at
175 rpm, in order to obtain a final concentration of 4 x 108 CFU/mL. The population was determined
by the spread plate technique on YM agar following 72 h incubation at 25°C in aerobic conditions.
The E. coli stock cultures were thawed and then grown in a BBL™ Trypticase™ Soy broth (TSB, BBL
Becton Dickson and Company, Cockeysville, MD, USA) at 37°C for 16 h without agitation, in order to
obtain a final concentration of 9 x 108 CFU/mL. The E. coli population levels were determined by the
spread plate technique using BD Difco™ MacConkey agar (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD,
USA) incubated at 37°C for 24 h.
Two lactic acid bacterial strains obtained from Lallemand Health Solutions (Montreal, QC, Canada)
were used as yogurt starters: Streptococcus thermophilus R0083 and Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus HA-137 (see culture selection in Appendix 2). For cellular counts of the freeze-
dried cultures, powders were rehydrated at a ratio of 1:10 in a broth composed of BD Bacto™
Peptone (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA), Tween® 80 (Sigma-Aldrich Canada Co.,
Oakville, ON, Canada), sodium ascorbate (Sigma-Aldrich Canada Co., Oakville, ON, Canada) and L-
cysteine (Sigma-Aldrich Canada Co., Oakville, ON, Canada) preheated at 37°C. The suspension was
homogenized at 27,000 rpm for 30 seconds with an Omni THQ Homogenizer (Omni International,
Kennesaw, GA, USA), and incubated at 37°C for 15 min. A volume of 1 mL of the cultures was
transferred to 9 mL of 1% peptone water and homogenized again to destroy most of the cell
aggregates. The population levels of the hydrated cultures were determined by the pour plate
technique in BD Difco™ M17 agar (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) for S. thermophilus
and in BD Difco™ MRS agar (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) for L. bulgaricus. The
77
plates were incubated at 37°C for 48 h under aerobic and anaerobic conditions for S. thermophilus
and L. bulgaricus, respectively.
4.4.2 Milk preparation
Two different milk solutions were prepared in a pilot plant facility from a low heat skim cow milk
powder (Dairytown Processing Ltd., Studholm, NB, Canada). The first solution was prepared by
rehydrating the skim milk powder to obtain a 4% protein content (Milk 1) which was stored overnight
at 4°C. For the second solution, skim milk powder was rehydrated to obtain a 3.1 % protein content
which was then pasteurized at 75°C for 18 seconds and ultrafiltered (50°C, 30 psi, 4–6 m/s) to obtain
a 10.6% protein milk (Milk 2). Pasteurization prior to ultrafiltration was carried out as a precautionary
measure to ensure microbiological quality of milk, because the ultrafiltration step was carried out in a
batch process that could have allowed limited bacterial growth. The ultrafiltration system was
equipped with 50-PM Romicon Hollow Fiber Cartridges (Koch Membrane Systems, Wilmington, MA,
USA) having a 50,000 Da cut-off. The two types of milk were then stored at -20°C in 4-L plastic
buckets for use in subsequent experiments. Milk samples were analyzed with a MilkoScan™ FT-120
Analyzer (Foss, Hilleroed, Denmark) and a Vario Max Cube Analyzer (Elementar, Langenselbold,
Germany) to confirm their protein content. The buffering capacity of the milk solutions was
determined by measuring the amount of 0.1 N HCl required to reduce the pH of the sample from its
initial pH level to 4.0. Measurements were made three times for each milk matrix.
4.4.3 Yogurt production
9 L of 4% milk (Milk 1) and 3 L of 10.6% milk (Milk 2) were thawed at 4°C and heat treated at 90°C
for 10 min in an autoclave operated in isotherm program. The two milk solutions were then cooled to
42°C and separated into 3-L fractions in sanitized plastic buckets. A small volume of milk 1 was used
to rehydrate the starter cultures at 42°C for 5 min (S. thermophilus) or 10 min (L. bulgaricus). The
starter cultures were then added to the milk solutions using inoculation rates of 3 x 107 and 3 x 105
CFU/mL for S. thermophilus and L. bulgaricus, respectively (see selection of inoculation rates in
Appendix 2). Fermentation took place at 42°C in a Fermentation Acquisition and Control System
(FACS) (Agriculture and Agri-Food Canada, Saint-Hyacinthe, QC, Canada) which allows continuous
78
measurements of temperature and pH. When the pH had fallen to 4.8 (Figure 4.1), the fermentation
was stopped by cooling the mixture to 18°C. Two types of yogurt were obtained; 9 L of regular stirred
yogurt (Control) and 3 L of Greek-style ultrafiltered (GS-UF) yogurt (Table 4.1).
Table 4.1. Relevant characteristics of the milk bases and the three yogurts produced for the comparative study
of the microbial contaminant populations.
Product Protein content
(%) Buffering capacity
(mol HCl /100 mL milk)
Milk 1 4.0 ± 0.01 0.008 ± 0.00
Milk 2 10.6 ± 0.02 0.016 ± 0.00
Control 4.1 ± 0.03 ND
GS-CF 10.3 ± 0.09 ND GS-UF 11.0 ± 0.02 ND
ND: not determined
A 3 L portion of stirred yogurt was kept as Control (Table 4.1). The remaining 6 L of stirred yogurt
was distributed in 1-L polypropylene bottles and centrifuged at 6000 x g for 5 min at 18°C (Beckman
Coulter Avanti™ J-20XPI centrifuge with a JLA 8.100 rotor). The whey was discarded, the
concentrated curds were pooled, and the concentration of protein was adjusted by adding the
required quantity of whey (see development of centrifugation method in Appendix 2). This process
gave the Greek-style centrifuged (GS-CF) yogurt (Table 4.1).
4.4.4 Contamination with yeast and E. coli surrogate cultures
The study was designed to simulate a contamination occurring after fermentation (centrifugation or
packaging). For this purpose, K. marxianus culture or E. coli surrogate culture was added to 3 L of
yogurt to obtain an inoculation rate of 1 x 105 CFU/mL. A hand mixer was used to produce mixed and
smoothed yogurts. Their pH levels were adjusted to 4.65 ± 0.05 with a 25% lactic acid solution to
have a uniform pH values between products at the beginning of the storage. The yogurts were mixed
well, separated into 100 mL samples in small plastic containers, and stored in a 4°C refrigerated
room. After 24 h, half of the containers were placed in an 8°C refrigerated unit, and the other half left
79
at 4°C. The yogurts contaminated with E. coli were stored for 27 days and the ones contaminated
with K. marxianus were stored for 43 days.
4.4.5 Comparison of the two Escherichia coli strains
Because of our production methods and because of biosafety issues, it was not possible to use the
pathogenic strain E. coli O157: H7 in our pilot plants. To avoid unnecessary risks, we used the non-
pathogenic E. coli strain ATCC® BAA-1430™ as a surrogate, after comparing it to a pathogenic
strain in small-scale assays carried out in a Biosafety Level (BL) 2 containment facility. Thus, before
starting the pilot plant experimentations, the fate of the E. coli surrogate strain (ATCC® BAA-1430™)
in yogurt was evaluated in order to verify if this strain’s behavior was similar to that of a pathogenic
O157: H7 strain (ATCC® 43895™). The 4% protein Control yogurt was used for this purpose.
Contamination at a rate of 1 x 105 CFU/mL was carried out directly in the small containers, after the
smoothing step with the hand mixer. The contaminant was added at this point, rather than prior to the
smoothing step, to avoid generating aerosols containing pathogenic bacteria in the BL-2 laboratory.
The yogurts were stored at 4°C for 28 days and 7 samplings were taken to perform microbial counts.
4.4.6 Yogurt analyses
For the enumeration of microorganisms, a small container of stored yogurt was mixed thoroughly with
a sterile spoon, and 11 g of the sample was put in a Fisherbrand™ Lab Blender polyethylene bag
(Ottawa, ON, Canada) along with 99 mL of 1% peptone trisodium citrate buffer (Sigma-Aldrich
Canada Co., Oakville, ON, Canada). The sample was homogenized in a Stomacher® 400 Circulator
(Seward, Worthing, UK) for 1 min at 230 rpm. Then, ten-fold dilutions were made in 1% peptone
water. Enumeration was performed by the spread plate technique with 100 µL of the appropriate
dilution, in duplicate.
For the enumeration of K. marxianus, the samples were plated on EMD Millipore™ Dichloran Rose
Bengal Chloramphenicol (DRBC) agar media and incubated at 25°C for 72 h in aerobic conditions,
with protection from light. For the enumeration of E. coli, the samples were plated on a BD Difco™
MacConkey agar media and incubated at 37°C for 24 h in aerobic conditions. S. thermophilus counts
80
were obtained on M17 agar after incubation of plates at 37°C for 48 h in aerobic conditions. The
development of the selective enumeration methods is presented in Appendix 2.
During the fermentation step, the pH level was measured using the FACS equipped with red rod
Radiometer analytical pH electrodes (Hach, London, ON, Canada). During the rest of the production
steps and during storage, pH was measured using a portable pH meter (Oakton Instruments, Vernon
Hills, IL, USA) with a Fisher Scientific™ Accumet™ refillable glass pH electrode (Fisher Scientific,
Ottawa, ON, Canada).
4.4.7 Statistical analyses
A split-plot design was used to compare the two E. coli strains (O157: H7 and surrogate). The two
strains were considered as the main plot and the days of storage as the subplot factor. A split-split-
plot design was used to compare the influence of the production processes and the storage
temperatures on the K. marxianus and E. coli surrogate counts. The three processes were
considered as the main plot, the two temperatures as the sub-plot, and the days of storage as the
sub-sub-plot factor.
The experiments were repeated three times, with new batches of yogurt produced for each repetition.
ANOVA and least squares means analyses with a probability threshold of 0.05 were performed (SAS,
Toronto, ON, Canada) on data from the above-mentioned designs to compare the effects of the
different factors on the microbial counts.
81
4.5 Results
4.5.1 Fermentation process
Milk 1 had an initial pH of 6.75 ± 0.01, while the pH of Milk 2 was 6.86 ± 0.01. The time required to
reach a pH level of 4.8 during fermentation differed in the two types of milk. In Milk 1, it took 7 hours
on average to reach a pH level of 4.8 at 42°C, compared with 17 hours for Milk 2 (Figure 4.1).
Figure 4.1. Effect of the protein content of the milk matrix on the fermentation profiles of the starter bacteria
Streptococcus thermophilus R0083 and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus HA-137 (100:1 ratio) at
42 °C. Error bars represent the Standard Error of the Mean (SEM).
The viable counts of S. thermophilus in the Control, GS-CF and GS-UF were respectively of 1.4 x
109, 2.3 x 109 and 4.0 x 109 CFU/g. The CFU readings were very constant between the 3 assays and,
although differences were small, they were found to be statistically significant (p > 0.05). The three-
fold increase of CFU in GS-CF is in line with the concentration factor of the Control curd during
centrifugation. Thus, cells mostly remained in the curd during processing, rather than being released
in the yogurt whey.
Fermentation profils in the two milks (4% protein and 10% protein)
Time (hours)0 5 10 15
pH
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Milk 1: 4% Protein
Milk 2: 10.6% Protein
82
4.5.2 Comparison of the two Escherichia coli strains
The pathogenic E. coli O157: H7 ATCC® 43895™ population showed a 1.4 Log CFU/g decrease
over the 28-day storage period at 4°C (Figure 4.2), while the population of the E. coli surrogate strain
ATCC® BAA-1430™ decreased by 1.6 Log CFU/g. However, this small difference between the two
strains was not significant (p > 0.05). In fact, for each day of sampling, none of the bacterial counts
differed significantly between the two strains, except on day 21 (Figure 4.2). The results obtained for
the Control yogurt suggest that the surrogate strain had a viability pattern similar to that of the O157:
H7 strain in this matrix. Larger-scale experiments with the Greek-style yogurt products were therefore
carried out based on the assumption that the surrogate strain provided a good indication of how a
pathogenic E. coli O157: H7 strain would react in these matrices.
Figure 4.2. Comparison between a pathogenic Escherichia coli O157: H7 (ATCC® 43895™) strain and a non-
pathogenic E. coli surrogate strain (ATCC® BAA-1430™). Both strains were cultured separately in two regular
stirred yogurts stored at 4 °C. The letters indicate for each day of storage if the counts of the two stains are
significantly different; values with the same letters are not significantly different (p < 0.05) from one another.
Error bars represent the Standard Error of the Mean (SEM).
E. coli surrogate vs O157:H7
Storage (days)
0 5 10 15 20 25 30
Ba
cte
ria
l C
ou
nt (L
og
CF
U/g
)
3,5
4,0
4,5
5,0
E. coli surrogate
E. coli O157:H7
a
aa
a
a
aa
a
a
a
a
a
a
b
83
4.5.3 Survival of Escherichia coli surrogate in yogurt
For the first six days of storage, there was no significant difference (p > 0.05) between the three
yogurts, the two temperatures or the days of storage (Figure 4.3). Differences began to appear on
day 15.
Figure 4.3. Population of Escherichia coli surrogate ATCC® BAA-1430™ in regular stirred yogurt (Control)
and Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4°C and
8°C. Values at Day 0 constitute the inoculated counts in yogurts, while values at Day 1 represent those in the
fresh products. The letters indicate for each day of storage if the counts in the three yogurts are significantly
different; values with the same letters are not significantly different (p < 0.05) from one another. Error bars
represent Standard Error of the Means (SEM).
For the yogurts stored at 4°C, there was no difference (p > 0.05) between the Control and the GS-CF
yogurts during the 27 days of storage. The E. coli ATCC® BAA-1430™ populations showed a 0.8 to
0.9 Log CFU/g total decrease over the 27 days in both yogurts. However, the GS-UF yogurt differed
significantly (p < 0.05) from the Control on days 15 and 27, with an E. coli population that was 0.2
Log CFU/g lower than the Control on day 15, and 1.4 Log CFU/g lower on day 27. Therefore, a 2.2
CFU E. coli surrogate during storage
Storage (days)0 10 20 30
Ba
cte
ria
l C
ou
nt (L
og
CF
U/g
)
2
3
4
5
Control 4°C
GS-CF 4°C
GS-UF 4°C
Control 8°C
GS-UF 8°C
GS-CF 8°C
bc
ab
a
a
b
c
d
c
d
e
84
Log CFU/g total decrease in the E. coli population was observed in the GS-UF yogurt stored at 4°C
during 27 days of storage.
During storage at 8°C, significant differences (p < 0.05) were observed for GS-UF yogurt on day 15
and for all yogurt types on day 27. Overall, the E. coli populations in the yogurts stored at 8°C
decreased by a total of 1 Log CFU/g in the Control, 1.7 Log CFU/g in the GS-CF, and 3 Log CFU/g in
the GS-UF yogurt, in 27 days.
Finally, the E. coli populations were significantly lower (p < 0.05) in the yogurts stored at 8°C than in
those stored at 4°C, at days 15 and 27, except for the GS-CF yogurt on day 15.
4.5.4 Growth of Kluyveromyces marxianus in yogurt
The yeast K. marxianus grew well regardless of the yogurt type or the storage temperature. However,
its growth was faster (p < 0.05) in the yogurts stored at 8°C, for which a 2 Log CFU/g increase was
recorded in just one week (Figure 4.4). After that, at 8°C, the populations stabilized around 7.3 Log
CFU/g in all three yogurts. For the yogurts stored at 4°C, growth was slower and it took a week more
for a 2 Log CFU/g increase to be observed in the Greek-style yogurts. At days 15 and 27, the K.
marxianus cell counts at 4°C were slightly lower (p < 0.05) in the Control yogurt. However, at day 42,
the populations stabilized at around 7.2 Log CFU/g. The K. marxianus population was slightly lower
(p < 0.05) in the Control than in the Greek-style yogurts, with a maximum of 7 Log CFU/g. The type of
yogurt did not affect growth patterns at 8°C, but growth was slightly more rapid in the Greek-style
yogurts at 4°C, as compared to the Control.
85
Figure 4.4. Population of Kluyveromyces marxianus ATCC® 36907™ in regular stirred yogurt (Control) and
Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-CF) or ultrafiltration (GS-UF) during storage at 4 °C and 8 °C.
Values at Day 0 constitute the inoculated counts in yogurts, while values at Day 1 represent those in the fresh
products. The letters indicate for each day of storage if the counts in the three yogurts are significantly
different; values with the same letters are not significantly different (p < 0.05) from one another. Error bars
represent the Standard Error of the Mean (SEM).
4.5.5 pH profiles during storage
The acidification profiles of the yogurts contaminated with E. coli were almost identical for the GS-CF
and the Control (Figure 4.5). In fact, the pH values were significantly different (p < 0.05) only on day 6
for the yogurts stored at 4°C. The pH values of the two yogurts decreased faster during the first week
of storage, and then tended to stabilize at around 4.5 (4°C) and 4.45 (8°C). In the case of the GS-UF
yogurt, the pH remained at a higher level than the two other yogurts. The pH decreased steadily and
stabilized at around 4.6 at 4°C, whereas at 8°C, it continued to decline after 27 days. Overall, there
was no difference (p > 0.05) in the acidification profiles between the two storage temperatures.
CFU K. marxianus during storage
Storage (days)0 10 20 30 40
Mic
rob
ial C
ou
nt (L
og
CF
U/g
)
5
6
7
Control 4°C
GS-CF 4°C
GS-UF 4°C
Control 8°C
GS-CF 8°C
GS-UF 8°C
c
b
b
d
c
a
b
cab
aa
a
a
86
Figure 4.5. pH of the regular stirred yogurt (Control) and the Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-
CF) or ultrafiltration (GS-UF), which were contaminated with Escherichia coli surrogate ATCC® BAA-1430™,
during storage at 4 °C and 8 °C. Values at Day 0 constitute the pH value at the end of production, while values
at Day 1 represent those in the fresh products. The letters indicate for each day of storage if the pH levels in
the three yogurts are significantly different; values with the same letters are not significantly different (p < 0.05)
from one another. Error bars represent the Standard Error of the Mean (SEM).
As was noted for the products contaminated with the E. coli surrogate ATCC® BAA-1430™, the
acidification profiles of the yogurts contaminated with K. marxianus were not significantly affected by
storage temperature (p > 0.05). However, they differed among the three kinds of yogurt (p < 0.05).
The Control yogurt had a traditional acidification profile, with a slight decline in the pH during the first
week of storage, followed by stabilization at around 4.5 (Figure 4.6). Appreciable post-acidification
was observed in the GS-CF yogurt, where the pH dropped to 4.4 in one week and stayed around 4.4
until the end of storage. The GS-UF yogurt had higher pH values throughout storage than the two
others.
pH E. coli surrogate during storage
Storage (days)0 10 20 30
pH
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8Control 4°C
GS-CF 4°C
GS-UF 4°C
Control 8°C
GS-CF 8°C
GS-UF 8°C
a
b
a
b
b
a
c
a
a
b
b
b
b
b
cd
bc
d
87
Figure 4.6. pH of the regular stirred yogurt (Control) and the Greek-style yogurts made by centrifugation (GS-
CF) or ultrafiltration (GS-UF), which were contaminated with Kluyveromyces marxianus ATCC® 36907™,
during storage at 4 °C and 8 °C. Values at Day 0 constitute the pH value at the end of production, while
values at Day 1 represent those in the fresh products. For the corresponding days of storage, the letters
indicate if the pH levels in the three yogurts are significantly different; values with the same letters are not
significantly different (p < 0.05) from one another. Error bars represent the Standard Error of the Mean (SEM).
pH K. marxianus during storage
Storage (days)
0 10 20 30 40
pH
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8
Control 4°C
GS-CF 4°C
GS-UF 4°C
Control 8°C
GS-CF 8°C
GS-UF 8°C
a
a
a
a
b
a
b
bb
b
cdc
cd
a
a
a
aab
bc
bbc
bd
c d
88
4.6 Discussion
4.6.1 Fermentation profiles
The microbial contaminants were inoculated into the yogurts after the fermentation step to ensure
that the effects observed on the populations were caused by the different yogurts themselves, and
not by the fermentation, which has variable effects on the storage stability of bacteria (Hsin-Yi &
Chou, 2001; Settachaimongkon et al., 2015; Tirloni et al., 2015).
Due to a higher buffering capacity, fermentation took 17 h in the 10.6% milk as compared to 7 h in
the 4% milk. High protein concentration, along with salts and organic acids, are known to contribute
to the buffering capacity of milk (Li & Corredig, 2014; Lucey et al., 1993; Salaun et al., 2005).
4.6.2 Survival of Escherichia coli
The decline of the E. coli surrogate population that was observed in the regular stirred yogurts is
consistent with the results of some previous studies on the survival of E. coli during yogurt storage
(Cirone et al., 2013; Govaris et al., 2002; Lee & Chen, 2005). However, the bacterial counts
decreased at a slower rate than in several of those studies. This can be explained by the strains
used, the moment of inoculation, differences in final pH values, or greater tolerance of the strain to
acidic environments in this study (Buchanan & Edelson, 1999; Hsin-Yi & Chou, 2001; Jyhshiun et al.,
1996; Leyer et al., 1995).
The almost identical acidification profiles of the GS-CF yogurt and the Control yogurt at a storage
temperature of 4°C suggest that the low pH level was the main cause of the decrease in the E. coli
population. However, the difference in E. coli viability losses between the yogurts cannot be
attributed solely to pH, since the greatest population decline occurred in the GS-UF yogurt, which had
the highest pH values. That result can be explained by the higher buffering capacity of the GS-UF
yogurt. Similar results were obtained in a study on yogurt made from ultrafiltered goat milk, where the
pH remained at a higher level in a more concentrated yogurt (Domagala, 2012). Thus, the substantial
loss of viability of E. coli in the GS-UF yogurt is more likely due to a larger accumulation of lactic acid.
89
Buchanan and Edelson (1999) showed that lactic acid has considerable antimicrobial activity against
several E. coli O157: H7 strains and other biotypes. Furthermore, recent studies have shown that
casein hydrolysate can promote lactic acid production by the yogurt starter cultures (Qingli et al.,
2013; Qingli et al., 2011). That finding suggests that the higher casein content of the UF milk and its
longer fermentation could have led to an increase in lactic acid production.
In general, larger declines in E. coli populations were observed in the yogurts stored at 8°C then at
4°C. In other studies, better survival of E. coli was reported at 4°C compared to around 8–10°C
(Bachrouri et al., 2002; Hsin-Yi & Chou, 2001; Osaili et al., 2013). This is consistent with the fact that
LAB have a higher metabolic rate at 8°C (Russell, 2002), allowing them to better compete with E.
coli. This phenomenon was even more marked in the Greek-style yogurts, where the S. thermophilus
populations were higher due to the lengthy fermentation of the UF milk or by the centrifugation step.
These data on LAB are in line with those of Meijer et al. (1995) .
The pH values obtained in previous studies did not seem to differ significantly between the two
storage temperatures, as was the case for our results. This confirms that the appreciable
antimicrobial effect of Greek-style yogurts against E. coli is mostly attributable to higher accumulation
of antimicrobial compounds such as lactic acid.
4.6.3 Growth of Kluyveromyces marxianus
The rapid growth of K. marxianus and the slight difference observed in the viable counts between the
two temperatures are consistent with the findings of other studies on the presence of K. marxianus in
regular yogurt (Salomskiene & Macioniene, 2009; Viljoen et al., 2003). However, in the products
stored at 4°C, the yeast grew faster and reached a higher population level in the two Greek-style
yogurts than in the regular stirred yogurt, although its growth was similar in all products stored at 8°C.
The higher counts obtained in the Greek-style yogurts at 4°C could be attributable to greater protein
hydrolysis by the yeast (Chaves-Lopez et al., 2014) during storage. Tofalo et al. (2014) also showed
that some strains of K. marxianus have caseinolytic activity. However, there is no report indicating
that this is true for the strain used in the present study. Yeasts can benefit from higher quantities of
nutrients that can be easily assimilated, such as sugars, amino acids and nitrogen compounds, when
90
their metabolism is slowed down by low temperatures (Broach, 2012). It has also been shown that K.
marxianus can catabolize free amino acids released by starter bacteria activity (Cholet et al., 2007;
Tofalo et al., 2014). Moreover, some studies have reported a synergistic interaction between yeasts
and LAB in yogurt (Fleet, 1990; Viljoen et al., 2003), and it can be hypothesized that the same thing
occurred to a greater extent in the Greek-style yogurts stored at 4°C. However, this difference in
growth rates between Greek-style yogurt and regular stirred yogurt was not observed at a storage
temperature of 8°C. Greater stability of the yeast lactase (Fonseca et al., 2008) or higher proteolytic
activity of the starter cultures, even in the regular stirred yogurt, could be the reason. Thus, lactose
assimilation and nutrient availability would not be affected by the yogurt production method at 8°C
(Broach, 2012).
Furthermore, the low pH values of the yogurts did not prevent the growth of K. marxianus. It has been
shown in cheese that some K. marxianus strains can consume lactic acid and then contribute to the
deacidification of the curd (Tofalo et al., 2014). As the pH of the yogurts did not increase in parallel
with the yeast populations, lactate consumption was probably not extensive.
The rapid growth of K. marxianus in Greek-style yogurts stored at 4°C, combined with the amplified
potential for contamination due to processing conditions (longer fermentation in GS-UF and
centrifugation in GS-CF), suggests that there is an increased risk of yeast-induced spoilage in Greek-
style yogurts in comparison with regular stirred yogurt. Nevertheless, accidental contamination in
industrial conditions are not likely to occur at a scale equivalent to the inoculation rate used in this
study (1 x 105 CFU/mL).
91
4.7 Conclusion
In conclusion, this study confirmed the following data in the literature: 1) during yogurt manufacture,
the decrease rate of pH is slower in 10.6% protein UF-concentrated milk than in traditional 4% protein
milk, 2) viable counts of E. coli drop during storage, while those of K. marxianus increase; 3) the
decline in viability of E. coli is amplified during storage by incubating at 8°C rather than 4°C, while the
growth of K. marxianus is increased at 8°C. This study also provides the following new observations:
1) E. coli ATCC® BAA-1430™ had a similar viability pattern as E. coli O157: H7 ATCC® 43895™
during the storage in traditional yogurt and could be considered an appropriate surrogate to E. coli
O157: H7 for yogurt products; 2) viability losses of E. coli during storage of Greek-style yogurts were
higher than in traditional yogurts, particularly in UF-based products; 3) growth of K. marxianus at 4°C
was slightly more rapid in the Greek-style yogurts; 4) the pH of the GS-UF yogurts remained higher
during storage compared to the traditional and GS-CF products; 5) the storage temperature (4°C or
8°C) did not significantly affect the changes in pH of either of the three yogurt products.
Since the processes used to increase the protein concentration of Greek-style yogurts influence their
suitability for the growth and survival of undesirable microorganisms, further research on the effect of
yogurt composition on microbiota is needed to gain a better understanding of the enhanced
antibacterial effect of Greek-style yogurt, and to verify whether the data obtained with the surrogate
E. coli strain can be confirmed for other E. coli serotypes as well as other pathogenic species.
92
4.8 Acknowledgements
This work was supported by Novalait and the Fonds de recherche du Quebec – Nature et
Technologie. Yogurt starter cultures were graciously provided by Lallemand Health Solutions
(Montreal, QC, Canada). Aliments Ultima (Granby, Qc, Canada) kindly provided the commercial
plastic cups for yogurt storage. We also thank Sonia Lafleur, Marie-Josée Lemay, Gaétan Bélanger,
Daniel St-Gelais, Ph.D., Annie Caron and Hélène Drolet, from the Saint-Hyacinthe Research and
Development Centre (AAFC, Saint-Hyacinthe, QC, Canada) for their technical advice, scientific
contribution and assistance. Gratitude is also expressed to Barbara Chunn from Public Services and
Procurement Canada (AAFC) for English revision.
93
Conclusion générale
Ce projet avait comme objectif de déterminer l’impact de deux procédés de fabrication de yogourt de
type grec sur les populations de probiotiques et contaminants microbiens durant l’entreposage, et de
les comparer à une fabrication classique de yogourt brassé. L’hypothèse était que comparativement
à un yogourt brassé régulier, la forte teneur en protéines des yogourts de type grec augmenterait leur
pouvoir tampon, réduisant ainsi la baisse de pH associée à la sur-acidification durant l’entreposage
et, par conséquent, procurant des populations supérieures et plus stables de cultures lactiques et
probiotiques, tout en améliorant également la survie des contaminants microbiens fongiques et
bactériens. Pour atteindre le but et valider l’hypothèse émise, trois types de yogourt ont été produits;
un yogourt de type grec par ultrafiltration du lait, un yogourt de type grec par centrifugation du caillé,
puis un yogourt brassé régulier. La croissance et la survie du ferment S. thermophilus, de deux
souches probiotiques (B. longum R0175 et L. helveticus R0052), et de deux contaminants microbiens
(E. coli et K. marxianus) ont été suivies durant l’entreposage des yogourts. La composition et
certaines propriétés physicochimiques des yogourts probiotiques ont également été analysées.
L’étude sur l’impact des procédés de production sur les cultures lactiques et probiotiques (Chapitre 3)
a démontré que des yogourts de type grec produits par ultrafiltration du lait ou centrifugation du caillé
permettent d’augmenter les populations de cultures lactiques et d’une souche probiotique
comparativement à un yogourt brassé régulier. En effet, les populations de S. thermophilus et L.
helveticus R0052 étaient plus élevées dans les produits grecs que dans le yogourt régulier à la fin de
la production. De plus, les comptes viables de L. helveticus R0052 étaient plus stables durant
l’entreposage dans le yogourt centrifugé que dans le yogourt régulier. Toutefois, le chapitre a
également démontré que les yogourts de type grec n’ont pas d’effet bénéfique sur les souches
probiotiques ayant une sensibilité accrue aux stress environnementaux. En effet, les comptes viables
de B. longum R0175 ont décliné de façon importante dans les trois types de yogourts. L’hypothèse
que les produits HTP favoriseraient des populations de cultures lactiques et probiotiques plus
élevées et plus stables s’est ainsi avérée fondée avec L. helveticus seulement.
94
L’étude sur l’évolution des populations de levures contaminantes et de bactéries pathogènes
(Chapitre 4) a démontré que les yogourts de type grec fabriqués par ultrafiltration du lait ou
centrifugation du caillé sont sujets à une détérioration plus rapide que les yogourts brassés réguliers.
En effet, la croissance de la levure K. marxianus durant l’entreposage à 4°C était légèrement plus
rapide dans les produits grecs. De plus, la croissance plus rapide de K. marxianus durant
l’entreposage à 8°C a démontré qu’un mauvais contrôle de la température de réfrigération peut
accélérer la détérioration de tous les produits, sans distinction du procédé de fabrication employé.
Toutefois, le chapitre a aussi démontré que les yogourts de type grec issus de la centrifugation ou de
l’ultrafiltration sont autant, sinon plus, défavorables à la survie des bactéries pathogènes que les
yogourts réguliers. En effet, les comptes d’E. coli ont diminué de façon semblable durant
l’entreposage des yogourts centrifugé et régulier, mais de façon plus importante dans le yogourt
ultrafiltré. L’hypothèse que les produits HTP amélioreraient la survie de contaminants fongiques et
bactériens s’est avérée vraie pour K. marxianus uniquement.
Les procédés utilisés pour augmenter la teneur en protéines des yogourts de type grec influencent
donc la capacité des produits à promouvoir la croissance et la survie des bactéries lactiques et
probiotiques, ainsi que des contaminants microbiens. Cette influence varie toutefois selon les
espèces de microorganismes. Certaines analyses de composition et propriétés physicochimiques
effectuées donnent une indication des changements apportés à la matrice par les procédés qui
influencent le plus les communautés microbiennes des yogourts. Toutefois, davantage d’analyses
seraient nécessaires pour comprendre avec certitude l’effet antimicrobien supérieur des yogourts de
type grec produits par ultrafiltration du lait et l’effet stabilisateur supérieur des yogourts de type grec
issus de la centrifugation du caillé. Des études supplémentaires seraient également nécessaires pour
vérifier si l’effet antimicrobien contre E. coli peut aussi s’appliquer avec d’autres types de bactéries
pathogènes fréquemment associées aux produits laitiers, de même que pour vérifier si la stabilité
d’autres lactobacilles utilisés comme probiotiques serait également améliorée. De plus, une meilleure
stabilité des probiotiques durant l’entreposage des produits HTP soulève l’hypothèse d’une meilleure
survie durant la digestion. Des études seraient donc également requises afin de vérifier si les
probiotiques ajoutés aux yogourts de type grec produits par centrifugation auraient une meilleure
survie lors de la digestion que ceux ajoutés à un yogourt brassé régulier.
95
Les résultats obtenus dans le cadre de ce mémoire pourraient aider les industries à déterminer quel
procédé de fabrication serait le plus approprié selon leurs besoins et priorités. Grâce aux populations
probiotiques supérieures et plus stables pouvant être obtenues dans les yogourts de type grec
produits par centrifugation, l’adoption de ce procédé permettrait de réduire les quantités de
probiotiques nécessaires pour respecter les réglementations et par le fait même, réduire les coûts
associés à l’achat ou à la production de ces cultures. À l’inverse, grâce à l’effet antimicrobien
supérieur des yogourts de type grec produits par ultrafiltration, l’adoption de ce procédé permettrait
de réduire les risques de toxi-infections associés à la présence de bactéries pathogènes.
96
Annexes
Annexe 1. Procédés de concentration en protéines par séparation
du lait ou du caillé
Figure A1.1. Égouttage du caillé en sac de tissu sous l’effet de la gravité (a) ou par pressage (b). Tiré de
Karlien (2014).
a)
b)
97
Figure A1.2. Exemple de centrifugeuse industrielle appelée « séparateur à buses » pouvant être utilisée pour
concentrer le yogourt. Tiré de GEA Group (2016).
Figure A1.3. Fonctionnement interne d’un séparateur à buses. Image traduite tirée de Alfa Laval (2016).
Liquide non séparé
Liquide clarifié
Concentré
98
Figure A1.4. Exemple de système d’ultrafiltration pouvant servir à la concentration du lait. Tiré de REDA
(2017).
Figure A1.5. Fonctionnement interne d’une cartouche d’ultrafiltration. Image traduite tirée de Tetra Pak
(2003).
Flux d’alimentation
Membrane
Perméat (filtrat)
Concentré(rétentat)
Effet depolarisation
99
Annexe 2. Mise au point du dénombrement sélectif des
microorganismes et des méthodes de production des yogourts
A2.1 Choix des milieux sélectifs
Afin de suivre la croissance des probiotiques et des contaminants microbiens dans les yogourts
durant leur entreposage, il était d’abord nécessaire de trouver des milieux d’énumération sélectifs
pour chaque souche d’intérêt. Plusieurs milieux présentant un potentiel de sélectivité pour dénombrer
chacun des probiotiques, contaminants et ferments, ont été identifiés dans la littérature (Tableau
A2.1).
Tableau A2.1. Liste des milieux sélectifs sélectionnés parmi la littérature pour l’énumération sélective des
ferments, probiotiques et contaminants microbiens utilisés dans le projet.
Microorganisme Milieu Agent sélectif Référence
B. longum TOS-MUP Mupirocine Bunesova et al. (2015); ISO (2010) MRS-MUP Mupirocine Simpson et al. (2004) L. bulgaricus MRS-KAN Kanamycine Lallemand Solutions Santé (Montréal, Qc, Canada) MRS-F Fructose Tabasco et al. (2007) L. helveticus MRS-B Sels biliaires Lima et al. (2009); Vinderola et Reinheimer (2000) MRS-CIP Ciprofloxacine Verdu et al. (2008) MRS-CL Clindamycine D'Aimmo et al. (2007); Van de Casteele et al. (2006) S. thermophilus M17-L Lactose Tabasco et al. (2007); ISO (2003) E. coli MAC Sels biliaires et
Crystal violet Wilson (2001)
K. marxianus DRBC Chloramphénicol Beuchat et al. (2007); Tournas et al. (2007)
A2.1.1 Essai de milieux de culture
Des essais en bouillon et en gélose ont été faits simultanément afin de tester les différents milieux
sélectifs présélectionnés. Les tests ont été faits avec les ferments Streptococcus thermophilus R0083
et Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus HA-137 (Lallemand Solutions Santé, Montréal, QC,
Canada), les probiotiques Bifidobacterium longum ssp. longum R0175 et Lactobacillus helveticus
R0052 (Lallemand Solutions Santé), puis le contaminant bactérien Escherichia coli ATCC® BAA-
100
1430™ et le contaminant levurier Kluyveromyces marxianus ATCC® 36907™ (American Type
Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA).
A2.1.1.1 Essai en bouillon
Les lactobacilles L. bulgaricus et L. helveticus possèdent de grandes ressemblances métaboliques
qui rendent leur dénombrement sélectif difficile lorsqu’ils se retrouvent dans un même milieu. Des
essais de croissance en bouillon MRS ont ainsi été effectués pour tester différentes concentrations
de trois agents sélectifs (Tableau A2.2). Pour ce faire, les milieux ont d’abord été placés dans les
puits d’une microplaque, puis ils ont été inoculés avec chacune des souches (L. bulgaricus, S.
thermophilus, B. longum et L. helveticus) à un taux de 9 x 106 UFC/mL. Les plaques ont ensuite été
incubées dans un spectrophotomètre à 45°C durant 48 h, en aérobiose (MRS-CL) ou en anaérobiose
(MRS-B et MRS-KAN). Des lectures de densité optique ont été effectuées à 600 nm toutes les 15
minutes durant les 48 h d’incubation. La sélectivité des milieux a ensuite été déterminée en fonction
de la durée de la phase de latence, de l’intensité de la croissance, et de la vitesse de croissance (µ
max) des souches dans chacun des milieux. Les conditions permettant d’inhiber la croissance d’une
souche de lactobacille tout en permettant la croissance de l’autre étaient ainsi recherchées.
Tableau A2.2. Efficacité de milieux MRS supplémentés d’un agent sélectif à diverses concentrations pour
générer des croissances sélectives de L. helveticus et L. bulgaricus.
MRS-CL MRS-B MRS-KAN
Concentration clindamycine
(mg/L) Sélectivité
Concentration sels biliaires
(mg/L) Sélectivité
Concentration kanamycine
(mg/L) Sélectivité
0 Mauvaise 0 Mauvaise 0 Mauvaise 0.01 Mauvaise 0.1 Mauvaise 4 Mauvaise
0.015 Mauvaise 0.15 Mauvaise 10 Mauvaise 0.02 Mauvaise 0.25 Mauvaise 16 Mauvaise
0.025 Moyenne 0.35 Mauvaise 22 Mauvaise 0.03 Bonne 28 Mauvaise
Incubation à 45°C durant 48h en aérobiose pour MRS-CL, et en anaérobiose pour MRS-B et MRS-KAN.
101
Les milieux MRS-B et MRS-KAN n’avaient pas une bonne sélectivité puisqu’ils n’empêchaient pas la
croissance de l’autre Lactobacille. Par contre, le milieu MRS-CL commençait à avoir un effet sélectif
à partir d’une concentration de 0.025 mg/L de clindamycine, en affectant la croissance de toutes les
souches sauf celle de L. helveticus. Le milieu MRS-CL a par la suite été testé en boites de Petri
(Tableau A2.3).
A2.1.1.2 Essais en boites de Petri
La croissance des souches a également été testée en Petri sur les milieux sélectifs plus couramment
utilisés ou semblants les plus prometteurs, afin de tester leur sélectivité et d’établir les meilleures
conditions d’incubation à utiliser (Tableau A2.3). Pour ce faire, 1 g de culture pure lyophilisée de
chaque souche à tester a été réhydraté dans 9 mL d’eau peptonée supplémentée de Tween® 80,
sodium ascorbate et L-cystéine à 37°C durant 15 minutes, puis homogénéisé à 27 000 rpm durant
30 secondes avec un Omni THQ Homogenizer (Omni International, Kennesaw, GA, USA). Des
dilutions 1:10 ont ensuite été effectuées dans de l’eau peptonée. Les dilutions appropriées ont été
inoculées au milieu gélosé correspondant à raison de 1 mL par la technique de pour plate pour les
ferments et probiotiques, et à raison de 0.1 mL par la technique de spread plate pour les
contaminants. Les boîtes de Petri ont été incubés selon les conditions à tester, puis dénombrés.
102
Tableau A2.3. Essais en Petri de divers milieux et conditions d’incubation pour le dénombrement sélectif de S.
thermophilus (St), L. bulgaricus (Lb), B. longum (Bl), L. helveticus (Lh), K. marxianus (Km) et E. coli (Ec).
Souche voulue
Milieu Conditions d’incubation Rétablissement
des souches (Log UFC/mL)
Inhibition des ferments
(Log UFC/mL)
Atmosphère Température Temps St Lb
St M17 Aérobiose 42°C 48 h -0.6
-7.3
M17 Aérobiose 45°C 48 h -1.4
-7.6
Lb
MRS-F Aérobiose 37°C 48 h 0.0 -7.4
MRS-F Aérobiose 42°C 48 h +0.1 -7.4
MRS-F Aérobiose 45°C 48 h +0.2 -6.4
MRS-F Anaérobiose 37°C 48 h 0.0
MRS-F Anaérobiose 42°C 48 h +0.1
MRS-F Anaérobiose 45°C 48 h 0.0 -4.2
Bl
TOS-MUP Anaérobiose 37°C 48h -1.5 -8.2 -7.9
TOS-MUP Anaérobiose 37°C 72h -0.1 -8.2 -4.8
MRS-MUP Anaérobiose 37°C 48h -0.1 -7.7 -6.6
MRS-MUP Anaérobiose 37°C 72h 0.0 -7.6 -6.6
Lh
MRS-CIP Aérobiose 37°C 48h -0.2 -9.0 -0.2
MRS-CIP Anaérobiose 37°C 48h -0.1 -9.0 -0.3
MRS-CL 1 Anaérobiose 45°C 48h -0.1 -5.0 -3.3
MRS-CL 2 Anaérobiose 45°C 48h -0.2 -7.7 -5.9
Km DRBC Aérobiose 25°C 72h -0.1 -8.0 -7.8
DRBC Aérobiose 25°C 96h -0.1
Ec MAC Aérobiose 37°C 24h 0.0 -9.0 -8.8
M17: supplémenté de 1% de lactose.
MRS-F: glucose remplacé par 1% de fructose.
TOS-MUP et MRS-MUP: 50 mg/L de mupirocine.
MRS-CIP : 5 mg/L de ciprofloxacine.
MRS-CL 1 : 0.025 mg/L de clindamycine.
MRS-CL 2 : 0.03 mg/L de clindamycine.
Un résultat négatif (-) indique une croissance inférieure sur milieu sélectif par rapport au milieu non sélectif, alors qu’un
résultat positif (+) indique une croissance supérieure sur milieu sélectif.
Le rétablissement des souches et l’inhibition des ferments ont été calculés en fonction des comptes
préalablement obtenus sur milieux non sélectifs avec des conditions d’incubations optimales : M17
en aérobiose à 37°C durant 48 h pour S. thermophilus; MRS en anaérobiose à 37°C durant 48 h
pour L. bulgaricus, et durant 72 h pour B. longum et L. helveticus; YM en aérobiose à 25°C durant 72
103
h pour K. marxianus; MAC en aérobiose à 37°C durant 16 h pour E. coli. Les comptes maximums
dans les suspensions testées étaient les suivants :
• S. thermophilus: 11.0 log UFC/mL
• L. bulgaricus: 10.8 log UFC/mL
• B. longum : 10.5 log UFC/mL
• L. helveticus: 10.9 log UFC/mL
• K. marxianus : 8.8 log UFC/mL
• E. coli : 8.9 log UFC/mL
Les résultats obtenus par les essais de croissance en boîte de Petri ont permis de sélectionner les
milieux et conditions d’incubation les plus appropriés pour le dénombrement sélectif des différentes
souches. Pour l’énumération sélective de S. thermophilus, une température de 42°C a été retenue
puisqu’elle permettait un meilleur rétablissement de la souche sans trop diminuer la sélectivité envers
l’autre ferment. Pour l’énumération de L. bulgaricus, une température de 45°C en aérobiose a été
retenue pour les mêmes raisons. Pour B. longum R0175, le milieu MRS-MUP a été retenu puisqu’il
est moins dispendieux que le milieu TOS-MUP et permet d’obtenir un bon rétablissement de la
souche en 48 h. Une durée de 48 h a ainsi été retenue puisqu’une incubation plus longue n’était pas
nécessaire. Dans le cas de L. helveticus R0052, une concentration de clindamycine de 0.03 mg/L a
été retenue pour l’inhibition supérieure des ferments. Pour K. marxianus, une incubation de 72 h a
été retenue puisque la sélectivité était bonne et qu’il n’y avait pas davantage de croissance avec une
incubation prolongée. Pour E. coli, le milieu MAC et les conditions d’incubation testés ont été
conservés puisque la sélectivité était bonne.
A2.1.2 Vérification de la sélectivité des milieux de culture
Les milieux de culture et conditions d’incubation sélectionnés ont ensuite été testés une dernière fois
en Petri pour vérifier leur sélectivité envers toutes les souches présentes dans les yogourts
probiotiques (Figure A2.1) et dans les yogourts avec contaminants (Figure A2.2). Pour ce faire,
chacune des souches a été inoculée individuellement sur chacun des milieux sélectifs sélectionnés,
selon la méthode décrite dans la section A2.1.1.2.
104
Figure A2.1. Vérification de la sélectivité en Petri des milieux de culture et conditions d’incubation
sélectionnés pour effectuer les dénombrements sélectifs dans les yogourts avec probiotiques. MRS-MUP
incubé en anaérobiose à 37°C durant 48 h; MRS-F en aérobiose à 45°C durant 48 h; MRS-CL en
anaérobiose à 45°C durant 48 h; M17 en aérobiose à 42°C durant 48 h. Les barres d’erreur représentent
l’erreur standard des moyennes.
La sélectivité du milieu MRS-MUP s’est avérée très bonne pour énumérer B. longum. Comme prévu,
le milieu MRS-F n’empêchait pas suffisamment la croissance de L. helveticus, mais avait une bonne
sélectivité lorsque B. longum et S. thermophilus étaient présentes. Les milieux MRS-CL et M17
semblent à première vue ne pas être suffisamment sélectifs envers L. bulgaricus et B. longum
respectivement. Toutefois dans les yogourts, les taux d’inoculation supérieurs de L. helveticus par
rapport à L. bulgaricus, et de S. thermophilus par rapport à B. longum, devraient permettre d’obtenir
des populations nettement supérieures de ces bactéries suite à la fermentation, et augmenter ainsi la
sélectivité des milieux.
Sélectivité milieux pour probiotiques
MRS-MUP MRS-F MRS-CL M17
Com
pte
s b
acté
riens (
Log U
FC
/mL)
0
2
4
6
8
10
12
B. longum
L. bulgaricus
L. helveticus
S. thermophilus
105
Figure A2.2. Vérification de la sélectivité en Petri des milieux de culture sélectionnés pour effectuer les
dénombrements sélectifs dans les yogourts avec contaminants microbiens. DRBC incubé en aérobiose à
25°C durant 72 h; MAC en aérobiose à 37°C durant 24 h.
Dans le cas des yogourts avec contaminants microbiens, le dénombrement des ferments durant
l’entreposage ne devait pas être effectué. Ainsi, seule la sélectivité des milieux permettant de
dénombrer les contaminants microbiens a été vérifiée. Celle-ci était très bonne pour les deux milieux,
permettant une bonne croissance des contaminants, et une bonne répression des ferments.
Les milieux sélectifs et conditions d’incubation sélectionnés ont donc été utilisés pour l’ensemble du
projet afin de dénombrer les différents microorganismes d’intérêts présents dans les yogourts
probiotiques et contaminés.
Sélectivité milieux pour contaminants
DRBC MAC
Co
mp
tes m
icro
bie
ns (
Lo
g U
FC
/mL
)
0
2
4
6
8
10
Contaminants
S.thermophilus
L. bulgaricus
K. marxianus E. coli
106
A2.2 Choix du ferment et du taux d’inoculation
Des essais de fermentation ont été effectués afin d’optimiser la production des yogourts. Les essais
ont été faits dans un premier temps pour la production des yogourts avec contaminants microbiens,
puis par la suite, pour la production des yogourts probiotiques. Les essais de fermentation ont tous
été effectués à l’aide d’un système automatisé appelé « Fermentation Acquisition and Control
System (FACS) » (CRDH, Agriculture and Agri-Food Canada, Saint-Hyacinthe, QC, Canada) qui
permet d’obtenir des mesures continues du pH et de la température des produits durant la
fermentation. Les essais de fermentation ont également été effectués dans deux types de lait ayant
subi un traitement thermique (90°C, 10 min). Pour la première matrice laitière, de la poudre de lait
écrémé a été réhydratée afin d’obtenir un lait à 4% de protéines (lait régulier). Pour la deuxième
matrice, la poudre de lait écrémé a été réhydratée de manière à obtenir un lait à 3.1% de protéines,
puis ce dernier a été ultrafiltré pour obtenir un lait concentré à 10.6% de protéines (lait UF).
A2.2.1 Détermination du taux d’inoculation
Au début du projet, les cultures de ferments S. thermophilus R0083 et L. bulgaricus HA-137 de
Lallemand Solutions Santé ont été choisies pour la fabrication des yogourts. Ces cultures, pouvant
être obtenues séparément, rendaient possible l’ajustement du taux d’inoculation et du ratio des
souches selon les besoins. Les expérimentations sur la partie contaminants du projet (Chapitre 4) ont
donc été effectuées avec des yogourts fermentés par ces cultures. Toutefois, des essais de
fermentation ont d’abord dû être effectués afin d’optimiser les méthodes de production des yogourts.
A2.2.1.1 Essais de ratios St : Lb
Des essais ont été effectués pour déterminer le ratio S. thermophilus : L. bulgaricus (St : Lb) à
utiliser. Autrefois, les ferments à yogourt se composaient des cultures S. thermophilus et L.
bulgaricus à un ratio de 1:1. Toutefois, afin d’éviter des problèmes de sur-acidification causés
principalement par L. bulgaricus (Beal et al., 1989), les ferments d’aujourd’hui sont composés d’une
forte concentration en S. thermophilus et d’une faible concentration en L. bulgaricus. Les différents
ratios testés (Figure A2.3) ont donc été décidés par rapport aux tendances industrielles actuelles.
107
Les ratios d’inoculations St : Lb 1: 1/10, 1: 1/30 et 1: 1/100 ont été basés sur un taux d’inoculation de
1 x 107 UFC/mL de S. thermophilus, L. bulgaricus variant selon le ratio (Figure A2.3a). Pour les ratios
suivants (2: 1/20, 2: 1/60 et 2: 1/200), les taux d’inoculation des ferments ont simplement été
doublés, tout en conservant les mêmes ratios entre les deux souches (Figure A2.3b). Pour ce faire,
les cultures bactériennes lyophilisées ont d’abord été réhydratées dans du lait régulier à 40°C durant
10 minutes. Celles-ci ont ensuite été inoculées dans 100 mL de lait régulier, de manière à obtenir les
différents ratios à tester. La fermentation s’est effectuée dans le FACS à 40°C durant 8 h.
Figure A2.3. Effet du ratio de St : Lb et du taux d’inoculation sur la durée de fermentation à 40°C d’un lait
régulier à 4% de protéines. Dans la partie « a », S. thermophilus a été inoculé à 1 x 107 UFC/mL, alors que le
taux d’inoculation a été doublé dans la partie « b » pour 2 x 107 UFC/mL. Les mêmes ratios St : Lb ont été
testés dans les deux parties. Donnée manquante pour le pH 4.7 du ratio 2: 1/200.
La figure A2.3 montre le temps de fermentation requis avec différents ratios St : Lb pour acidifier un
lait régulier à 4% de protéines d’un pH de 6.4 à 4.6-4.7. Selon les résultats, les ratios d’inoculation
testés ne semblent pas influencer le temps de fermentation requis pour atteindre le pH final. En effet,
pour un même taux d’inoculation de S. thermophilus, les temps de fermentation nécessaires pour
atteindre un même pH sont presque identiques entre les différents ratios St : Lb, à l’exception du
b) 2x
2: 1/20 2: 1/60 2: 1/200
a) 1x
Ratio St : Lb (x107 UFC/mL)
1: 1/10 1: 1/30 1: 1/100
Te
mp
s d
e fe
rme
nta
tio
n r
eq
uis
(h
eu
res)
0
2
4
6
8
pH 4.7
pH 4.6
108
ratio 1: 1/30. Il est possible qu’un problème au niveau de la température ou de la lecture du pH soit
survenu au cours de la fermentation de ce dernier. Le ratio 1: 1/100, équivalent à 100 St : 1 Lb, a
finalement été retenu pour la fabrication subséquente des yogourts avec contaminants, puisque ce
ratio permet de réduire la quantité de L. bulgaricus inoculée, sans pour autant affecter la vitesse
d’acidification du lait. Ceci à l’avantage de réduire l’interférence potentielle de L. bulgaricus dans le
dénombrement de L. helveticus. Par ailleurs, ces résultats ont démontré qu’il y a intérêt à augmenter
le taux d’inoculation des ferments à un niveau supérieur.
A2.2.1.2 Essais de taux d’inoculation
Les essais préliminaires (Figure A2.3) suggéraient que le taux d’inoculation affecte le temps de
fermentation. Des essais additionnels ont donc été effectués pour déterminer le taux d’inoculation
optimum des ferments en termes de quantité et de vitesse d’acidification (Figure A2.4). Différents
taux d’inoculation basés sur la population en S. thermophilus ont été testés, tout en conservant un
même ratio de 10 St : 1 Lb. Il est à noter que ces essais ont été effectués de manière simultanée
avec les essais de ratio d’inoculation, c’est pourquoi le ratio choisit dans la section A2.2.1.1 de 100
St : 1 Lb n’a pas été utilisé ici. Pour ce faire, les souches ont été préparées selon la méthode décrite
dans la section A2.2.1.1. Celles-ci ont toutefois été inoculées dans 100 mL de lait régulier et dans
100 mL de lait UF. La fermentation s’est effectuée dans le FACS à 40°C durant 7 h pour le lait
régulier à 4% de protéines, et durant 17 h pour le lait UF à 10% de protéines.
109
Figure A2.4. Effet du taux d’inoculation du ferment sur la durée de fermentation à 40°C d’un lait régulier à 4%
de protéines et d’un lait ultrafiltré à 10% de protéines. Les taux d’inoculation sont de 2 x 107 UFC/mL (2x),
3 x 107 UFC/mL (3x) et 4 x 107 UFC/mL (4x) de S. thermophilus.
La figure A2.4 montre le temps de fermentation requis avec différents taux d’inoculation de ferments
pour acidifier les deux types de lait d’un pH de 6.5 à 4.6-4.7. Dans le lait régulier à 4% de protéines,
l’augmentation de la population de ferments inoculée ne semble pas avoir un impact notable sur la
vitesse d’acidification. Par contre dans le lait UF à 10% de protéines, il y a une réduction marquée du
temps requis pour atteindre le pH final avec l’augmentation du taux d’inoculation. Un taux
d’inoculation supérieur à 2 x 107 UFC/mL était donc à considérer. Toutefois, la différence entre un
taux d’inoculation de 3 x 107 et de 4 x 107 UFC/mL n’était pas suffisamment importante pour justifier
l’utilisation de plus de ferments. En effet, les industries doivent composer avec le meilleur rapport
quantité-efficacité possible pour éviter des dépenses trop importantes en cultures de ferments. Un
taux d’inoculation de 3 x 107 UFC/mL de S. thermophilus a ainsi été retenu.
Taux d'inoculation
Taux d'inoculation
2x 3x 4x
Te
mp
s d
e fe
rme
nta
tio
n re
qu
is (
he
ure
s)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18pH 4.7 : Lait 4% de protéines
pH 4.7 : Lait 10% de protéines
pH 4.6 : Lait 4% de protéines
pH 4.6 : Lait 10% de protéines
110
A2.2.2 Essais de différents ferments
Lors de la fabrication des yogourts contaminés (Chapitre 4), nous avons constaté que le ferment
choisi n’était pas idéal pour le type d’analyses prévues avec les yogourts probiotiques (Chapitre 3).
Différents ferments ont donc été testés (Tableau A2.4) afin d’en retenir un qui possédait les
caractéristiques suivantes : acidification rapide durant la fermentation de deux matrices laitières (4%
et 10% de protéines), texture lisse du yogourt et arômes typiques de yogourt. Tous les ferments
testés, sauf le Rosell, se composaient de cultures lactiques lyophilisées pré-mélangées dans un ratio
St : Lb inconnu.
Tableau A2.4. Ferments commerciaux testés pour la fermentation de deux matrices laitières.
Ferment Provenance
Biena T1 Biena (Saint-Hyacinthe, QC, Canada)
Biena T2 Biena
Rosell Lallemand Solutions Santé (Montréal, QC, Canada)
Yógourmet® Lyo-San (Lachute, QC, Canada)
YO-MIX® 860 DuPont (Mississauga, ON, Canada) YO-MIX® T11 DuPont
YO-MIX® T12 DuPont
Pour ce faire, les cultures lyophilisées des ferments ont d’abord été réhydratées dans du lait régulier
durant 10 minutes à température pièce. Celles-ci ont ensuite été inoculées dans 100 mL de lait
régulier et dans 100 mL de lait UF à un taux de 3 x 107 UFC/mL basé sur S. thermophilus. Une
exception a été faite pour le ferment Yógourmet® puisqu’il s’agit d’un ferment destiné à l’utilisation
domestique. Ce dernier a été inoculé de façon directe (sans réhydratation) selon les indications du
fabricant. La fermentation s’est effectuée dans le FACS à 40°C avec agitation à 100 rpm durant les
30 premières minutes, jusqu’à l’atteinte d’un pH de 4.65 ± 0.05. Afin de ne pas porter atteinte à
certains fabricants par la présentation des résultats, les noms des différents ferments ont été codés
(Figure A2.5). Il est important de noter que les codes ne suivent pas l’ordre dans laquelle
apparaissent les ferments dans le tableau A2.4.
111
Figure A2.5. Profil de fermentation des différents ferments dans le lait régulier à 4% de protéines et dans le
lait UF à 10% de protéines. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard des moyennes.
Dans le lait régulier, l’acidification la plus rapide durant la fermentation a été obtenue avec les
ferments A, E et G. Dans le lait UF, on retrouvait également les trois mêmes ferments parmi les plus
rapides, en plus du ferment F.
Parmi les yogourts obtenus des quatre ferments plus rapides, le F présentait des défauts de texture
(granulosités, manque de fermeté), alors que les A et F présentaient des défauts aromatiques (odeur
acide ou étrangère). Parmi les yogourts qui n’avaient aucun défaut marqué (E et G), les arômes et la
texture des yogourts obtenus avec le ferment G se rapprochaient davantage d’un yogourt
commercial classique. C’est donc le ferment G, soit le ferment YO-MIX® T11, qui a été retenu pour la
fabrication des yogourts avec probiotiques.
En résumé, pour fabriquer les yogourts avec contaminants (Chapitre 4), le ferment Rosell (Lallemand
Solutions Santé) composé des souches S. thermophilus R0083 et L. bulgaricus HA-137, a été utilisé
avec un ratio de 100 St : 1 Lb, et un taux d’inoculation de 3 x 107 UFC/mL de S. thermophilus et 3 x
105 UFC/mL de L. bulgaricus. Pour fabriquer les yogourts avec probiotiques (Chapitre 3), le ferment
YO-MIX® T11 a été utilisé à un taux d’inoculation de 3 x 107 UFC/mL de S. thermophilus.
a) Lait régulier à 4% de protéines
Durée (heures)
0 2 4 6
pH
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
A
B
C
D
E
F
G
b) Lait UF à 10% de protéines
Durée (heures)
0 2 4 6 8 10
pH
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
A
B
C
D
E
F
G
112
A2.3 Détermination des paramètres de centrifugation
Pour produire les yogourts de type grec, deux technologies ont été retenues afin d’augmenter la
teneur en protéines ; l’ultrafiltration du lait avant fermentation et la centrifugation du caillé après
fermentation.
Les paramètres à appliquer au système d’ultrafiltration ont été choisis selon le type de membrane
utilisée et les connaissances techniques du responsable du système au CRDSH. Puisqu’il s’agissait
d’un système pilote industriel déjà adapté pour le lait, aucune mise au point n’a été nécessaire. Une
membrane de 50-PM Romicon Hollow Fiber Cartridges (Koch Membrane Systems, Wilmington, MA,
USA) ayant une capacité de rétention de 50 000 Dalton a été utilisée avec les paramètres suivants;
pression de 30 psi; vitesse de 4-6 m/s; température de 50°C.
Dans le cas de la centrifugation, il n’était pas possible d’utiliser le même genre de centrifugeuse que
celles retrouvées en industrie (Annexe 1) puisque la quantité de yogourt produite n’était pas
suffisante. La centrifugation a dû être effectuée dans une centrifugeuse de laboratoire pouvant
contenir 6 bouteilles de 1 L, ce qui a nécessité des essais de mise au point. Diverses combinaisons
de vitesses et durées de centrifugation ont ainsi été testées afin d’obtenir une teneur en protéines
légèrement supérieure à 10% dans le caillé. En fonction du taux protéique obtenu suite à la
centrifugation, une partie du lactosérum retiré pouvait y être rajouté pour standardiser le caillé à 10%
de protéines. Cette façon de faire permettait de contrer les différences de composition et de texture
qui pouvait subvenir entre chaque production de yogourt, ce qui aurait pu mener à différentes teneurs
en protéines après la centrifugation. Les paramètres retenus sont présentés dans le tableau A2.5.
Tableau A2.5. Paramètres de centrifugation retenus pour la production des yogourts de type grec centrifugés.
Centrifugeuse Beckman Coulter Avanti™ J-20XPI avec rotor JLA 8.100.
Traitement expérimental
Ferment Vitesse (G) Durée (min) Température (°C)
Contamination Rosell 6000 5 18
Probiotique YO-MIX® T11 8000 15 18
113
Les paramètres établis pour les yogourts destinés aux essais avec contaminants (E. coli ou K.
marxianus) (Chapitre 4) et les yogourts destinés à la supplémentation avec probiotiques (Chapitre 3)
ne sont pas les mêmes puisque différents ferments ont été utilisés. Le ferment YO-MIX® T11
contient des souches productrices d’EPS, ce qui modifie la composition du yogourt et affecte
légèrement sa texture. Les yogourts probiotiques étaient donc beaucoup plus visqueux, ce qui
nécessitait une centrifugation plus longue et plus rapide pour obtenir une séparation aussi importante
que celle des yogourts contaminés.
114
Bibliographie
Abe, F., Tomita, S., Yaeshima, T., et Iwatsuki, K. (2009). Effect of production conditions on the stability of a human bifidobacterial species Bifidobacterium longum in yogurt. Letters in Applied Microbiology, 49(6), 715-720. doi: 10.1111/j.1472-765X.2009.02719.x
Adhikari, K., Gruen, I. U., Mustapha, A., et Fernando, L. N. (2002). Changes in the profile of organic acids in plain set and stirred yogurts during manufacture and refrigerated storage. Journal of Food Quality, 25(5), 435-451. doi: 10.1111/j.1745-4557.2002.tb01038.x
Agence Canadienne d'Inspection des Aliments (ACIA). (2016). Allégations relatives aux probiotiques. Consulté le 2017-02-08, au http://www.inspection.gc.ca/food/labelling/food-labelling-for-industry/health-claims/eng/1392834838383/1392834887794?chap=9
Agende de la Santé Publique du Canada (ASPC). (2016). Infographic: Food-related illnesses, hospitalizations and deaths in Canada. Consulté le 2017-03-29, au http://healthycanadians.gc.ca/publications/eating-nutrition/foodborne-illness-infographic-maladies-origine-alimentaire-infographie/index-eng.php
Agende de la Santé Publique du Canada (ASPC). (2017). E. coli. Consulté le 2017-03-29, au http://www.phac-aspc.gc.ca/fs-sa/fs-fi/ecoli-fra.php
Akalin, A. S., Gönç, S., Ünal, G., et Fenderya, S. (2007). Effects of fructooligosaccharide and whey protein concentrate on the viability of starter culture in reduced-fat probiotic yogurt during storage. Journal of Food Science, 72(7), M222-M227. doi: 10.1111/j.1750-3841.2007.00436.x
Al-Kadamany, E., Toufeili, I., Khattar, M., Abou-Jawdeh, Y., Harakeh, S., et Haddad, T. (2002). Determination of shelf life of concentrated yogurt (labneh) produced by in-bag straining of set yogurt using hazard analysis. Journal of Dairy Science, 85(5), 1023-1030. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(02)74162-3
Alemka, A., Clyne, M., Shanahan, F., Tompkins, T., Corcionivoschi, N., et Bourke, B. (2010). Probiotic colonization of the adherent mucus layer of HT29MTXE12 cells attenuates Campylobacter jejuni virulence properties. Infection and Immunity, 78(6), 2812-2822. doi: 10.1128/IAI.01249-09
Alfa Laval. (2016). FEQX 520S - Large capacity nozzle centrifuge. Consulté le 2017-04-28, au http://www.alfalaval.com/products/separation/centrifugal-separators/separators/feqx/
Alm, L. (1983). Survival rate of salmonella and shigella in fermented milk products with and without added human gastric juice: An in vitro study. Progress in Food and Nutrition Science, 7(3/4), 19-28.
Amatayakul, T., Sherkat, F., et Shah, N. P. (2006). Syneresis in set yogurt as affected by EPS starter cultures and levels of solids. International Journal of Dairy Technology, 59(3), 216-221. doi: 10.1111/j.1471-0307.2006.00264.x
Amrane, A., et Prigent, Y. (1999). Differentiation of pH and free lactic acid effects on the various growth and production phases of Lactobacillus helveticus. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 74(1), 33-40. doi: 10.1002/(SICI)1097-4660(199901)74:1<33::AID-JCTB994>3.0.CO;2-K
Andriantsoanirina, V., Allano, S., Butel, M. J., et Aires, J. (2013). Tolerance of Bifidobacterium human isolates to bile, acid and oxygen. Anaerobe, 21, 39-42. doi: 10.1016/j.anaerobe.2013.04.005
Antunes, A. E. C., Cazetto, T. F., et Bolini, H. M. A. (2005). Viability of probiotic micro-organisms during storage, post acidification and sensory analysis of fat-free yogurts with added whey protein concentrate. International Journal of Dairy Technology, 58(3), 169-173. doi: 10.1111/j.1471-0307.2005.00203.x
Arican, A., et Andic, S. (2011). Survival of E. coli O157: H7 in yogurt incubated until two different pH values and stored at 4°C. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 17(4), 537-542.
Arseneault-Breard, J., Rondeau, I., Gilbert, K., Girard, S. A., Tompkins, T. A., Godbout, R., et Rousseau, G. (2012). Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model. British Journal of Nutrition, 107(12), 1793-1799. doi: 10.1017/S0007114511005137
115
Audy, J., Labrie, S., Roy, D., et LaPointe, G. (2010). Sugar source modulates exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium longum subsp. longum CRC 002. Microbiology (United Kingdom), 156(3), 653-664. doi: 10.1099/mic.0.033720-0
Azadnia Parisa, P., Zamam, M. H., Ghasemi, S. A., Babaki, A. K., Jashni, M. K., et Taarof, N. (2011). Isolation and identification of thermophilic lactobacilli from traditional yoghurts of tribes of Kazerun. Journal of Animal and Veterinary Advances, 10(6), 774-776. doi: 10.3923/javaa.2011.774.776
Bachrouri, M., Quinto, E. J., et Mora, M. T. (2002). Survival of Escherichia coli O157: H7 during storage of yogurt at different temperatures. Journal of Food Science, 67(5), 1899-1903. doi: 10.1111/j.1365-2621.2002.tb08743.x
Beal, C., Louvet, P., et Corrieu, G. (1989). Influence of controlled pH and temperature on the growth and acidification of pure cultures of Streptococcus thermophilus 404 and Lactobacillus bulgaricus 398. Applied Microbiology and Biotechnology, 32(2), 148-154. doi: 10.1007/BF00165879
Benedict, K., Chiller, T. M., et Mody, R. K. (2016). Invasive fungal infections acquired from contaminated food or nutritional supplements: A review of the literature. Foodborne Pathogens and Disease, 13(7), 343-349. doi: 10.1089/fpd.2015.2108
Benjamin, M. M., et Datta, A. R. (1995). Acid tolerance of enterohemorrhagic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 61(4), 1669-1672.
Bergey, D. H., Krieg, N. R., et Holt, J. G. (1984). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Vol. Vol. 1). Baltimore, MD : Williams & Wilkins.
Beshkova, D. M., Simova, E. D., Frengova, G. I., Simov, Z. I., et Adilov, E. F. (1998). Production of amino acids by yogurt bacteria. Biotechnology Progress, 14(6), 963-965. doi: 10.1021/bp980082j
Beuchat, L. R., Mann, D. A., et Gurtler, J. B. (2007). Comparison of dry sheet media and conventional agar media methods for enumerating yeasts and molds in food. Journal of Food Protection, 70(11), 2661-2664. doi: 10.4315/0362-028X-70.11.2661
Biliaderis, C. G., Khan, M. M., et Blank, G. (1992). Rheological and sensory properties of yogurt from skim milk and ultrafiltered retentates. International Dairy Journal, 2(5), 311-323. doi: 10.1016/0958-6946(92)90035-K
Boelrijk, A. E. M., de Jong, C., et Smit, G. (2003). Flavour generation in dairy products. Dairy Processing: Improving Quality (pp. 130-154): Elsevier.
Bong, D. D., et Moraru, C. I. (2014). Use of micellar casein concentrate for Greek-style yogurt manufacturing: Effects on processing and product properties. Journal of Dairy Science, 97(3), 1259-1269. doi: 10.3168/jds.2013-7488
Brazuelo, A., Suarez, E., Riera, F. A., Alvarez, R., Iglesias, J. R., et Granda, J. (1995). Protein-enriched yoghurt by ultrafiltration of skim-milk. Journal of the Science of Food and Agriculture, 69(3), 283-290. doi: 10.1002/jsfa.2740690304
Broach, J. R. (2012). Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics, 192(1), 73-105. doi: 10.1534/genetics.111.135731
Broadbent, J. R., Cai, H., Larsen, R. L., Hughes, J. E., Welker, D. L., Carvalho, V. G. d., Tompkins, T. A., Ardo, Y., Vogensen, F., Lorentiis, A. d., Gatti, M., Neviani, E., et Steele, J. L. (2011). Genetic diversity in proteolytic enzymes and amino acid metabolism among Lactobacillus helveticus strains. Journal of Dairy Science, 94(9), 4313-4328. doi: 10.3168/jds.2010-4068
Brudzinski, L., et Harrison, M. A. (1998). Influence of incubation conditions on survival and acid tolerance response of Escherichia coli O157: H7 and non-O157: H7 isolates exposed to acetic acid. Journal of Food Protection, 61(5), 542-546.
Buchanan, R. L., et Edelson, S. G. (1999). pH-dependent stationary-phase acid resistance response of enterohemorrhagic Escherichia coli in the presence of various acidulants. Journal of Food Protection, 62(3), 211-218. doi: 10.4315/0362-028X-62.3.211
Bunesova, V., Musilova, S., Geigerova, M., Pechar, R., et Rada, V. (2015). Comparison of mupirocin-based media for selective enumeration of bifidobacteria in probiotic supplements. Journal of Microbiological Methods, 109, 106-109. doi: 10.1016/j.mimet.2014.12.016
116
Bury, D., Jelen, P., et Kimura, K. (1998). Whey protein concentrate as a nutrient supplement for lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 8(2), 149-151. doi: 10.1016/S0958-6946(98)00033-8
Canganella, F., Ovidi, M., Paganini, S., Vettraino, A. M., Bevilacqua, L., et Trovatelli, L. D. (1998). Survival of undesirable micro-organisms in fruit yoghurts during storage at different temperatures. Food Microbiology, 15(1), 71-77. doi: 10.1006/fmic.1997.0142
CanLII. (2016). Règlement sur les aliments, RLRQ c P-29, r 1. Consulté le 2017-03-28, au http://canlii.ca/t/69vn7
Centre Canadien d'information laitière (CCIL). (2016a). Consommation de produits laitiers par habitant [pdf]. Consulté le 2017-04-03, au http://www.infolait.gc.ca/index_f.php?s1=dff-fcil&s2=cons&s3=conscdn
Centre Canadien d'information laitière (CCIL). (2016b). Transformation du yogourt [pdf]. Consulté le 2017-04-03, au http://www.infolait.gc.ca/index_f.php?s1=dff-fcil&s2=proc-trans&s3=psdp-pvpl&s4=yp-py
Champagne, C.P., Gardner, N.J., et Lacroix, C. (2007). Fermentation technologies for the production of exopolysaccharide-synthesizing Lactobacillus rhamnosus concentrated cultures. Electronic Journal of Biotechnology, 10(2): 211-220. doi: 10.2225/vol10-issue2-fulltext-10
Champagne, C. P., Gardner, N. J., et Roy, D. (2005). Challenges in the addition of probiotic cultures to foods. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 45(1), 61-84. doi: 10.1080/10408690590900144
Champagne, C. P., Green-Johnson, J., Raymond, Y., Barrette, J., et Buckley, N. (2009). Selection of probiotic bacteria for the fermentation of a soy beverage in combination with Streptococcus thermophilus. Food Research International, 42(5-6), 612-621. doi: 10.1016/j.foodres.2008.12.018
Champagne, C. P., Raymond, Y., Pouliot, Y., Gauthier, S. F., et Lessard, M. (2014). Effect of bovine colostrum, cheese whey, and spray-dried porcine plasma on the in vitro growth of probiotic bacteria and Escherichia coli. Canadian Journal of Microbiology, 60(5), 287-295. doi: 10.1139/cjm-2014-0130
Chandrapala, J., Chen, G. Q., Kezia, K., Bowman, E. G., Vasiljevic, T., et Kentish, S. E. (2016). Removal of lactate from acid whey using nanofiltration. Journal of Food Engineering, 177, 59-64. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2015.12.019
Chapman, H. R., Bines, V. E., Glover, F. A., et Skudder, P. J. (1974). Use of milk concentrated by ultrafiltration for making hard cheese, soft cheese and yoghurt. International Journal of Dairy Technology, 27(3), 151-155. doi: 10.1111/j.1471-0307.1974.tb01690.x
Chaves-Lopez, C., Serio, A., Paparella, A., Martuscelli, M., Corsetti, A., Tofalo, R., et Suzzi, G. (2014). Impact of microbial cultures on proteolysis and release of bioactive peptides in fermented milk. Food Microbiology, 42, 117-121. doi: 10.1016/j.fm.2014.03.005
Cheng, H. (2010). Volatile flavor compounds in yogurt: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 50(10), 938-950. doi: 10.1080/10408390903044081
Cholet, O., Henaut, A., Casaregola, S., et Bonnarme, P. (2007). Gene expression and biochemical analysis of cheese-ripening yeasts: Focus on catabolism of l-methionine, lactate, and lactose. Applied and Environmental Microbiology, 73(8), 2561-2570. doi: 10.1128/AEM.02720-06
Christensen, J. E., et Steele, J. L. (2003). Impaired growth rates in milk of Lactobacillus helveticus peptidase mutants can be overcome by use of amino acid supplements. Journal of Bacteriology, 185(11), 3297-3306. doi: 10.1128/JB.185.11.3297-3306.2003
Christiansen, J. K., Hughes, J. E., Welker, D. L., Rodríguez, B. T., Steele, J. L., et Broadbent, J. R. (2008). Phenotypic and genotypic analysis of amino acid auxotrophy in Lactobacillus helveticus CNRZ 32. Applied and Environmental Microbiology, 74(2), 416-423. doi: 10.1128/AEM.01174-07
Cirone, K., Huberman, Y., Morsella, C., Mendez, L., Jorge, M., et Paolicchi, F. (2013). Growth of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Escherichia coli, and Salmonella enteritidis during preparation and storage of yogurt. ISRN Microbiol, 2013, 247018. doi: 10.1155/2013/247018
Codex Alimentarius Commission (CAC). (2003). Standard for Fermented Milks (Codex Stan 243-2003). Conner, D. E., et Kotrola, J. S. (1995). Growth and survival of Escherichia coli O157: H7 under acidic
conditions. Applied and Environmental Microbiology, 61(1), 382-385. Corsetti, A., Rossi, J., et Gobbetti, M. (2001). Interactions between yeasts and bacteria in the smear surface-
ripened cheeses. International Journal of Food Microbiology, 69(1-2), 1-10. doi: 10.1016/S0168-1605(01)00567-0
117
Cruz, A. G., Castro, W. F., Faria, J. A. F., Bogusz, S., Granato, D., Celeguini, R. M. S., Lima-Pallone, J., et Godoy, H. T. (2012a). Glucose oxidase: A potential option to decrease the oxidative stress in stirred probiotic yogurt. LWT - Food Science and Technology, 47(2), 512-515. doi: 10.1016/j.lwt.2012.01.037
Cruz, A. G., Castro, W. F., Faria, J. A. F., Bolini, H. M. A., Celeghini, R. M. S., Raices, R. S. L., Oliveira, C. A. F., Freitas, M. Q., Conte Júnior, C. A., et Mársico, E. T. (2013). Stability of probiotic yogurt added with glucose oxidase in plastic materials with different permeability oxygen rates during the refrigerated storage. Food Research International, 51(2), 723-728. doi: 10.1016/j.foodres.2013.01.028
Cruz, A. G., Castro, W. F., Faria, J. A. F., Lollo, P. C. B., Amaya-Farfán, J., Freitas, M. Q., Rodrigues, D., Oliveira, C. A. F., et Godoy, H. T. (2012b). Probiotic yogurts manufactured with increased glucose oxidase levels: Postacidification, proteolytic patterns, survival of probiotic microorganisms, production of organic acid and aroma compounds. Journal of Dairy Science, 95(5), 2261-2269. doi: 10.3168/jds.2011-4582
Cutrim, C. S., de Barros, R. F., da Costa, M. P., Franco, R. M., Conte-Junior, C. A., et Cortez, M. A. S. (2016). Survival of Escherichia coli O157: H7 during manufacture and storage of traditional and low lactose yogurt. LWT - Food Science and Technology, 70, 178-184. doi: 10.1016/j.lwt.2016.02.047
D'Aimmo, M. R., Modesto, M., et Biavati, B. (2007). Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp. isolated from dairy and pharmaceutical products. International Journal of Food Microbiology, 115(1), 35-42. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.003
Damin, M. R., Alcântara, M. R., Nunes, A. P., et Oliveira, M. N. (2009). Effects of milk supplementation with skim milk powder, whey protein concentrate and sodium caseinate on acidification kinetics, rheological properties and structure of nonfat stirred yogurt. LWT - Food Science and Technology, 42(10), 1744-1750. doi: 10.1016/j.lwt.2009.03.019
Damin, M. R., Minowa, E., Alcântara, M. R., et Oliveira, M. N. (2008). Effect of cold storage on culture viability and some rheological properties of fermented milk prepared with yogurt and probiotic bacteria. Journal of Texture Studies, 39(1), 40-55. doi: 10.1111/j.1745-4603.2007.00129.x
Dave, R. I., et Shah, N. P. (1997a). Effectiveness of ascorbic acid as an oxygen scavenger in improving viability of probiotic bacteria in yoghurts made with commercial starter cultures. International Dairy Journal, 7(6/7), 435-443. doi: 10.1016/S0958-6946(97)00026-5
Dave, R. I., et Shah, N. P. (1997b). Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts made from commerical starter cultures. International Dairy Journal, 7(1), 31-41. doi: 10.1016/S0958-6946(96)00046-5
Dave, R. I., et Shah, N. P. (1998). Ingredient supplementation effects on viability of probiotic bacteria in yogurt. Journal of Dairy Science, 81(11), 2804-2816. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(98)75839-4
De Brabandere, A. G., et De Baerdemaeker, J. G. (1999). Effects of process conditions on the pH development during yogurt fermentation. Journal of Food Engineering, 41(3), 221-227. doi: 10.1016/S0260-8774(99)00096-5
De Vin, F., Radstrom, P., Herman, L., et De Vuyst, L. (2005). Molecular and biochemical analysis of the galactose phenotype of dairy Streptococcus thermophilus strains reveals four different fermentation profiles. Applied and Environmental Microbiology, 71(7), 3659-3667. doi: 10.1128/aem.71.7.3659-3667.2005
Delavenne, E., Ismail, R., Pawtowski, A., Mounier, J., Barbier, G., et Le Blay, G. (2013). Assessment of lactobacilli strains as yogurt bioprotective cultures. Food Control, 30(1), 206-213. doi: 10.1016/j.foodcont.2012.06.043
Diop, L., Guillou, S., et Durand, H. (2008). Probiotic food supplement reduces stress-induced gastrointestinal symptoms in volunteers: A double-blind, placebo-controlled, randomized trial. Nutrition Research 28(1), 1-5. doi: 10.1016/j.nutres.2007.10.001
Dlamini, B. C., et Buys, E. M. (2009). Survival and growth of acid adapted Escherichia coli strains in broth at different pH levels. Journal of Food Safety, 29(3), 484-497. doi: 10.1111/j.1745-4565.2009.00171.x
Domagala, J. (2012). Instrumental texture, syneresis, and microstructure of yoghurts prepared from ultrafiltrated goat milk: Effect of degree of concentration. International Journal of Food Properties, 15(3), 558-568. doi: 10.1080/10942912.2010.492545
118
Drake, M. A., Boylston, T. D., Spence, K. D., et Swanson, B. G. (1996). Chemical and sensory effects of a Lactobacillus adjunct in Cheddar cheese. Food Research International, 29(3-4), 381-387. doi: 10.1016/0963-9969(96)00006-3
Easo, J. G., Measham, J. D., Munroe, J., et Green-Johnson, J. M. (2002). Immunostimulatory actions of Lactobacilli: Mitogenic induction of antibody production and spleen cell proliferation by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Lactobacillus acidophilus. Food and Agricultural Immunology, 14(1), 73-83. doi: 10.1080/09540100220137682
Elliott, J. (2013). Whey too much: Greek yogurt’s dark side. Modern Farmer. Consulté le 2017-08-30, au http://modernfarmer.com/2013/05/whey-too-much-greek-yogurts-dark-side/
Escalante, A., Wacher-Rodarte, C., Garcia-Garibay, M., et Farres, A. (1998). Enzymes involved in carbohydrate metabolism and their role on exopolysaccharide production in Streptococcus thermophilus. Journal of Applied Microbiology, 84(1), 108-114. doi: 10.1046/j.1365-2672.1997.00330.x
Evans, M., Salewski, R. P., Christman, M. C., Girard, S. A., et Tompkins, T. A. (2016). Effectiveness of Lactobacillus helveticus and Lactobacillus rhamnosus for the management of antibiotic-associated diarrhoea in healthy adults: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. British Journal of Nutrition, 116(1), 94-103. doi: 10.1017/S0007114516001665
Evrendilek, G. A. (2007). Survival of Escherichia coli O157: H7 in yogurt drink, plain yogurt and salted (tuzlu) yogurt: Effects of storage time, temperature, background flora and product characteristics. International Journal of Dairy Technology, 60(2), 118-122. doi: 10.1111/j.1471-0307.2007.00312.x
Fabre, C. E., Duviau, V. J., Blanc, P. J., et Goma, G. (1995). Identification of volatile flavour compounds obtained in culture of Kluyveromyces marxianus. Biotechnology Letters, 17(11), 1207-1212. doi: 10.1007/BF00128387
Farnworth, E.R., Champagne, C.P., et Van Calsteren, M.R. (2007). Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: Food uses, production, chemical structures, and health effects. Chapitre 18 dans Handbook of Nutraceuticals and Functional Foods, 2e Ed., 353-371: CRC Press Boca Raton.
Fasoli, G., Tofalo, R., Lanciotti, R., Schirone, M., Patrignani, F., Perpetuini, G., Grazia, L., Corsetti, A., et Suzzi, G. (2015). Chromosome arrangement, differentiation of growth kinetics and volatile molecule profiles in Kluyveromyces marxianus strains from Italian cheeses. International Journal of Food Microbiology, 214, 151-158. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2015.08.001
Favier, C. F., Vaughan, E. E., De Vos, W. M., et Akkermans, A. D. L. (2002). Molecular monitoring of succession of bacterial communities in human neonates. Applied and Environmental Microbiology, 68(1), 219-226. doi: 10.1128/AEM.68.1.219-226.2002
Fleet, G. H. (1990). Yeasts in dairy products. Journal of Applied Bacteriology, 68(3), 199-211. doi: 10.1111/j.1365-2672.1990.tb02566.x
Fonseca, G. G., Heinzle, E., Wittmann, C., et Gombert, A. K. (2008). The yeast Kluyveromyces marxianus and its biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology, 79(3), 339-354. doi: 10.1007/s00253-008-1458-6
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). (2003). Food energy – Methods of analyses and conversion factors. FAO Food and Nutrition Paper 77. Report of a technical workshop, Rome. Consulté le 2017-09-30, au http://www.fao.org/docrep/006/Y5022E/y5022e00.htm#Contents
Food and Drug Administration (FDA). (2009). Guidance for FDA Staff – Compliance Policy Guide on Dairy Products – Microbial Contaminants and Alkaline Phosphatase Activity Consulté le 2016-10-02, au http://www.fda.gov/downloads/ICECI/ComplianceManuals/CompliancePolicyGuidanceManual/UCM192468.pdf
Food and Drug Administration (FDA). (2012). Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins (2 ed.): Food and Drug Administration.
Food and Drug Administration (FDA). (2013). Chobani, inc. voluntarily recalls Greek yogurt because of product concerns. Consulté le 2016-09-29, au http://www.fda.gov/Safety/Recalls/ucm367298.htm
119
Fooladi, A. A. I., Forooshai, M. C., Saffarian, P., et Mehrab, R. (2014). Antimicrobial effects of four lactobacilli strains isolated from yoghurt against Escherichia coli O157: H7. Journal of Food Safety, 34(2), 150-160. doi: 10.1111/jfs.12108
Foster, L. M., Tompkins, T. A., et Dahl, W. J. (2011). A comprehensive post-market review of studies on a probiotic product containing Lactobacillus helveticus R0052 and Lactobacillus rhamnosus R0011. Beneficial Microbes, 2(4), 319-334. doi: 10.3920/BM2011.0032
Gadaga, T. H., Mutukumira, A. N., et Narvhus, J. A. (2001). Growth characteristics of Candida kefyr and two strains of Lactococcus lactis subsp lactis isolated from Zimbabwean naturally fermented milk. International Journal of Food Microbiology, 70(1-2), 11-19. doi: 10.1016/s0168-1605(01)00501-3
Gardiner, G. E., O'Sullivan, E., Kelly, J., Auty, M. A. E., Fitzgerald, G. F., Collins, J. K., Ross, R. P., et Stanton, C. (2000). Comparative survival rates of human-derived probiotic Lactobacillus paracasei and L. salivarius strains during heat treatment and spray drying. Applied and Environmental Microbiology, 66(6), 2605-2612. doi: 10.1128/AEM.66.6.2605-2612.2000
Gatti, M., Trivisano, C., Fabrizi, E., Neviani, E., et Gardini, F. (2004). Biodiversity among Lactobacillus helveticus strains isolated from different natural whey starter cultures as revealed by classification trees. Applied and Environmental Microbiology, 70(1), 182-190. doi: 10.1128/AEM.70.1.182-190.2004
GEA Group. (2016). Séparateurs à buses pour fromage frais, fromage blanc et yaourt brassé. Consulté le 2017-04-28, au http://www.gea.com/fr/products/nozzle-separators-fresh-cheese-cream-cheese-strained-yoghurt.jsp
Gilbert, K., Arseneault-Breard, J., Flores Monaco, F., Beaudoin, A., Bah, T. M., Tompkins, T. A., Godbout, R., et Rousseau, G. (2013). Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion. British Journal of Nutrition, 109(1), 50-56. doi: 10.1017/S0007114512003807
Gilliland, S. E., Reilly, S. S., Kim, G. B., et Kim, H. S. (2002). Viability during storage of selected probiotic lactobacilli and bifidobacteria in a yogurt-like product. Journal of Food Science, 67(8), 3091-3095. doi: 10.1111/j.1365-2621.2002.tb08864.x
Giraffa, G., Gatti, M., Rossetti, L., Senini, L., et Neviani, E. (2000). Molecular diversity within Lactobacillus helveticus as revealed by genotypic characterization. Applied and Environmental Microbiology, 66(4), 1259-1265. doi: 10.1128/AEM.66.4.1259-1265.2000
Giudici, P., Masini, G., et Caggia, C. (1996). The role of galactose fermenting yeast in plain yogurt spoilage. Annali di Microbiologia ed Enzimologia, 46(1), 11-19.
Glass, K. A., Loeffelholz, J. M., Ford, J. P., et Doyle, M. P. (1992). Fate of Escherichia coli O157: H7 as affected by pH or sodium chloride and in fermented, dry sausage. Applied and Environmental Microbiology, 58(8), 2513-2516.
Gomes, A. M. P., et Malcata, F. X. (1999). Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: Biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics. Trends in Food Science and Technology, 10(4-5), 139-157. doi: 10.1016/S0924-2244(99)00033-3
Gomes, A. M. P., Malcata, F. X., et Klaver, F. A. M. (1998). Growth Enhancement of Bifidobacterium lactis Bo and Lactobacillus acidophilus Ki by milk hydrolyzates. Journal of Dairy Science, 81(11), 2817-2825. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(98)75840-0
González-Martínez, C., Becerra, M., Cháfer, M., Albors, A., Carot, J. M., et Chiralt, A. (2002). Influence of substituting milk powder for whey powder on yoghurt quality. Trends in Food Science and Technology, 13(9-10), 334-340. doi: 10.1016/S0924-2244(02)00160-7
Govaris, A., Koidis, P., et Papatheodorou, K. (2002). Behaviour of Escherichia coli O157: H7 in sour milk, cows' milk yogurt and ewes' milk yogurt. Journal of Dairy Research, 69(4), 655-660. doi: 10.1017/S0022029902005824
Griffiths, M. W., et Tellez, A. M. (2013). Lactobacillus helveticus: the proteolytic system. Frontiers in Microbiology, 4. doi: 10.3389/fmicb.2013.00030
120
Grobben, G. J., Chin-Joe, I., Kitzen, V. A., Boels, I. C., Boer, F., Sikkema, J., Smith, M. R., et de Bont, J. A. (1998). Enhancement of exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 with a simplified defined medium. Applied and Environmental Microbiology, 64(4), 1333-1337.
Gueimonde, M., Delgado, S., Mayo, B., Ruas-Madiedo, P., Margolles, A., et De Los Reyes-Gavilán, C. G. (2004). Viability and diversity of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium populations included in commercial fermented milks. Food Research International, 37(9), 839-850. doi: 10.1016/j.foodres.2004.04.006
Gulmez, M., et Guven, A. (2003). Survival of Escherichia coli O157: H7, Listeria monocytogenes 4b and Yersinia enterocolitica O3 in different yogurt and kefir combinations as prefermentation contaminant. Journal of Applied Microbiology, 95(3), 631-636. doi: 10.1046/j.1365-2672.2003.02016.x
Guraya, R., Frank, J. F., et Hassan, A. N. (1998). Effectiveness of salt, pH, and diacetyl as inhibitors for Escherichia coli O157: H7 in dairy foods stored at refrigeration temperatures. Journal of Food Protection, 61(9), 1098-1102. doi: 10.4315/0362-028X-61.9.1098
Gurgui, M., Sanchez, F., March, F., Lopez-Contreras, J., Martino, R., Cotura, A., Galvez, M. L., Roig, C., et Coll, P. (2011). Nosocomial outbreak of Blastoschizomyces capitatus associated with contaminated milk in a haematological unit. Journal of Hospital Infection, 78(4), 274-278. doi: 10.1016/j.jhin.2011.01.027
Harmsen, H. J. M., Wildeboer-Veloo, A. C. M., Raangs, G. C., Wagendorp, A. A., Klijn, N., Bindels, J. G., et Welling, G. W. (2000). Analysis of intestinal flora development in breast-fed and formula-fed infants by using molecular identification and detection methods. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 30(1), 61-67. doi: 10.1097/00005176-200001000-00019
Harwalkar, V. R., et Miloslav, K. (1986). Relationship between microstructure and susceptibility to syneresis in yoghurt made from reconstituted nonfat dry milk. Food Structure, 5(2), 287-294.
Haug, A., Hostmark, A. T., et Harstad, O. M. (2007). Bovine milk in human nutrition - A review. Lipids in Health and Disease, 6. doi: 10.1186/1476-511X-6-25
Hill, C., Guarner, F., Reid, G., Gibson, G. R., Merenstein, D. J., Pot, B., Morelli, L., Canani, R. B., Flint, H. J., Salminen, S., Calder, P. C., et Sanders, M. E. (2014). Expert consensus document: The international scientific association for probiotics and prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology, 11(8), 506-514. doi: 10.1038/nrgastro.2014.66
Hopkins, M. J., Sharp, R., et Macfarlane, G. T. (2001). Age and disease related changes in intestinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. Gut, 48(2), 198-205. doi: 10.1136/gut.48.2.198
Hsin-Yi, C., et Chou, C. C. (2001). Acid adaptation and temperature effect on the survival of E. coli O157: H7 in acidic fruit juice and lactic fermented milk product. International Journal of Food Microbiology, 70(1-2), 189-195. doi: 10.1016/S0168-1605(01)00538-4
Huffman, L. M., et De Barros Ferreira, L. (2011). Whey-based ingredients. Dairy Ingredients for Food Processing (pp. 179-198): Wiley-Blackwell.
Hull, R. R., Roberts, A. V., et Mayes, J. J. (1984). Survival of Lactobacillus acidophilus in yoghurt. Australian Journal of Dairy Technology, 39(4), 164-166.
Ibrahim, S. A., et Bezkorovainy, A. (1994). Growth-promoting factors for Bifidobacterium longum. Journal of Food Science, 59(1), 189-191. doi: 10.1111/j.1365-2621.1994.tb06929.x
International Standardisation Organisation (ISO). (2003). Yogurt — Identification of characteristic microorganisms (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus). ISO 9232:2003 (IDF 146:2003).
International Standardisation Organisation (ISO). (2010). Milk products -- Enumeration of presumptive bifidobacteria -- Colony count technique at 37 degrees C . ISO 29981:2010 (IDF 220:2010).
121
Jandu, N., Jingjing Zen, Z., Johnson-Henry, C., et Sherman, P. M. (2009). Probiotics prevent enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H7-mediated inhibition of interferon-gamma-induced tyrosine phosphorylation of STAT-1. Microbiology (United Kingdom), 155(2), 531-540. doi: 10.1099/mic.0.021931-0
Jasjit, S., Adarsh, K., et Harish, C. (1979). Antibacterial activity of yogurt starter in cow and buffalo milk. Journal of Food Protection, 42(8), 664-665.
Jauhiainen, T., Vapaatalo, H., Poussa, T., Kyrönpalo, S., Rasmussen, M., et Korpela, R. (2005). Lactobacillus helveticus fermented milk lowers blood pressure in hypertensive subjects in 24-h ambulatory blood pressure measurement. American Journal of Hypertension, 18(12), 1600-1605. doi: 10.1016/j.amjhyper.2005.06.006
Jensen, M. P., Vogensen, F. K., et Ardö, Y. (2009). Variation in caseinolytic properties of six cheese related Lactobacillus helveticus strains. International Dairy Journal, 19(11), 661-668. doi: 10.1016/j.idairyj.2009.04.001
Jiang, T., Mustapha, A., et Savaiano, D. A. (1996). Improvement of lactose digestion in humans by ingestion of unfermented milk containing Bifidobacterium longum. Journal of Dairy Science, 79(5), 750-757. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(96)76422-6
Johnson-henry, K. C., Hagen, K. E., Gordonpour, M., Tompkins, T. A., et Sherman, P. M. (2007). Surface-layer protein extracts from Lactobacillus helveticus inhibit enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H7 adhesion to epithelial cells. Cellular Microbiology, 9(2), 356-367. doi: 10.1111/j.1462-5822.2006.00791.x
Juillard, V., Bars, D. l., Kunji, E. R. S., Konings, W. N., Gripon, J. C., et Richard, J. (1995). Oligopeptides are the main source of nitrogen for Lactococcus lactis during growth in milk. Applied and Environmental Microbiology, 61(8), 3024-3030.
Jyhshiun, L., Smith, M. P., Chapin, K. C., Hyung Suk, B., Bennett, G. N., et Foster, J. W. (1996). Mechanisms of acid resistance in enterohemorrhagic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 62(9), 3094-3100.
Kailasapathy, K. et Chin, J. (2000). Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium ssp. Immunology and Cell Biology, 78(1), 80-88. doi: 10.1046/j.1440-1711.2000.00886.x
Kailasapathy, K., et Supriadi, D. (1996). Effect of whey protein concentrate on the survival of Lactobacillus acidophilus in lactose hydrolysed yoghurt during refrigerated storage. Milchwissenschaft, 51(10), 565-568.
Karam, M. C., Gaiani, C., Hosri, C., Burgain, J., et Scher, J. (2013). Effect of dairy powders fortification on yogurt textural and sensorial properties: A review. Journal of Dairy Research, 80(4), 400-409. doi: 10.1017/S0022029913000514
Karlien. (2014). New fairview labneh cheese by Shelly. Retrieved from https://theonek.com/tag/fairview-labneh/
Kavas, G., Kinik, O., Uysal, H., Kilic, S., Celikel, N., et Akbulut, N. (2006). Characterisation of yeasts isolated from artisanal Turkish dairy products. International Journal of Dairy Science, 1(1), 44-50. doi: 10.3923/ijds.2006.44.50
Kilara, A., et Chandan, R. C. (2013). Greek-style yogurt and related products. Manufacturing yogurt and fermented milks (2 ed., pp. 297-318): John Wiley and Sons.
Kim, G. H., Breidt, F., Fratamico, P., et Oh, D. H. (2015). Acid resistance and molecular characterization of Escherichia coli O157: H7 and different non-O157 shiga toxin-producing E. coli serogroups. Journal of Food Science, 80(10), M2257-2264. doi: 10.1111/1750-3841.12996
Kotz, C. M., Peterson, L. R., Moody, J. A., Savaiano, D. A., et Levitt, M. D. (1990). In vitro antibacterial effect of yogurt on Escherichia coli. Digestive Diseases and Sciences, 35(5), 630-637. doi: 10.1007/BF01540412
Kumar, P., et Mishra, H. N. (2004). Yoghurt powder - A review of process technology, storage and utilization. Food and Bioproducts Processing, 82(C2), 133-142. doi: 10.1205/0960308041614918
Lacasse, D. (2002). Introduction à la microbiologie alimentaire : Éditions Saint-Martin.
122
Lanciotti, R., Vannini, L., Pittia, P., et Guerzoni, M. E. (2004). Suitability of high-dynamic-pressure-treated milk for the production of yoghurt. Food Microbiology, 21(6), 753-760. doi: 10.1016/j.fm.2004.01.014
Lane, M. M., Burke, N., Karreman, R., Wolfe, K. H., O'Byrne, C. P., et Morrissey, J. P. (2011). Physiological and metabolic diversity in the yeast Kluyveromyces marxianus. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 100(4), 507-519. doi: 10.1007/s10482-011-9606-x
Lankaputhra, W. E. V., Shah, N. P., et Britz, M. L. (1996). Survival of bifidobacteria during refrigerated storage in the presence of acid and hydrogen peroxide. Milchwissenschaft, 51(2), 65-69.
Lapointe-Vignola, C. (2002). Science et technologie du lait: Transformation du lait : Presses internationales Polytechnique.
Large, T. M., Walk, S. T., et Whittam, T. S. (2005). Variation in acid resistance among shiga toxin-producing clones of pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 71(5), 2493-2500. doi: 10.1128/AEM.71.5.2493-2500.2005
Lazar, S. P., Lukaszewicz, J. M., Persad, K. A., et Reinhardt, J. F. (2014). Rhinocerebral Mucor circinelloides infection in immunocompromised patient following yogurt ingestion. Delaware Medical Journal, 86(8), 245-248.
Leahy, S. C., Higgins, D. G., Fitzgerald, G. F., et Sinderen, D. v. (2005). Getting better with bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology, 98(6), 1303-1315. doi: 10.1111/j.1365-2672.2005.02600.x
Ledenbach, L. H., et Marshall, R. T. (2010). Microbiological spoilage of dairy products. Compendium of the microbiological spoilage of foods and beverages (pp. 41-67). New York: Springer
Lee, S. C., Billmyre, R. B., Li, A., Carson, S., Sykes, S. M., Huh, E. Y., Mieczkowski, P., Ko, D. C., Cuomo, C. A., et Heitman, J. (2014). Analysis of a food-borne fungal pathogen outbreak: Virulence and genome of a Mucor circinelloides isolate from yogurt. Mbio, 5(4), 12. doi: 10.1128/mBio.01390-14
Lee, S. M., et Chen, J. (2005). The influence of an extracellular polysaccharide, comprised of colanic acid, on the fate of Escherichia coli O157: H7 during processing and storage of stirred yogurt. LWT - Food Science and Technology, 38(7), 785-790. doi: 10.1016/j.lwt.2004.09.003
Leyer, G. J., Lih-Ling, W., et Johnson, E. A. (1995). Acid adaptation of Escherichia coli O157: H7 increases survival in acidic foods. Applied and Environmental Microbiology, 61(10), 3752-3755.
Li, Y., et Corredig, M. (2014). Calcium release from milk concentrated by ultrafiltration and diafiltration. Journal of Dairy Science, 97(9), 5294-5302. doi: 10.3168/jds.2013-7567
Lima, K. G. d. C., Kruger, M. F., Behrens, J., Destro, M. T., Landgraf, M., et Gombossy de Melo Franco, B. D. (2009). Evaluation of culture media for enumeration of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Bifidobacterium animalis in the presence of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus and Streptococcus thermophilus. LWT - Food Science and Technology, 42(2), 491-495. doi: 10.1016/j.lwt.2008.08.011
López, P., Monteserín, D. C., Gueimonde, M., de los Reyes-Gavilán, C. G., Margolles, A., Suárez, A., et Ruas-Madiedo, P. (2012). Exopolysaccharide-producing Bifidobacterium strains elicit different in vitro responses upon interaction with human cells. Food Research International, 46(1), 99-107. doi: 10.1016/j.foodres.2011.11.020
Lucey, J. A., Hauth, B., Gorry, C., et Fox, P. F. (1993). The acid-base buffering properties of milk. Milchwissenschaft, 48(5), 268-272.
Macedo, M.G., Lacroix, C. et Champagne, C.P. (2002) Combined effects of temperature and medium composition on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus RW-9595M in a whey permeate based medium. Biotechnology Progress, 18(2), 167-173. doi: 10.1021/bp0101637
Mani-López, E., Palou, E., et López-Malo, A. (2014). Probiotic viability and storage stability of yogurts and fermented milks prepared with several mixtures of lactic acid bacteria. Journal of Dairy Science, 97(5), 2578-2590. doi: 10.3168/jds.2013-7551
Marafon, A. P., Sumi, A., Alcantara, M. R., Tamime, A. Y., et Oliveira, M. N. D. (2011). Optimization of the rheological properties of probiotic yoghurts supplemented with milk proteins. LWT - Food Science and Technology, 44(2), 511-519. doi: 10.1016/j.lwt.2010.09.005
123
Masotti, A. I., Buckley, N., Champagne, C. P., et Green-Johnson, J. (2011). Immunomodulatory bioactivity of soy and milk ferments on monocyte and macrophage models. Food Research International, 44(8), 2475-2481. doi: 10.1016/j.foodres.2011.02.004
Mataragas, M., Dimitriou, V., Skandamis, P. N., et Drosinos, E. H. (2011). Quantifying the spoilage and shelf-life of yoghurt with fruits. Food Microbiology, 28(3), 611-616. doi: 10.1016/j.fm.2010.11.009
Meijer, W. C., Tacken, M., Noomen, A., et Hugenholtz, J. (1995). Determination of growth parameters of lactococci in milk and ultrafiltered milk. Journal of Dairy Science, 78(1), 17-23. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(95)76611-5
Messaoudi, M., Lalonde, R., Violle, N., Javelot, H., Desor, D., Nejdi, A., Bisson, J. F., Rougeot, C., Pichelin, M., Cazaubiel, M., et Cazaubiel, J. M. (2011). Assessment of psychotropic-like properties of a probiotic formulation (Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175) in rats and human subjects. British Journal of Nutrition, 105(5), 755-764. doi: 10.1017/S0007114510004319
Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation du Québec (MAPAQ). (2013). Bilan 2012-2013 - Toxi-infections alimentaires. Consulté le 2017-02-16, au http://www.mapaq.gouv.qc.ca/fr/Consommation/toxiinfections/Pages/CONBilanannuel.aspx
Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation du Québec (MAPAQ). (2014). Bilan 2013-2014 - Toxi-infections alimentaires. Consulté le 2017-02-16, au http://www.mapaq.gouv.qc.ca/fr/Consommation/toxiinfections/Pages/CONBilanannuel.aspx
Mohammed, S. S. D., et Ijah, U. J. J. (2013). Isolation and screening of lactic acid bacteria from fermented milk products for bacteriocin production. Annals Food Science and Technology, 14(1), 122-128. doi: 10.1016/j.foodcont.2010.09.010
Moreno-Montoro, M., Olalla, M., Gimenez-Martinez, R., Bergillos-Meca, T., Ruiz-Lopez, M. D., Cabrera-Vique, C., Artacho, R., et Navarro-Alarcon, M. (2015). Ultrafiltration of skimmed goat milk increases its nutritional value by concentrating nonfat solids such as proteins, Ca, P, Mg, and Zn. Journal of Dairy Science, 98(11), 7628-7634. doi: 10.3168/jds.2015-9939
Morgan, D., Newman, C. P., Hutchinson, D. N., Walker, A. M., Rowe, B., et Majid, F. (1993). Verotoxin producing Escherichia coli O 157 infections associated with the consumption of yoghurt. Epidemiology and Infection, 111(2), 181-187. doi: 10.1017/S0950268800056880
Morishita, T., Deguchi, Y., Yajima, M., Sakurai, T., et Yura, T. (1981). Multiple nutritional requirements of lactobacilli: Genetic lesions affecting amino acid biosynthetic pathways. Journal of Bacteriology, 148(1), 64-71.
Mottar, J., Bassier, A., Joniau, M., et Baert, J. (1989). Effect of heat-induced association of whey proteins and casein micelles on yoghurt texture. Journal of Dairy Science, 72(9), 2247-2256. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(89)79355-3
Naser, S. M., Hagen, K. E., Vancanneyt, M., Cleenwerch, I., Swings, J., et Tompkins, T. A. (2006). Lactobacillus suntoryeus Cachat and Priest 2005 is a later synonym of Lactobacillus helveticus (Orla-Jensen 1919) Bergey et al. 1925 (Approved Lists 1980). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56(2), 355-360. doi: 10.1099/ijs.0.64001-0
Nassib, T. A., El-Din, M. Z., et El-Sharoud, W. M. (2006). Effect of thermophilic lactic acid bacteria on the viability of Salmonella serovar Typhimurium PT8 during milk fermentation and preparation of buffalo's yogurt. International Journal of Dairy Technology, 59(1), 29-34. doi: 10.1111/j.1471-0307.2006.00238.x
Naumova, E. S., Naumov, G. I., Nikitina, T. N., Sadykova, A. Z., et Kondratieva, V. I. (2012). Molecular genetic and physiological differentiation of Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces marxianus: Analysis of strains from the all-Russian collection of microorganisms (VKM). Microbiology (United Kingdom), 81(2), 216-223. doi: 10.1134/s0026261712020087
Navarrete del Toro, M. A., et García-Carreño, F. L. (2001). Evaluation of the progress of protein hydrolysis. Current Protocols in Food Analytical Chemistry (Vol. 1).
Nicolò, M. S., Gioffrè, A., Carnazza, S., Platania, G., Silvestro, I. D., et Guglielmino, S. P. P. (2011). Viable but nonculturable state of foodborne pathogens in grapefruit juice: A study of laboratory. Foodborne Pathogens and Disease, 8(1), 11-17. doi: 10.1089/fpd.2009.0491
124
Nsabimana, C., Jiang, B., et Kossah, R. (2005). Manufacturing, properties and shelf life of labneh: A review. International Journal of Dairy Technology, 58(3), 129-137. doi: 10.1111/j.1471-0307.2005.00205.x
O'Kennedy, B. T. (2011). Caseins. Handbook of Food Proteins (pp. 13-29): Elsevier Inc. Odamaki, T., Xiao, J. Z., Yonezawa, S., Yaeshima, T., et Iwatsuki, K. (2011). Improved viability of
bifidobacteria in fermented milk by cocultivation with Lactococcus lactis subspecies lactis. Journal of Dairy Science, 94(3), 1112-1121. doi: 10.3168/jds.2010-3286
Oliveira, R. P. D. S., Perego, P., Converti, A., et Oliveira, M. N. D. (2009). Effect of inulin on growth and acidification performance of different probiotic bacteria in co-cultures and mixed culture with Streptococcus thermophilus. Journal of Food Engineering, 91(1), 133-139. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2008.08.013
Oliveira, R. P. D. S., Torres, B. R., Perego, P., Oliveira, M. N. D., et Converti, A. (2012). Co-metabolic models of Streptococcus thermophilus in co-culture with Lactobacillus bulgaricus or Lactobacillus acidophilus. Biochemical Engineering Journal, 62, 62-69. doi: 10.1016/j.bej.2012.01.004
Orrhage, K., Brismar, B., et Nord, C. E. (1994). Effect of supplements with Bifidobacterium longum and Lactobacillus acidophilus on the intestinal microbiota during administration of clindamycin. Microbial Ecology in Health and Disease, 7(1), 17-25. doi: 10.3109/08910609409141570
Osaili, T. M., Taani, M., Al-Nabulsi, A. A., Attlee, A., Odeh, R. A., Holley, R. A., et Obaid, R. S. (2013). Survival of Escherichia coli O157: H7 during the manufacture and storage of fruit yogurt. Journal of Food Safety, 33(3), 282-290. doi: 10.1111/jfs.12051
Ostlie, H. M., Treimo, J., et Narvhus, J. A. (2005). Effect of temperature on growth and metabolism of probiotic bacteria in milk. International Dairy Journal, 15(10), 989-997. doi: 10.1016/j.idairyj.2004.08.015
Ozer, B. H., Bell, A. E., Grandison, A. S., et Robinson, R. K. (1998). Rheological properties of concentrated yoghurt (labneh). Journal of Texture Studies, 29(1), 67-79. doi: 10.1111/j.1745-4603.1998.tb00154.x
Ozer, B. H., et Robinson, R. K. (1999). The behaviour of starter cultures in concentrated yoghurt (labneh) produced by different techniques. LWT - Food Science and Technology, 32(7), 391-395. doi: 10.1006/fstl.1999.0566
Ozer, B. H., Stenning, R., Grandison, A. S., et Robinson, R. K. (1999a). Effect of protein concentration on the properties and structure of concentrated yogurts. International Journal of Dairy Technology, 52(4), 135-138. doi: 10.1111/j.1471-0307.1999.tb02855.x
Ozer, B. H., Stenning, R. A., Grandison, A. S., et Robinson, R. K. (1999b). Rheology and microstructure of labneh (concentrated yogurt). Journal of Dairy Science, 82(4), 682-689. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(99)75284-7
Patrignani, F., Serrazanetti, D. I., Mathara, J. M., Siroli, L., Gardini, F., Holzapfel, W. H., et Lanciotti, R. (2016). Use of homogenisation pressure to improve quality and functionality of probiotic fermented milks containing Lactobacillus rhamnosus BFE 5264. International Journal of Dairy Technology, 69(2), 262-271. doi: 10.1111/1471-0307.12251
Peng, Y., Serra, M., Horne, D. S., et Lucey, J. A. (2009). Effect of fortification with various types of milk proteins on the rheological properties and permeability of nonfat set yogurt. Journal of Food Science, 74(9), C666-C673. doi: 10.1111/j.1750-3841.2009.01350.x
Pineda, C., Kaushik, A., Kest, H., Wickes, B., et Zauk, A. (2012). Maternal sepsis, chorioamnionitis, and congenital Candida kefyr infection in premature twins. Pediatric Infectious Disease Journal, 31(3), 320-322. doi: 10.1097/INF.0b013e31823eee1a
Pinto, D., Santos, M.A., et Chambel, L. (2015). Thirty years of viable but nonculturable state research: Unsolved molecular mechanisms. Critical Reviews in Microbiology, 41(1), 61-76. doi: 10.3109/1040841X.2013.794127
Prasanna, P. H. P., Grandison, A. S., et Charalampopoulos, D. (2012a). Effect of dairy-based protein sources and temperature on growth, acidification and exopolysaccharide production of Bifidobacterium strains in skim milk. Food Research International, 47(1), 6-12. doi: 10.1016/j.foodres.2012.01.004
Prasanna, P. H. P., Grandison, A. S., et Charalampopoulos, D. (2012b). Screening human intestinal Bifidobacterium strains for growth, acidification, EPS production and viscosity potential in low-fat milk. International Dairy Journal, 23(1), 36-44. doi: 10.1016/j.idairyj.2011.09.008
125
Prazeres, A.R., Carvalho, F., et Rivas, J. (2012). Cheese whey management: A review. Journal of Environmental Management, 110, 48-68. doi: 10.1016/j.jenvman.2012.05.018
Qingli, Z., Bao, Y., Brashears, M. M., Zhimin, Y., Mouming, Z., Ning, L., et Yinjuan, L. (2014). Influence of casein hydrolysates on exopolysaccharide synthesis by Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of the Science of Food and Agriculture, 94(7), 1366-1372. doi: 10.1002/jsfa.6420
Qingli, Z., Brashears, M. M., Zhimin, Y., Jiaoyan, R., Yinjuan, L., et Mouming, Z. (2013). Effect of ultrafiltered fractions from casein on lactic acid biosynthesis and enzyme activity in yoghurt starter cultures. International Journal of Food Science and Technology, 48(7), 1474-1482. doi: 10.1111/ijfs.12115
Qingli, Z., Jiaoyan, R., Haifeng, Z., Mouming, Z., Jiaoyun, X., et Qiangzhong, Z. (2011). Influence of casein hydrolysates on the growth and lactic acid production of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus. International Journal of Food Science & Technology, 46(5), 1014-1020. doi: 10.1111/j.1365-2621.2011.02578.x
Qiuye, L., Mathieu, O., Tompkins, T. A., Buckley, N. D., et Green-Johnson, J. M. (2016). Modulation of the TNF alpha-induced gene expression profile of intestinal epithelial cells by soy fermented with lactic acid bacteria. Journal of Functional Foods, 23, 400-411. doi: 10.1016/j.jff.2016.02.047
Radke-Mitchell, L. C., et Sandine, W. E. (1986). Influence of temperature on associative growth of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus. Journal of Dairy Science, 69(10), 2558-2568. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(86)80701-9
Ramona, M., Ramona, M., Kianoush, K.-D., et Reza Nikbakht, H. (2015). Improving the viability of probiotic bacteria in yoghurt by homogenization. Journal of Food Processing and Preservation, 39(6), 2984-2990. doi: 10.1111/jfpp.12551
Rangel, J. M., Sparling, P. H., Crowe, C., Griffin, P. M., et Swerdlow, D. L. (2005). Epidemiology of Escherichia coli O157: H7 outbreaks, United States, 1982-2002. Emerging Infectious Diseases, 11(4), 603-609. doi: 10.3201/eid1104.040739
Raymond, Y., et Champagne, C. P. (2015). The use of flow cytometry to accurately ascertain total and viable counts of Lactobacillus rhamnosus in chocolate. Food Microbiology, 46, 176-183. doi: 10.1016/j.fm.2014.07.002
REDA. (2017). Ultrafiltration. Consulté le 2017-04-28, au http://www.redaspa.com/fr/applications/separation-par-membrane/ultrafiltration/#!prettyPhoto
Reis, J. A., Paula, A. T., Casarotti, S. N., et Penna, A. L. B. (2012). Lactic acid bacteria antimicrobial compounds: Characteristics and applications. Food Engineering Reviews, 4(2), 124-140. doi: 10.1007/s12393-012-9051-2
Remeuf, F., Mohammed, S., Sodini, I., et Tissier, J. P. (2003). Preliminary observations on the effects of milk fortification and heating on microstructure and physical properties of stirred yogurt. International Dairy Journal, 13(9), 773-782. doi: 10.1016/S0958-6946(03)00092-X
Rinaldoni, A. N., Campderros, M., Menendez, C. J., et Padilla, A. P. (2009a). Fractionation of skim milk by an integrated membrane process for yoghurt elaboration and lactose recuperation. International Journal of Food Engineering, 5(3), 2-3. doi: 10.2202/1556-3758.1531
Rinaldoni, A. N., Tarazaga, C. C., Campderrós, M. E., et Padilla, A. P. (2009b). Assessing performance of skim milk ultrafiltration by using technical parameters. Journal of Food Engineering, 92(2), 226-232. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2008.11.009
Robinson, R. K. (2012). Modern dairy technology: Volume 2 advances in milk products : Springer US. Robinson, R. K., Lucey, J. A., et Tamime, A. Y. (2007). Manufacture of yoghurt. Fermented Milks (pp. 53-75):
Blackwell Publishing Ltd. Rodrigues, L. R., Teixeira, J. A., van der Mei, H. C., et Oliveira, R. (2006). Isolation and partial characterization
of a biosurfactant produced by Streptococcus thermophilus A. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 53(1), 105-112. doi: 10.1016/j.colsurfb.2006.08.009
Roy, D. (2005). Technological aspects related to the use of bifidobacteria in dairy products. Lait, 85(1-2), 39-56. doi: 10.1051/lait:2004026
126
Rubin, H. E., et Vaughan, F. (1979). Elucidation of the inhibitory factors of yogurt against Salmonella typhimurium. Journal of Dairy Science, 62(12), 1873-1879. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(79)83517-1
Rubio-Texeira, M. (2006). Endless versatility in the biotechnological applications of Kluyveromyces LAC genes. Biotechnol Adv, 24(2), 212-225. doi: 10.1016/j.biotechadv.2005.10.001
Russell, N. J. (2002). Bacterial membranes: The effects of chill storage and food processing. An overview. International Journal of Food Microbiology, 79(1-2), 27-34. doi: 10.1016/S0168-1605(02)00176-9
Sadat-Mekmene, L., Jardin, J., Corre, C., Mollé, D., Richoux, R., Delage, M. M., Lortal, S., et Gagnaire, V. (2011). Simultaneous presence of PrtH and PrtH2 proteinases in Lactobacillus helveticus strains improves breakdown of the pure αs1-casein. Applied and Environmental Microbiology, 77(1), 179-186. doi: 10.1128/AEM.01466-10
Sadowska, B., Walencka, E., Wieckowska-Szakiel, M., et Rózalska, B. (2010). Bacteria competing with the adhesion and biofilm formation by Staphylococcus aureus. Folia Microbiologica, 55(5), 497-501. doi: 10.1007/s12223-010-0082-x
Salaun, F., Mietton, B., et Gaucheron, F. (2005). Buffering capacity of dairy products. International Dairy Journal, 15(2), 95-109. doi: 10.1016/j.idairyj.2004.06.007
Salomskiene, J., et Macioniene, I. (2009). The influence of contamination yoghurt, quark and semi-hard cheese by yeasts on their sensory properties. Veterinarija Ir Zootechnika, 48(70), 72-76.
Santé Canada. (2009a). Allégations acceptées relatives à la nature des microorganismes probiotiques utilisés dans les aliments - Étiquetage des aliments. Consulté le 2017-09-30, au https://www.canada.ca/fr/sante-canada/services/aliments-nutrition/etiquetage-aliments/allegations-sante/allegations-acceptees-relatives-nature-microorganismes-probiotiques-utilises-aliments-etiquetage-aliments.html
Santé Canada. (2009b). Lines directrices - Utilisation des microorganismes probiotiques dans les aliments. Consulté le 2016-11-10, au https://www.canada.ca/fr/sante-canada/services/aliments-nutrition/legislation-lignes-directrices/document-reference/lignes-directrices-utilisation-microorganismes-probiotiques-aliments-2009.html
Savijoki, K., Ingmer, H., et Varmanen, P. (2006). Proteolytic systems of lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology, 71(4), 394-406. doi: 10.1007/s00253-006-0427-1
Schaack, M. M., et Marth, E. H. (1988). Survival of Listeria monocytogenes in refrigerated cultured milks and yogurt. Journal of Food Protection, 51(11), 848-852.
Schwendel, B. H., Wester, T. J., Morel, P. C. H., Tavendale, M. H., Deadman, C., Shadbolt, N. M., et Otter, D. E. (2015). Invited review: Organic and conventionally produced milk - An evaluation of factors influencing milk composition. Journal of Dairy Science, 98(2), 721-746. doi: 10.3168/jds.2014-8389
Settachaimongkon, S., Van Valenberg, H. J. F., Winata, V., Wang, X., Nout, M. J. R., Van Hooijdonk, T. C. M., Zwietering, M. H., et Smid, E. J. (2015). Effect of sublethal preculturing on the survival of probiotics and metabolite formation in set-yoghurt. Food Microbiology, 49, 104-115. doi: 10.1016/j.fm.2015.01.011
Sherman, P. M., Johnson-Henry, K. C., Yeung, H. P., Ngo, P. S. C., Goulet, J., et Tompkins, T. A. (2005). Probiotics reduce enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7- and enteropathogenic E. coli O127:H6-induced changes in polarized T84 epithelial cell monolayers by reducing bacterial adhesion and cytoskeletal rearrangements. Infection and Immunity, 73(8), 5183-5188. doi: 10.1128/IAI.73.8.5183-5188.2005
Shihata, A., et Shah, N. P. (2000). Proteolytic profiles of yogurt and probiotic bacteria. International Dairy Journal, 10(5-6), 401-408. doi: 10.1016/S0958-6946(00)00072-8
Silva, A. M., Barbosa, F. H. F., Duarte, R., Vieira, L. Q., Arantes, R. M. E., et Nicoli, J. R. (2004). Effect of Bifidobacterium longum ingestion on experimental salmonellosis in mice. Journal of Applied Microbiology, 97(1), 29-37. doi: 10.1111/j.1365-2672.2004.02265.x
Simpson, P. J., Fitzgerald, G. F., Stanton, C., et Ross, R. P. (2004). The evaluation of a mupirocin-based selective medium for the enumeration of bifidobacteria from probiotic animal feed. Journal of Microbiological Methods, 57(1), 9-16. doi: 10.1016/j.mimet.2003.11.010
127
Singh, J., Rivenson, A., Tomita, M., Shimamura, S., Ishibashi, N., et Reddy, B. S. (1997). Bifidobacterium longum, a lactic acid-producing intestinal bacterium inhibits colon cancer and modulates the intermediate biomarkers of colon carcinogenesis. Carcinogenesis, 18(4), 833-841. doi: 10.1093/carcin/18.4.833
Slattery, L., O'Callaghan, J., Fitzgerald, G. F., Beresford, T., et Ross, R. P. (2010). Invited review: Lactobacillus helveticus - A thermophilic dairy starter related to gut bacteria. Journal of Dairy Science, 93(10), 4435-4454. doi: 10.3168/jds.2010-3327
Stiles, M. E., et Holzapfel, W. H. (1997). Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology, 36(1), 1-29. doi: 10.1016/S0168-1605(96)01233-0
Svensson, M., Lohmeier-Vogel, E., Waak, E., Svensson, U., et Radstrom, P. (2007). Altered nucleotide sugar metabolism in Streptococcus thermophilus interferes with nitrogen metabolism. International Journal of Food Microbiology, 113(2), 195-200. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2006.06.032
Tabasco, R., Paarup, T., Janer, C., Peláez, C., et Requena, T. (2007). Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk. International Dairy Journal, 17(9), 1107-1114. doi: 10.1016/j.idairyj.2007.01.010
Talwalkar, A., et Kailasapathy, K. (2004). A review of oxygen toxicity in probiotic yogurts: Influence on the survival of probiotic bacteria and protective techniques. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 3(3), 117-124. doi: 10.1111/j.1541-4337.2004.tb00061.x
Tamime, A. Y. (2008). Fermented Milks : Blackwell Science Ltd. Tamime, A. Y., et Robinson, R. K. (1999). Yoghurt: Science and Technology : CRC Press. Tamime, A. Y., et Robinson, R. K. (2007). Tamime and Robinson's yoghurt: Science and technology (3 ed.):
Elsevier Inc. Tamime, A. Y., Saarela, M., Søndergaard, A. K., Mistry, V. V., et Shah, N. P. (2007). Production and
maintenance of viability of probiotic micro-organisms in dairy products. Probiotic Dairy Products (pp. 39-72): Blackwell Science Ltd.
Taverniti, V., et Guglielmetti, S. (2012). Health-promoting properties of Lactobacillus helveticus. Frontiers in Microbiology, 3, 392. doi: 10.3389/fmicb.2012.00392
Ten Bruggencate, S.J.M., Girard, S.A., Floris-Vollenbroek, E.G.M., et Bhardwaj, R., Tompkins, T.A., (2015). The effect of a multi-strain probiotic on the resistance toward Escherichia coli challenge in a randomized, placebo-controlled, double-blind intervention study. European Journal of Clinical Nutrition, 69(3), 385-391. doi: 10.1038/ejcn.2014.238
Tetra Pak. (2003). Membranes Filters. Dairy Processing Handbook (pp. 131-140). Lund (Suède). Thomas, M. K., Murray, R., Flockhart, L., Pintar, K., Fazil, A., Nesbitt, A., Marshall, B., Tataryn, J., et Pollari, F.
(2015). Estimates of foodborne illness-related hospitalizations and deaths in Canada for 30 specified pathogens and unspecified agents. Foodborne Pathogens and Disease, 12(10), 820-827. doi: 10.1089/fpd.2015.1966
Thomas, M. K., Murray, R., Flockhart, L., Pintar, K., Pollari, F., Fazil, A., Nesbitt, A., et Marshall, B. (2013). Estimates of the burden of foodborne illness in Canada for 30 specified pathogens and unspecified agents, Circa 2006. Foodborne Pathogens and Disease, 10(7), 639-648. doi: 10.1089/fpd.2012.1389
Tirloni, E., Bernardi, C., Colombo, F., et Stella, S. (2015). Microbiological shelf life at different temperatures and fate of Listeria monocytogenes and Escherichia coli inoculated in unflavored and strawberry yogurts. Journal of Dairy Science, 98(7), 4318-4327. doi: 10.3168/jds.2015-9391
Tofalo, R., Fasoli, G., Schirone, M., Perpetuini, G., Pepe, A., Corsetti, A., et Suzzi, G. (2014). The predominance, biodiversity and biotechnological properties of Kluyveromyces marxianus in the production of Pecorino di Farindola cheese. International Journal of Food Microbiology, 187, 41-49. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.06.029
Tompkins, T. A., Barreau, G., et Broadbent, J. R. (2012). Complete genome sequence of Lactobacillus helveticus R0052, a commercial probiotic strain. Journal of Bacteriology, 194(22), 6349-6349. doi: 10.1128/JB.01638-12
128
Tournas, V. H., Kohn, J. S., et Katsoudas, E. J. (2007). The identification of antibacterial compounds for the development of enhanced media for the detection of foodborne fungi. International Journal of Food Microbiology, 118(1), 83-86. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2007.04.013
Tripathi, M. K., et Giri, S. K. (2014). Probiotic functional foods: Survival of probiotics during processing and storage. Journal of Functional Foods, 9(1), 225-241. doi: 10.1016/j.jff.2014.04.030
Turroni, F., Peano, C., Pass, D. A., Foroni, E., Severgnini, M., Claesson, M. J., Kerr, C., Hourihane, J., Murray, D., Fuligni, F., Gueimonde, M., Margolles, A., Bellis, G. d., O'Toole, P. W., Sinderen, D. v., Marchesi, J. R., et Ventura, M. (2012). Diversity of bifidobacteria within the infant gut microbiota. PLoS ONE, 7(5). doi: 10.1371/journal.pone.0036957
Uduwerella, G., Chandrapala, J., et Vasiljevic, T. (2017). Minimising generation of acid whey during Greek yoghurt manufacturing. Journal of Dairy Research, 84, 346-354. doi: 10.1017/S0022029917000279
Unal, G., et Akalin, A. S. (2013). Influence of fortification with sodium-calcium caseinate and whey protein concentrate on microbiological, textural and sensory properties of set-type yoghurt. International Journal of Dairy Technology, 66(2), 264-272. doi: 10.1111/1471-0307.12016
United States Pharmacopoeia & the National formulary (USP-NF). (1995). Content of alpha amino nitrogen (Vol. USP 23-NF18).
Van de Casteele, S., Vanheuverzwijn, T., Ruyssen, T., Van Assche, P., Swings, J., et Huys, G. (2006). Evaluation of culture media for selective enumeration of probiotic strains of lactobacilli and bifidobacteria in combination with yoghurt or cheese starters. International Dairy Journal, 16(12), 1470-1476. doi: 10.1016/j.idairyj.2005.12.002
Vardjan, T., Lorbeg, P. M., Rogelj, I., et Majhenic, A. C. (2013). Characterization and stability of lactobacilli and yeast microbiota in kefir grains. Journal of Dairy Science, 96(5), 2729-2736. doi: 10.3168/jds.2012-5829
Vénica, C. I., Perotti, M. C., et Bergamini, C. V. (2014). Organic acids profiles in lactose-hydrolyzed yogurt with different matrix composition. Dairy Science and Technology, 94(6), 561-580. doi: 10.1007/s13594-014-0180-7
Ventura, M., Van Sinderen, D., Fitzgerald, G. F., et Zink, R. (2004). Insights into the taxonomy, genetics and physiology of bifidobacteria. Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, 86(3), 205-223. doi: 10.1023/B:ANTO.0000047930.11029.ec
Verdu, E. F., Bercik, P., Xian, X. H., Lu, J., Al-Mutawaly, N., Sakai, H., Tompkins, T. A., Croitoru, K., Tsuchida, E., Perdue, M., et Collins, S. M. (2008). The role of luminal factors in the recovery of gastric function and behavioral changes after chronic Helicobacter pylori infection. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology, 295(4), G664-G670. doi: 10.1152/ajpgi.90316.2008
Viljoen, B. C., Lourens-Hattingh, A., Ikalafeng, B., et Peter, G. (2003). Temperature abuse initiating yeast growth in yoghurt. Food Research International, 36(2), 193-197. doi: 10.1016/s0963-9969(02)00138-2
Vinderola, C. G., Costa, G. A., Regenhardt, C. S., et Reinheimer, J. A. (2002). Influence of compounds associated with fermented dairy products on the growth of lactic acid starter and probiotic bacteria. International Dairy Journal, 12(7), 579-589. doi: 10.1016/S0958-6946(02)00046-8
Vinderola, C. G., et Reinheimer, J. A. (2000). Enumeration of Lactobacillus casei in the presence of L. acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria in fermented dairy products. International Dairy Journal, 10(4), 271-275. doi: 10.1016/S0958-6946(00)00045-5
Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N. R., Ludwig, W., Rainey, F. A., Schleifer, K. H., et Whitman, W. (2011). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes : Springer New York.
Wacher-Rodarte, C., et Farres, A. (1993). Yogurt production from reconstituted skim milk powders using different polymer and non-polymer forming starter cultures. Journal of Dairy Research, 60(2), 247-254. doi: 10.1017/S0022029900027564
Wagar, L. E., Champagne, C. P., Buckley, N. D., Raymond, Y., et Green-Johnson, J. M. (2009). Immunomodulatory properties of fermented soy and dairy milks prepared with lactic acid bacteria. Journal of Food Science, 74(8), M423-M430. doi: 10.1111/j.1750-3841.2009.01308.x
129
Wallace, T. D., Bradley, S., Buckley, N. D., et Green-Johnson, J. M. (2003). Interactions of lactic acid bacteria with human intestinal epithelial cells: Effects on cytokine production. Journal of Food Protection, 66(3), 466-472. doi: 10.4315/0362-028X-66.3.466
Wang, C., Chang, T., Yang, H., et Cui, M. (2015). Antibacterial mechanism of lactic acid on physiological and morphological properties of Salmonella Enteritidis, Escherichia coli and Listeria monocytogenes. Food Control, 47, 231-236. doi: 10.1016/j.foodcont.2014.06.034
Wilson, P. (2001). Dénombrement des coliformes dans les aliments au moyen de la gélose au Rouge Violet et aux Sels Biliaires (VRBA) (MFHPB-31). Compendium de méthode (Vol. 2): Agence Canadienne d'inspection des aliments.
Wine, E., Gareau, M. G., Johnson-Henry, K., et Sherman, P. M. (2009). Strain-specific probiotic (Lactobacillus helveticus) inhibition of Campylobacter jejuni invasion of human intestinal epithelial cells. FEMS Microbiology Letters, 300(1), 146-152. doi: 10.1111/j.1574-6968.2009.01781.x
Wouters, R. (2012). Low fat yet rich in texture, Greek yoghurt proves irresistible to consumers. Wellness Foods Europe(No. 3), 4-8.
Xanthopoulos, V., Petridis, D., et Tzanetakis, N. (2001). Characterization and classification of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strains isolated from traditional Greek yogurts. Journal of Food Science, 66(5), 747-752. doi: 10.1111/j.1365-2621.2001.tb04632.x
Yang, E., Fan, L., Jiang, Y., Doucette, C., et Fillmore, S. (2012). Antimicrobial activity of bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from cheeses and yogurts. AMB Express, 2(1), 1-12. doi: 10.1186/2191-0855-2-48
Yasui, H., Nagaoka, N., Mike, A., Hayakawa, K., et Ohwaki, M. (1992). Detection of Bifidobacterium strains that induce large quantities of IgA. Microbial Ecology in Health and Disease, 5(3), 155-162. doi: 10.3109/08910609209141310
Yazici, F., et Akgun, A. (2004). Effect of some protein based fat replacers on physical, chemical, textural, and sensory properties of strained yoghurt. Journal of Food Engineering, 62(3), 245-254. doi: 10.1016/S0260-8774(03)00237-1
![Bande Dessinée Découverte Des Procédés de Fabrication, Foucher, [1980]](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/55cf9467550346f57ba1c72a/bande-dessinee-decouverte-des-procedes-de-fabrication-foucher-1980.jpg)
