サi:コこコi:コン研究

ISamineResearch

なる可能性を求めて

編 集

グルコサミン研究会

長 岡 功

中 村 洋

野 村 義 宏

南 三 郎

Iucosamine

Qlucosamine

Qlucosamine

グルコサミン研

(ど

賓宰淑青草裟

- 一 一 _ 一 一 一

∴ ~ ~~ ∴ ~ --- --:I

; . ; . ､ ～: ､. ･ ､･ ､

高齢社会を迎え,QOL低下の一因となる一次性変形性関節症が問題となっている｡ 現荏,変形 性

関節症の療病緩和を目的に,グルコサ ミン含有の健康食品を利用する人が増えている｡しかし,グル

コサミンの関節軟骨への作用メカニズムは不明な点が多い｡そこでわれわ れ は , グルコサミンとグル

コサ ミン含有健康食品の原材料であるキチンおよびキチン やキ トサン誘導体紫 を 含 むグルコサミン紫

似糖が,軟骨細胞株ATDC5に与える影響を検討し,これらの搾用メカニズムについて解明すること

を目的に研究を実施 した｡

ATD C 5をグルコサミン塩酸塩あるいは,グルコサミン幸似糖存在下で培拳 し,これらの物質の軟

骨細胞 の 増殖 ｡分似 二与える影響を調べた｡増殖はMTT活性,分化はアルが )フォスフアタ-ゼ活

性を指 標 に検討 した｡その結果,ダルコ-ス,N-アセチルグルコサ ミン,キ トビオ←ス,キ トサン

ダイマ- , ラク ト-ス,ラタ トサミン,N-アセチルラク トサミンは,Å耶〕C5の増殖や分化に影響を

与えなかった.一方,グルコサミン塩酸塩はATDC5の増殖に影響を与えなかったが,jWDC5の分

化を抑制 した｡

次に,グルコサミン塩酸塩がATDC5の基質産生および石灰化に影響を与えるかどうかを,アルシ

アンプjL,- (pH2.5およびpHl｡0)染色およびアリザリンレッド染色の手法を掛 1て検討した｡そ

の結果,グルコサミン塩酸塩を添加 したjWDC5の石灰イ飢ま,顕著に抑制されていた.さらに,グル

コサ ミン塩酸塩は硫酸基をもつグリコサ ミノグリカンの産生を誘導 したや また,グルコサミン塩酸塩

添加によるATDC5の遺伝子発現パタ-ンを,済yPC民法を用いて解析 した.その結果,グルコサミ

ン塩酸塩は,転写因子であるSmad2,Smawd逢および軟骨特異的基質蛋白質のmatr主ⅩGlapTOteまn

(Map)の mRNA発現を抑制した｡

以上の結果より,グルコサミン塩酸塩は軟骨組織の石灰化を抑制し,コンドロイチン硫酸の産生を

促進する可能性が考えられた.グルコサミン塩酸塩の石灰化抑制メカニズムは,転写因子であるSmad

2,Smad4のmRF挽発現を調節することにより,MGPなどの軟骨基質遺伝子の発現を介して石灰化

を抑制している可能性が考えられた｡

グ)L/コサミン研究2:8-14,2006

一･ I･ヾ

グルコサミン,ATDC5,軟骨 ,グ リコサ ミノ グ リ カン.Slllad

生活の乱れ,疾病および 薬 物 の 影 響 , メカニカルスト

レスなど,さまざまな要因で 変 形 性 関 節症を発症 した

軟骨組織の弾力,隆および圧縮抵抗性は, 軟 骨 細胞お 軟骨組織は,軟骨細胞間基質が 減 少 し , 軟骨の異所石

よび軟骨細胞間基質により維持されている｡加齢,食 灰化を起こしている卜3).近年,変 形 性 関節症 (oA)

l)城西大学薬学部医療栄養学科 〒350-0295埼玉県坂戸市けやき台 ト1h一mano@josaLacJ'p

グルコサミン研究 VoL2 2006 9

の療病緩和を目的として,ヒアルロン酸やコン ドロイ

チン硫酸などの構成糖であるグルコサ ミンが経口摂取

されている4)サヒア)i,ロン酸は,N-アセチルグルコサ

ミンとグルクロン酸が交互に結合 してできた直鎖状の

高分子多糖である5),コン ドロイチン硫酸は , ガラク

トサ ミンとグルクロン酸を構成糖 とし,アグ リカンの

側鎖 として軟骨組織 に存在 している6)｡グル コサ ミン

摂取による変形性関節症の症状改善効果は臨床 レベル

では報菖 されているが,詳 しい摩周メカニズムは現状

では不明である7,8)｡また,グルコサ ミン含有健康食品

揺,キチン加水分解物が利用 されているが,N-アセ

チルグルコサ ミンを含むグルコサ ミン類似糖の有効性

は 検討 されていない,

内軟骨性骨化は,軟骨細胞が間葉系幹細胞から分 化

し,軟骨細胞の増殖 ･成熟 ｡肥大化の過程 を 経 て , 骨

に置換 される骨の形成過程である9)｡その際 夕 関 節 軟

骨や肋軟骨など,一部の組織は骨に置換せず軟骨 の ま

ま維持 される.軟骨碓指の詳 しいメカニズムは不明な

点が多いが,さまざまな転写因子によって軟骨および

骨の形成過程は調節を受けており,これ らを介 して,

細胞間基質などの産生が調節 され軟骨の分化 ｡増殖が

制御 されている10,ll)｡軟骨が石灰化する前段階で,ア

ルカリフォスファタ-ゼ (A二ぼ)活性が上昇すること

が必須であると考 えられてお り,成熟 した軟骨細胞

揺 , ヒアルロン酸やコン ドロイチン硫酸などのグ リコ

サ ミノグ リカンを産生 し,軟骨細胞の性質を維持する

役割を絶っている12･13)

軟骨細胞間基質 と し て よく知 られてい る ⅠⅠ型 コラ

-ゲン (Coi≧)は,軟骨 特 異的コラ-ゲ ン で , 軟骨

形成過程の増殖軟骨細胞期および肥大化軟 骨 細 胞期の

細胞間基質に存在し,石灰化軟骨細胞期 お よ び 骨形成

の過程では消失することが報告 されているま4)｡matr反

Glap1-Ote主n (MGP)は,軟骨細胞 間基質蛋 白質の一

つで,血管内皮細胞の動脈硬化部においても観察され

ていることから,石灰化に深 く関 与 する蛋白質の一つ

で あ る と 考 え ら れ て い る15･16)らboneG旦aprotein

(BGP)は骨特異的基質蛋白質で,軟骨形成および骨

形成過程の進行に伴い増加 し,骨基質 を 維 持 す るため

に重要な蛋白質であると考えられている17)｡

軟骨細胞の増殖 中分化 を制御する増殖因 子は,bone

:･, = ･ ･ ･∴ 一 ･ll･:･ _

growthfactoT β (T G FlB ) がよく知 られている18)｡こ

れら披,細胞 膜 に 存 在 す るレセプタ-に結合後 , 転写

因子のSmad 群 を リ ン 酸 化 し ,軟骨特異的遺伝子の発

現を調節する19)卓 Sm ad 2 は き 骨形成園子の-つであ

るTG斉しβの下流に存在 し,軟骨の分化を促進する転

写因子の一つ と考 えられている19,20).また,Smad2は

Sox9や Rullx2などとへテロ二量体を形成すること

により,Sox9や 鮎 nx2の下流 に存在する軟 骨特異

的遺伝子の発現を調節すると考えられている19)｡smad

･‖まT)ン酸化され た Smad2やSlllad3とへ テ ロ 二量

体を形威し,さまざまな転写因子と相互摩周 す る こと

によって,軟骨の分化 を 制 御 し ていると考 え ら れ てい

る19B21).sox9は Soxfam 豆Iy に 属 する転写因子の 一つ

管,間葉系幹細胞か ら軟 骨 細 胞 への分化の誘導と,肥

大化軟骨細胞への分化の 抑 制 を 調節する軟骨特異的転

写因子 と考 え られている19,22,23)｡鮎nxlは肥大化軟骨

に発現 し,内 軟 骨 性骨化に 必 要な転写因子の一つと考

えられてい る19,24)｡一方,鮎nx2は成熟軟骨に発 現

し,骨細胞への置換に必要な骨特異的転写因子の一つ

と考えられている19725t26)

今回われわれ は.培養軟骨細胞株ATDC5を用い

て,グル コサ ミン塩酸塩およびグ)i,コサ ミン葦似 糖

が,軟骨細胞の増殖 ｡分化に与える影響を比較 し,グ

ルコサ ミン塩酸塩およびグルコサ ミン類似糖が,軟骨

細胞外基質の構成糖 としてのみではなく,軟骨細胞の

増殖および分化に影響 を与える可能性を検討 した｡さ

らに.ブルコサ ミンが軟骨組織維持に及ぼす メカニズ

ム解明のため,軟骨細胞外基質蛋白質および転写園子

のlllRNA発現について検討 した.

培養軟骨細胞株 は,mouseteratocarcinomaceiiAT

Li05由来の亜棟であるATDC5細胞を用いた uiIKEN

CeiiBankNo｡RCB0565)27)｡ATDC5の 培 地 は,Du1 -becco'smod道edEagle'S培 地 とHam'sF12培 地 の

1:1混合培地 (hvitrogen)に,5% ウシ胎児血清

(FBS昌nvitTOgen),100ti互/miペ ニ シ リン,50pl/mi

ス トレプ トマ イシ ンを添 加 し用 い た.ArrDC5は

37℃,5%C0 2の条件 で培養 した.継代 は0書25% ト

リプ シ ン0｡02%EDTA溶 液 (S呈gmaA故豆ch)を 用

い,2-3日ごとに行った｡

グルコサ ミン塩酸塩およびグルコサ ミン類似糖が軟

骨細胞の分化に与える影響を調べるために,通常培地

(N),グ )i,コ - ス (GまC),グ ル コ サ ミ ン塩 酸 塩

(GkN)タN-アセチルグル コサ ミン (GkNAc),キ ト

サ ンダイマ- (G呈cN)2,キ トビオ -メ (G互cNAc)2,

70

ラク ト-ス (GaトGIc),ラク トサ ミン (Ga卜GlcN),

N-アセチルラク トサ ミン (Ga卜GまcNAc)をそれぞれ

最終濃度で1jlg/miになるように培地率に添加 した｡

I:I~ . ･ ･､一･:･'1.

アルカリフォスフアタ-ゼ (ALP)染色液は0｡05

S' ･R..･･~ ･､ l･ ･:･S ･･.I; ち･ ･I

'-･･.1■J;i --_････ i- .● !､･! ･･. ･･!:

(Sigma)を使用 したB細胞は,96穴細胞培養庸マイ

クロテス トプ レ- トを用い,約 5×103個ずつ播種

し,GkNおよびグルコサ ミン類似糖を添加後,5日

間培牽 した｡培養後,細胞 を20% ホルマ リンで固定

し,ALP染色液を履いて37oCインキュベ-夕内で 15

分反応させ,水洗 した｡染色霧栄は,画像解析ソフ ト

N損弓mageを用いて数値化した.

~;.-I: ･t .′･..∴

AicまanBiue8GX (Fika)を0｡5M 酢酸 (pH2｡5)め

るいは0.1M塩酸 (pHl中0)に溶解 し,1% アルシア

ンプル -溶液 (ABp欝2｡5)ならびに (ABp塁上0)

を作製 した｡各アルシアンプル-溶液は用時漆過し,

使用 した.細胞は24穴細胞培養FHマ イクロテストプ

レ- 卜を用い,約 2さ5XiO4個ずつ播種 し,GkNおよ

-I.II I ･-I.I/.:

びグルコサミン類似糖を添加後,35日間培養 した｡

培養期間中,3日ごとに培地交換を行ったす35日間培

養後,20% ホルマリンで固定 した｡固定 した細胞

揺,アルシアンブル-染色液を室温で-晩反応させ,

水洗 した｡染色結果は,画像分析 ソフ トNiH弓mage

を招いて数億化した｡

､ ∴ ● ､ I .

アリザ リンし,ソド染色は,AlizarinRe(lSilel･tilled

(S短ma)と28% アンモニア水を履いて i% アリザ

リンレッ ド溶液 (pH6.38)を調製 し,染色に用い

た. 細胞は2逢穴細胞培養摺マイクロテス トプレ- ド

を 掩 い ,約 2｡5×104個ずつ播種 し,G呈cNおよびグ)i/

コサ ミン葦似糖を添加後,35日間培養 したB培養期

間中,3日ごとに培地交換 を行 った｡35日間培養

後,20% ホルマリンで固定 したp染色は,2恒量水 洗

後,アリザリンレッド染色液と室温で10分間反 応 さ

せ,水洗 し,石灰化を評価 した｡染色結果は, 画 像 分

析ソフ トNI冨Iimageを柳 1て数値 した｡

一 一-∴ '.

ATDC5を6cmシャ-レを用いて,約 5×105倦 げ

っ播種 し,GlcNおよびグル コサ ミン類似糖 を添加

･′∴/-∴/;. :///:/:////://///://://://:; /////

Smad2 5'-CCCACTCCATTCCAGAAAAC-3+ 58 25

3'-AACACCAGAATGCAGGTTCC-5ー - 一 ■ ■

Smad4 5'-CGTGCTTACCCACTGAAGGA-3' 58 25

3十一GCTGGCTGAGCAGTAAATCC-5'

SoX9 5㌧TGCAGCACAAGAAAGACCAC-3. 58 30

3'-CCCTCTCGCTTCAGATCAAC-5'

Runx1 5㌧ACTTCCTCTGCTCCGTGCTA-3' 58 25

3㌧GGTCGTTGAATCTCGCTACC-5' ー I ■ ■

Runx2 5十-ATGGTGGAGATCATCGCGGACCACCCGGCC-3' 58 28

3†-ACACCTACTCTCATACTGGGATGAGGAATG-5ー ■ 一 ■ 一 ■ ■

Co!2 5十一GTCGAGCAGCAAGAGCAAGGA-3' 58 28

3㌧CTTGCCCCACTTACCAGTGTC-5' ■ - ■ ■ ■

MGP 5'-ATGAAGAGCCTGCTCCCTC†-3' 58 22

3'-CTAATATTTGGCTCCTCGGC-5ー t I ■ ■

後,3日間培養 した.RNAはTrwoIReagent(hvitr0-

gen)を用い抽出した.抽出したRNAはDPC処理水

に溶解後,分光光度計を用い定量 した.cDNAは,常

法に従い1〝gのRNAから,逆転写酵素反応法で合成

した.PCRは常法に従い表1のプライマーを用いて

行った.

LL G 果

il書芸孟孟宗 慧 芸SAT,9",JiB].譜 がALP活性 を比較 した結果,本実験で用いたGIcN

は,グ)i,コサ ミン類 似 糖 で あ るGIc.GIcNAc.

(GIcN)2,(GIcNAc)2.Gal-GIc,Gal-GIcN,Gal-GIcNAc

と比較してALP活性を抑制 した (図1A).染色結果

杏,画像分析ソフ トNTH-imageを用いて数値化 した

結果,GIcNは,ネガティブコントロールであるGIc

と比較 しALP活性は約 1/3に減少 した (図18),こ

の結果から,GIcNは軟骨細胞の分化を顕著に抑制す

一軒通常培地 グルコース グルコサミン塩蛍塩

GIcN

■ J r 竃 IN-アセチルクルコサミン キトサンタイマー キトビオース

GIcNAc (GIcN)2 (GIcNAc),

ラクトース ラクトサミン N-アセチルラクトサミンGaトGIc Gal-GIcN Gal-GIcNAc

グルコサミン研究 Vo12 2006 77

ると考えられた.一方,グルコサ ミン禁似糖である

GIcNAc,(GIcN)2,(GIcNAc)2,Gal-GIc,GaトGIcN,

Gal-GIcNAcは,ATDC5のALP活性に影響を与えな

かった.また,結果には示さないが,グルコサミン塩

酸塩およびグルコサミン類似槍の添加は,本実額条件

においてMTTアッセイによるATDCの細胞増殖能に

影響を与えなかった.

2F

グルコサ ミン塩酸塩が軟骨細胞株 ATDC5

の石灰化に与える影響

GIcNはAJT)C5のALP活性 を顕著に抑制 したた

め.GIcNがATT)C5の石灰化に与える影響を検討 し

た ATDC5の石灰化は,アリザリンレッド染色を用

いて比較 した.その若紫.GIcNは,ネガティブコン

トロール (GIG)と比較 して,石灰化を著 しく抑制 し

た (図2).

B

打

N･アセチルラクトサ三ン

ラクトサミン

ラクトース

キトビオース

N･アセチルグルコサミン

キトサンタイマー

クルコサFlJン塩酸壕

グルコース

通常培地

図1 グルコサミン塩酸塩およびグルコサミン類似糖が,培養軟骨細胞株 ATDC5の分化に与える影響

B

l }

N GIc

(LrSIP%)E2aje

6u

ruLetspaJuuE)ZIEEZa^lle)aJ

『 過約

40

30

20

10

0囲2 グルコサミン塩酸塩が培養軟骨細胞株ATDC5の石灰化に与える影響

72

31

AB(pH25)(総グリコサミノグリカン)

A8(PHIO)(流転基特異的グリコサミノグリカン)

(LLSLP%)

e

aje

6

∈一uJ一elS

(s

NH

d

)an一q

Ue一〇一e

aNleleJ

N GIc GIcN

(oLHd)an

一qUt313一Pa^I

tPla｣

図3 グルコサミン塩酸塩が培養軟骨細胞株ATDC5のクリコサミノグリカン産生に与える影響

グルコサミン塩酸塩が軟骨細胞株 ATDC5のグリコサミノグリカン産生に与える影響

アルシアンブルー染色 (pH2.5)を用いて,総グ

リコサミノグリカンの産生を検討した結果,GIcNは

GIcと比較し,総グリコサミノグリカンの産生を抑制

した (図3).この結果は,石灰化およびALP活性の

結果と類似 していた.一方,アルシアンプル-染色

(pHl.0)の枯宋,総グリコサミノグリカンの染色と

異なり,GIcNは硫酸基特異的グリコサミノグリカン

の産生を促進した (図3).

4I

グルコサミン塩酸塩が軟骨細胞基質遺伝子群

の mRNA発現に与える影響

RT-PCR法を用いて,軟骨培養細胞ATDC5におけるGIcNが軟骨細胞基質遺伝子のmRNA発現に与え

た影響を図4に示 した.その結果,ColZmRNAと

BGPの発現量は.GIcNとGIcで顕著な差がなかった

が,MGPmRNA量は,GIcNによってGIcの約2/3

長に減少した,

51グルコサミン塩酸塩が転写因子群の mRNA発現に与える影響

RトPCR法を用いて.軟骨培賛細胞ATDC5においてGIcNが軟骨特異的転写因子群のmRNA発現正に

与える影響を図5に示 した.その結果.Smad2と

Smad4のmRNA量が,GIcNによってGIcの約2/3

に減少 した.それに対 して,Runxl,RunxZ,Sox9

のmRNAはGIcNの影響を受けなかった

lⅢ･考 察

本実験の結果,GIcNは,その他のグルコサミン架

BGP

ma

^一SUOIU〓

e

UE)一SO^-一IZLE)J

MGP厄

a

^一SUalU二eU6IsaN)

e

leJ

･∵8NSuaL⊆teu61Sa^r)

t2一aJ N GIc GtcN N GIc GIcN N GIc GIcN図4 グルコサミン塩酸塩が培養軟骨細胞株ATDC5の軟骨基質蛋白質mRNA発現)に与える影響

グルコサミン研究 VoL2 2006 73

rrĵ!(I,.uatU!JeuB!sâ膏PJ

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2

5

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0

0

Run大1

N NCGLJG

NGfcGZcN

図5グルコサミン塩酸塩が培養軟骨細胞株ATDC5の軟骨特異的転写因子mRNA発現量に与える影響

似糖 と比較 して,ATDC5の慮腰活性 を低下 させ る

ことが判明 した.G旦cNは,jWDC5のALP活性を抑

制したことから,軟骨細胞の分化調節に関与 している

可能性が考えられた｡一方,G且cNにみ られた軟骨分

･ ･･･. -l ~1･ . 叩.:･一･' -

似二糖類では観察 されなかった｡

.､. I･ ･● .‖∴.:l'､･;l: ･･㍉

の増殖 には影響 を与えなかったBしたがって,GicN

は,本実験で便周 した濃度では,ATDC5に細胞毒性

を与えないと考えられた¢

弘之cNによる分化調節作用がATDC5の石灰化に影

響を与えているかについて検討 した結果,ATDC5に

おいて,G旦C紺は,顕著に石灰化 を抑制することが明

らかとなった｡さらに,G旦cNが,総グ リコサ ミノグ

リカン産生および硫酸基 をもつグ リコサ ミノグ リカン

の産生に影響を与えるかどうかについて検討 した結

乳 GkNは,硫酸基 をもつ グ リコサ ミノグ リカンの

産生を誘導す ることが判明した｡

幣骨の代表的なグ リコサ ミノグ リカンには,ヒアル

ロン酸およびアグ リカンの 傍日銀であるコン ドロイチ ン

硫酸やケラタン硫酸がある12㌔今回の結果から,GkN

はヒアル ロン酸ではなく,コン ドロイチ ン硫酸やケラ

タン硫酸の産生調節を介 して,石灰化 を抑制 している

河能性が考 えられたp

そこで,石灰化抑制およびコンドロイチン硫酸 かケ

ラタン硫酸産生誘導に関与する遺伝子を検討 した｡そ

の結異.GlcNがh･,lGPlllRNAの発現を抑制 したこと

か ら,GicNは軟骨細胞のMGP遺伝子発現 を介 し

て,石灰化を抑制 した可能性が考えられた¢さらに ,

コン ドロイチン硫酸 やケラタン硫酸の産生を誘導 した

GまcNは,Smad2とSma銅 mRNAの発現量を減少 さ

せた.Sl11ad2は T CTF.βL]71く一流に存在する転写国子と

して知 られている18)¢また,Smad2は,Sox9および

毘unx2と結合 し,軟骨の分化過程を調節 している可

能性が報告されている19-20㌧ 以上のことより,GまcNの

石灰化抑制作用は,Smad2の発現調節を介 し,Smad

2が関与す るSOX9および 鮎 nx2の遺伝子発現制御

を通 して,最終的にその下流の MGPや軟骨基質蛋白

質の発現 を制御 している可能性が考 えられた中

本実験の結果から,GicNは ,軟 骨細胞の石灰化を

抑制する可能性が示唆された.そしり作剛 葦楢は.軒与:

国子であるSllladZや Smadい り111RNA 発現 ,を調節す

ることにより,MGPおよびコ ン ドロイチ ン硫酸産生

に関わる遺伝子など,軟骨特異的遺伝子の発現を調節

している可能性が考えられた.さらにGIcNによる

jYTDC5石灰化抑制作糟は,GicNAcお よびグ)i,コサ

ミン矧廿二糖類では得られない可能性が考えられた.

本実朕はATr)L15をf削 たゝ iTli.7'tj.()石r天化ア ､リセ イ

74

系を開いて実験 を行った.今後.['JlZlit:Oの動物実験

系やヒトでの有効性を検討することが必要であると考

える.

∴参考文献

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2006年 9月i5日発行

編集 ･発行者 グルコサ ミン研究会

会 長 黒滞 尚

編集委員 長岡 功

中村 洋

野村義宏

南 三郎

事務局 〒1i3-8421 東京都文京区本郷2｣｣

順天堂大学医学部整形外科学教室 内

TEL 03-3813-3111(鰭) 錯濫 03T38ま3-3428

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