IMMOBILIZÁLÁS

Mikroorganizmusok, sejtek, enzimek

felületi rögzítése hordozón

polimerekbe zárása

keresztkötése

Immobilizáció

• a sejtek kötődésének vagy bezárásának különböző formáit összefoglaló fogalom

• A természetben gyakran találkozunk vele

- legtöbb sejt életciklusa bizonyos fázisában igyekszik helyhez kötődni

• Élő sejtek polimer gélbe zárását először 1969-ben Updike és mtsai írták le

• Tudományos és ipari jelentőség: pl. aminosavak, szerves savak, antibiotikumok, szteroidok, enzimek előállítása

• Környezeti alkalmazásuk is egyre jobban terjed

Előnyök• Védjük a rögzített sejteket a külső behatásoktól, valamint

megakadályozzuk eltávozásukat a reakciótérből• Állati és növényi sejteket, szöveteket is lehet immobilizálni• Számos biokatalitikus rendszer számára előnyös• Javul a metabolikus aktivitása a sejteknek• Plazmid stabilitás nő• Kisebb a fertőzés veszélye • könnyebben tárolható

Hátrányok• A szaporodó sejtek kiszabadulhatnak az immobilizáló

anyagból, ha szétfeszítik azt• A diffúziós barrier a mátrix, vagy a nagy sejtsűrűség miatt

növekedhet• Aerob rdsz-knél az oxigénhez gátolt lehet a hozzáférés

Milyen paramétereknek kell megfelelnie egy jó hordozónak:• Nem-toxikus• Nem szennyező• Jó minőségű, hosszú élettartam• Biztosított legyen a sejtaktivitás és denzitás• Biztosított legyen a sejtek kijutása a célhelyre (ha szükséges)

Hordozók• Természetes és szintetikus polimerek:

agar, agaróz, poliakrilamid alginát, karragenan, polisztiréncellulóz, kollagén, stb poliuretán

• • Egyéb:

üveg, kerámia, agyag, apatit, alginit,ioncserélő gyanták

Immobilizálási stratégiák

1. felületi adszorpció

2. bezárás a: encapsulation

b: entrapment

3. keresztkötés

4. biofilm képzés

5. aggregátum képzés, flokkuláció

6. hordozóhoz kötés (ionos, kovalens)

1.

2. a, b,

3.

4., 5.

6.

A sejtek a szilárd felszínhez egy/több fehérjén keresztül kapcsolódnak

Lpp = lipoproteinOmpA = outer membrane

protein AAmCyan = cyan-fluorescent

protein

Alginát

• Barna algából nyerik• Lineáris poliszaharid, -D-mannuronát (M)

és -L-guluronát (G), 1 4 kötések• Homopolimer blokkok (G-, M-blokk) ill és

vegyes blokkok (GM blokk) random szerveződnek (az alginát eredetétől függően egyedi szerkezet/felépítés)

• G-blokk divalens kationokkal (Ca2+, Ba2+, stb) stabil keresztkötéseket hoz létre, ennek köszönhető, hogy immobilizáláshoz használni tudjuk

• Több G-blokk esetén erősebb, rigidebb gélt kapunk és kisebb porusméreteket, több M-blokk esetén lágyabb a gél és nagyobb porusméreteket találunk

• A gélesedés nem hőmérséklet függő

Keresztkötött G frakciót jelöli

Gélesedési zóna

M frakciót jelképezi

Alginát gélágy kialakítása

Idegen mikróbák

tápanyagok

Alginát burok

Metabolitok, anyagcsere termékek

sejtszuszpenzió Alginát oldat

CaCl2 oldat

sejtek

Egyszerű, sejt- és környezetbarát módszer

karrageenan

• Vörös algák termelik

• 3 típus: -, -, -karrageenan

• Nagyon sokféle forma, de az alapváz közös: (1,3)-D-galaktóz és (1,4)-D-galaktóz molekulák váltják egymást, viszont eltérnek abban, hogy a két cukor hol szulfonált és mennyi szulfoncsoportot tartalmaz

• A gélesedés hőmérséklet függő folyamat, K+ ionok jelenlétében

• Hátránya, hogy a gélesedéshez legalább 40°C szükséges, mely az immobilizálandó mikrobák többségének kedvezőtlen

hűtés

melegítés

Gelrite

• Természetes anionos poliszaharid, glükuronsav, rhamnóz és glükóz alegységekből épül fel

• rigid, agarszerű gélt képez elsősorban kétértékű kationok jelenlétében

• hőstabil

n

O O

O O

CH2OH

OH

OHOH

OH

COOH

CH2OH

OH

OH

OH OH

CH3

O

O

O

O

OOH

• Kationos polimer, D-glükóz-amin egységekből épül fel

• Legtöbb savban, főleg szerves savakban oldható

• Nem toxikus, lebontható

• Kozmetikai, orvosi, élelmiszeripari jelentősége is van

Kitozán

ciklodextrin• A ciklodextrin keményítőből előállítható, belül

üreges, henger alakú molekula, amelybe, mint egy kapszulába, bezárhatók más anyagok molekulái.

• A keményítőben a kötéseket térállású OH-csoportok hozzák létre, minden kötés ugyanolyan irányba fordul, ezért a keményítő molekulája úgy csavarodik, mint egy spirálrugó, vagyis hélixszerkezetű.

• A Bacillus macerans (és néhány egyéb mikro-organizmus) által termelt enzim ezt a hélix szer-kezetet úgy hasítja el egyszerre két helyen, hogy egyúttal össze is zárja a keletkező két szabad vég-csoportot, s így alakul ki a ciklodextrin-szerkezet.

• E molekuláris „csomagolóanyag” lehetővé teszi, hogy új, a meglevőknél hatékonyabb gyógyszereket gyártsunk.

• környezeti alkalmazhatósága is bizonyított, mivel immobilizálja a szennyeződéseket, vagy akár a remediációhoz használandó mikrobákat

alfa-ciklodextrin (a hidrogénatomokat zöld, az oxigént piros, a szenet szürke színű gömbök

jelölik)

Poliakrilamid

• Az akrilamid gyökképző (ammónium perszulfát) hatására lineáris polimert képez, s ezt a polimerizációs folyamatot katalizátorral (TEMED) lehet gyorsítani. A térhálós polimer szerkezet kialakítása bis-akrilamid alkalmazásával oldható meg. Ilyen térhálós szerkezet nemcsak makromolekulák, fehérjék, nukleinsavak elválasztását, de immobilizálását is lehetővé teszi.

kaolin agyag polyacrylamide ‘híddal’ metastabil szerkezetet hoz létre (SEM image)

Polisztirol

• Polisztirollal mindenhol találkozunk környezetünkben

• A polisztirol a sztirol polimerizációs terméke, policiklusos aromás szénhidrogén.

• a sztirol a kőolaj feldolgozás egyik mellék-terméke, normál hőmérsékleten meg-lehetősen állandó (az Egészségügyi Világ-szervezet (WHO) szabványa szerint azonban mérgező, és rákkeltőként is figyelembe kell venni). Könnyen polimerizálódik

• A polisztirol ellenáll a savaknak, lúgoknak, de a legtöbb szerves oldószer megtámadja, és érzékeny a fényre is.

• Az 1930-as évektől használják intenzíven, először szintetikus gumit állítottak elő belőle

Poliuretán

• A poliuretán (PUR) csaknem korlátlan lehetőségekkel bíró termoplasztikus műanyag. Régóta alkotóeleme mindennapi életünknek. Két, speciális receptúra szerint előállított komponensből (A - poliol, B - izocianát) áll, melyből az adalékok mennyisége és minősége, valamint a komponensek keverési aránya alapján kemény, félkemény és lágy habanyagok, öntőmasszák, lágy vagy kemény elasztomerek gyárthatók a legkülönbözőbb felhasználási célokra.

A B

Bioremediációs alkalmazások

• Fontos szempontok: produktivitásstabilitás az alkalmazás soránstabilitás a tárolás soránérzékenység a szennyezőanyagokraegyszerű/összetettbiztonságelőnyök/hátrányok

• Szennyvíz tisztítás, talaj remediáció, biofilm, bioreaktorok,

Biodegradáció immobilizált sejtekkel és enzimekkelpéldák

1. Szerves-foszfát peszticidek bontása:Pseudomonas diminuta - foszfotriészteráz enzim széles szubsztrát

specifitásparaoxon hidrolizis:

immobilizálás: (porózus szilikagélre), tritil agarózegyszerű eljárás fix-ágyas csőreaktor

O NO2PO

O

O

OHPO

O

O

OH NO2

CH3CH2

CH3CH2

H2O

CH3CH2

CH3CH2 +

szubsztrát

pumpabioreaktor

detektor

gyűjtőtartályUV/VIS

2. Herbicidek bontására példa:

glifozát széles spektrumú herbicid, előszeretettel alkalmazzák(Monsanto szennyvízkezelés szükségessé vált)

pilot plant: kovaföldre immobilizált mikroba konzorcium

H2SO4

Szennyvíz tározótó

bioreaktor

Tápanyagtank

levegőKiegyenlítő tank

3. Fenolos hulladékok bontásaFusarium flocciferumpoliuretán + felületaktív anyag1 g/L fenol koncentráció mellett négy hónap alatt teljesen elbontja

4. Pentaklórfenol bontásaArthrobacter sp.koimmobilizált rendszer: a baktériumot aktív szénre rögzíti, majd alginát oldatba adagolja (egyéb hordozókat is vizsgáltak)

gélmembrán

A kapszula belsejébenAz adszorbens és a sejtek

levegő

CO2 csapda

elhasználtlevegő

Fontos paraméterek: az adszorbens mennyisége, az alginát gél porozitása, segíti a PCP adszorbciót és mineralizációt felületaktív anyag jelenléte

PCP bontása Arthrobacter-rel

Alginát gélbe zárt, CP bontásban élenjáró baktériumok összehasonlítása

baktériumok: Pseudomonas putida, Pseudomonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter

1. 10 mg/L CP – free c.2. 50 mg/L CP – free c.3. 10 mg/L CP – imm. c.4. 50 mg/L CP – imm. c.

3

4

2

1

1. 5 mg/L CP – free c.2. 10 mg/L CP – free c.3. 50 mg/L CP – free c.4. 5 mg/L CP – imm. c.5. 10 mg/L CP – imm. c.6. 50 mg/L CP – imm. c.

3

12

6

4 5

1. 5 mg/L CP – free c.2. 50 mg/L CP – free c.3. 5 mg/L CP – imm. c.4. 50 mg/L CP – imm. c.

124

3

5. Fenol bontás kevert kultúrávalüveglapra kolloid szilika oldatba kevert mikroorganizmusok rögzítése, a rögzült rétegre újabb szilika réteget visznek.

6. p-nitrofenol (PNP) bontásapeszticid és gyógyszergyártásban fordul előPseudomonas sp. 8 törzs együttesen (P. putida, P. fluorescens, P. mendonica)Kovaföld hordozó, oszlop bioreaktor, levegőztetetta rögzített sejtek képesek tolerálni az 1800 mg/L PNP konc. is!

7. Poliklórozott bifenilek bontásakét Pseudomonas faj és egy Alcaligenes faj ko-kultúrában bont kevert PCB-t, három féle hordozón

8. Morfolin bontás Mycobacterium aurum-mal (G+ baktérium)morfolin = 1,4 – tetrahidro – oxazin (heterociklusos vegyület: C4H9NO)származékai: adalékanyagok, oldószerek,antioxidáns anyagok, stb.gyártásuk során az effluensben morfolinjelenik meg, ezért fontos lebontásánakkidolgozása

9. Nikkel - ötvözet szálakon létrehozott Thiobacillus ferrooxidans biofilm vas-szulfát oxidációja- acidofil, aerob kemolitotróf baktérium- extrém alacsony pH (< 2,0) a vas(III)szulfát kicsapódásának elkerülése érdekében- a baktérium igyekszik hozzátapadni szilárd felszínhez, így nem könnyen mosódik ki

10. Higany biotranszformáció fluid-ágyas bioreaktorban- különösen a szerves higany vegyületek veszélyesek, bár ipari és mezőgazdasági felhasználása ma már korlátozott, de tartósan ott maradt a környezetben, - ivóvízben < 1μg/L a max. megengedett konc.- mikrobiálisan az oxidációs állapot változtatható, illetve a szerves higany vegyületek átalakíthatók (az elemi higany kevésbé toxikus)- pl. Aeromonas hydrophilia – kofaktor függő higany reduktáz rendszere - szilika és aluminium porózus hordozóra rögzítve, de több probléma is volt, pl. az elemi higany akkumulálódott, nem távozott el. Levegőztetéssel némileg javult, és a gőztérből kihajtották a Hg-t, melyet kondenzáltak, majd reciklizálták- a problémák kiküszöbölésére új rendszer - Pseudomonas putida KT2442, random mutagenezissel létrehoztak egy Hg(II) redukáló törzset (első próba polivinil alkohol hidrogélbe)

- alginát gélbe ágyazott sejtekkel igen jó eredmények folyamatos rendszerben

11. Kadmium eltávolítása bioszorbens segítségével- abból indultak ki, hogy a poliszaharidok kötődnek fémekhez

ezt a tulajdonságot fordították meg, kadmiumot a cukor polimerhezalginát, mint szorbens megfelelő volt air-lift reaktorban kivitelezve

- a telítődött szorbensből megfelelő eljárással kivonható a kadmium

Flow rate: 2 dm3/min Flow rate: 4 dm3/min

Kevesebb belépőkadmium esetén a szorpció hatékonyabb

Emelt szorbens koncentrációmellett szintén kevesebbaz effluens kadmiumtartalma

A szorbens porozitásaszintén befolyásoljaa kötődés hatékonyságát

12. Felületaktív anyag bontása alginát/pektát gélbe immobilizilált Comamonas terrigena baktériummal- vegyipar, gyógyszeripar, élelmiszeripar használja- negatívan hat a mikrobiális életre, mivel megbontja a membrán stabilitását, habzik befolyásolva az oxigén diffúziót

(bizonyos esetekben előnyös a jelenlétük olajbontás)- gélágyba immobilizálva a sejteket megvédjük a káros hatásoktól

konkrét példa: anion aktív anyag – dihexilszulfoszukcinát (DHSS)

alginát/pektát kevert gélágyban Comamonas terrigena