III. BAHAN DAN METODE

3.1 WAKTU DAN TEMPAT

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai dengan Juli

2011, bertempat di Laboratorium Pangan Pusat Pengujian Obat dan

Makanan Nasional Badan POM RI, Jalan Percetakan Negara No. 23

Jakarta.

3.2 ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat

KCKT yang terdiri dari pompa (Shimadzu, Jepang), detektor ultraviolet

(Shimadzu, Jepang), detektor fluoresens (Shimadzu, Jepang), auto sampler

(Shimadzu, Jepang), kolom C18 dengan panjang 250 mm, diameter 4,6 mm

ukuran partikel 5,0 µm (Waters Xbridge, USA dan Shimadzu Shim-pack,

Jepang), penyaring 0,2 µm (Millipore), penyaring 0,45 µm (Millipore),

ultrasonik (Branson, USA), seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis

(Shimadzu, Jepang), timbangan analitik (Precisa, Switzerland) dan peralatan

gelas.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut (fase

gerak) berderajat KCKT yaitu metanol (Merck, Jerman), asetonitril (JT

Beaker, USA) dan air demineral. Pereaksi dan pelarut organik berkualitas

pro analis: butil hidroksi toluena (Merck, Jerman), n-pentana (Merck,

Jerman), 2-propanol (Merck, Jerman), tetra-n-butil ammonium hidroksida

0,1 M dalam 2-propanol (Merck, Jerman). Bahan baku pembanding yaitu:

vitamin A palmitat 1700000 IU/g (BASF, Jerman), butil hidroksi anisol

(BPFI, Indonesia), butil hidroksi toluena (BPFI, Indonesia), propil galat

(BPFI, Indonesia), tersier butil hidro kinon (BPFI, Indonesia), vitamin D

(BASF, Jerman), vitamin E (BASF, Jerman), beta karoten (BASF, Jerman),

sampel minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A dan

beberapa merek minyak goreng sawit yang mengandung vitamin A.

3.1

3.3.3.3.33333.33.3.3.33333.33.3.3333333.3333.33.3...33333333.33333333.....3.22222

28

3.3 METODE PENELITIAN

Penelitian ini merupakan percobaan laboratorium yang terdiri dari (3)

tiga tahap. Penelitian tahap I merupakan penelitian pemilihan kondisi

optimum (komposisi fase gerak, laju alir dan detektor) yang akan digunakan

dalam penetapan kadar vitamin A menggunakan KCKT. Parameter yang

dievaluasi meliputi: bentuk kromatogram, waktu retensi (Rt), resolusi (Rs),

jumlah lempeng teoritis (N) dan tailing faktor (Tf).

Penelitian tahap II merupakan validasi metode analisis penetapan

kadar vitamin A menggunakan KCKT. Parameter validasi yang akan

dilakukan adalah: kurva baku dan linieritas, presisi, akurasi, selektivitas,

robustness, batas deteksi dan batas kuantisasi metode.

Penelitian tahap III merupakan uji coba metode analisis yang telah

dikembangkan dan telah divalidasi untuk analisis vitamin A dalam minyak

goreng sawit yang beredar di pasaran. Parameter yang diuji adalah penga-

matan kromatogram dan penetapan kadar vitamin A.

3.3.1 Penetapan Aktivitas Baku Vitamin A

Aktivitas baku vitamin A ditetapkan sesuai metode Farmakope

Inggris (2009), yaitu dengan cara menimbang dengan saksama sejum-

lah baku vitamin A palmitat, dilarutkan dengan n-pentana dan diencer-

kan dengan 2-propanol hingga konsentrasinya 10 -15 IU/mL. Pengu-

kuran absorbansi dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis

pada panjang gelombang maksimum (326 nm), aktivitas baku vitamin

A dalam satuan unit internasional (IU) per gram dihitung dengan

rumus:

A26 = absorbansi pada panjang gelombang 326 nmV = total volume pengenceran untuk mendapatkan kadar 10-15

IU/mL1900 = faktor untuk mengkonversi absorbansi spesifik ester retinol

menjadi menjadi IU per gramm = bobot substansi yang di uji (dalam gram).

3.3 MMME

tiga

opt

dal

die

jujujuujujujuujujjjujujujujujujujujujjuujujujujuujujjujujujujujuujujujujjujujjujujujujujujjujujujujjuujuujjuuuuujujuuuuujujuuujujjjjuuuuuujuuuujujjjujjjjujjuuuujujj mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

kakakakakkakakakakkkakakakakakakakkakakkkakakakakakakkkkkkkkakakakkkkakkakakkkkakkkkkaakaakkkkakkkkakakakkaaakaakkaaaaaaaakkaaaakkakakaaakkakakkkkakakakkkakakaaakakakkkkkkkkkkaaakkakkkkkkaaaaaakakkkkkkkaaakkaaad

didididididiididiididididididdiddddiidddidididididididddidididiiididdddididddiiiiidddddddddiiiiidiiiiidiiiiiiiidddddiiddiidiiddiddiidddddddiidddddiid lallll

rorororororororororororoororororrorroooroooooooooororororooooooororooooorooorooorooooroooororrooooorrroroooroooooooorrooooorooorrooorrrrooorrrroorr bbbbbbbb

dididiiddididididddddddddidididididiididdddiddiidididididddiddiiddiiidiiididdddidiididididdddididiiddiddddddidddddididddddidiidddddidiidididddidddiiiidddiddiiiididdidiididddiddddidddiidididdiiddidididddiiddddiiidiididddddddddddidididididdidddiiikkkkk

gogogogogogogogogogogogogogogggogogogogoggggoggoogogogogogogoooooogogoooogoggggoggogooogoogggoggogoogoggggoooggggoooggoogooooogggogogooogoggoogggogogoogggoogog r

mamamamamammammammmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmammmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmammmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

3.3.3.3.3.3.3.3.333.3333.33.333.33.333.33.3.3.3.33.3.3.3.3333333...3.3.33.333333333.3333333.333333.333333.333.3333...3.333333333.3333.333.33.333333333333333333333333333333333333333333

29

3.3.2 Penetapan kondisi optimum KCKT

Larutan baku vitamin A yang akan disuntikkan ke dalam

sistem KCKT disiapkan sesuai metode Farmakope Inggris (2009).

Metode ini digunakan untuk penetapan kadar vitamin A dalam bentuk

baku atau konsentrat vitamin A, sehingga untuk penetapan kadar

vitamin A dalam minyak goreng sawit oleh peneliti dilakukan modifi-

asi, yaitu penambahan matriks minyak goreng sawit, perubahan

konsentrasi baku yang digunakan dan pada proses penyiapan sampel

tanpa pemanasan larutan uji.

Larutan dianalisis menggunakan KCKT dengan berbagai

kondisi percobaan seperti pada Tabel 6 dan analisis untuk setiap

kondisi percobaan dilakukan masing-masing dengan 3 kali pengu-

angan. Kromatogram yang dihasilkan dievaluasi dengan cara mencatat

atau menghitung: waktu retensi (Rt), resolusi (Rs), jumlah lempeng

teoritis (N) dan faktor ikutan atau tailing faktor (Tf) untuk masing-

masing hasil pada berbagai kondisi percobaan. Kondisi percobaan

memenuhi kriteria apabila: waktu retensi (Rt) < 15 menit; resolusi (Rs)

> 1,5; jumlah lempeng teoritis (N) > 3000 dan faktor ikutan atau

tailing faktor (Tf) mendekati 1. Untuk mempermudah dalam mengam-

bil keputusan pada pemilihan kondisi optimum, maka setiap parameter

kromatogram diberi nilai skor antara 1 - 3. Penentuan nilai skor untuk

penilaian kromatogram dapat dilihat pada Tabel 7.

Dari hasil tersebut kemudian ditentukan jumlah skor tertinggi

yang merupakan kondisi optimum dan selanjutnya digunakan pada

penelitian selanjutnya.

30

31

Tabe

l 6. K

ondi

si p

aram

eter

KC

KT

untu

k op

timas

i met

ode

Kon

disi

Para

met

er T

etap

Para

met

er B

erub

ah1

Kol

om C

18;

fase

ger

ak m

etan

ol; d

etek

tor U

V 3

25 n

mLa

ju a

lir: 0

,6; 0

,8 d

an 1

,0 m

L/m

enit

2K

olom

C 1

8; fa

se g

erak

met

anol

; det

ekto

r flu

ores

ens p

anja

ng

gelo

mba

ng e

ksita

si 32

5 nm

dan

pan

jang

gel

omba

ng e

mis

i 470

nm

.

Laju

alir

: 0,6

; 0,8

dan

1,0

mL/

men

it

3K

olom

C 1

8; fa

se g

erak

met

anol

dan

air;

laju

alir

1,5

mL/

men

it;

dete

ktor

UV

325

nm

Perb

andi

ng k

ompo

sisi

fase

ger

ak m

etan

ol

dan

air (

97,5

:2,5

; 95:

5; 9

0:10

; dan

85:

15)

4K

olom

C 1

8; fa

se g

erak

met

anol

dan

air;

laju

alir

1,5

mL/

men

it;

dete

ktor

fluo

rese

ns p

anja

ng g

elom

bang

eks

itasi

325

nm d

an

panj

ang

gelo

mba

ng e

mis

i 470

nm

.

Perb

andi

ng k

ompo

sisi

fase

ger

ak m

etan

ol

dan

air (

97,5

:2,5

; 95:

5; 9

0:10

; dan

85:

15)

5K

olom

C 1

8; fa

se g

erak

ase

toni

tril d

an m

etan

ol; l

aju

alir

1,0

mL/

men

it; d

etek

tor U

V 3

25nm

Perb

andi

ng k

ompo

sisi

fase

ger

ak m

etan

ol

dan

air (

75:2

5;50

:50;

dan

25:

75)

6K

olom

C 1

8; fa

se g

erak

ase

toni

tril d

an m

etan

ol; l

aju

alir

1,0

mL/

men

it; d

etek

tor f

luor

esen

s pan

jang

gel

omba

ng e

ksita

si 32

5 nm

dan

pan

jang

gel

omba

ng e

mis

i 470

nm

.

Perb

andi

ng k

ompo

sisi

fase

ger

ak m

etan

ol

dan

air (

75:2

5; 5

0:50

; dan

25:

75)

7K

olom

C 1

8; fa

se g

erak

ase

toni

tril d

an a

ir; la

ju a

lir 1

,5m

L/m

enit;

de

tekt

or U

V 3

25 n

mPe

rban

ding

kom

posi

si fa

se g

erak

ase

toni

tril

dan

air (

100:

0; 9

5:5;

90:

10; 8

5:15

; 80:

20

dan

75:2

5).

8K

olom

C 1

8; fa

se g

erak

ase

toni

tril d

an a

ir; la

ju a

lir 1

,5m

L/m

enit;

de

tekt

or fl

uore

sens

pan

jang

gel

omba

ng e

ksita

si 3

25 n

m d

an

panj

ang

ge-lo

mba

ng e

mis

i 470

nm

.

Perb

andi

ng k

ompo

sisi

fase

ger

ak a

seto

nitr

il da

n ai

r (10

0:0;

95:

5; 9

0:10

; 85:

15; 8

0:20

da

n 75

:25)

9K

olom

C 1

8; fa

se g

erak

ase

toni

tril d

an a

ir; la

ju a

lir

1,75

mL/

men

it; d

etek

tor U

V 3

25 n

mPe

rban

ding

kom

posi

si fa

se g

erak

ase

toni

tril

dan

air (

100:

0; 9

5:5;

90:

10; 8

5:15

; 80:

20

dan

75:2

5)10

Kol

om C

18;

fase

ger

ak a

seto

nitri

l dan

air;

laju

alir

1,

75m

L/m

enit;

det

ekto

r flu

ores

ens p

anja

ng g

elom

bang

eks

itasi

32

5 nm

dan

pan

jang

gel

omba

ng e

mis

i 470

nm

.

Perb

andi

ng k

ompo

sisi

fase

ger

ak a

seto

nitr

il da

n ai

r (10

0:0;

95:

5; 9

0:10

; 85:

15; 8

0:20

da

n 75

:25)

32

Tabe

l 7. P

enen

tuan

skor

unt

uk p

enila

ian

krom

atog

ram

Skor

Peng

amat

anR

tR

sN

Tf1

���

���

��

�

����

����

� �

�����

����

���

2>

10 d

an <

15

> 1,

5 da

n <

2,5

���

��

����

��

>

0,75

ata

u <

1,25

3�

� ��

��

���

33

3.3.3 Uji kesesuaian sistem (UKS)

Uji kesesuaian sistem dilakukan sesuai metode Farmakope

Indonesia (1995) dengan cara menyuntikkan salah satu larutan baku seri

ke dalam sistem KCKT minimal 5 kali pengulangan. Kondisi KCKT

sesuai prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi, kemudian dihitung %

RSD dari waktu retensi dan luas area dari vitamin A. SD dan RSD

dihitung dengan menggunakan rumus:

UKS diterima bila memenuhi kriteria apabila % RSD dari waktu retensi

dan luas area dari vitamin A kurang atau sama dengan 1.

3.3.4 Pembuatan kurva baku dan uji linieritas

Untuk pembuatan kurva baku dan uji linieritas, sebelumnya dibuat

larutan baku seri vitamin A dengan konsentrasi 0,5– 4 IU/mL. Larutan

baku dibuat dengan cara menimbang dan memasukkan 2,5 g minyak

goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A dan 2,5 mL n-pentana ke

dalam labu takar berwarna coklat 25 mL lalu dikocok sehingga minyak

goreng sawit larut, kemudian ditambahkan baku vitamin A dengan cara

memipet 0,5–7,0 mL larutan baku vitamin A 50 IU/mL dan dimasukkan

ke dalamnya. Selanjutnya dilakukan perlakuan yang sama seperti pada

pembuatan larutan larutan uji pada penetapan kondisi optimum KCKT.

Larutan baku seri disuntikan ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur yang

telah dipilih pada uji optimasi dan masing-masing larutan baku seri

disuntikan dengan 3 kali pengulangan, kemudian dibuat kurva antara

konsentrasi analit yang berbeda-beda (x) terhadap respon instrumen atau

luas area (y) dan dikaji secara visual, apakah linier atau tidak. Selanjutnya

ditetapkan kurva linier: y = bx + a, dimana a adalah intersept (perpotongan

dengan garis dengan sumbu y) dan b adalah slope (kemiringan garis

regresi), kelinieran kurva ditentukan dengan cara menghitung koefesien

korelasi (r) dan standar deviasi relatif regresi linier (Vxo). Linieritas

3.3

3.3.3.33333333333333.3.3333333333.333.3333.33333333.3333.3.33.3.33333333333.3.333.33333333333333333333333333333.33333333333333333333333333333.3333333.333333333333333333.3333.333

34

diterima apabila nilai r > 0,995 dan Vxo �. Untuk menentukan nilai a,

b, r dan Vxo digunakan rumus sebagai berikut:

Selanjutnya dibuat kurva konsentrasi versus faktor respon detektor

dan kurva konsentrasi versus residual. Faktor respon detektor dihitung

dengan menggunakan rumus:

Residual dihitung menggunakan rumus:

Residual = (Y^ - Y)

Y^ = Luas area vitamin A secara teoritis (dari persamaan garis regresi).

Y = Luas area vitamin A yang diamati.

Masing-masing kurva tersebut diamati secara visual, jika terjadi

penyebaran titik-titik secara random antara konsentrasi vitamin A dengan

faktor respon detektor dan konsentrasi vitamin A dengan residual yang

mendekati garis tengah menunjukkan linieritas yang baik.

d

b

d

d

R

YYYYY

YYYYYY

ppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppp

ffaff

mmmm

35

3.4.5 Uji presisi

Untuk pembuatan larutan uji presisi, sebelumnya disiapkan terlebih

dahulu sampel minyak goreng sawit yang mengandung vitamin A dengan

3 tingkat konsentrasi yang berbeda yaitu: kadar rendah 22,5 IU/g, kadar

menengah 45 IU/g dan kadar tinggi 67,5 IU/g. Masing-masing sampel

tersebut ditimbang dengan saksama sejumlah 2,5 gram, dimasukkan ke

dalam labu takar berwarna coklat 25 mL, kemudian ditambahkan 2,5 mL

n-pentana, lalu dikocok sehingga minyak goreng sawit larut. Selanjutnya

dilakukan perlakuan yang sama seperti pada pembuatan larutan larutan uji

pada penetapan kondisi optimum KCKT. Uji presisi dilakukan dengan

cara menyuntikkan larutan uji ke dalam sistem KCKT menggunakan

prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi. Masing-masing sampel

dengan 3 tingkat konsentrasi yang berbeda dianalisis sebanyak 6 kali

pengulangan. Perhitungan kadar sampel dilakukan menggunakan

persamaan kurva kalibrasi dengan menggunakan rumus:

Kemudian kadar dari masing-masing uji presisi dihitung dan

ditentukan nilai rata-ratanya, standar deviasi (SD) dan standar deviasi

relatif (RSD). Presisi diterima bila memenuhi kriteria: untuk satu penguji

(repeatabilitas): % RSD sampel �������������� !"�#������ntuk intralab

(intra reprodubilitas): % RSD sampel � ��������� !"�#$��� D Horwitz

dihitung menggunakan rumus:

3.4.6 Uji akurasi

Untuk pembuatan larutan uji akurasi, digunakan sampel minyak

goreng sawit yang sama pada uji presisi. Masing-masing sampel minyak

goreng tersebut ditimbang dengan saksama sejumlah 1,25 gram,

dimasukkan ke dalam labu takar coklat 25 mL, kemudian ditambahkan 2,5

mL n-pentana, lalu dikocok sehingga minyak goreng sawit larut. Untuk

akurasi pada tingkat kadar rendah ditambahkan baku vitamin A 50 IU/mL

3.4

333.3.3333.3.3.33.3.3.3.3.33.3.33.3.33.3.3333.33333.3333.33.333333333.33.33.3.333.33.333.3.3.33.3.3.3.3.3.3333.3333.3333.333333333 44444

36

sebanyak 0,6 mL, untuk tingkat kadar menengah 1,2 mL dan untuk akurasi

tingkat kadar tinggi ditambahkan 1,8 mL. Selanjutnya dilakukan perlakuan

yang sama seperti pada pembuatan larutan larutan uji pada penetapan

kondisi optimum KCKT. Uji akurasi dilakukan dengan cara menyuntikkan

larutan uji ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur penetapan kadar yang

telah ditentukan dari hasil uji optimasi. Masing-masing sampel dengan 3

tingkat konsentrasi yang berbeda dianalisis sebanyak 6 kali pengulangan.

Berdasarkan luas area yang didapat, dengan menggunakan kurva kalibrasi

baku selanjutnya dihitung jumlah total vitamin A, vitamin A dari sampel

dan rekoveri vitamin A. Akurasi metode dinyatakan sebagai % rekoveri

yang dihitung dengan menggunakan rumus:

Akurasi diterima bila memenuhi kriteria: rekoveri yang diperoleh pada

rentang 80–110 %

3.4.7 Uji selektivitas (spesifisitas)

Larutan untuk uji selektivitas dibuat dengan cara menimbang dengan

saksama sejumlah 2,5 gram sampel minyak goreng sawit yang sama pada

uji presisi (mengandung vitamin A dengan konsentrasi 45 IU/g), kemudian

dimasukkan ke dalam labu takar coklat 25 mL, ditambahkan 2,5 mL n-

pentana lalu dikocok sehingga minyak goreng sawit larut, ditambahkan 2,5

mL larutan butil hidroksi toluena 0,25 % dalam 2-propanol, 1 mL

campuran larutan butil hidroksi anisol (BHA), butil hidroksi toluena

(BHT), propil galat, tersier butil hidrokuinon (TBHQ), vitamin D dan

vitamin E masing-masing 1000 ppm serta beta karoten 100 ppm dalam 2-

propanol dan 10 mL larutan tetra-n-butil amonium hidroksisida 0,1 M

dalam 2-propanol, kemudian larutan diencerkan dengan 2-propanol hingga

tanda tera, lalu dikocok hingga homogen. Kemudian larutan disaring

menggunakan membran filter 0,2 µm dan dilakukan sonifikasi selama 10

menit. Uji selektivitas (spesifisitas) dilakukan dengan cara menyuntikkan

larutan ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur yang telah dipilih pada uji

s

ti

y

k

la

te

titititititititittititttitiitiittititititittitittititttititttitittititiitttttttttittttittttttttttttttttttttttttttt

BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB

bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb

ddddd

yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy

AAAAAAAAAA

rrrrerrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr

3.4.777 UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU

s

u

d

p

m

ccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccc

((B(((

vvvvvv

pppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppp

ddddddd

ttattt

mmmm

mmmmmm

lalalalalalllllllllllllllllllllllllllllllllal

37

optimasi. Uji selektivitas (spesifisitas) dilakukan sebanyak 6 kali

pengulangan. Perhitungan kadar dilakukan menggunakan kurva kalibrasi,

kadar rata-rata dan SD dari masing-masing uji selektivitas (spesifisitas)

dihitung. Dengan menggunakan uji t, dibandingkan kadar rata-rata dan SD

yang diperoleh dari uji selektivitas (spesifisitas) dengan kadar rata-rata dan

SD yang diperoleh dari perhitungan presisi. Selektivitas (spesifisitas)

diterima apabila nilai yang diperoleh dari perhitungan uji t seperti di atas

memberikan hasil yang tidak berbeda bermakna.

3.4.8 Uji robustness

Larutan untuk uji selektivitas dibuat dengan cara menimbang dengan

saksama sejumlah 2,5 gram sampel minyak goreng sawit yang sama pada

uji presisi (mengandung vitamin A dengan konsentrasi 45 IU/g).

Selanjutnya dilakukan perlakuan yang sama seperti pada pembuatan

larutan uji pada presisi. Uji robustness dilakukan dengan cara

menyuntikkan larutan uji ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur yang

telah dipilih pada uji optimasi, namun pada metode tersebut dilakukan

sedikit perubahan kecil seperti: perubahan penambahan atau pengurangan

jumlah pereaksi yang digunakan, perubahan komposisi fase gerak,

perubahan laju alir, dan perubahan merek kolom. Pada penelitian ini, uji

dilakukan dengan cara melakukan sedikit perubahan pada:

1. Pengurangan jumlah pereaksi n-pentana 2 mL, larutan antioksidan

butil hidroksi toluena 2 mL dan larutan tetra-n-butil amonium

hidroksida 9,5 mL

2. Penambahan jumlah pereaksi n-pentana 3 mL, larutan antioksidan butil

hidroksi toluena 3 mL dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida

10,5 mL

3. Perubahan komposisi fase gerak menjadi asetonitril : air (81:19) dan

laju alir 1,74 mL/menit.

4. Perubahan komposisi fase gerak menjadi asetonitri : air (79:21) dan

laju alir 1,76 mL/menit.

3.3.3.3.3.3.3.33.3333333333.3333.33333333.3.33333..3...3.33333333333333333333 444

38

5. Perubahan penggunakan merek kolom yang berbeda: kolom C 18

panjang 250 mm, diameter dalam 4,6 mm dan ukuran partikel 5 �m

(Shimadzu Shim-pack, Jepang).

Masing-masing perubahan kondisi pada uji robutsness dilakukan

sebanyak 6 kali pengulangan. Perhitungan kadar dilakukan menggunakan

kurva kalibrasi, kadar rata-rata dan SD dari masing-masing uji dihitung.

Dengan menggunakan uji t, dibandingkan kadar rata-rata dan SD yang

diperoleh dari uji robustness dengan kadar rata-rata dan SD yang diperoleh

dari perhitungan presisi. Uji robustness diterima apabila nilai yang

diperoleh dari perhitungan uji t seperti di atas memberikan hasil yang tidak

berbeda bermakna.

3.4.9 Uji batas deteksi dan batas kuantisasi

Untuk pembuatan larutan untuk penentuan uji batas deteksi dan batas

kuantisasi, sebelumnya disiapkan terlebih dahulu sampel minyak goreng

sawit yang mengandung vitamin A dengan 7 tingkat konsentrasi yang

berbeda yaitu: kadar 0,5 IU/g, 0,625 IU/g, 1 IU/g, 1,25 IU/g, 2,5 IU/g, 5

IU/g dan 10 IU/g. Penyiapan larutan uji dilakukan dengan cara dilakukan

perlakuan yang sama seperti pada pembuatan larutan uji pada presisi. Uji

penentuan batas deteksi (LOD) dan batas kuantisasi (LOQ) dilakukan

dengan cara menyuntikkan larutan uji ke dalam sistem KCKT sesuai

prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi. Kromatogram yang

diperoleh dianalisis dengan membuat data kadar spike yang berbeda-beda

(X), tinggi noise (N), tinggi sinyal atau puncak (S) dan perbandingkan

sinyal dengan noise (S/N). Kemudian dibuat kurva hubungan antara

konsentrasi spike (X) terhadap respon S/N (Y) dan dibuat persamaan garis

regresi kurva linier: y = bx + a. Berdasarkan kurva linier tersebut,

kemudian dihitung nilai LOD dan LOQ dengan menggunakan rumus:

LOD = harga nilai X pada S/N = 3, sedangkan nilai LOQ = harga nilai X

pada S/N = 10

5

s

k

DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD

ddddddddddddddddddddddd

ddddddddddddddddddddddd

dddddd

bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb

3.4.9999 UUUUUUUUUUUUUUUUU

kkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk

sssssssssss

bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb

IUIII

p

p

d

p

d

(X

ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss

kkkkkk

rerrrr

kkkkkkkkkkk

LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL

ppppppppppppppppppppppppppppppppp

39

3.4.10 Penetapan kadar vitamin A pada minyak goreng sawit yang beredar

di pasaran

Untuk penetapan kadar vitamin A pada minyak goreng sawit yang

beredar di pasaran, sebelumnya dilakukan pembelian sampel beberapa

merek minyak goreng sawit yang pada labelnya mengklaim akan

kandungan vitamin A. Penyiapan larutan uji dilakukan dengan cara

dilakukan perlakuan yang sama seperti pada pembuatan larutan uji pada

presisi. Masing-masing sampel dilakukan pengulangan pengujian minimal

2 kali. Masing-masing larutan uji tersebut kemudian disuntikkan ke dalam

sistem KCKT sesuai prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi.

Kromatogram yang dihasilkan diamati dan perhitungan kadar vitamin A

dilakukan menggunakan kurva kalibrasi.

3.4