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IMAGING MASS SPECTROMETRY
m/z 10165
m/z 4554
m/z 4940
Veronica Mainini PhD Biomedical Technologies Post-DOC researcher Clinical Proteomics Unit Dept. Of Health Science Università degli studi di Milano-Bicocca
Mainini V., Angel PM, Magni F., Caprioli RM. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2011 25(1):199-204
IMAGING MASS SPECTROMETRY (IMS)
• Tecnologia che permette di analizzare componenti sia endogeni che esogeni presenti nei tessuti, mantenendo nel contempo la loro orientazione spaziale .
IMS
• Rileva analiti di varia natura
• Analisi condotta direttamente sul campione nativo
• Non necessita di marcatori, purificazioni, etc…
• Fornisce informazioni relative alla distribuzione spaziale
• Combina le informazioni molecolari ottenute mediante MS con informazioni derivanti dalla microscopia ottica.
• Spettrometro (TOF, TOF-TOF, orbitrap, synapt, FT-ICR, Q-TOF...)
• Ionizzazione
• Risoluzione Spaziale
Ø area colpita
• Range di Massa
• Velocità dell’acquisizione Frequenza del laser 200Hz – 2kHz
IMS: quale spettrometro???
MALDI
SIMS
DESI
MALDI
SIMS
DESI
MALDI
SIMS
Proteine, peptidi, lipidi, farmaci
Piccole molecole, elementi
Piccole molecole, lipidi
10 µm -200 µm
100 nm – 10 µm
300 µm - 500 µm
0-30 K m/z– fino 150 K m/z
< 1000 m/z
DESI < 3000 m/z
Ec = ½ mv2
Ec = zeV zeV = ½ mv2 t = L √ m/2zeV v = √ 2zeV/m
m/z 4554
INTENSITY SCALE
0% 100%
m/z 4940
MALDI-TOF Imaging/Profiling
Large Droplets (µL)
Small Droplets (pL)
Uniform Coating (spray)
LOW HIGH SPATIAL RESOLUTION
MATRIX
IMAGING PROFILING
A
B
C
Find discriminatory patterns Proteins/peptides spatial distribution
Wild Type IRF6 -/-
Manuscript in press
3 mm
PROFILING IMAGING
PROFILING RESULTS….
IMAGING RESULTS!
IMS_Tecnologia
Campione:
• Spessore della sezione: 5-20 µm ↑spessore = ↓ conduttività
• Tipologia di campione:
-qualsiasi tipo di cellula o tessuto (cellule da coltura,
colonie batteriche, tessuti, biopsie…)
-tessuti freschi o FFPE
•Degradazione del campione
•Inclusione in polimero OCT (Optimal Cutting Temperature,
polyvinyl alcohol + polyethylene glycol ) o altre resine.
•Lavaggi per eliminare interferenti
con OCT
no OCT
Matrice:
•tipo di matrice:
•Preparazione
della matrice !
4. Ferulic acid [(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)prop-2-enoic acid] has been
recently reported for the detection of high molecular weight proteins on thin tissue
sections.
Matrice:
•Deposito: automatizzato/manuale
Kaletas KB, et al Proteomics 2009; 9 (10):2622-33
AUTOMATED SPOTTING
SHIMADZU ChIP Chemical Inkjet Printer
LABCYTE PORTRAIT 630 Spotter Acustico
VANTAGGI - riproducibilità - buona qualità spettri SVANTAGGI - cristallizzazione della mx - costo elevato - ris. spaziale limitata - tempistiche lunghe
SPRAY MANUALE Ris. Spaziale: 50-150 µm VANTAGGI - Basso costo
- Elevata risoluzione spaziale SVANTAGGI: Scarsa riproducibilità
TLC Sprayer
Airbrush
SPRAY AUTOMATIZZATO Ris. Spaziale: 50µm VANTAGGI: Riproducibile Buona risoluzione spaziale SVANTAGGI: Costo elevato
SUBLIMAZIONE
1_Informazione clinica
2_Dati sperimentali
3_Analisi biocomputazionale
IMS e PROTEOMICA CLINICA
1
3
2
IMS si focalizza sul fenotipo della
patologia
Tecnica veloce ed efficace capace di
valutare una finestra di centinaia di
segnali proteici in un range di massa
molto ampio
Firme proteiche legate alla malattia
primaria
Ricerca di firme molecolari: il
vantaggio combinatoriale
Marcatori diagnostici e target terapeutici
Risposta al trattamento terapeutico
Studio del microambiente della lesione
Biologia dello sviluppo
Imaging Mass Spectrometry (IMS)
Distribuzione spaziale e caratterizzazione in situ di biomarcatori proteici
Distribuzione spaziale di piccole molecole (<1KDa) nel tessuto
Xenobiotici (composti farmaceutici e loro metaboliti, droghe, tossine,..)
Farmacocinetica
Farmacodinamica
IMS = alternativa all’autoradiografia!
No molecole radioattive
Metaboliti
Tissue protein profiling by MS
Tissues comparison:
normal vs disease
m/z 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
In
ten
sity (
arb
. u
.)
MALDI-TOF Profiling –RCC (Renal Cell Carcinoma)
*
*
Spettro medio del normale
Spettro medio RCC
*
*
Normale RCC Spettri Normale : 23
Spettri RCC : 20
* Differenze statisticamente
significative
m/z
In
ten
sit
y (
arb
. u
.)
Normale RCC
9800 10000 10200 10400 10600 10800 11000 11200 11400
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
Normale RCC
P-Value = 0.00335
AR
EA
DE
L P
ICC
O
Spettro medio del normale
Spettro medio RCC
MALDI-TOF Profiling –RCC (Renal Cell Carcinoma)_II
2900 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700 3800 3900
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
40.0
42.5
45.0
47.5
m/z
In
ten
sity (
arb
. u
.)
RCC
RCC
Normale RCC
P-Value = 6.24e-005
Normale RCC
P-Value = 6.24e-005
Normale
Normale
Spettro medio del normale
Spettro medio RCC A
RE
A D
EL
PIC
CO
AR
EA
DE
L P
ICC
O
MALDI-TOF Profiling –RCC (Renal Cell Carcinoma)_III
Applicazioni TUMORE: definizione margini istologici e margini molecolari
Molecular Tumor Margin!
TUMORE ALLO STOMACO
• Non esistono Biomarker diagnostici affidabili
• CEA e CA19-9 non sono sufficientemente sensibili né specifici
• Difficile interpretazione istologica delle lesioni precancerose da quelle di stadio più avanzato.
Histology driven approach !!!
Controls n=43 Patients n=63
CTRL vs DISEASE
PCA
Sensitivity 94% Specificity 96%
SUMMARY
• Histology driven approach allowed to apply profiling analysis in order to:
- detect diagnostic pattern characterizing gastric cancer
- define molecular patterns discriminating intestinal and diffuse histological lesions
- differentiate stage Ia lesions to more advanced lesions (support to prognosis/aid in resolving ambiguous ultrasonography/TAC
Tissue Imaging by MS
MALDI IMS: Applications
Terapia adiuvante preoperatoria condotta con Paclitaxel + radioterapia: - Pazienti con risposta completa (pCR) - Pazienti che non rispondono alla terapia (NR)
α-defensine: peptidi ad effetto citotossico coinvolti nel processo di difesa mediato dai neutrofili
POTENZIALI MARKER PROGNOSTICI – RISPOSTA AL TRATTAMENTO
OLANZAPINA: 2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-tieno[2,3-b][1,5] benzodiazepina, utilizzata per il trattamento di schizofrenia e disturbi bipolari.
OLANZAPINE m/z 256 N-desmethyl m/z 256 2-hydroximethyl m/z 272
2h
OLANZAPINE m/z 256 N-desmethyl m/z 256 2-hydroximethyl m/z 272
6h
PDZ = primary decidual zone SDZ = secondary decidual zone
M= mesometrial pole AM= antimesometrial pole
Distribuzione di sfingomieline e fosfatidilcoline durante lo sviluppo embrionale
Distribuzione di lisofosfatidilinositolo, fosfatidilinositolo, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerolo e fosfatidilserina
durante lo sviluppo embrionale
SUMMARY OF APPLICATIONS
• Normale vs Tumorale
• Definizione dei margini tumorali
• Diagnosi e prognosi di lesioni tumorali: presenza/assenza della lesione, grado della lesione, caratterizzazione istotipo
• Risposta al trattamento
• Farmacocinetica e farmacodinamica
• Lipidomica e proteomica per la definizione di pathways cellulari rilevanti in specifici processi patologici
PROFILING
IMAGING
LIMITI e PROSPETTIVE
Sensibilità: aumentare il numero e la varietà dei composti osservabili
Identificazione: metodi più semplici, veloci ed efficaci ad elevata
risoluzione/ proteomica top down
Risoluzione spaziale: laser; ionizzazione (SIMS, DESI)
Validazione: nuovi software biostatistici
Quantificazione
Integrazione dati: correlazione con altre tecniche di imaging (es:PET,
MRI) e complementazione con metodologie tradizionali (es:shotgun, 2DE)
IMPROVING SENSITIVITY
MALDI IMS:
LIVER
No detergent
0.05% TRITON X-100 matrix
0.05% SDS matrix
BRAIN
No detergent
0.05% TRITON X-100 matrix
0.05% SDS matrix
HEART
No detergent
0.05% TRITON X-100 matrix
0.05% SDS matrix
m/z 4554
NO DETERGENT MATRIX
SDS MATRIX
m/z 4940
m/z 8956
INTENSITY SCALE
0% 100%
NO DETERGENT MATRIX
TRITON X-100 MATRIX
m/z 10165
m/z 11083
m/z 14004
INTENSITY SCALE
0% 100%
NEW TECHNOLOGIES
&
ADVANCED APPROACHES
Imaging Mass Spectrometry:
Anna C. Crecelius et Al. Three-Dimensional Visualization of Protein Expression in Mouse Brain Structures Using Imaging
Mass Spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry, Volume 16, Issue 7, 2005, 1093-1099
MBP 8 MBP 5
Unident.
Prot.
MALDI imaging_ visualizzazione 3D
Andersson M, Groseclose MR, Deutch AY, Caprioli RM. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume
reconstruction. Nat Methods. 2008 Jan;5(1):101-8.
Immagini 2D - Localizzazione di proteine in specifiche
regioni istologiche
TUMOR STRIATUM
NORMALE
HISTONE H4 TUMORE
GB protein γ7 STRIATUM
Cyt c OXase
polypeptide VIIc
NORMALE
es:
Immagini 3D
Piano colorato
Piano nero
MRI
IMS
proteine
- Ricostruzione 3D (IMS + imm. Ottiche)
- Correlazione immagini in 3D
(MRI + IMS + imm. Ottiche)
MALDI imaging:
visualizzazione 3D e RMI
Tatiana C. Rohner, Dieter Staab, Markus Stoeckli.
MALDI mass spectrometric imaging of biological
tissue sections. Mechanisms of Ageing and
Development 126 (2005) 177–185
1. Molecular Scanner Approach
2. Digestione proteolitica in situ
M. Reid Groseclose, Malin
Andersson, William M. Hardesty and
Richard M. Caprioli. Identification
of proteins directly from tissue: in
situ tryptic digestions coupled
with imaging mass spectrometry.
J. Mass Spectrom. 2007; 42: 254–
262
IDENTIFICAZIONE PROTEINE – sequenziamento su sezioni tissutali
* Peptidi di siero
amiloide A
Spettro MS/MS del
peptide a 1550 m/z
Spettro MS
IMS con digestione triptica in situ su sezione
conservata in formaldeide del 1899 di milza di paziente
malato di amiloidosi
IMS di materiale archiviato: tessuti FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded)
rimozione della paraffina e
digestione triptica in situ
Principale metodo di
conservazione e stoccaggio
MALDI-IMS
Vaste librerie correlate a dati
clinici accurati
diagnosi
prognosi
progressione della malattia
trattamento terapeutico
1550 m/z
LIPIDOMICA: FT-ICR e Ion Mobility
Specie molecolari isobare
Strumenti ad elevata risoluzione
(FT-ICR: R=1 x 106)
LIP
IDI
in R
EN
E m
uri
no
ΔMW=0.061Da
Specie difficilmente frazionabili
Separazione per
mobilità ionica
oltre che per
tempo di volo
IMAGING LIPIDI
PR
OF
ILIN
G L
IPID
I
Nello stesso
campione lipidi
distinti da altre
piccole molecole
con stessa massa
nominale
BIBLIOGRAFIA – REVIEWS & BOOKS -
• Mass Spectrometry Imaging Principles and Protocols Rubakhin SS, Sweedler JV .Methods in Molecular Biology 656 Humana Press
• Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chughtai K, Heeren RM. Chem Rev. 2010 May 12;110(5):3237-77. Review.
• Imaging of intact tissue sections: moving beyond the microscope. Seeley EH, Schwamborn K, Caprioli RM. J Biol Chem. 2011 Jul 22;286(29):25459-66.
• MALDI imaging mass spectrometry of human tissue: method challenges and clinical perspectives. Seeley EH, Caprioli RM. Trends Biotechnol. 2011 Mar;29(3):136-43
• MALDI imaging mass spectrometry--painting molecular pictures. Schwamborn K, Caprioli RM. Mol Oncol. 2010 Dec;4(6):529-38.
• Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Schwamborn K, Caprioli RM. Nat Rev Cancer. 2010 Sep;10(9):639-46.
• Imaging mass spectrometry: viewing the future. Schwartz SA, Caprioli RM. Methods Mol Biol. 2010;656:3-19.
BIBLIOGRAFIA – APPLICATIONS 1 - • Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal
carcinoma. Oppenheimer SR, Mi D, Sanders ME, Caprioli RM. J Proteome Res. 2010 May 7;9(5):2182-90.
• Gastric cancer-specific protein profile identified using endoscopic biopsy samples via MALDI mass spectrometry. Kim HK, Reyzer ML, Choi IJ, Kim CG, Kim HS, Oshima A, Chertov O, Colantonio S, Fisher RJ, Allen JL, Caprioli RM, Green JE. J Proteome Res. 2010 Aug 6;9(8):4123-30. Erratum in: J Proteome Res. 2011 Jan 7;10(1):361.
• Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation Bauer JA, Chakravarthy BA, Rosenbluth JM et al. Clin Canc Res 2010; 16:681-690
• Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by imaging MALDI mass spectrometry. Khatib-Shahidi S, Andersson M, Herman JL, Gillespie TA, Caprioli RM. Anal Chem. 2006 Sep 15;78(18):6448-56.
• Spatial and temporal alterations of phospholipids determined by mass spectrometry during mouse embryo implantation. Burnum KE, Cornett DS, Puolitaival SM, Milne SB, Myers DS, Tranguch S, Brown HA, Dey SK, Caprioli RM. J Lipid Res. 2009 Nov;50(11):2290-8.
• 3D Imaging by Mass Spectrometry: a new frontier Seeley EH, Caprioli RM Anal Chem 2012 Mar 6;84(5):2105-10.
BIBLIOGRAFIA – APPLICATIONS 2 -
•Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume proteomics Andersson M. Groseclose MR, Deutch AY, Caprioli RM Nat Meth vol 5, n.1 Jan2008; 101-108 • MALDI Imaging and Profiling Mass Spectrometry in Neuroproteomics. Andersson M, Andren P, Caprioli RM. In: Alzate O, editor. europroteomics. Boca Raton (FL): CRC Press; 2010. Chapter 7. • Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Casadonte R, Caprioli RM. Nat Protoc. 2011 Oct 13;6(11):1695-709. •Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections Seeley EH, Oppenheimer SR, Deming M, Chaurand P, Caprioli RM J Am Soc Mass Spec 2008; 19(8): 1069-1077. • Detergent enhancement of on-tissue protein analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry Mainini V, Angel PM, Magni F, Caprioli RM Rapid Comm Mass Spec 2011; 25: 199-204. • Detection of high molecular weight proteins by MALDI imaging mass spectrometry Mainini V, Bovo G, Chinello C, Gianazza E, Grasso M, Cattoretti G, Magni F. • Multiplex target protein imaging in tissue sections by mass spectrometry – TAMSIM Thiery G, Schepinov MS, Southern EM, et al RCM 2007; 21:823-829. • Tag-Mass: specific molecular imaging of transcriptome and proteome by mass spectrometry based on photocleavable tag. Lemaire R et al. J Prot Res 2007; 6(6):2057-2067. • Improvements of Targeted multiplex mass spectrometry Imaging. Thiery G, Anselmi E etal Proteomics 2008; 8:3725-3734
