Imcagiornale_V1.5

www.zanzare.eu/imca

CHI SIAMOL'obiettivo generale dell'IMCA, così come definito dal proprio statuto, è

quello di promuovere misure di lotta agli insetti vettori di patologiedivulgando informazioni metodiche e realistiche al fine di contribuire, cononestà intellettuale, allo sviluppo scientifico ed applicativo delle strategie

di contenimento.La struttura organizzativa dell’associazione prevede, per ciascuna azione o

attività intrapresa, la realizzazione di specifici Gruppi di Lavoro, il cuicompito è quello di aggregare i soci favorendo l’interazione fra diversi

ambiti professionali e sviluppando tra loro approcci multidisciplinari, sia alivello nazionale che a rispetto delle peculiarità territoriali delle

varie regioni.A nostro avviso è questa l’occasione per seminare in un terreno fertile, chegenera entusiasmo e proposte innovative, dove la freschezza delle idee puòriuscire ad ottenere risultati, affrontando la sfida di proiettarsi e misurarsicon le risorse e le prerogative dei giovani professionisti che vi partecipano,sviluppando riflessioni condivisibili con i diversi protagonisti del concerto

nazionale e del mondo globalizzato.Fondatori

Sede Legale:C / O Talbalaghivia martiri delle foibe, 2140068 san lazzaro di savena boC.F.: 91322310375www.zanzare.eu/imca

PERCHE IMCAGIORNALE?

In occasione del convegno “Rischi sanitari delle zanzare” organizzato da IMCA in Alessandria si presentata l’esigenza di riuscire a creare un bagaglio comune di informazioni che sia usufruibile da tutti i soci IMCA, in modo da poter condividere tutte le conoscenze acquisite. Tutto questo risulta

abbastanza complicato essendo i soci dislocati su tutto il territorio nazionale; l’idea che è apparsa più immediata è stata quella di creare una pubblicazione specifica per le attività dell’associazione, uno strumento che possa tenere aggiornati tutti i soci sulle attività scientifiche svolte dai membri Stessi.

Come linea guida della pubblicazione si è pensato di considerare come argomento principale la Lotta contro i vettori di malattie di importanza sanitaria”. Questo sia per l’importanza oggettiva

dell’argomento sia perchè, allo stato attuale, risulta uno dei fondamentali punti di dialogo con le amministrazioni pubbliche che costituiscono gli utenti fondamentali delle nostre consulenze.

Lo scopo di tale pubblicazione può quindi essere sintetizzata in:•Rendere più visibile l’attività svolta dai soci IMCA

•Fornire spunti per stimolare nuove attività o progetti•Arricchire il bagaglio di conoscenze dei soci IMCA

•Aumentare la possibilità di interazione tra i soci o collaborazioni con personalità professionali esterne all’associazione.

IL PROBLEMA SANITARIO

Sono molte le malattie infettive ad eziologiavirale veicolate dalla puntura di zanzare; i virusche causano queste malattie appartengono perlo più al genere Flavivirus che comprende ivirus responsabili del WND, dell’EncefaliteGiapponese, dell’Encefalite di St. Louis,dell’Encefalite della Valle del Murray, i virusUsutu, Kunjin. Kokobera, Stratford, Dengue eCikungun.Il ciclo naturale del virus prevede il passaggiodell’agente patogeno dal vettore ad un elevatonumero di specie di uccelli selvatici, nei qualipuò provocare anche una significativamortalità.Il virus può infettare diverse specie divertebrati (mammiferi, uccelli, rettili) e tra imammiferi l’uomo e il cavallo possonomostrare sintomatologia clinica.L’infezione dell’uomo da parte dei Flavivirus ètipicamente accidentale in quanto l’uomo nonha un grado di replicazione del virussufficientemente alto da poter reinfettare gliartropodi. (Fatta eccezione per la Febbre Giallae la Dengue)L’uomo dunque non risulta ne un vettore ne unserbatoio anche se vi è la possibilità ditrasmissione del virus da uomo a uomo tramitetrasfusioni o trapianti.Sono dunque gli uccelli l’ospite vertebratod’elezione per i Flavivirus. Gli uccelli migratoripossono quindi trasportare diversi virus lungoelevate distanze e diffonderli in vasti territori.I cambiamenti climatici avvenuti negli ultimianni hanno indotto molti uccelli a mutare i loropercorsi migratori permettendo così unadiffusione dei virus in territori che prima nonne erano interessati e gli stessi cambiamenticlimatici hanno reso territori ospitabili areedove prima i virus non erano in grado disvilupparsi.Nel corso degli anni sono stati molti i casid’infezione negli uccelli e nei mammiferi in

Europa.Il primo focolaio di infezione da WNV in Italia siverificò nel 1998 in Toscana (Padule diFucecchio) dove causò 14 casi clinici in cavalli,di cui 6 mortali. Nel corso dell’epidemia non siverificò alcun caso umano, ma vennero rilevatepositività anticorpali in persone checondividevano con i cavalli il rischio dellepunture di zanzara.Nel 2008 i territori della provincie di Ferrara.Bologna. Modena, Rovigo, Padova e Mantovasono stati interessati da casi sintomatici econfermati di infezione da WNV in cavalli.Successivamente a questo episodio sono statisegnalati tre casi umani di WND (West NileDisease) : uno in provincia di Bologna e due inprovincia di Ferrara.Nel 2008 in Italia si sono verificati per la primavolta casi di malattia neuro-invasiva di West-Nile (WNND) nell’uomo in alcune provincedell’Emilia-Romagna e Veneto, per un totale di8 casi di malattia neuro-invasiva.Nel 2009, nelle Regioni Emilia Romagna,Veneto e Lombardia si sono verificati un totaledi l8 casi di WND nell’uomo.Durante l’estate del 2010 sono stati rinvenutiparecchi casi di WND in Grecia, nelle regioniNord Orientali confinanti con la Macedonia edin Russia, in aree fin’ora considerate troppofredde e dunque inospitali per il virus ; alcunidi questi casi hanno portato a casi clinici graviche in alcuni casi hanno causato il decesso delpaziente.Negli ultimi 10 anni sono stati parecchi i casid’infezione da parte di Usutu Virus in tuttaEuropa.Tra l’agosto e il settembre 2001, nei pressi diVienna, furono segnalati diversi casi di merlimalati che mostravano segni di apatia epiumaggio arruffato, vi fu inoltre unaconsiderevole moria di Merli (Turdus Merula)

Inoltre, sempre nel territorio austriaco, furonoritrovati 5 Allocchi di Lapponia (Strix nebulosa)e numerose Rondini (Hirundo rustica) morti.Dal 2003 al 2006 è stato attuato in Ungheria unprogramma di costante monitoraggioornitologico;nel corso di 4 anni, nei pressi di Budapest, sonostati raccolti 332 esemplari di uccelli mortiappartenenti a 52 specie differenti.Ogni singolo esemplare è statosuccessivamente sottoposto a necroscopia e adun’analisi per poter accertare l’eventualepresenza di Usutu Virus; in un esemplareraccolto nel mese di Agosto del 2005 furiscontrata la presenza del Virus esuccessivamente nei mesi di Luglio e Agosto del

2006 furono rinvenuti altri 6 merli positivi.Nell’agosto del 2006, da una pozza presso ildelta del fiume Llobregat, furono catturatealcune zanzare della specie Culex pipiens. 3 diqueste risultarono positive per l’Usutu Virus.Nel maggio del 2009, in Emilia Romagna, èstato riscontrato il primo caso di infezioneneuroinvasiva da parte dell’Usutu Virus su unpaziente umano, successivamente, nel mese diagosto fu riscontrato un secondo caso che,tramite l’analisi dell’iter clinico del paziente hadimostrato che la trasmissione era avvenutatramite trasfusione.

Lotta alla zanzara tigre porta a porta nelcomune di Montecatini Terme

Macchioni F. 1 Torracca B. 1 Magi M. 1, GuardoneL. 1, Colga N. 2, Muller K2., Biasci A3. Rose A2

1Dip. Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degliAlimenti, Università di Pisa; 2UniversitätRegensburg, Germany; 3Entomox, Ditta didisinfestazione e derattizzazione, Pisa

IntroduzioneAedes albopictus, la cosiddetta “zanzara tigre”, èun insetto di origine asiatica che sta invadendoaltri continenti grazie alla sua notevole capacità diadattamento. Negli ultimi anni si è diffusaampiamente nel nostro Paese destando allarme epreoccupazione, sia per la possibile attività comevettore di patogeni, sia per gli attacchi all’uomonelle ore diurne caratterizzati da una aggressivitàfuori del comune. Le punture della zanzaraprovocano rigonfiamenti dolorosi, spessoedematosi o emorragici e, in personeparticolarmente sensibili, anche manifestazionilocali di tipo allergico.Il trattamento delle forme larvali rappresentaattualmente uno dei metodi di lotta contro Aedesalbopictus Skuse. Tale trattamento consente diottenere buoni risultati nel tempo e conseguenzeminori sull’ambiente rispetto alla lotta contro laforma adulta. Nel 2009 è stato condotto in trezone urbane della città di Montecatini Terme unesperimento per valutare varie metodiche di lottaalla zanzara tigre. Qui vengono presentati i dati diuna parte dell’esperimento che riguarda soltantola lotta con metodi antilarvali in due zoneresidenziali nella città. Usualmente i trattamentiche vengono effettuati coinvolgono solamente ilsuolo pubblico e non quello privato. L’obiettivo inquesto caso è stato quello di valutare qualeriduzione della densità di popolazione dellezanzare è possibile ottenere operando trattamentiantilarvali nel suolo pubblico e privato rispetto ad

un trattamento soltanto nel suolo pubblico.Materiali e metodiLa raccolta dei dati è avvenuta dal 1° maggio 2009al 31° ottobre 2009. Le zone sperimentali erano:la zona 1 costituita da abitazioni e giardini conun’estensione di circa 25.000 m2, la zona 2costituita da abitazioni ed alberghi con giardinicon un’estensione di circa 20.000 m2 e rispettivezone di controllo. Entrambe le zone sono statetrattate ogni 15-20 giorni con larvicidi - compressecontenenti piriproxifen e/o compresseeffervescenti contenenti diflubenzuron IGR.Nella zona 1 sono state trattate 75 caditoie nellestrade pubbliche e 128 caditoie/grate nei giardiniprivati di 38 case; il trattamento nelle abitazioni earee private è stato fatto capillarmente, con pienacollaborazione della (quasi) totalità dei cittadiniche hanno inoltre seguito le indicazioni fornitesulla prevenzione per rimuovere ogni possibilefocolaio. Nella zona 2 sono state trattate 56caditoie nella zona stradale e 55 in aree private; ipunti trattati in aree private rappresentavano solouna frazione del totale poiché il trattamento delleabitazioni e degli alberghi privati della zona èpotuto avvenire solo a sprazzi con unacollaborazione estremamente limitata, quandonon del tutto assente, da parte dei cittadini chehanno ignorato le forme di prevenzione.Le variabili misurate sono state: il numero dizanzare nelle trappole di monitoraggio BG-Sentinel messe una o due volte alla settimana inciascuna zona per 24 ore; Human Landing Ratemisurato una volta alla settimana in due posizioniper ciascuna zona per 30 minuti.

Risultati e discussioneNella zona 1 (Fig 1a, 1b) si può notare unamarcata riduzione del numero di zanzare nellazona trattata rispetto al controllo con unariduzione del 62.46% nelle MT e 67.89% nell'HLR.Nella zona 2 (Fig 2a, 2b) una riduzione del 27.47%nelle MT e 56.61% nell'HLR . Con entrambi imetodi di controllo, e particolarmente nelle MT,nella zona 1 è stata osservata una riduzionesignificativa del tasso di A. albopictus maggiore econ andamento più costante rispetto allariduzione della zona 2.

Considerando che la maggior proliferazione dellezanzare si ha proprio nei giardini privati e nonnelle strade pubbliche, questo esperimentoevidenzia l’importanza di un trattamento che siasvolto in maniera accurata e che non si limiti allearee pubbliche, ma che interessi anche, perquanto possibile, le aree private coinvolgendo inmodo sempre più massivo la popolazione.

Fig. 1a, femmine di A. albopictus per settimana Fig. 2a, femmine di A. albopictus per settimana

ZONA 2 – MT

ZONA 1 – HLR

Fig. 1b, femmine di A.albopictus per settimana

ZONA 2 – HLR

ZONA 1 – MT

Fig. 2b, femmine di A. albopictus per settimana

CAMPAGNA DI INFORMAZIONE PORTA A PORTASULLA ZANZARA TIGREAmodio A.1, Bazzoni M.1, Bombonato S.1, Cotroneo G.1, Fossati F.1, Moriggia S. 1, Storgato M.1, e Talbalaghi A.2,3

1Tecnici di campo del “gruppo ricerche ambientali” nel Progetto di lotta biologica ed integrata alle zanzare -Alessandria2Entomologo, consulente del Progetto di lotta biologica edintegrata alle zanzare - Alessandria3Direttore Nazionale dell’ European Mosquito Control Association (www.zanzare.eu)

INTRODUZIONE:Dalle analisi del Gruppo ricerche ambientali èstata rilevata un’elevata infestazione di Zanzaratigre (Aedes albopictus) nel comune di PozzoloFormigaro e nel quartiere Orti di Alessandria;questo ha portato il nostro gruppo a definire unprogetto di contrasto da attuare definito“campagna di informazione porta a porta”. Lacampagna di informazione porta a porta ha comeprimo obiettivo la rimozione dei “microfocolai”larvali di Zanzara tigre presenti sul suolo privato.La grande plasticità ecologica che caratterizzaquesta specie le ha permesso di adattarsirapidamente ad ambienti diversi anche agliambienti urbani, grazie alla sua capacità diutilizzare per la deposizione delle uova unagrande varietà di contenitori derivanti dall’attivitàumana. Quartieri o zone in cui predominanovillette con orti e giardini o condomini con spaziverdi interni e terrazzi costituiscono le aree piùfavorevoli alla colonizzazione da parte diAe.albopictus, per l’abbondanza sia di focolai perlo sviluppo larvale che di rifugi per gli adulti (siepi,erba alta, alberi bassi). I tecnici di campo hannoeffettuato sopralluoghi e monitorato le aree verdidelle abitazioni private, hanno informato iproprietari riguardo i possibili punti di formazionedei microfocolai, consegnando dei volantinidivulgativi e bottigliette di prodotto larvicida dovenecessario, con lo scopo di ottenere un correttocomportamento da parte dei cittadini.

MATERIALI E METODI:Il progetto di intervento si è articolato su alcuni

punti essenziali:1. Informare l’amministrazione localedell’iniziativa in programma a livello sperimentale,di intervento porta a porta.2. Chiedere all’amministrazione di informare lapopolazione di tale progetto, divulgando lanotizia attraverso la cartellonistica ed avvisimediatici come tv locali, programmi radiofonici,articoli giornalistici di quotidiani locali per unamaggiore collaborazione tra i tecnici operatori ed iproprietari delle abitazioni, agevolando cosìl’accesso alle aree private.3. Interventi porta a porta per monitorare lasituazione ed informare direttamente lapopolazione, con consegna di volantini divulgativie sopralluoghi in presenza del proprietario,rimuovendo o riducendo la causa del problema(es.: evitare i ristagni d’acqua o coprirli; bidoni,annaffiatoi, sottovasi, fontane, caditoie dellegrondaie, ecc…).4. Acquisire attraverso la compilazione di unascheda le informazioni relative alle abitazioni, iltipo di area verde presente, i ristagni d’acqua, lapresenza di animali, il numero di tombini e lapresenza/assenza di infestazione.5. Rilevare nelle acque delle tombinature lapresenza di culicidi allo stadio larvale, mediantel’uso di un campionatore e contenitori falcon, inmodo da determinare la specie infestante.6. Distribuire dove necessario un prodottobiologico B.T.I. granulare (Bacillus ThuringiensisIsraeliensis) per contrastare la popolazione larvalenei microfocolai non rimovibili nelle abitazioni(es.: grondaie, sottovasi, tombini, ecc…),mostrando le modalità ed i tempi di utilizzo pergarantire una piena efficacia del trattamento incompleta sicurezza per il cittadino.7. Distribuire in modo diffuso e comunque neicontesti individuati dal Tecnico un’ovitrappola conun listello, per monitorare in modo capillare lapresenza della Zanzara tigre e misurare l’efficaciadegli eventuali interventi successivi.

8. Verificare lo status dell’infestazione edeffettuare le verifiche di efficacia dei trattamentiattuati.9. Estendere l’intervento attuato come modelload altre aree urbane.

RISULTATI:Nel comune di Pozzolo Formigaro il numero totaledelle abitazioni che sono state informate è 517; icittadini hanno dato il permesso di effettuare icontrolli in 257 abitazioni (il 49%), mentre in 260abitazioni (51%) non è stato possibile effettuare icontrolli (per assenza degli abitanti o per accessonegato). Nelle 257 abitazioni controllate, è statariscontrata la presenza di Z.Tigre in 44 case, siacome individui adulti sia come presenze larvali; diqueste 44 residenze, è stato possibile effettuare leverifiche di efficacia dei trattamenti in 41 case (inquanto in 3 abitazioni gli abitanti sono risultatiassenti) e si è verificato che l’86% delleinfestazioni che erano state trovate è statorimosso (le infestazioni sono stati ritrovatesolamente in 3 abitazioni). Durante la campagnasono state rilasciate 65 bottigliette di prodottolarvicida granulare.Nel quartiere Orti di Alessandria il numero totaledelle abitazioni informate è 452; i cittadini cihanno dato il permesso di effettuare i controlli in211 abitazioni (il 47%), mentre in 241 abitazioni (il53%) non è stato possibile effettuare i controlliper assenza degli abitanti o per accesso negato.Nelle 211 abitazioni controllate, è statariscontrata la presenza di Z.Tigre in 58 case. Èstato possibile effettuare le verifiche di efficaciadei trattamenti in 52 case (in quanto in 6abitazioni gli abitanti sono risultati assenti) e si èverificato che l’86% delle infestazioni che eranostate trovate è stato rimosso (le infestazioni sonostate ritrovate solamente in 2 abitazioni). Durantela campagna sono state rilasciate 106 bottigliettedi prodotto larvicida granulare. Nelle case in cui siha avuto l’accesso, si è registrata la fonte che hainformato la popolazione del progetto, mentre in

quelle in cui l’accesso è stato negato, si sonoannotate le “motivazioni” date dai cittadini pernon consentire i controlli. Il 30% dei proprietaridelle abitazioni controllate erano informate delprogetto mediante i media (interviste televisive earticoli su giornali), mentre il 67% non erainformato; il 2% è stato informato dai vicinimediante il passaparola e il restante 1% è venutoa conoscenza della campagna attraverso le“Panchine parlanti” (banchetti informativi).

CONCLUSIONI:Dai risultati ottenuti si può osservare che il livellodi informazione riguardante il progetto è risultatobasso e anche la percentuale degli accessi risultaessere circa la metà delle abitazioni suonate.Pertanto si può concludere che una buona econtinua informazione attraverso i mezzi dicomunicazione agevolerebbe il controllo e lariduzione del problema, in quanto le persone,informate del progetto in atto, sarebbero piùpropense ad una collaborazione con i tecnici.Inoltre, dalle verifiche di efficacia svoltesuccessivamente ai trattamenti effettuati, si puòdedurre che la rimozione dei microfocolai e iltrattamento dei tombini con il prodotto larvicida,hanno portato a una riduzione dell'infestazione. Isoli metodi di disinfestazione su suolo pubbliconon sono sufficienti a debellare il problema, adessi vanno affiancati l'eliminazione e iltrattamento dei microfocolai durante tutto l'anno,compreso il periodo invernale, informando lapopolazione sui corretti comportamenti daadottare attraverso volantini e l'uso dei media, ededucando i ragazzi in età scolare al problema.Osservando i dati ed i buoni risultati ottenuti,valuteremo di estendere questo modello anchenegli altri Comuni aderenti al progetto che sonointeressati a questo problema.

Molecular approach forESOVE 2010

Molecular approach for identification of mosquito q

species (Diptera: Culicidae) in hi h i k t ia high-risk ecosystem in

Province of Alessandria,Province of Alessandria, Piedmont, Italy

Elena Shaikevich and Asghar TalbalaghiElena Shaikevich and Asghar Talbalaghi

Foto:eid-med.org

Piovera

Rivarone

Pietra Marazzi

ALLUVIONI CAMBIO'

Piedmont, NW ItalyALESSANDRIA Tortona

Oviglio Frugarolo

Castellazzo BormidaC ti

Novi LigurePredosa

Sezzadio

Bosco Marengo

Basaluzzo

Gamalero

Carentino

Fresonara

SezzadioCapriata d'Orba

Silvano d'Orba

Tassarolo

OvadaTagliolo Monferrato

Project of Alessandria: 29 Municipalities

82000 Hectares

Foto: www.thesmartmama.com/ii-49/

Anopheles spp.Fragments resulting from restriction with CfoI and BstACI of ITS2 amplificates of A. maculipennis complex mosquitoes from Piedmont

Municipality Sample code Date of sampling or capture

Storing conditions

Adult

CfoI

Adult

Ovada 25 26.08.2009 Dry

Rivarone 33 10.08.2009 Dry

Alessandria 36 08 09 2009 Dry

bpAlessandria 36 08.09.2009 Dry

Larvae

Alluvioni Cambiò 67 26.08.2009 Ethanol500

389BstACI272

111 bp

207

141+135

BstACI

111

50

bp

500

292

102

9

150

Culex pipiens

Municipality Sample code

Date of sampling

Number ofidentified Storing

conditionscode or capture specimen conditions

Adult

Alluvioni Cambiò 5 26.08.2009 3 Ethanol

Castellazzo Bormida 13 17.08.2009 2 Dry

Frugarolo 18 17.06.2009 2 Dry

Fragments resulting from restriction with HaeIII of 603 bp amplificates of DNA of COI gene of mosquitoes

Ovada 24 29.09.2009 4 Dry

Alessandria 35 01.09.2009 2 Dry

Larvae

Al d i 69 28 08 2009 1 E h lC. pipiens from Piedmont: 5-1, 13-1, 18-1, 24-1(the sample numbers correspond to the numbers in Table);

of anautogenous mosquitoes from open rural habitats

Alessandria 69 28.08.2009 1 Ethanol

Gamalero 70 24.08.2009 5 Ethanol

Oviglio 71 25.08.2009 8 Ethanol

Tortona 73 26 08 2009 5 Ethanolfrom Moscow (pip-1) and Krasnodar (pip-2) region;

of autogenous mosquitoes from basement habitats from Moscow (mol-1) and Krasnodar (mol-2)

Tortona 73 26.08.2009 5 Ethanol

Novi Ligure 74 24.08.2009 5 Ethanol

Tassarolo 75 24.08.2009 9 Ethanol

Total 48Total 48

1222444 5556667888 ]7771013567 8894572349 ]1349629888 5802775086 ]1349629888 5802775086 ]

#pipiensRussia(300) AGAGAGTTTA CCAAGAAAAA#pipiensGermanyHannover(13) .......... ..........#pipiensGermanyBerlin(17) .......... ..........#molestusRussia(250) A G#molestusRussia(250) ...A...... .........G#Novi Ligure ...A...... .........G #Frugarolo ...A...... .........G#molestusGermanyHannover(1) ...A...... .........G#molestusGermanyBerlin(4) A G#molestusGermanyBerlin(4) ...A...... .........G#IsraelHaifa(2) ....G..... ........G.#pipiensPortugal201-2(10) ....G..... ........G.#pipiensPortugal88-6 ....G..... ........G.#molestusPortugal205-29 G GG#molestusPortugal205 29 ....G..... .......GG.#molestusPortugal169-5 (9) ....G..... ........G.

Alignment showing variable nucleotide sites of the gene COI from mosquitoes of theAlignment showing variable nucleotide sites of the gene COI from mosquitoes of the C. pipiens compex. Numbers correspond to the quantity of the investigated individuals.

Ochlerotatus caspiusOchlerotatus caspius

• 1 2 3 3 5 555]• [ 111 111 111 122 222 222 223 333 333 3 6 9 0 1 4 666]• [ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 7 5 7 9 2 3 123]• Och1_Alessandria GGA GTT TGA TCA GGA ATA GTT GGA ACA TCA TTA AGA G G A A A T ATT• Och2_Alessandria ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . . . . . . ...• Och_Valle_S._Bartolomeo ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . . . . . . ...• Och_Alluvioni_Cambio ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . A . . . . ...• Och_Bosco_Marengo ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A . G G G A G..• Och_Castellazzo_Bormida ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A . . . . A G..

7 variable nucleotide sites of the 563 bp 5’region of COI (Barcode fragment) of O. caspius from Piedmont.

GenBank search revealed that the COI sequences of O. caspius from Piedmont share 98% similarity with specimens from Iran (Azari-Hamidian et al., 2009). The neighbor-joining d d h l h fi i f d b I li d h d I i Odendrogram shows two clusters: the first is formed by Italian and the second – Iranian O. caspius.

FJ210905.1 Iran76

FJ210903.1 Iran

FJ210904.1 Iran

FJ210902.1 Iran63

63

88

92 FJ210906.1 Iran

FJ210908 Iran

FJ210907 Iran

O h B M

65

92

Och Bosco Marengo

Och Castellazzo Bormida

Och Valle S. Bartolomeo

Och1 Alessandria

92

62

Och1 Alessandria

Och2 Alessandria

Och Alluvioni Cambio

42

Dendrogramm based on 563bp COI gene mtDNA sequence data demonstrating the relation of

0.001

Dendrogramm based on 563bp COI gene mtDNA sequence data demonstrating the relation of haplotypes within the O. caspius. The tree was constructed using neighbor-joining method with Kimura 2-parameter distances. Numbers are bootstrap percentages (1000 replicates).

nucleotide sequences of the ITS2 fragment of O. caspius

Och2_Alessandria CGCGTTTCAC TTCGGGTGGA CAGGCGCACG GCCCATAAGC ACGTATGCGT AGTGATGCGT TGCCCGCCTTOch1_Alessandria .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Och_Valle_S._Bartolomeo .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Och Alluvioni CambioOch_Alluvioni_Cambio .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Och_Bosco_Marengo .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Och_Castellazzo_Bormida .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Och2_Alessandria CGGTGGCGGT CAAACATTGA AGATAGT CAGGCGCGGC GTCCTCGCGA CGACGTGGTT GATGAATACA Och1 Alessandria AOch1_Alessandria .A........ .......... ....... .......... .......... .......... .......... Och_Valle_S._Bartolomeo .......... .......... ....... .......... .......... .......... .......... Och_Alluvioni_Cambio .......... .......... ....... .......... .......... .......... .......... Och_Bosco_Marengo .......... .......... ....... .......... .......... .......... .......... Och_Castellazzo_Bormida .......... .......... ....... .......... .......... .......... ..........

Och2_Alessandria TCCCATATGC CACACCATCG CGTTGGATAT GTTGTATTCC ATCA--CACA [187]Och1_Alessandria .......... ...--....A .......... .......... ....CG.... [187]Och_Valle_S._Bartolomeo .......... .......... .......... .......... ....--.... [187]Och_Alluvioni_Cambio .......... .......... .......... .......... ....--.... [187]Och Bosco Marengo .......... .......... .......... .......... ....--.... [187]Och_Bosco_Marengo .......... .......... .......... .......... .... .... [187]Och_Castellazzo_Bormida .......... .......... .......... .......... ....--.... [187]

nucleotide sequences of the ITS2 fragment of O. caspius

from Italy Spain and Tunisfrom Italy, Spain and Tunis

Och2_Alessandria CGCGTTTCAC TTCGGGTGGA CAGGCGCACG GCCCATAAGC ACGTATGCGT AGTGATGCGT TGCCCGCCTT CGGTGGCGGT CAAACATTGA AGATAGTOch1_Alessandria .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .A........ .......... .......Och Valle S BartolomeoOch_Valle_S._Bartolomeo .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......Och_Alluvioni_Cambio .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......Och_Bosco_Marengo .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......Och_Castellazzo_Bormida .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......AM084685Spain .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208089Tunisia:Gharelmelh .......... .C........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208084Tunisia:Gharelmelh .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208091Tunisia:Sidibouali -FM208091Tunisia:Sidibouali ........ . .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208086Tunisia:Menziljemil .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208093Tunisia:Ken .......... .......... .......... ......N... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208085Tunisia:Utique ........-. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208088Tunisia:Utique .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208090Tunisia:Utique .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......FM208087Tunisia:Utique .......... .......... .......... ......G... .......... .......... .......... .......... .......... .......

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ConclusionsConclusionsTh A h l li i l i h di d f• The Anopheles maculipennis complex in the studied area of Piedmont is represented by A. messeae, A. maculipennis, A. sacharovi, and A. atroparvus.p , , p

• The Culex pipiens complex is represented by an antropophilicThe Culex pipiens complex is represented by an antropophilic form molestus.

• High genetic homogeneity can be suggested for O. caspius from Piedmont.

Foto: www.independent.co.uk/multimedia/archive/0003

The use of DNA-based methods for confirming the identity of mosquito species greatly reduces the risk of misidentification and could enable more efficient

monitoring of control programs.

Elena Shaikevich Asghar TalbalaghiElena Shaikevich Group of Insect Genetics,N. I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia. Email: [email protected]

Asghar TalbalaghiMosquito Control District of Alessandria,National Director of EMCA – ItalyItalian Mosquito Control [email protected] [email protected] [email protected]

[ 1222444 5556667888 ][ 7771013567 8894572349 ][ 1349629888 5802775086 ]#pipiensRussia(300) AGAGAGTTTA CCAAGAAAAA#pipiensRussia(300) AGAGAGTTTA CCAAGAAAAA#pipiensGermanyHannover(13) .......... ..........#pipiensGU474011USA(1) .........G ----------#pipiensDQ360492USA(1) ........C. ......G...#pipiensGermanyBerlin(17) .......... ..........#pipiensACMC044-04CanadaOntario(11) .......... ----------#pipiensGU474003USA(5)P7FA .......... ----------#pipiensGU474009USA(1) ......C... ----------#molestusGU474005USA(9) .......... ----------#molestusRussia(250) ...A...... .........G

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identical quinquefasciatus 58different quinquefasciatus 1pipiens similar with quinq COI 24

#quinquefasciatusIndiaPondicherry(20) ....G..... ........G.#quinquefasciatusIndiaHydarabad(20) ....G..... ........G.#quinquefasciatusFJ210901Iran(1)Abu-MusaI ...A...... ----------#quinquefasciatusFJ210909Iran(2)GheshmLar ....G..... ----------#quinquefasciatusEU259297India(1) ----G..... .......---#quinquefasciatusDQ267689IndiaTamilNadu ---.GA.... ...GC.----#quinquefasciatusAY729977IndiaPondicherry GAT.G..... TAC-------#quinquefasciatusGQ165807Uganda(9) ....G..... ----------#quinquefasciatusGQ255650 ----G..... ........G.#pipiensGQ255652Argentina(1) ----G..... ........G.p p Q g ( )#pipiensIsraelHaifa(2) ....G..... ........G.#pipiensPortugal201-2(10) ....G..... ........G.#molestusPortugal205-29 ....G..... .......GG.#molestusPortugal169-5 (9) ....G..... ........G.#pipiensPortugal88-6 G G#pipiensPortugal88-6 ....G..... ........G.

Le Aedes albopictus o le altre specie di zanzare provenienti dal nord Italia sono in grado di dar vita ad un nuovo focolaio arbovirale?

A. TALBALAGHI1, S. MOUTAILLER2, M. VAZEILLE2 e A.-B. FAILLOUX2

1 Dipartimento per il controllo delle zanzare di Alessandria, Bologna, Italy and 2 Génétique Moléculaire des Bunyavirus, Institut Pasteur, Paris, France Estratto. La zanzara tigre asiatica Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), nativa del sud est asiatico, ha esteso la sua distribuzione geografica per invadere nuove regioni temperate e tropicali. Questa specie è stata introdotta in Italia nel 1990 e da allora è diventata il parassita principale nei centri urbani. Essa fu incriminata come il principale vettore nel primo focolaio europeo del virus chikungunya (CHIKV) nella provincia di Ravenna (Italia) nel 2007. Il focolaio venne associato a CHIKV E1-226V, trasmesso efficientemente da Ae. albopictus. Il fatto che il focolaio si sia sviluppato in zone temperate ci ha condotto a stimare la potenzialità del Ae. albopictus di trasmettere il CHIKV ed il dengue virus (DENV), ed a determinare la predisposizione di altre specie di zanzare raccolte nel nord Italia al CHIKV. Le ispezioni sperimentali hanno mostrato che Ae. Albopictus presenta alto tasso di diffusione dell’infezione di CHIKV (75.0% in Alessandria; 90.3% in San Lazzaro) e bassi tasso di diffusione dell’infezione di DENV-2 (14.3% in San Lazzaro; 38.5% in Alessandria). Inoltre, Ae. albopictus è in grado di ottenere un elevato livello di replicazione virale, con rilevabili tracce di CHIKV nelle ghiandole salivari nel giorno 2 dopo l’infezione. Inoltre, le altre tre specie di zanzare, Anopheles maculipennis Meigen, Aedes vexans vexans (Meigen) and Culex pipiens L., mostrano una predisposizione variabile all’infezione da CHIKV, di rispettivamente 0%, 7.7% e 0–33%. Questa informazione sulla capacità vettrice è fondamentale per la valutazione del rischio di focolai in Italia di CHIKV o DENV. Parole chiave. Aedes albopictus, chikungunya, dengue, capacità vettrice, Italia. Introduzione Dal suo stabilimento a Genova nel 1990, la zanzara tigre asiatica, Aedes albopictus (Skuse), ha invaso la maggior parte delle regioni italiane, divenendo il maggior infestante pungente degli essere umani (Knudsen et al., 1996). Queste specie sono state introdotte accidentalmente con il commercio in pneumatici usati spediti dagli U.S.A. (Dalla Pozza et al., 1994). La sua alta duttilità ecologica ha condotto questa specie a colonizzare numerosi piccoli container riempiti con acqua dolce pulita o rifiuti organici (Romi & Majori, 2008). Inoltre, la sua abilità ad alimentarsi su diversi ospiti favorisce il suo rapido stabilimento in aree sia popolate che isolate (Valerio et al., 2008). Le zanzare adulte si osservano soprattutto da febbraio a dicembre ed hanno un picco di densità durante l’estate; esse hanno contribuito, in parte, al primo focolaio europeo di chikungunya virus (CHIKV) nel 2007. Chikungunya è un virus endemico in Africa, Asia sud est e nel subcontinenete indiano, ma ampi focolai CHIKV sono stati registrati nelle Isole dell’Oceano Indiano (Renault et al., 2007) e nel subcontinente indiano (Yergolkar et al., 2006) nel 2005–2006. Ai viaggiatori in ritorno da aree infette da CHIKV, esso è stato diagnosticato in numerosi paesi europei (Beltrame et al., 2007). Nel 2007 un focolaio di CHIKV si è riscontrato nel

nord Italia (Rezza et al., 2007). Il caso indice, chi aveva viaggiato in India nel giugno del 2007 ha sviluppato i sintomi mentre stava visitando i parenti nei villaggi a nord est. Fra luglio e settembre 2007 sono stati registrati un totale di 204 casi totali. Il virus è stato individuato nella popolazione locale di Ae. albopictus, confermando il ruolo delle zanzare come principale vettore. Questa situazione riflette la convergenza di diversi fattori che favoriscono l’emergere di CHIKV, tra i quali: il rapido trasporto; lo stabilimento di successo di zanzare esotiche; un controllo inadeguato delle zanzare, e le condizioni climatiche. L’alta carica virale dei pazienti [es. 108–9 RNA copie/mL (Parola et al., 2006)] in un ambiente altamente infestato da Ae. albopictus ha permesso l’inizializzazione di un ciclo inter-umano. I ceppi isolati italiani di CHIKV nel 2007 portavano una singola sostituzione di aminoacido da una alanina ad una valina nella posizione 226 nel E1 glicoproteina (Rezza et al., 2007; Bordi et al., 2008). Questa mutazione A226V, la quale fu identificata per la prima volta durante il focolaio sull’isola di La Réunion, favorisce la trasmissione tramite Ae. albopictus (Tsetsarkin et al., 2007; Vazeille et al., 2007). Così, questa mutazione promuove i focolai in regioni ove il vettore tipico, Aedes aegypti (L), è assente.

La diffusione di Ae. albopictus in altri paesi europei, così come l’incremento di casi d’importazione di virus Aedes-generati come il CHIKV e la dengue (DENV), indica un incremento di rischio di ricorrente focolai arbovirali nei paesi occidentali. Qui riportiamo una valutazione della capacità di vettore per il CHIKV ed il DENV delle Ae. albopictus e delle altre specie di zanzare, Aedes vexans vexans (Meigen), Anopheles maculipennis Meigen e Culex pipiens L., provenienti dal nord Italia.

Fig. 1 Siti di raccolta delle zanzare nel nord Italia nel 2008 Materiali e Metodi Zanzare Sono state raccolte, nel nord Italia, le larve e le uova di sette campioni di zanzare (Fig. 1). Le femmine F0 sono state nutrite con un 10% di soluzione saccarina ad libitum e sono state mantenute in un insettario fino all’infezione. Sono state studiate 4 specie: Ae. albopictus, Ae. vexans, An. maculipennis e Cx pipiens. Virus I test sono stati eseguiti su due virus, CHIKV e DENV; questi rappresentano i due principali arbovirus associati al Ae. albopictus. Il ceppo isolato di CHIKV, nel novembre del 2005, in un paziente sull’isola di La Réunion presenta la mutazione di un aminoacido (A226V) nell’involucro della glicoproteina E1 (Schuffenecker et al., 2006). Questo ceppo è filogeneticamente vicino a quello isolato dal ceppo italiano di CHIKV (Bordi et al., 2008; Kumar et al., 2008). Il ceppo della dengue 2 (DENV-2) venne isolato nel 1974 a un paziente in Tailandia (Vazeille-Falcoz et al., 1999). Entrambi gli stock virali sono stati prodotti sulle cellule di Ae. Albopictus C6/36 ed immagazzinati a −80"C.

Infezioni orali delle zanzare Le femmine private di soluzione saccarina 24 h prima dell’alimentazione, sono state esposte da farina di sangue composta per il 67% da lavati eritrociti di coniglio e per il 33% da sospensione virale. La procedura è descritta nel Vazeille-Falcoz et al. (1999). La farina di sangue aveva un titolo finale di 107.0 PFU (placca-formante l’unità)/mL per CHIKV e 108.0 MID50 (dosi zanzare infettive)/mL per DENV-2. Questi titoli sono stati selezionati in accordo con i dati ottenuti dai precedenti esperimenti (Vazeille-Falcoz et al., 1999; Vazeille et al., 2007). Abbiamo confermato il dato riguardante le femmine di zanzara che hanno ingerito farine di sangue infette tramite una titolazione eseguita a caso sulle femmine dopo 1 ora; tutte erano positive confermando l’ingestione di particelle virali infette (dati non mostrati). Per stimare la diffusione del tasso d’infezione e della capacità dei vettori, le femmine alimentate con il sangue sono stati mantenuti ad una temperatura di 28"C per 14 giorni. Le femmine sopravvissute sono state uccise a −80"C e decapitate su una diapositiva. Gli antigeni CHIKV e DENV sono stati individuati nella testa appiattita tramite l’esame ad immunofluorescenza (IFA). I campioni di zanzare sono stati confrontati in relazione ai tassi d’infezione diffusi i quali corrispondono alla proporzione di femmine positive secondo IFA sulle teste appiattite fra le femmine sopravvissute 14 giorni dopo l’infezione (p.i.). Riproduzione virale nelle Ae. albopictus Sono stati esaminati i campioni provenienti da Alessandria e San Lazzaro. Ogni 2 giorni da 0 a 14 giorni p.i., cinque femmine sono state uccise e sezionate per raccogliere l’intestino medio e le ghiandole salivari. L’intestino medio controlla l’entrata del virus nell’emocele della zanzara, la quale è seguita dalla infezione delle ghiandole salivari. Il virus deve essere secerso con la saliva, il quale sarà trasmesso la volta successiva che tenta di nutrirsi. L’intestino medio e le ghiandole della saliva sono predisposte per l’estrazione dell’RNA usando il kit Nucleospin® RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Germany) seguito da una fase di quantitativa di trascrizione inversa della reazione a catena della polimerase (qRT-PCR) per individuare il numero delle copie RNA virale. Il protocollo è decritto in dettaglio nel Vazeille et al. (2007). Risultati Aedes albopictus provenienti da Alessandria e San Lazzaro erano altamente predisposte al CHIKV, con alte e non significative differenze di tassi di infezione (esatto test di Fisher: P = 0.19) di 90.3% a San Lazzaro e 75.0% a Alessandria (Table 1). Queste zanzare erano meno predisposte alla DENV-2, con bassi e significativi

differenze nei tassi (esatto test di Fisher: P = 0.01) di 14.3% a San Lazzaro e 38.5% a Alessandria. Per le altre tre specie, il tasso della divulgazione dell’infezione per il CHIKV si estende da 0% a 33.3%. Le specie di An. maculipennis e due campioni di Cx pipiens (da Novi Ligure e Predosa) non erano suscettibili a questi virus. Aedes vexans provenineti da Bosco Marengo mostrano un tasso di 7.7%. Le figure 2 e 3 presentano una quantità stimata di RNA virale nell’intestino medio e nelle ghiandole salivari delle femmine provenienti da Alessandria e da San Lazzaro analizzato in diversi giorni p.i. Per le Ae. Albopictus provenienti da Alessandria, il numero delle copie dell’RNA virale nell’intestino medio aumenta dal giorno 0 (105.7 ± 100.1 copie/intestino) al giorno 4 p.i. (107.5 ± 100.4

copie/intestino) e decresce lentamente al giorno 6 p.i. fino a 107 ± 100.5 copie/intestino. Dal giorno 8 al 14 p.i., il numero delle copie dell’RNA virale fluttua attorno alle 108 copie/intestino. Nelle ghiandole salivari, RNA virale era ritracciabile al giorno 2 p.i. (101.7 ± 100.6 copie/ghiandole salivari) e decresce lentamente fino a raggiungere il minimo al giorno 6 p.i. (101.3 ± 100.5

copie/ghiandole salivari). Successivamente, l’RNA virale varia da 102.2 ± 100.7 copie/ghiandole salivari al giorno 8 p.i. a 101.3± 101.2 copie/ ghiandole salivari al giorno 14 p.i. Tabella 1. Tassi di infezione disseminata dai virus chikungunya e dengue da diversi campioni di specie di zanzara nel nord Italia ne 2008

* CHIKV ad un titolo di 107.5 PFU/mL; † DENV-2 ad un titolo di 108.5MID50/mL. CHIKV, chikungunya virus; DENV-2, dengue 2 virus; n, numero di femmine testate; PFU, plaque-forming unit; MID50

dosi di infettivo per le zanzare. Per le Ae. albopictus provenienti da San Lazzaro, il numero di copie di RNA virale nell’intestino medio incrementa dal giorno 0 (105.6 ± 100.2

copie/intestino) al giorno 2 p.i. (108 ± 100.5

copie/intestino) ed oscilla attorno alle 108 copie/intestino fino al giorno 14 p.i. Nelle ghiandole salivari, l’RNA virale diventa rintracciabile nel giorno 2 p.i. 103.4 ± 100.4

copie/ghiandole salivari ed oscilla attorno 103–4

copie/ ghiandole salivari. Quando si confrontano dei profili di replicazione virale dell’intestino medio, il numero delle copie dell’RNA virale in relazione ai giorni p.i. era abbastanza simile nelle

femmine provenienti sia da Alessandria che da San Lazzaro.

Fig. 2. La riproduzione del chikungunya virus nelle ghiandole salivari delle Aedes albopictus provenienti da Alessandria e San Lazzaro dopo l’infezione orale.

Fig. 3. La riproduzione del chikungunya virus nell’intestino medio delle Aedes albopictus provenienti da Alessandria e San Lazzaro dopo l’infezione. Per contro il numero delle copie dell’RNA virale nelle ghiandole salivari delle femmine provenienti da San Lazzaro era quasi il doppiamente più alto che nelle ghiandole delle femmine provenineti da Alessandria, potenziando l’elevata divulgazione del tasso d’infezione ottenuto al giorno 14 p.i. per le femmine di San Lazzaro (Tabella 1). Dibattito Abbiamo dimostrato che i campioni di Ae. albopictus provenienti dal nord Italia sono più sensibili alle infezioni da CHIKV rispetto a quelle da DENV; il CHIKV era rintracciabile nelle ghiandole salivari dal 2° giorno dopo l’ingestione di farine di sangue infette. Inoltre, per le Ae. albopictus provenienti da Alessandria è stata trovata una correlazione fra l’elevato livello di replicazione nelle ghiandole salivari e un elevato tasso di divulgazione dell’infezione, quando sono infettate con il CHIKV. Oltre a ciò, Ae. vexans, An. maculipennis e Cx pipiens, le quali sono fra le specie di zanzare dominanti nel nord Italia, erano non suscettibili oppure meno suscettibili al CHIKV. Aedes albopictus ha sviluppato una infezione disseminata dal giorno 2 dopo l’infezione; l’RNA

Luogo Specie

Tasso infezione disseminata

Giorni dopo l’infezione

Giorni dopo l’infezione

virale contenuto nelle ghiandole salivari è stato rilevato tramite une RT-PCR quantitativa. Questo conferma l’abilità delle specie di di erogare presto particelle infettive virali attraverso la saliva (Dubrulle et al., 2009). Questi risultati supportano I nostri precedenti dati sull’Ae. albopictus (Vazeille et al., 2007, 2008; Moutailler et al., 2009) e dimostrano il probabile ruolo chiave di questa specie come vettore del CHIKV nella provincia di Ravenna durante l’estate del 2007 (Rezza et al., 2007). Fra le specie di zanzara di solito rintracciabili nel nord Italia, Ae. Vexans mostra una bassa suscettibilità al CHIKV. Comunque, data l’elevata densità di popolazione di questa specie in luglio e agosto durante la stagione turistica (Romi et al., 2004), essa può agire come potenziale vettore secondario. Inoltre, An. maculipennis, la quale è largamente rintracciabile durante il periodo estivo, era resistente all’infezione da CHIKV. Questo risultato supporta la nostra precedente conclusione (dati non mostrati), che sostiene che la maggior parte dei Anopheles spp. Sono resistenti al CHIKV. In fine, i due campioni di Cx pipiens sono stati ritenuti resistenti al virus, come lo erano quelli del sud della Francia (Vazeille et al., 2008). Alla dose virale testata (107 PFU/mL), più del 70% dei Ae. albopictus si infetta dopo essersi alimentata con cibo infetto. La carica virale nel paziente può raggiungere 108–9 RNA virale/mL durante I primi 2–4 giorni dopo l’inizio dei sintomi (Parola et al., 2006), permettendo a Ae. albopictus di essere infetti con successo e di trasmettere il virus dopo 2 giorni dall’infezione (Dubrulle et al., 2009). Questo breve ritardo nella trasmissione può aumentare il rischio della diffusione dell’infezione importata fra le Ae. Albopictus locali, come accadde nel 2007 in Italia. Il ruolo di altre speci non può essere dimenticato. Un’attenzione speciale dovrebbe essere data alle Ae. vexans. La recente comparsa di una trasmissione autoctona del CHIKV in Italia ha sollevato la questione circa la persistenza del virus in Italia. Molto probabilmente, in quanto la trasmissione verticale non è stata dimostrata per le Ae. albopictus infettate con CHIKV (Vazeille et al., 2009), la diffusione dell’infezione rimarrà limitata. Comunque, numerosi casi di CHIKV viremia importata sono stati registrati in Europa ogni anno, provenienti da regioni ove il CHIKV è endemico. Perciò, l’Italia, così come altre parti del sud Europa, sono a rischio di infezioni di arbovirus, come la DENV ed il CHIKV, i quali hanno gravi effetti sulla salute pubblica. Dovrebbero essere svolte ulteriori investigazioni riguardanti zanzare provenienti da altre parti d’Italia ed anche da altri paesi europei nei quali la specie Ae. albopictus si è stabilita.

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Articolo pubblicato in lingua inglese sul Medical and Veterinary Entomology (2010) 24, (pagine 83-87) scritto da A. TALBALAGHI (*), S. MOUTAILLER (**), M. VAZEILLE (**) e A.-B. FAILLOUX (**) e qui riproposto nella traduzione italiana. Si ringraziano gli autori per l'autorizzazione alla pubblicazione, sottolineando il carattere puramente scientifico del'informazione divulgata (*) Dipartimento per il controllo delle zanzare di Alessandria, Bologna, Italy (**) Genetique Moleculaire des Bunyavirus, Institut Pasteur, Paris, France Ringraziamenti Ringraziamo Laurence Mousson per l’aiuto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dall’Institut Pasteur, di Parigi. Bibliografia Beltrame, A., Angheben, A., Bisoffi, Z. et al. (2007) Imported chikungunya infection, Italy. Emerging Infectious Diseases, 13, 1264–1266.

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Accettato, 3 dicembre 2009/2010

Medical and Veterinary Entomology (2010) 24, 83–87

Are Aedes albopictus or other mosquito speciesfrom northern Italy competent to sustain newarboviral outbreaks?

A. T A L B A L A G H I1, S. M O U T A I L L E R2, M. V A Z E I L L E2

and A.-B. F A I L L O U X2

1Mosquito Control District of Alessandria, Bologna, Italy and 2Genetique Moleculaire des Bunyavirus, Institut Pasteur,

Paris, France

Abstract. The Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae),native to Southeast Asia, has extended its geographical distribution to invade newtemperate and tropical regions. This species was introduced in 1990 to Italy andhas since become the main pest in urban settings. It was incriminated as a principalvector in the first European outbreak of chikungunya virus (CHIKV) in the provinceof Ravenna (Italy) in 2007. This outbreak was associated with CHIKV E1-226V,efficiently transmitted by Ae. albopictus. The occurrence of this outbreak in a temperatecountry led us to estimate the potential of Ae. albopictus to transmit CHIKV anddengue virus (DENV), and to determine the susceptibility to CHIKV of other mosquitospecies collected in northern Italy. Experimental infections showed that Ae. albopictusexhibited high disseminated infection rates for CHIKV (75.0% in Alessandria; 90.3%in San Lazzaro) and low disseminated infection rates for DENV-2 (14.3% in SanLazzaro; 38.5% in Alessandria). Moreover, Ae. albopictus was able to attain a highlevel of viral replication, with CHIKV detectable in the salivary glands at day 2after infection. In addition, the other three mosquito species, Anopheles maculipennisMeigen, Aedes vexans vexans (Meigen) and Culex pipiens L., showed variablesusceptibilities to infection with CHIKV, of 0%, 7.7% and 0–33%, respectively. Thisinformation on vector competence is crucial in assessing the risk for an outbreak ofCHIKV or DENV in Italy.

Key words. Aedes albopictus, chikungunya, dengue, vector competence, Italy.

Introduction

Since its establishment in Genova in 1990, the Asian tigermosquito, Aedes albopictus (Skuse), has invaded most Italianregions, becoming the major human biting pest (Knudsen et al.,1996). This species was accidentally introduced by trade inused tyres shipped from the U.S.A. (Dalla Pozza et al., 1994).Its high ecological plasticity leads this species to colonizevarious small containers filled with clean fresh water or organicwastes (Romi & Majori, 2008). Moreover, its ability to feedon different hosts favours its rapid establishment in populated,

Correspondence: Anna-Bella Failloux, Genetique Moleculaire des Bunyavirus, Institut Pasteur, 25-28 rue du Dr Roux, F-75724 Cedex 15, Paris,France. Tel.: + 33 1 40 61 36 17; Fax: + 33 1 40 61 31 51; E-mail: [email protected]

as well as in remote, areas (Valerio et al., 2008). Mosquitoadults are mostly observed from February to December andpeak in density during the summer; they contributed in part tothe first European outbreak of chikungunya virus (CHIKV) in2007.

Chikungunya virus is endemic to Africa, Southeast Asiaand the Indian subcontinent, but large CHIKV outbreakswere reported in 2005–2006 in the islands of the IndianOcean (Renault et al., 2007) and the Indian subcontinent(Yergolkar et al., 2006). Travellers returning from areasaffected by CHIKV have been diagnosed in several European

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Fig. 1. Sites of mosquito collections in northern Italy in 2008.

countries (Beltrame et al., 2007). In 2007 a CHIKV outbreakoccurred in northern Italy (Rezza et al., 2007). The indexcase, who had travelled from India in June 2007, developedsymptoms while visiting relatives in a northeastern village.A total of 204 cases were recorded between July andSeptember 2007. The virus was detected in local populationsof Ae. albopictus, confirming the mosquito’s role as amain vector. This situation reflects a convergence of severalfactors favouring the emergence of CHIKV, including: rapidtransportation; successful establishment of exotic mosquitospecies; inadequate mosquito control, and climatic conditions.The high viral loads of patients [e.g. 108–9 RNA copies/mL(Parola et al., 2006)] in an environment highly infestedwith Ae. albopictus allowed the initiation of an inter-humancycle.

The Italian CHIKV strains isolated in 2007 carried a singleamino acid substitution from an alanine to a valine at position226 in the E1 glycoprotein (Rezza et al., 2007; Bordi et al.,2008). This A226V mutation, which was first identified duringthe outbreak in La Reunion Island, favours transmission byAe. albopictus (Tsetsarkin et al., 2007; Vazeille et al., 2007).Thus, this mutant promotes outbreaks in regions from whichthe typical vector, Aedes aegypti (L), is absent.

The spread of Ae. albopictus in other European countries,as well as the increase of imported cases of Aedes-borneviruses such as CHIKV and dengue (DENV), indicates anincrease in the risk for recurrent arboviral outbreaks inwestern countries. Here we report an evaluation of the vectorcompetence for CHIKV and DENV of Ae. albopictus and othermosquito species, Aedes vexans vexans (Meigen), Anophelesmaculipennis Meigen and Culex pipiens L., from northernItaly.

Materials and methods

Mosquitoes

Seven mosquito samples were collected in northern Italyas larvae and eggs (Fig. 1). The F0 females were fed with a10% sucrose solution ad libitum and maintained in insectariesuntil infection. Four species were studied: Ae. albopictus,Ae. vexans, An. maculipennis and Cx pipiens.

Virus

Tests were performed for two viruses, CHIKV and DENV;these represent the two main arboviruses associated withAe. albopictus. The CHIKV strain isolated in November 2005from a patient in La Reunion Island presented an amino acidchange (A226V) in the envelope glycoprotein E1 (Schuffe-necker et al., 2006). This strain is phylogenetically close toisolates from the Italian strain of CHIKV (Bordi et al., 2008;Kumar et al., 2008). The dengue 2 (DENV-2) strain was iso-lated in 1974 from a patient in Thailand (Vazeille-Falcoz et al.,1999). Both viral stocks were produced on Ae. albopictusC6/36 cells and stored at −80◦C.

Oral infection of mosquitoes

Females deprived of sucrose solution 24 h before feedingwere exposed to a bloodmeal composed of 67% washedrabbit erythrocytes and 33% viral suspension. The procedureis described in Vazeille-Falcoz et al. (1999). The bloodmealhad a final titre of 107.0 PFU (plaque-forming units)/mLfor CHIKV and 108.0 MID50 (mosquito infectious doses)/mLfor DENV-2. These titres were selected according to dataobtained from previous experiments (Vazeille-Falcoz et al.,1999; Vazeille et al., 2007). We confirmed that femalemosquitoes ingested an infectious bloodmeal by titrationsperformed on randomly chosen females 1 h after ingestion;all were positive, confirming the ingestion of infectious viralparticles (data not shown). To estimate the disseminatedinfection rate and vector competence, blood-fed females weremaintained at 28◦C for 14 days. Surviving females were killedat −80◦C and beheaded on a slide. CHIKV and DENV antigenswere detected in head squashes by immunofluorescence assay(IFA). Mosquito samples were compared according to thedisseminated infection rate which corresponds to the proportionof females positive by IFA on head squashes among survivingfemales 14 days post-infection (p.i.).

Viral replication in Ae. albopictus

Samples from Alessandria and San Lazzaro were examined.Every 2 days from day 0 to day 14 p.i., five females werekilled and dissected to collect the midgut and the salivaryglands. The midgut controls the entry of the virus into themosquito’s haemocoel, which is followed by the infection ofthe salivary glands. The virus must then be secreted into the

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saliva, in which it is transmitted the next time the mosquitoattempts to feed. Midguts and salivary glands were prepared forRNA extraction using the Nucleospin® RNA II kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany) followed by a one-step quantitativereverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) todetect the number of viral RNA copies. Protocols have beendescribed in detail in Vazeille et al. (2007).

Results

Aedes albopictus from Alessandria and San Lazzaro werehighly susceptible to CHIKV, with high and not significantlydifferent disseminated infection rates (Fisher’s exact test: P =0.19) of 90.3% in San Lazzaro and 75.0% in Alessandria(Table 1). These mosquitoes were less susceptible to DENV-2, with lower and significantly different rates (Fisher’s exacttest: P = 0.01) of 14.3% in San Lazzaro and 38.5% inAlessandria. For the other three species, disseminated infectionrates for CHIKV ranged from 0% to 33.3%. Specimens ofAn. maculipennis and two samples of Cx pipiens (from NoviLigure and Predosa) were not susceptible. Aedes vexans fromBosco Marengo showed a rate of 7.7%.

Figures 2 and 3 present the amount of viral RNA estimatedin midguts and salivary glands of females from Alessandria andSan Lazzaro analysed at different days p.i. For Ae. albopictusfrom Alessandria, the number of viral RNA copies in midgutsincreased from day 0 (105.7 ± 100.1 copies/midgut) to day4 p.i. (107.5 ± 100.4 copies/midgut) and decreased slightlyat day 6 p.i. to 107 ± 100.5 copies/midgut. From day 8 today 14 p.i., the number of viral RNA copies fluctuated ataround 108 copies/midgut. In salivary glands, viral RNA wasdetectable at day 2 p.i. (101.7 ± 100.6 copies/salivary glands)and decreased slowly to reach a minimum at day 6 p.i. (101.3 ±100.5 copies/salivary glands). Subsequently, viral RNA variedfrom 102.2 ± 100.7 copies/salivary glands at day 8 p.i. to 101.3

± 101.2 copies/salivary glands at day 14 p.i.For Ae. albopictus from San Lazzaro, the number of viral

RNA copies in midguts increased from day 0 (105.6 ± 100.2

copies/midgut) to day 2 p.i. (108 ± 100.5 copies/midgut)

Table 1. Disseminated infection rates to chikungunya and dengueviruses of different mosquito species sampled in northern Italy in 2008.

Disseminated infection rate (n)

Species Site CHIKV∗ DENV-2†

Aedes albopictus San Lazzaro 90 (31) 14 (42)Alessandria 75 (32) 38 (65)

Aedes vexans Bosco Marengo 8 (26) –Anopheles

maculipennisOvada 0 (10) –

Culex pipiens Novi Ligure 0 (1) –Predosa 0 (45) –

∗CHIKV at a titre of 107.5 PFU/mL;†DENV-2 at a titre of 108.5 MID50/mL.CHIKV, chikungunya virus; DENV-2, dengue 2 virus; n, number offemales tested; PFU, plaque-forming units; MID50, mosquito infectiousdoses.

Fig. 2. Chikungunya virus replication in midguts of Aedes albopictusfrom Alessandria and San Lazzaro after oral infection.

Fig. 3. Chikungunya virus replication in salivary glands of Aedesalbopictus from Alessandria and San Lazzaro after oral infection.

and fluctuated around 108 copies/midgut until day 14 p.i. Insalivary glands, viral RNA became detectable at day 2 p.i.at 103.4 ± 100.4 copies/salivary glands and fluctuated around103–4 copies/salivary glands. When comparing viral replicationprofiles of midguts, numbers of viral RNA copies according today p.i. were quite similar in females from both Alessandriaand San Lazzaro. By contrast, the number of viral RNA copiesin the salivary glands of females from San Lazzaro was nearlytwice as high as that in glands of females from Alessandria,strengthening the higher disseminated infection rate obtainedat day 14 p.i. for San Lazzaro females (Table 1).

Discussion

We showed that samples of Ae. albopictus from northern Italyare more susceptible to infection with CHIKV than DENV;CHIKV was detectable in the salivary glands from 2 daysafter the ingestion of an infectious bloodmeal. Moreover,a correlation between a high replication level in salivaryglands and a high disseminated infection rate was found forAe. albopictus from Alessandria when infected with CHIKV.In addition, Ae. vexans, An. maculipennis and Cx pipiens,


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which are among the dominant mosquito species in northernItaly, were either not susceptible or were less susceptible toCHIKV.

Aedes albopictus developed a disseminated infection fromday 2 after infection; salivary glands contained viral RNAdetected by quantitative RT-PCR. This confirms the ability ofthe species to deliver early infectious viral particles throughsaliva (Dubrulle et al., 2009). These results support ourprevious data on Ae. albopictus (Vazeille et al., 2007, 2008;Moutailler et al., 2009) and demonstrate the likely key role ofthis species as a vector of CHIKV in the province of Ravennaduring the summer of 2007 (Rezza et al., 2007). Amongmosquito species usually found in the north of Italy, Ae. vexansexhibited a low susceptibility to CHIKV. However, given thevery high densities of this species in July and August duringthe tourist season (Romi et al., 2004), it may act as a potentialsecondary vector. In addition, An. maculipennis, which iswidely found during the summer season, was refractory toCHIKV infection. This result supports our previous findings(data not shown), suggesting that most Anopheles spp. arerefractory to CHIKV. Lastly, the two Cx pipiens samples werefound to be refractory to the virus, as were those from southernFrance (Vazeille et al., 2008).

At the viral dose tested (107 PFU/mL), more than 70%of Ae. albopictus became infected after feeding on theinfectious meal. Viral loads in patients can reach 108–9

viral RNA/mL during the first 2–4 days after the onset ofsymptoms (Parola et al., 2006), allowing Ae. albopictus tobe infected successfully and to transmit 2 days after infection(Dubrulle et al., 2009). This short delay in transmission mayheighten the risk for an imported infection to spread amonglocal Ae. albopictus, as occurred in 2007 in Italy. The roleof the other species cannot be neglected. Special attentionshould be given to Ae. vexans. The recent occurrence of anautochthonous transmission of CHIKV in Italy raises questionsabout the persistence of the virus in Italy. Most probably,because vertical transmission has not been demonstrated forAe. albopictus infected with CHIKV (Vazeille et al., 2009),the spread of infection will remain limited. However, numerouscases of imported CHIKV viraemia are reported each year inEurope from regions in which CHIKV is endemic. Therefore,Italy, as well as other parts of southern Europe, are at risk forinfection with arboviruses, such as DENV and CHIKV, whichhave serious effects on public health. Further investigationsshould be encouraged with mosquitoes from other parts ofItaly and even from other European countries in whichAe. albopictus has become established.

Acknowledgements

We thank Laurence Mousson for technical help. This work wassupported by the Institut Pasteur, Paris.

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Accepted 3 December 2009


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