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ImmuLisa™Anti-Saccharomyces cerevisiaeAntibody (ASCA)IgA and IgG ELISAFor in vitro diagnostic use

PRODUCT INSERTCatalog No. 1156G 96 DeterminationsCatalog No. 1156A 96 DeterminationsINTENDED USEAn enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection and semi-quantitation ofanti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (IgG or IgA) in human serum of patients withinflammatory bowel disorder (IBD) as an aid in the diagnosis of Crohn’s disease (CD).SUMMARY AND EXPLANATIONInflammatory bowel diseases (UC and CD) are chronic remitting disorders with unpredictablecourses and variable responses to therapy. The diagnosis of IBD is based on clinical, radiologi-cal, endoscopic and histological findings. Immunological, environmental, infectious (Yersiniaenterocolitica) and genetic factors have been postulated to increase the risk for developingIBD1.CD is primarily a disease of older children and young adults and is rare in infancy. Few epidemio-logical studies have been conducted to find the incidence of CD in the general population. In theScandinavian population alone, the incidence of IBD is 7 per 100,000, with CD at 1.3 per100,0002. CD can affect any part of the intestine, and the lesions are often patchy and occasion-ally very extensive. Histologically, CD is characterized by a transmural inflammatory infiltratecomposed predominantly of lymphocytes and macrophages. Macrophage aggregates are oftenseen in biopsy specimens, but well developed granulomas are present in only 50% resectedspecimens3. The usual surgical procedures for CD include segmental resection and stricturoplasty2.CD can also manifest itself along with other disorders like Henoch-Schonlein purpura4. Vasculitisis an uncommon complication of CD, however, few cases have been reported of cutaneouspolyarteritis nodosa with CD4. A milder form of perianal CD exists and can vary from mildasymptomatic disease to a severe disabling disorder5.ASCA of IgG and IgA isotype are present in 60% of cases with diagnosed CD1. The ASCA’s aredirected against phosphopeptidomannans present in the yeast (S. cerevisiae) cell walls6. ASCAmay be elicited due to molecular mimicry and priming by a high mannose-containing bacterial orviral antigen or an “auto antigenic (self) molecule”1,7. It has been observed that levels of ASCA inCD cases are independent of disease activity, duration and treatment8.ASCA occur frequently in CD patients with positive familial history. ASCA are not consideredspecific markers of genetic susceptibility, but their presence indicates a genetic predisposition9.Studies in monozygotic twins and the Jewish population indicates an influence of geneticfactors on the pathogenesis of CD10. The mode of inheritance seems to be complex andheterogenous, with candidate loci of IBD located on chromosomes 2, 6, 12, and 1611.Recently, serological testing algorithms have been proposed for diagnosis of IBD and to improvediscrimination between CD and UC1. In summary, all suspected cases of IBD must be tested forASCA (IgG and IgA).PRINCIPALS OF THE PROCEDUREThe ASCA test is performed as a solid phase immunoassay (ELISA). Microwells are coated withSaccharomyces cerevisiae phosphopeptidomannan antigen followed by blocking the unreactedsites to reduce nonspecific binding. Controls, calibrators and patient serum samples are incubatedin the antigen coated wells which allows ASCA present in the serum to bind. Unbound antibodyand other serum proteins are removed by washing the microwells. Antibodies bound to the

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microwells are detected by adding enzyme labeled anti-human IgG or IgA conjugates to the wells.These enzyme conjugated antibodies bind specifically to the human immunoglobulin of the appropriateclass. Unbound enzyme conjugate is removed by washing. Specific enzyme substrate (pNPP) isthen added to the wells and the presence of antibodies to Saccharomyces cerevisiae isdetected by a color change produced by the conversion of the pNPP substrate. The reaction isstopped and the intensity of color change, which is proportional to the concentration of antibody,is read by a spectrophotometer at 405 nm. Results are expressed in enzyme units per milliliter (EU/ml).REAGENTSStorage and PreparationStore all reagents at 2-8°C. Do not freeze. Do not use if reagent is not clear or if aprecipitate is present. All reagents must be brought to room temperature (20-25°C) prior touse. When stored at 2-8°C, the reconstituted wash buffer is stable until the kit expirationdate. Reconstitute the wash buffer to 1 liter with distilled or deionized water. Coatedmicrowell strips are for one time use only.PrecautionsFor in vitro Diagnostic Use. All human derived components used have been tested forHBsAg, HCV, HIV-1 and 2 and HTLV-I and found negative by FDA required tests. Howeverhuman blood derivatives and patient specimens should be considered potentially infectious.Follow good laboratory practices in storing, dispensing and disposing of these materials17.WARNING - Sodium azide (NaN3) may react with lead and copper plumbing to form highlyexplosive metal azides. Upon disposal of liquids, flush with large volumes of water toprevent azide buildup. Sodium azide may be toxic if ingested. If ingested, report incidentimmediately to laboratory director or poison control center.Instructions should be followed exactly as they appear in this kit insert to en-sure valid results. Do not interchange kit components with those from other sourcesother than the same catalog number from IMMCO DIAGNOSTICS.Use good laboratory techniques to minimize microbial and chemical contamination.Do not use after expiration date.Materials providedImmuLisa™ IgA-ASCA ELISA 1156AImmuLisa™ IgG-ASCA ELISA 1156G

Kits contain sufficient reagents to perform 96 determinations each.12 x 8 MICROPLATE ASCA Microplate with individual breakaway

microwells coated with S. cereviceaephosphopeptidomannan.

1 x 1.5 ml CALIBRATOR A ASCA * † Ready to use Calibrator A (green cap).Human serum containing antibodies toASCA.

1 x 1.5 ml CALIBRATOR B ASCA * † Ready to use Calibrator B (violet cap).Human serum containing antibodies toASCA.

1 x 1.5 ml CALIBRATOR C ASCA * † Ready to use Calibrator C (blue cap).Human serum containing antibodies toASCA.

1 x 1.5 ml CALIBRATOR D ASCA * † Ready to use Calibrator D (yellow cap).Human serum containing antibodies toASCA.

1 x 1.5 ml CONTROL + ASCA * † Ready to use Positive Control (redcap). Contains human serum positive forASCA.

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1 x 1.5 ml CONTROL - * Ready to use Negative Control (whitecap). Contains human serum.

1 x 12 ml IgA-CONJ ALKPHOS * † Ready to use anti-human Alk. Phos.Conjugate. Color coded pink.

1 x 12 ml IgG-CONJ ALKPHOS * † Ready to use anti-human Alk. Phos.Conjugate. Color coded pink.

1 x 60 ml DIL * Ready to use Serum Diluent. Colorcoded blue.

1 x 12 ml SUBSTRATE * Ready to use Enzyme Substrate. Con-tains pNPP. Protect from light.

1 x 12 ml STOP Ready to use Stop Solution.2 BUF WASH Powder Wash Buffer. Reconstitute to

one liter each.* Contains < 0.1% NaN3† 1156A contains IgA-ASCA calibrators, controls and IgA conjugate

1156G contains IgG-ASCA calibrators, controls and IgG conjugate

Materials Required But Not Provided• Pipettes capable of delivering 5 μl to 1000 μl• Disposable pipette tips• Clean test tubes 12 x 75 mm and test tube rack• Deionized or distilled water• Microplate reader capable of reading absorbance values at 405 nm. If dual wavelength

microplate reader is available, the reference filter should be set at 600-650 nm.• Squeeze bottle to hold diluted wash buffer• Timer• Absorbent paper• Automatic microplate washer capable of dispensing 200 μlSPECIMEN COLLECTION AND HANDLINGOnly serum specimens should be used in this procedure. Grossly hemolyzed, lipemic ormicrobially contaminated specimens may interfere with the performance of the test andshould not be used. Store specimens at 2°- 8°C for no longer than one week. For longerstorage, serum specimens should be frozen. Avoid repeated freezing and thawing ofsamples.PROCEDUREProcedural Notes• Before starting the assay read these instructions carefully.• Bring all reagents and samples to room temperature (20-25°C) for 30 minutes. Return

materials to refrigerator immediately after use.• Prepare all dilutions of the patient specimens before starting the test.• Immediately return unused strips to the pouch containing desiccants and

seal securely to minimize exposure to water vapor.• Wash step: Good technique is critical. An automated microplate washer is rec-

ommended.• Use a multichannel pipette capable of delivering 8 wells simultaneously. This speeds

the process and provides for a more uniform incubation time.• Careful timing is important. Incubation periods begin after dispensing reagents.Assay procedure1. ALL REAGENTS MUST BE BROUGHT TO ROOM TEMPERATURE (20-25°C) PRIOR

TO BEGINNING THE ASSAY.2. Label protocol record to indicate specimen placement in the microplate. It is good

laboratory practice to test specimens in duplicate.

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3. Qualitative determination: use only Calibrator D.Semi-quantitative determination: use Calibrators A - D as shown in theexample below.

4. Prepare a 1:51 dilution of the patient specimen by mixing 10 μl of the patient specimenwith 0.5 ml of Serum Diluent.

5. Add 100 μl of Calibrators, Positive and Negative controls and diluted patient speci-mens to the appropriate microwells indicated on the protocol record.

Note: Include one well with 100 μl of the Serum Diluent as a reagent blank. Zero the ELISAreader against the reagent blank. The absorbance of this well should not be greaterthan 0.3.

6. Incubate 30 minutes (± 5 minutes) at room temperature on a level surface.7. Wash step: Thoroughly aspirate the contents of each well. Add 200-300μL of the

reconstituted wash buffer to all wells then aspirate. Repeat this sequence thricemore for a total of four washes. Invert the plate and tap it on absorbent material toremove any residual fluid after the last wash. Do not dry wells completely.

8. Add 100μL of the Conjugate to each well.9. Incubate the wells for 30 minutes.10. Wash step: Repeat step 7.11. Add 100μL of Enzyme Substrate to each well.12. Incubate for 30 minutes at room temperature.13. Add 100μL of Stop Solution to each well. Maintain the same sequence and timing of

Stop Solution addition as was used for the Enzyme Substrate. Read the absorbance(OD) of each well at 405nm within one hour of stopping the reaction.

14. Read the absorbance (OD) of each well at 405nm using a single or dual wavelengthmicroplate reader against the reagent blank set at zero absorbance.

Quality ControlCalibrators, Positive and Negative Controls and a reagent blank must be run with each assayto verify the integrity and accuracy of the test. The absorbance reading of the reagent blankshould be <0.3. The Calibrator A should have an absorbance reading of not less than 1.0,otherwise the test must be repeated. The negative control must be <20 EU/ml. If the test is runin duplicate, take the mean of the two readings to determine the EU/ml. While performingQualitative determinations, the optical density of the Calibrator D must be greater than that ofthe negative control and lesser than the absorbance of the positive control. For semi-quanti-tative determinations, the positive control must give values in the range stated on the vial.

RESULTSCalculationsThe concentrations of the patient samples can be determined by either of two methods:

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1. QUALITATIVE DETERMINATION

Abs. of Test Sample------------------------------- X EU/ml of Calibrator D = EU/ml Test SampleAbs. of Calibrator D

2. SEMI-QUANTITATIVE DETERMINATIONPlot absorbance of Calibrator A through D against their respective concentration on alinear-linear graph paper. Plot the concentration in EU/ml on the X-axis against theabsorbance on the Y-axis and draw the best fit curve. Determine the concentrations ofthe patient samples from the curve against its corresponding absorbance value.

CalibratorThe ready to use calibrators are included to provide semi-quantitation and must be used witheach run. Patient samples containing higher antibody levels may give absorbance valuesgreater than that of the Calibrator A. For determining accurate semi-quantitative values suchserum sample should be further diluted so they fall within the range of the calibrator curvewhen retested. For determining EU/ml, multiply the units obtained by the dilution factor.Sample standard curves appear at the end of this document.

InterpretationThe following serves only as a guide in the interpretation of the laboratory results. Thevalues depicted below were determined by testing 64 normal blood donors and representthe mean of the normals plus 3SD. Each laboratory must determine its own normal values.

ASCA Values EU/ml Interpretation

IgA or IgG < 20 Negative

IgA or IgG 20-25 Borderline

IgA or IgG > 25 Positive

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

The ImmuLisaTM Test should not be performed on grossly hemolyzed, microbially contaminated,lipemic or icteric samples. The method should be used for testing human serum samples only.Testing for both isotypes of ASCA is strongly recommended. Testing for only one and not bothmay lead to false negative results. A negative ASCA result does not rule out the presence ofCrohn’s disease. A negative ASCA antibody result does not rule out the presence of ASCAantibodies, because the concentration of antibody may be below the detection limit of theassay. Furthermore, a diagnosis cannot be made on the basis of ASCA results alone. Theresults of other laboratory tests and clinical findings must also be considered. The presenceof immune complexes or other immunoglobulin aggregates in the patient sample may cause anincreased level of non-specific binding and produce false positives in this assay. ASCA alsooccur in patients with UC, their first degree relatives and mixed families with CD and UC3,9. Theyare also present to a lesser extent in some other autoimmune diseases13. Assay performancehas not been established for pediatric CD and UC patients.

EXPECTED VALUESThe expected values in a normal population are negative (<20 EU/ml). However, it hasbeen determined that some apparently healthy, asymptomatic individuals may test positivefor IgA or IgG ASCA antibodies9. Combined evaluation of ASCA and perinuclear anti-netrophil cytoplasmic antibody (pANCA) for all suspected cases of IBD is suggested, toincrease the positive predictive value in comparison to individual assessment of CD casesby ASCA and UC cases by pANCA14, 15. See Tables I and II at the end of this document.

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PERFORMANCE CHARACTERISTICS

Samples from patients with clinical diagnosis of CD (30 specimens) and UC (30specimens) were tested along with normal human sera (6 specimens). Resultsobtained with the ImmuLisa ™ anti-ASCA ELISA assays follow:

Positive Negative Total

CD 12 18 30

Other 0 36 36

Total 12 54 66

Sensitivity: 40% Specificity: 100%

Dise

ase D

iagno

sis

ImmuLisa™ ASCA-IgA

ImmuLisa™ ASCA-IgGPositive Negative Total

CD 18 12 30

Other 6 31 36

Total 23 43 66

Sensitivity: 60% Specificity: 86%

Dise

ase D

iagno

sis

The same sample set was used in a comparitive evaluation of the ASCAImmuLisa™ (IgG and IgA) against another commercially-available ASCA ELISA.Results are depicted in table III at the end of this document.Cross Reactivity Study:Sera from patients suffering from various conditions and individuals positive forcertain autoantibodies were tested for ASCA with the ImmuLisa assay. Resultsappear in table IV at the end of this document.Precision:In ten replicates, three different ASCA positive sera were tested with the ImmuLisato determine the intra-assay variation, and three positive sera were tested todetermine the inter-assay variation. The results appear in table V at the end ofthis document.Reportable Range:Four ASCA positive samples were tested with the ImmuLisa to determine precisionat even intervals through the reportable range of the assays. The results appearin table VI at the end of this document.Recovery:Samples with known ASCA concentrations were mixed with appropriate dilutionsof another positive sample with known amounts of ASCA. ASCA levels of themixed samples were determined and from the values obtained the percentrecovery calculated. The results appear in table VII at the end of this document.Clinical Studies:39 diagnosed Crohn's disease cases, 38 Ulcerative colitis cases and 12 caseswith unrelated gastrointestinal disturbances were tested both on ImmuLisa™ASCA IgG and IgA. Results are depicted in table VIII at the end of this document.

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ImmuLisa™Anti-Saccharomyces cerevisiae(ASCA) Anticuerpo ELISA

1156G 96 determinacións 1156A 96 determinacións

ImmuLisa™ ASCA (S. cerevisiae) es un ensayo basado en la técnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para la detección semi cuantitativa de anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) de clase IgA o IgG en suero humano. La presenciade anticuerpos anti-ASCA IgG puede ser utilizada como ayuda en el diagnóstico depacientes con la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn (CD).

Sumario y explicación de la pruebaLas enfermedades inflamatorias del intestino (UC y CD) son desórdenes que remitencrónicos con cursos imprevisibles y respuestas variables a la terapia. La diagnosis deIBD se basa en resultados clínicos, radiológicos, endoscópicos e histológicos. Los factoresinmunológicos, ambientales, infecciosos (Yersinia enterocolitica) y genéticos se hanpostulado para aumentar el riesgo para desarrollar IBD 1.El CD es sobre todo una enfermedad de más viejos niños y de adultos jóvenes y es raroen infancia. Pocos estudios epidemiológicos se han conducido para encontrar la incidenciadel CD en la población en general. En la población escandinava solamente, la incidencia deIBD es 7 por 100.000, con el CD en 1.3 por 100.000 2. El CD puede afectar cualquier piezadel intestino, y las lesiones son a menudo desiguales y de vez en cuando muy extensas.Histológico, el CD es caracterizado por un inflamatorio transmural infiltra integradopredominante por linfocitos y macrófagos. Los agregados del macrófago se consideran amenudo en especímenes de la biopsia, pero los granulomas bien desarrollados estánpresentes en los especímenes resecados el solamente 50% 3. Los procedimientosquirúrgicos generalmente para el CD incluyen la resección segmentaria y stricturoplasty2.El CD puede también manifestarse junto con otros desórdenes como la Henoch-Schonleinpúrpura 4. La vasculitis es una complicación infrecuente del CD, sin embargo, pocoscasos se han divulgado de polyarteritis nodosa cutáneo con el CD 4. Una forma más suavede CD perianal existe y puede variar de enfermedad asintomática suave a un desordenque inhabilita severo 5.ASCA del isotypo de IgG y de IgA están presentes en el 60% de casos con el CDdiagnosticado 1. Los ASCA’s se dirigen contra los phosphopeptidomannans presentes enlas paredes de célula de la levadura (S. cerevisiae) 6. ASCA puede ser sacado debido ala mímica y oscurecimiento moleculares por un colmo mannose-que contiene el antígenobacteriano o viral o “una molécula autoantigénica” 1.7. Se ha observado que los niveles deASCA en casos del CD son independiente de la actividad de la enfermedad, la duración yel tratamiento 8.ASCA ocurren con frecuencia en pacientes del CD con historia doméstica positiva. ASCAno se consideran los marcadores específicos de la susceptibilidad genética, pero supresencia indica un predisposición genético 9. Los estudios en los gemelos monozigóticosy la población judía indican una influencia de factores genéticos en la patogenesia del CD10. El modo de la herencia se parece ser complejo y heterogéneo, con lugares geométricosdel candidato de IBD situado en de los cromosomas 2, 6, 12, y 16 11.

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Recientemente, los algoritmos de prueba serológicos se han propuesto para ladiagnosis de IBD y mejorar la discriminación entre el CD y UC1. En resumen, todos loscasos sospechados de IBD se deben probar para ASCA (IgG e IgA).

PROCEDIMIENTO DE TRABAJOLos pocil los de la microplaca contienen antígeno Saccharomyces cerevisiaephosphopeptidomannan. La microplaca se bloquea para reducir reacciones no específicas.Se añaden controles, calibradores y muestras diluidas en pocillos separados, uniéndosedurante la incubación los anticuerpos anti ASCA al antígeno que los recubre. El resto decomponentes no unidos se elimina mediante lavado y se añade conjugado anti IgG o IgAhumana a cada pocillo. Este la enzima conjugó los anticuerpos ata específicamente a lainmunoglobulina humana de la clase apropiada. Tras un lavado que elimina el conjugadosobrante, se agrega el substrato enzimático specifico (pNPP). Tras incubación la actividadenzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado. Sedetermina la presencia o ausencia de anticuerpos contra la ASCA por medio de lacomparación de la densidad óptica de la muestra con la de una curva de calibración dequatro puntos. Los resultados se dan a conocer de forma semicuantitativa en unidadesenzimas (EU/ml).

REACTIVOS

Condiciones de Almacenaje

Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8°C. No congelar. Los reactivos sonestables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente.No utilizar si el reactivo no está claro.Tampón de lavado: Agregar el agua destilada o desionizada para el volumen del 1L.Micropocillos: Utilizar una vez solamente.

PrecaucionesTodo material de origen humano usado en la preparación de los controles para esteproducto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HbsAg, yHCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecergarantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lotanto, los reactivos deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso.Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico poringestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar conel plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas.Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos conabundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas.La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generarresultados inconsistentes.Utilizar las buenas técnicas de laboratorio para reducir al mínimo la contaminaciónmicrobiana y química.No utilizar después de fecha de vencimiento.

ImmuLisa™ IgA-ASCA ELISA 1156AImmuLisa™ IgG-ASCA ELISA 1156G

El kit contiene los suficientes reactivo para realizar 96 determinaciones.12 x 8 MICROPLATE ASCA Microplaca con los micropocillos

disidentes individuales cubrió con elantígeno del ASCA.

1 x 1.5 ml CALIBRATOR A ASCA * † Calibrador A (casquillo verde), listopara uso. Contiene suero humano.

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1 x 1.5 ml CALIBRATOR B ASCA * † Calibrador B (casquillo violeta), listopara uso. Contiene suero humano.

1 x 1.5 ml CALIBRATOR C ASCA * † Calibrador C (casquillo azul), listopara uso. Contiene suero humano.

1 x 1.5 ml CALIBRATOR D ASCA * † Calibrador D (casquillo amarillo),listo para uso. Contiene suerohumano.

1 x 1.5 ml CONTROL + ASCA * † control positivo, listo para uso.(casquillo rojo). Contiene suerohumano.

1 x 1.5 ml CONTROL - * control negativo, listo para uso.(casquillo blanco). Contiene suerohumano.

1 x 12 ml IgA-CONJ ALKPHOS * † conjugado fos. alc. Color de rosacifrado color.

1 x 12 ml IgG-CONJ ALKPHOS * † conjugado fos. alc. Color de rosacifrado color.

1 x 60 ml DIL * tampón de dilución para muestras.Azul cifrado color.

1 x 12 ml SUBSTRATE * substrato enzimático. Contiene el pNPP.Proteger contra luz.

1 x 12 ml STOP solución de parada2 BUF WASH tampón de lavado para 1 litro/vial* PRECAUCIÓN - Contiene < 0.1% NaN3† 1156A contiene IgA-ASCA calibradores, controles y IgA conjugado

1156G contiene IgG-ACA calibradores, controles y IgG conjugado

Material necesario no incluido• Micropipetas para 5 - 1000μl• Puntas desechables para micropipeta• Tubos para dilución de muestras, 4ml• Agua destilada• Lector de microplacas capaz de medir densidades ópticas a 405nm• Botella para tampón de lavado• Contador de tiempo• Papel absorbenteRecolección de MuestrasEste kit requiere suero como muestra. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadaspor calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicaso hemolizadas.Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. Si el ensayo no se vacompletar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8°C. Si el ensayo no se va completar entre48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20°C o a temperatura inferior. Evitarcongelar repetido y deshelar.PROCEDIMIENTONotas Procesales• Antes comenzando con el análisis leer cuidadosamente el relleno del producto.• Dejar los especímenes del suero y los reactivo de la prueba equilibrear en la temperatura

ambiente antes comenzando con el método de prueba. Volver todos los especímenesy reactivo inusitados al refrigerador inmediatamente después del uso.

• Todas las dilusiones de las muestras pacientes se deben preparar antes comenzandocon del análisis.

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• Quitar requirió tiras del micropocillos de la bolsa y resellan cuidadosamente la bolsapara prevenir la condensación en los pozos inusitados. Volver la bolsa inmediatamenteal refrigerador.

• Lavado: La buena técnica es crítica. Se recomienda una arandela automatizadadel microplaca.

• Utilizar una pipeta de varios canales capaz de entregar 8 pozos simultáneamente.Esto apresura el proceso y preve por un más tiempo uniforme de la incubación.

• Para todos los pasos, el control cuidadoso de la sincronización es importante. Elcomienzo de todos los períodos de la incubación comienza con la terminación de laadición el reactivo.

Metodologia1. Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente.2. Indicar la colocación del espécimen en la página del protocolo. Es buena práctica

del laboratorio funcionar muestras en duplicado.3. Determinación cualitativo: Utilizar solamente el calibrador D.

Determinación semi cuantative: Utilizar calibradores A a D según lo representado enla disposición de la muestra abajo.

Determinación cualitativo Determinación semi cuantative

4. Preparar una dilución 1:51 de cada muestra a procesar añadiendo 10 μl de muestraa 0.5 ml de tampón de dilución para muestras.

5. Agregar 100 μl de los controles, de calibratores, de y las muestras pacientesdiluidas a los micropocillos apropiados según protocolo cubre.Nota: Incluir un pozo que contenga 100 μl del tampón de dilución para muestrascomo espacio en blanco el reactivo. Poner a cero a lector de ELISA contra el espacioen blanco el reactivo.

6. Incubar 30 minutos (± 5 minutos) en la temperatura ambiente.7. Lavado (4x): Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar 200-300μl de solución

de lavado a todos pocillos y aspirar. Para el lavado manual, llenar cada micropocillosdel almacenador intermediario reconstituido de la colada. Desechar el líquidoinvirtiendo y golpeando ligeramente fuera del contenido de cada uno el pozo oaspirando el líquido de cada uno bien. Para borrar en el extremo de la colada pasada,de las tiras invertidas y golpear ligeramente los pozos vigoroso en las toallas depapel absorbentes. Para las arandelas automáticas, programar la arandela segúnlas instrucciones del fabricante.

8. Agregar 100 μl de conjugado en micropocillos.9. Incubar 30 minutos (± 5 minutos) en la temperatura ambiente.

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4

BLANK

NEG

POS

CAL

D

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

S11

S12

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4

BLANK

NEG

POS

CAL

A

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

CAL

B

CAL

C

CAL

D

S1

11

10. Lavado: Todos los micropocillos como en 7.11. Agregar 100 μl de substrato enzimático en cada micropocillos en la misma orden y la

sincronización que para el conjugado.12. Incubar 30 minutos (± 5 minutos) en la temperatura ambiente.13. Agregar 100 μl de solución de parada en cada micropocillos usando la misma orden

y midiendo el tiempo que para la adición del substrato enzimático. Leer los valores dela absorbencia en el plazo de 1 hora de agregar solución de parada.

14. Leer la absorbancia (OD) de cada pocillo a 405nm en un plazo máximo de una hora.Si se desea seguir el método de lectura bicromática puede utilizarse 620 nm comolongitud de onda de referencia.

RESULTADOSCálculo de ResultadosLas concentraciones de las muestras pacientes se pueden determinar por cualquiera dedos métodos:

1. DETERMINACIÓN CUALITATIVA

OD Espécimen————————— X EU/ml de Calibradore D = EU/ml EspécimenOD Calibradore D

2. DETERMINACIÓN SEMI-CUANTATIVE

Absorbancia del diagrama de Calibradore A a D contra su concentración respectiva en unpapel de gráfico linear-linear. Trazar la concentración en EU/ ml en el X-eje contra laabsorbancia en el Y-eje y dibujar la mejor curva apta. Determinar las concentraciones de lasmuestras pacientes de la curva contra su valor correspondiente de la absorbancia.CalibradorLos calibradores se incluyen para proporcionar semi - cuantificación y se deben utilizar concada prueba. Los especímenes pacientes que contienen niveles más altos del anticuerpopueden dar los valores de la absorbancia mayores que el del Calibradore A. Para quedetermina valores semi-cuantative exactos tales especímenes debe ser diluido más a fondoasí que bajan dentro de la gama de la curva del calibrador cuando están reexaminados. Paradeterminación EU/ ml, multiplicar las unidades obtenidas por el factor de la dilusión.InterpretaciónLa información siguiente sirve solamente como guía en la interpretación de los resultadosdel laboratorio. Cada laboratorio debe determinar sus propios valores normales.

Anti-ASCA (EU/ml) Interpretation/Interprétation/Interpretazione/Value/Valeur/Valore/Valor/Wert Interpretación/Deutung/Interpretação

IgA o IgG <20 Neg (-)IgA o IgG 20-25 Borderline/Indéterminé/Indeterminato/Indeterminado/UnbestimmtIgA o IgG >25 Pos (+)

LimitacionesEste kit requiere suero como muestra. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadaspor calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestraslipémicas o hemolizadas.La prueba para ambos isotypos de ASCA se recomienda fuertemente. La prueba parasolamente uno y no ambas pueden conducir a los resultados negativos falsos. Unresultado negativo de ASCA no elimina la presencia de la enfermedad de Crohn. Un

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resultado negativo del anticuerpo de ASCA no elimina la presencia de los anticuerpos deASCA, porque la concentración del anticuerpo puede estar debajo del límite de deteccióndel análisis. Además, una diagnosis no se puede hacer en base de resultados de ASCAsola. Los resultados de otros pruebas de laboratorio y resultados clínicos deben tambiénser considerados. La presencia de complejos inmunes o de otros agregados de lainmunoglobulina en la muestra paciente puede causar un nivel creciente del atascamientono específico y producir positivos falsos en este análisis. ASCA también ocurren enpacientes con UC, sus primeros parientes del grado y familias mezcladas con el CD yUC3.9. Están también presentes en un grado inferior en algunas otras enfermedadesautoinmunes 13. El funcionamiento del análisis no se ha establecido para el CD pediátrico ylos pacientes UC.

VALORES PREVISTOSLos valores previstos en una población normal son negativos (< 20 EU/ml). Sin embargo,se ha determinado que algunos individuos al parecer sanos, asintomáticos pueden probarel positivo para los anticuerpos de IgA o de IgG ASCA9. La evaluación combinada de ASCAy del anticuerpo del anti-netrophil citoplásmico perinuclear (pANCA) para todos los casossospechados de IBD se sugiere, para aumentar el valor profético positivo en la comparaciónal gravamen individual de los casos del CD en los casos de ASCA y de UC en pANCA 14, 15.Ver la tabla 1 y la tabla II en el extremo de este documento.

CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL FUNCIONAMIENTOLas muestras de pacientes con la diagnosis clínica del CD (30 especímenes) y UC (30especímenes) fueron probadas junto con los sueros humanos normales (6especímenes). Los resultados obtenidos con los análisis de ImmuLisa anti-ASCA ELISAsiguen:

IMMCO anti-ASCA IgAPOS (+) NEG (-) TOT (=)

CD Pos (+) POS (+) 12 18 30

Otro NEG (-) 0 36 36

Total TOT (=) 12 54 66

relative specificity/spécificité relative/especificidad relativa/relative Spezifität/specificità relativa/especificidade relativa: 40%relative sensitivity/sensibilité relative/sensibilidad relativa/relative Sensitivität/sensibilità relativa/sensibilidade relativa: 100%

IMMCO anti-ASCA IgAPOS (+) NEG (-) TOT (=)

CD Pos (+) POS (+) 18 12 30

Otro NEG (-) 6 31 36

Total TOT (=) 23 43 66

relative specificity/spécificité relative/especificidad relativa/relative Spezifität/specificità relativa/especificidade relativa: 60%relative sensitivity/sensibilité relative/sensibilidad relativa/relative Sensitivität/sensibilità relativa/sensibilidade relativa: 86%

Precisión:El mismo sistema de la muestra fue utilizado en una evaluación comparativo del ASCAImmuLisa™ (IgG e IgA) contra otro ELISA disponible en el comercio de ASCA. Los resultadosse representan en la tabla III en el extremo de este documento.

Estudio Cruzado De la Reactividad:

13

Los sueros de los pacientes que sufrían de varias condiciones y de individuospositivos para ciertos autoanticuerpos fueron probados para ASCA con el análisis deImmuLisa. Los resultados aparecen en la tabla IV en el extremo de este documento.

Precisión:En diez réplicas, tres diversos sueros positivos de ASCA fueron probados con el ImmuLisapara determinar la variación del intra-ana’lisis, y tres sueros positivos fueron probadospara determinar la variación del inter-ana’lisis. Los resultados aparecen en la tabla V en elextremo de este documento.

Gama Denunciable:Cuatro muestras positivas de ASCA fueron probadas con el ImmuLisa para determinar laprecisión en los intervalos uniformes a través de la gama denunciable de los análisis. Losresultados aparecen en la tabla VI en el extremo de este documento.

Recuperación:Las muestras con concentraciones sabidas de ASCA fueron mezcladas con dilusionesapropiadas de otra muestra positiva con cantidades sabidas de ASCA. Los niveles deASCA de las muestras mezcladas fueron determinados y de los valores obtuvo larecuperación de los por ciento calculada. Los resultados aparecen en la tabla VII en elextremo de este documento.

Estudios Clínicos:39 diagnosticaron las cajas de la enfermedad de Crohn, 38 casos del UC y 12 casos condisturbios gastrointestinales sin relación fueron probados en ImmuLisa™ ASCA IgG e IgA.Results en la tabla VIII en el extremo de este documento.

14

ImmuLisa™Anticorpi Anti-Saccharomycescerevisiae (ASCA) IgA e IgGELISA

Ref. N. 1156G 96 DeterminazioniRef. N. 1156A 96 Determinazioni

USO PREVISTOTest immunoenzimatico (ELISA) per la determinazione semi-quantitativa di anticorpi anti-Saccharomyces cerevisiae (IgG o IgA) nel siero umano di pazienti con una MalattiaInfiammatoria Intestinale (IBD) da usarsi quale ausilio nella diagnosi del Morbo di Crohn(CD).

RIEPILOGOLe Malattie Infiammatorie Intestinali - la Colite Ulcerativa (UC) e il Morbo di Crohn (CD) -sono disturbi con andamento cronico e remittente e con decorsi imprevedibili e rispostediverse alle terapie. La diagnosi delle IBD si basa su un vasto quadro clinico, radiologico,endoscopico e istologico. Sono stati presupposti fattori immunologici, ambientali, infettivi(Yersinia enterocolitica) e genetici per poter considerare un maggior rischio di sviluppo diuna delle IBD1.Il Morbo di Crohn è una patologia che si manifesta principalmente in adolescenti e giovaniadulti, mentre è rara durante l’infanzia. Sono stati condotti alcuni studi epidemiologici percalcolare l’incidenza del Morbo di Crohn in una popolazione generale. Considerando solola popolazione scandinava, l’incidenza di una delle forme di IBD è pari a 7 su 100.000, equella del Morbo di Crohn in particolare è 1,3 su 100.0002. Il Morbo di Crohn può colpirequalsiasi parte dell’intestino; le lesioni e le infiammazioni provocate sono spessoasimmetriche e in alcuni casi molto estese in profondità. Dal punto di vista istologico, ilMorbo di Crohn si caratterizza per un infiltrato infiammatorio trasmurale compostoprincipalmente da linfociti e macrofagi. Gli aggregati dei macrofagi sono spesso visibili neicampioni sottoposti a biopsia, ma granulomi ben sviluppati sono presenti solo nel 50% deicampioni resecati3. Tra le procedure chirurgiche più utilizzate per asportare le lesionicausate dal Morbo di Crohn sono la resezione segmentale e la stricturoplastica2. Il Morbodi Crohn si può manifestare anche in concomitanza con altri disturbi come la Henoch-Schonlein purpura4. La vasculite è una complicazione poco comune del Morbo di Crohn,tuttavia sono stati registrati alcuni casi di poliartrite nodosa cutanea con il Morbo stesso4.Esiste anche una forma più lieve del Morbo di Crohn perianale, la quale può variare da lievipatologie asintomatiche a gravi disturbi disabilitanti5.Gli ASCA di classe IgG e IgA sono presenti nel 60% dei casi di Morbo di Crohn diagnosticati1.Gli ASCA sono diretti contro le sequenze di mannosio che compongono il mannano dellaparete cellulare del lievito (S. cerevisiae)6. Si potrebbe dedurre la presenza di ASCA acausa di mimetismo molecolare e da uno studio affrettato degli antigeni batterici o virali adalto contenuto di mannosio oppure da una “molecola autoantigenica”1,7. Si è osservato chei livelli di ASCA nei casi di Morbo di Crohn sono indipendenti dall’andamento della patologia,dalla durata e dal trattamento8.Gli ASCA sono spesso presenti in pazienti affetti dal Morbo di Crohn con un’anamnesifamiliare positiva. Gli ASCA non sono considerati un marker specifico per stabilire un’ereditàgenetica, ma la loro presenza sta a indicare una predisposizione genetica9. Gli studieffettuati sui gemelli monozigoti e sulla popolazione ebraica riportano un’influenza dei

15

fattori genetici sulla patogenesi del Morbo di Crohn10. Le modalità di eredità geneticarisultano complesse ed eterogenee, con loci delle IBD situati sui cromosomi 2, 6, 12, e 1611.Data la sintomatologia molto simile delle due forme principali di IBD, recentemente sono statiproposti dei test sierologici con relativi algoritmi per una diagnosi meno problematica delleIBD e una distinzione più chiara tra il Morbo di Crohn e la Colite Ulcerativa1. Ricapitolando,tutti i casi ritenuti sospetto di IBD devono essere esaminati a ASCA (IgG ed IgA).

REAGENTICondizioni di conservazioneConservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla datadi scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.Non usare se il reagente non è chiaro.Tampone di lavaggio: Aggiungere l’acqua distillata o deionizzata per il volume del 1L.Microstrips: Usare una volta soltanto.PrecauzioniTutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodottosono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HbsAge per anticorpi anti-HCV mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre lacertezza completa dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i reagentidevono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossicase ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con letubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciarscorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, perprevenire la formazione di azidi.La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.Usare le buone tecniche di laboratorio per minimizzare la contaminazione microbica e chimica.Non usare dopo la data di scadenza.Materiali fornitiImmuLisa™ IgG-ASCA ELISA 1156GImmuLisa™ IgA-ASCA ELISA 1156AI corredi contengono i reagenti sufficienti per realizzare 96 determinazioni ciascuno.12 x 8 MICROPLATE ASCA microstrips da 96 pozzetti individuali

con antigene ASCA1 x 1.5 ml CALIBRATOR A ASCA * † calibratore A (protezione verde),

pronto al uso, contiene siero umano.1 x 1.5 ml CALIBRATOR B ASCA * † calibratore B (protezione viola),

pronto al uso, contiene siero umano.1 x 1.5 ml CALIBRATOR C ASCA * † calibratore C (protezione blu), pronto

al uso, contiene siero umano.1 x 1.5 ml CALIBRATOR D ASCA * † calibratore D (protezione gialla),

pronto al uso, contiene siero umano.1 x 1.5 ml CONTROL + ASCA * † controllo positivo (protezione rossa),

pronto al uso, contiene siero umano.1 x 1.5 ml CONTROL - * controllo negativo (protezione

bianca), pronto al uso, contiene sieroumano.

1 x 12 ml IgG-CONJ ALKPHOS * † coniugato fos. alc. Colore rosacodificato colore.

1 x 12 ml IgA-CONJ ALKPHOS * † coniugato fos. alc. Colore rosacodificato colore.

16

1 x 60 ml DIL * diluente per campioni. Colorarel’azzurro codificato.

1 x 12 ml SUBSTRATE * substrato enzimatico. Contiene ilpNPP. Proteggere da luce.

1 x 12 ml STOP soluzione bloccante2 BUF WASH tampone di lavaggio per 1 litro/fiala* Contiene < 0.1% NaN3† 1156G contiene IgG-ASCA calibratori, controlli e IgG coniugato

1156A contiene IgA-ASCA calibratori, controlli e IgA coniugato

Materiali richiesti ma non forniti• Micropipette in grado di erogare volume di 5 – 1000 μL• Puntali monouso per micropipette• Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL• Acqua distillata o deionizzata• Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 405nm• Bottiglia per tampone di lavaggio• Temporizzatore• Carta assorbenteRaccolta dei campioniQuesta tecnica deve essere usata con un campione di siero. Campioni con segni dicontaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebberoessere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici.Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. Se il test non può essereeseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8°C. Se il test non può essereeseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20°C. Evitare ilcongelamento ripetuto e lo scioglimento.METODICAPrima di incominciare• Prima di cominciare l’analisi ha letto con attenzione queste istruzioni.• Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-25°C) per 30 minuti.

Materiali di ritorno al frigorifero subito dopo di uso.• Preparare tutte le diluzioni degli esemplari pazienti prima di iniziare la prova.• Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il

materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l’esposizione all’umiditàambientale.

• Lavaggio: La buona tecnica è critica. Una rondella automatizzata del piastra microtiterELISA è suggerita.

• Utilizzare una pipetta multicanale capace di trasporto delle 8 posizioni simultaneamente.Ciò accelera il processo e provvede ad un più tempo di incubazione dell’uniforme.

• La sincronizzazione attenta è importante. I periodi di incubazione cominciano dopol’erogazione del reagentes.

Esecuzione del test1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-

25°C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST.2. Usare l’annotazione di protocollo per notare la posizione degli esemplari nel piastra

microtiter. È buona pratica del laboratorio verificare gli esemplari due volte.3. Determinazione qualitativa: usare soltanto Calibratore D.

Determinazione semi-quantitativa: usare Calibratori A - D come indicatonell’esempio qui sotto.

17

Determinazione qualitativa: Determinazione semi-quantitativa:

4. Preparare una diluzione di 1:51 dei campioni mescolando 10 μl dei campioni con 0.5ml di diluente per campioni.

5. Distribuire 100 μL di ciascuno dei calibratori, dei campioni diluiti, del Controllo Negativoe del Controllo Positivo nei pozzetti corrispondenti.

Nota: Includere una posizione con 100 μl del diluente per campioni come spazio inbianco del reagente. Il valore zero del lettore del piastra microtiter dovrebbeessere regolato usando questa posizione. La capacità di assorbimento di questopozzetto non dovrebbe essere più grande di 0.3.

6. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana.7. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire 200-

300μL di soluzione di lavaggio in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questaoperazione per altre tre volte, per un totale di quattro lavaggi. Dopo l’ultimo lavaggiocapovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente perrimuovere eventuali residui di liquido. Non asciugarsi pozzetti completamente.

8. Distribuire 100μL di Coniugato in ciascun pozzetto.9. Incubare i pozzetti per 30 minuti.10. Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto 7.11. Distribuire 100μL di substrato enzimatico in ciascun pozzetto12. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.13. Distribuire 100μL di soluzione bloccante in ogni pozzetto. Per l’aggiunta della soluzione

bloccante mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l’aggiunta delsubstrato enzimatico. Leggere l’assorbanza (OD) entro 1 ora dall’aggiunta dellasoluzione bloccante.

14. Leggere l’assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 405nm usando un singolo o lettoredoppio del piastra microtiter di lunghezza d’onda contro l’insieme in bianco del reagentealla capacità di assorbimento zero.

Controllo di qualitàI calibratori, controllo positivo e controllo negativo e uno spazio in bianco devono essere fattifunzionare con ogni analisi per verificare l’integrità e l’esattezza della prova. La lettura dicapacità di assorbimento dello spazio in bianco dovrebbe essere < 0.3. Il calibratore Adovrebbe avere un OD di 1.0, altrimenti la prova deve essere ripetuta. Il controllo negativodeve essere < 20 EU/ml. Se la prova è funzionata due volte, la media delle due letturedovrebbe essere presa per EU/ml di determinazione. Mentre realizza le determinazioniqualitativa, il OD di calibratore D deve essere più grande di quello del controllo negativo e di

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4

BLANK

NEG

POS

CAL

D

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

S11

S12

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4

BLANK

NEG

POS

CAL

A

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

CAL

B

CAL

C

CAL

D

S1

18

di meno che il OD del controllo positivo. Per le determinazioni semiquantitativa il controllopositivo deve avere valori nella gamma stampata sulla fiala.

RISULTATICalcolo dei risultatiLe concentrazioni dei campioni pazienti possono essere determinate da uno di due metodi:1. DETERMINAZIONE QUALITATIVA

OD di Esemplare————————— X EU/ml de Calibratore D = EU/ml di EsemplareOD di Calibratore D

2. DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVACapacità di assorbimento del diagramma di calibratores da A a D contro la loro concentrazionerispettiva su una carta da grafico lineare-lineare. Tracciare la concentrazione EU / ml sull’X-asse contro la capacità di assorbimento sull’Y-asse e disegnare la curva adatta migliore.Determinare le concentrazioni dei campioni pazienti dalla curva contro il relativo valorecorrispondente di capacità di assorbanza.CalibratoreI calibratori sono inclusi per fornire semi - la quantificazione e devono essere usati con ogniprova. Gli esemplari pazienti che contengono i livelli elevati dell’anticorpo possono dare ivalori di capacità di assorbanza più grandi di quello del calibratore A. Per che determina ivalori semiquantitativi esatti tali esemplari dovrebbe più ulteriormente essere diluito in mododa fanno parte della gamma della curva del calibratore una volta riprovati. Per determinazioneEU/ ml, moltiplicare le unità ottenute per il fattore di diluzione.InterpretazioneLe seguenti informazioni servono soltanto da guida nell’interpretazione dei risultati dellaboratorio. Ogni laboratorio deve determinare i relativi propri valori normali.

ASCA (EU/ml) Interpretation/Interprétation/Interpretazione/Value/Valeur/Valore/Valor/Wert Interpretación/Deutung/Interpretação

IgG <20 Neg (-)IgG 20-25 Borderline/Indéterminé/Indeterminato/Indeterminado/UnbestimmtIgG >25 Pos (+)

IgA <20 Neg (-)IgA 20-25 Borderline/Indéterminé/Indeterminato/Indeterminado/UnbestimmtIgA >25 Pos (+)

LIMITI DELLA PROCEDURAIl Test ImmuLisaTM non deve essere eseguito su campioni fortemente emolizzati, contaminati,lipemici o itterici. Per questo metodo utilizzare solo campioni di siero umano.Si consiglia fortemente di eseguire il test per entrambi gli isotipi degli anticorpi anti-saccha-romyces cerevisiae in quanto effettuare il test per un solo isotipo potrebbe condurre arisultati falso-negativi. Un risultato negativo del test per gli ASCA non esclude la presenzadel Morbo di Crohn. Un risultato negativo del test per gli ASCA non esclude la presenza dianticorpi anti-saccharomyces cerevisiae in quanto è possibile rilevare una concentrazionedi anticorpi al di sotto del limite di rilevazione del test. Inoltre, non è possibile procedere auna diagnosi basandosi solo sui risultati relativi agli anticorpi anti-saccharomyces cerevisiae.E’ necessario valutare anche i risultati di altri test di laboratorio e il quadro clinico delpaziente. La presenza di immunocomplessi o di altri aggregati di immunoglobuline nel

19

campione del paziente potrebbe portare a un aumento del livello di legami non specifici e iltest potrebbe dare risultati falso- positivi. Gli ASCA si manifestano anche in pazienti affettida Colite Ulcerativa, nei loro parenti di primo grado e nelle famiglie miste colpite dal Morbodi Crohn e dalla Colite Ulcerativa3,9. Si rilevano anche, in minor misura, in presenza di altridisturbi autoimmuni13. La prestazione del test non è stata stabilita per il Morbo di Crohn adesordio pediatrico e per i pazienti affetti da Colite Ulcerativa.

VALORI ATTESII valori attesi in una popolazione normale sono negativi (<20 EU/ml). Tuttavia, è statorilevato che alcuni individui asintomatici e apparentemente in salute potrebbero risultarepositivi al test per gli anticorpi anti-saccharomyces cerevisiae IgA o IgG9. Si consiglia unavalutazione combinata degli ASCA e degli anticorpi anti-neutrofili citoplasmatici (pANCA)per tutti i casi sospetti di IBD, in modo da aumentare il valore predittivo positivo acomparazione della singola valutazione dei casi di Morbo di Crohn mediante gli anticorpianti-saccharomyces cerevisiae e dei casi di Colite Ulcerativa mediante gli anticorpi anti-neutrofili citoplasmatici.14, 15. Vedi Tabelle I e II alla fine della metodica.

CARATTERISTICHE SPECIFICHE DEL METODOSono stati analizzati i campioni di pazienti diagnosticati come affetti da Morbo di Crohn (30campioni) e da Colite Ulcerativa (30 campioni) con normali sieri umani (6 campioni). Irisultati ottenuti con il test ImmuLisa™ASCA ELISA sono i seguenti:

Lo stesso set di campioni è stato usato in una valutazione comparativa: il test ASCAImmuLisa™ (IgG e IgA) è stato confrontato con un altro test contro ASCA ELISA disponibilein commercio. I risultati sono riportati nella tabella III alla fine della metodica.

Studio delle Reazioni Crociate:Sono stati analizzati con il test ImmuLisa i sieri dei pazienti affetti da vari disturbi e individuipositivi ad alcuni autoanticorpi per la determinazione degli anticorpi anti-S.cerevisiae. Irisultati compaiono nella tabella IV alla fine della metodica.

Precisione:Sono stati analizzati con iI test ImmuLisa tre diversi sieri positivi agli anticorpi anti-S.cerevisiaeper un totale di 10 volte ciascuno per determinarne la variazione intra-seduta, mentre altritre sieri positivi sono stati analizzati per determinare la variazione inter-seduta. I risultatisono riportati nella tabella V alla fine della metodica.

Range Riportabile:Procedendo, con il test ImmuLisa, all’analisi di quattro campioni positivi agli anticorpi anti-S.cerevisiae, è stato possibile determinare la precisione del test a intervalli regolari. Irisultati sono riportati nella tabella VI alla fine della metodica.

Integrazione:Dei campioni con concentrazioni conosciute di anticorpi ASCA sono stati miscelati con leappropriate diluizioni di un altro campione positivo con quantità note di ASCA. Sono statipoi determinati i livelli dei campioni misti e dai valori ottenuti è stata calcolata la percentualedi integrazione. I risultati compaiono nella tabella VII alla fine della metodica.

Studi Clinici:Sono stati analizzati, con il test ImmuLisa™ ASCA IgG e IgA 39 casi diagnosticati di Morbodi Crohn, 38 casi di Colite Ulcerativa e 12 casi con disturbi gastrointestinali indipendenti gliuni dagli altri. I risultati sono riportati nella tabella VIII alla fine della metodica.

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and antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in inflammatory bowel disease. Am JGastroenterol. 96: 730-734. 2001.

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17. Ruemmele FM, Targan SR, Levy G, et al. Diagnostic accuracy of serological assays inpediatric inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 115(4):822-9, 1998.

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Anti-ASCA IgA Standard Curve

R2 = 1.00

.0

.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 50 100 150 200Concentration (EU/ml)

OD

@ 4

05/6

30nm

Anti-ASCA IgG Standard Curve

R2 = 0.99

.0

.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 50 100 150 200Concentration (EU/ml)

OD

@ 4

05/6

30nm

pANCA + ASCA + ASCA - pANCA -pANCA + ASCA +

PPV % PPV % PPV % PPV %

Crohn's Disease 89 96

Ulcerative Colitis 74 92.5

pANCA: atypical pANCA NPV: Negative predictive value PPV: Positive predictive value

Table I: Diagnostic significance of ASCA and pANCA in IBD14

Table II: Prevalence of ASCA in Crohn’s Disease Versus Other GI DisordersStudy CD ASCA Pos. UC ASCA Pos Control ASCA Pos

(n) (%) (n) (%) (n) (%)

Quinton e al14 100 61 101 12 163 (healthy) 0.627 (GI) 11

Hoffenberg et al8 20 60 25 12 74 (GI &liver) 5

Ruemmele et al17 130 55 35 6 78 (GI) 5

Peeters et al1 407 60 147 14 157 (healthy) 374(non-IBD) 11

Kim et al15 85 49 77 20 20 (healthy) 10

Table III: IMMCO ASCA ELISA vs. Other ELISAASCA IgA ASCA IgG

Sensitivity Specificity Sensitivity Specificity(%) (%) (%) (%)

ImmuLisa ASCA 40 100 60 86

Other ELISA I 52 86 62 82

Figure I: ASCA Standard Curves

22

Table IV: IMMCO ASCA ELISA vs. Other ELISA

Specimen Type n IgA Pos n IgG Pos

Disease controls 12 3 13 1ds DNA Antibodies 23 3 23 1

Smooth Muscle Antibodies 22 3 24 3

Immune Complex 21 3 24 1

Rheumatoid Factor 22 3 22 0

Table V: PrecisionIgA IgG

Positive Intra-assay Inter-assay Positive Intra-assayInter-assaySera %CV %CV Sera %CV %CV

1. 167 EU/ml 3.6% 8.2% 1. 170 EU/ml 5.5% 11.5%2. 129 EU/ml 5.1% 10.5% 2. 140 EU/ml 3.5% 4.6%3. 108 EU/ml 3.4% 10.3% 3. 116 EU/ml 5.2% 7.4%

Table VI:Reportable RangeIgA IgA IgG IgG

Avg EU/ml %CV Avg EU/ml %CV

Sample 1 172 6.8% 160 4.0%Sample 2 94 6.0% 72 5.1%Sample 3 37 7.0% 37 5.6%Sample 4 10 10.3% 13 10.7%

Table VII: RecoveryASCA-IgA ASCA-IgA

Ab. conc. added Ab. conc. obtained % Recovery(EU/ml) (EU/ml)

Sample 1 129.5 130.2 101Sample 2 59.8 60.6 101Sample 3 21.0 22.2 106

ASCA-IgG ASCA-IgG Ab. conc. added Ab. conc. obtained % Recovery

(EU/ml) (EU/ml)

Sample 1 130.4 128.4 98Sample 2 56.5 57.7 102Sample 3 24.6 26.3 107

Table VIII: Clinical StudiesIgG IgA IgG or IgA IgG and IgA

Clinical Group n Pos % Pos % Pos % Pos %

Crohn’s Disease 39 24 62% 31 79% 36 92% 19 49%Ulcerative Colitis 38 1 3% 9 24% 9 24% 1 3%Controls 12 1 8% 3 25% 3 25% 1 8%

23

24

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