1

Original Research Article  

Identification of pivotal cellular factors involved in HPV‐induced dysplastic and neoplastic cervical pathologies† 

 Stefano Mattarocci1$, Claudia Abbruzzese2$, Anna M. Mileo2, Mariantonia Carosi3, Edoardo Pescarmona3, Carmen Vico2, Antonio Federico2, Enrico Vizza4, Giacomo Corrado4, Ivan Arisi5 

Armando Felsani6 and Marco G. Paggi2*  1 Department of Molecular Biology, University of Geneva, 30, quai Ernest‐Ansermet, 1211 Geneva, Switzerland. 

2 Department. of Development of Therapeutic Programs, Regina Elena National Cancer Institute, Via E. Chianesi, 53, 00144 Rome, Italy. 

3 Department of Pathology, Regina Elena National Cancer Institute, Via E. Chianesi, 53, 00144 Rome, Italy 

4 Department of Gynecology, Regina Elena National Cancer Institute, Via E. Chianesi, 53, 00144 Rome, Italy 

5 Genomics Facility, European Brain Research Institute (EBRI) “Rita Levi‐Montalcini”, Via Fosso di Fiorano, 64, 00143 Rome, Italy 

6 CNR, Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare, Via Fosso di Fiorano, 64, 00143 Rome, Italy 

 $ These authors contributed equally to this work  Running head:  Genes involved in cervical dysplasia and cancer Keywords:    HPV, Cervical Dysplasia, Cervical Cancer, Viral Oncogenesis  Contract grant sponsors: This work was supported by grants from Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) (www.airc.it) and Ministero della Salute (www.ministerosalute.it) grants to M.G.P., from Ministero dell’Università dell’Istruzione e della Ricerca (www.miur.it) (FIRB No. RBAP10L8TY) and Fondazione Roma to I.A. and grant CNR “Medicina Personalizzata” to A.F.  * Corresponding author: Marco G. Paggi, MD, PhD Regina Elena National Cancer Institute, Via Elio Chianesi, 53, 00144 Rome, Italy Tel.: +39‐06‐5266.2550 ‐ Fax: +39‐06‐8928.2762 Email: paggi@ifo.it  †This article has been accepted for publication and undergone full peer review but has not been through the copyediting, typesetting, pagination and proofreading process, which may lead to differences between this version and the Version of Record. Please cite this article as doi: [10.1002/jcp.24465] Additional Supporting Information may be found in the online version of this article.

Received 18 July 2013; Revised 20 August 2013; Accepted 29 August 2013 Journal of Cellular Physiology © 2013 Wiley Periodicals, Inc.

DOI 10 .1002 / j cp .24465   

2

Abs t rac t  Cervical carcinoma represents the paradigm of virus‐induced cancers, where virtually all 

cervical cancers come  from previous “high‐risk” HPV  infection. The persistent expression of  the 

HPV viral oncoproteins E6 and E7  is  responsible  for  the  reprogramming of  fundamental cellular 

functions  in the host cell, thus generating a noticeable, yet only partially explored,  imbalance  in 

protein molecular networks and cell signaling pathways. Eighty‐eight cellular factors, identified as 

HPV direct or surrogate targets, were chosen and monitored  in a retrospective analysis for their 

mRNA expression in HPV‐induced cervical lesions, from dysplasia to cancer. Real‐time quantitative 

PCR  (qPCR) was performed by using  formalin‐fixed, paraffin embedded  archival  samples. Gene 

expression analysis identified 40 genes significantly modulated in LSIL, HSIL and squamous cervical 

carcinoma.  Interestingly,  among  these,  the  expression  level  of  a  panel  of  four  genes,  TOP2A, 

CTNNB1, PFKM and GSN, was able to distinguish between normal tissues and cervical carcinomas. 

Immunohistochemistry was also done to assess protein expression of two genes among those up‐

regulated during the transition between dysplasia and carcinoma, namely E2F1 and CDC25A, and 

their correlation with clinical parameters. Besides the possibility of significantly enhancing the use 

of some of these factors in diagnostic or prognostic procedures, these data clearly outline specific 

pathways, and thus key biological processes, altered  in cervical dysplasia and carcinoma. Deeper 

insight  on  how  these  molecular  mechanisms  work  may  help  widen  the  spectrum  of  novel 

innovative approaches to these virus‐induced cell pathologies. 

3

I n t roduc t i on  

Infection from different pathogens is recognized as a major cause of cancer (zur Hausen, 

2009;de Martel C. et al, 2012). Among these infectious agents, the body of knowledge concerning 

the role of “high‐risk” Human Papillomavirus (HPV) strains, mainly HPV 16 and HPV 18, in cervical 

cancer appears large and consistent. Over the last few years, cervical cancer incidence and death 

rates are falling, mainly due to the access to reliable screening procedures which facilitate early 

diagnosis and treatment (Siegel et al, 2013). While HPV vaccines represent a promising preventive 

approach towards HPV infection and related neoplastic diseases, their therapeutic effectiveness is 

yet to be proven. Despite ongoing massive anti‐HPV vaccination campaigns, a significant number 

of  cancers are  still expected  to occur mainly  in developing countries due  to cultural and  socio‐

economic  reasons and  to  the potential selection of high‐risk HPV strains not neutralized by  the 

vaccines. 

HPV‐induced  tumors  usually  arise  several  years  after  viral  infection,  displaying  the 

integration  of  the  viral  genome  into  cancer  cell  chromosomes,  which  allows  the  stabilized 

expression of  the E6  and E7 oncogenes  and of  the  respective protein products,  the E6 and E7 

oncoproteins. These are  the major effectors of HPV‐driven  cell  transformation and appear also 

central  for  cancer  cell  clones  maintenance  and  proliferation  by  acting  via  several  molecular 

mechanisms  able  to  weaken  normal  cell  cycle  control  and  modulate  the  cellular  apoptotic 

response  (Fehrmann  and  Laimins,  2003;Munger  et  al,  2004;Whiteside  et  al,  2008;McLaughlin‐

Drubin and Munger, 2009;Bellacchio and Paggi, 2013). Interestingly, E6 and E7 from high‐risk HPV 

strains are void of any enzymatic activity, but display the peculiarity to generate specific protein‐

protein  interactions  through which  they  are  able  to  reprogram  fundamental  cellular  functions. 

Nowadays, the most investigated cellular targets of E6 and E7 are the p53 and the Retinoblastoma 

(RB)  family proteins, respectively  (Helt and Galloway, 2003;Felsani et al, 2006).  In several cases, 

4

the endogenous factors targeted by the small DNA virus oncoproteins undergo dramatic changes 

also in their cellular amount, due to direct effects on the protein or to transcriptional interference 

(Munger et al, 2001;Helt and Galloway, 2003;Felsani et al, 2006;Mileo et al, 2013). 

In HPV‐induced pathologies of the uterine cervix, the discovery of sensitive and specific 

biomarkers differentially expressed  in non‐progressive and progressive diseases might efficiently 

integrate the current procedures for risk assessment and inform therapeutic decisions. 

The  purpose  of  our  study  was  to  identify  pivotal  factors  involved  in  dysplastic  and 

neoplastic  cervical  pathologies,  in  order  to  gain  information  on  the  molecular  processes 

implicated  in  these HPV‐induced  processes.  Therefore, we  selected  a  series  of  cellular  factors 

whose amount appears modulated in HPV‐related cervical pathologies plus others chosen through 

experimental data generated in our laboratory. We then performed an extensive quantitative PCR 

(qPCR) analysis by monitoring a supervised set of 88 cellular genes possibly  involved  in cervical 

dysplastic and neoplastic diseases. Our samples consisted of a set of 127 formalin‐fixed paraffin‐

embedded  (FFPE)  archival  cervical  samples,  including  control  cases,  Low‐grade  Squamous 

Intraepithelial Lesions (LSIL), High‐grade Squamous Intraepithelial Lesions (HSIL) and carcinomas. 

The expression of a subset of genes was found significantly different  in the various categories of 

cervical  samples,  thus  some  of  these  genes  have  been  selected  as  potential  indicators  for 

transition from dysplasia to cancer. For two of these genes, specifically E2F1 and CDC25A, analysis 

of  their  protein  product was  evaluated  via  immunohistochemistry  (IHC)  in  squamous  cervical 

carcinoma samples. 

Our  results  can  significantly  promote  the  use  of  some  of  these  factors  in 

diagnostic/prognostic procedures by  identifying a panel of genes/proteins whose expression can 

be  correlated with known  clinical parameters.  It  is  crucial  to direct new  investigative efforts  to 

improve  our  knowledge  and  understanding  on  the  molecular  mechanisms  behind  HPV 

5

infection/transformation  in  order  to widen  the  spectrum  of  novel  and  innovative  approaches 

against virus‐induced pathologies. 

 

6

Mate r i a l s  and  Methods  

Pat i en t s  

Tissues  from 127  cervical  surgical  specimens  [Control  (normal  cervical epithelium  from 

patients who underwent hysterectomy for reasons other than cancer) (22 cases), LSIL (35 cases), 

HSIL (27 cases), Cervical Cancer (43 cases)] were evaluated. All the patients were diagnosed and 

treated  at  the  Regina  Elena  National  Cancer  Institute,  Rome,  Italy.  Patients  underwent 

international  standard  therapeutic  protocols. Clinical data  (patient diagnosis  and  staging) were 

obtained  from  the  Regina  Elena  National  Cancer  Institute  databases.  Samples were  collected 

according to the current institutional ethical guidelines. 

RNA   ex t rac t i on   and   quant i ta t i ve   gene   exp re s s i on   ana l y s i s   i n  arch i va l   samp le s  

Total RNA extraction  from  formalin‐fixed, paraffin‐embedded  (FFPE) cervical  specimens 

was done as described (Abbruzzese et al, 2012). Total RNA was checked for quality and quantified 

using the 2100 bioanalizer (Agilent, Santa Clara, CA). RNA samples, even with a low RNA integrity 

number  (RIN),  were  retrotranscribed  using  the  High  Capacity  cDNA  Reverse  Transcription  Kit 

(Applied  Biosystems,  Branchburg, NJ).  Each  sample was  then  analyzed  by  qPCR  using  custom‐

made microfluidic  cards  (Applied  Biosystems)  containing  sequence  specific  primer  pairs  for  88 

genes to be examined and for 6 endogenous control genes   (Table S1, Supplementary Material). 

The  cards were  processed  as  indicated  by  the manufacturer  using  the  7900HT  thermal  cycler 

apparatus equipped with the SDS software version 2.3 (Applied Biosystems) for data collection. 

Hi s to log i ca l  examina t i on  and   IHC  

The  histological  diagnosis  was  re‐evaluated  in  2‐μm  FFPE  sections  after  routine 

laboratory haematoxylin/eosin staining. 

IHC  analysis  was  performed  as  described  (Mattarocci  et  al,  2009)  after  an  antigen 

retrieval  step,  treating  slides  in microwave oven at 800 W  for 15 min  x 2  in 300 ml of 10 mM 

7

citrate buffer, pH 6.0.Immunostaining was carried out by using a primary monoclonal antibody for 

Cdc25a (sc‐56264, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA), applied overnight (ON) at room 

temperature (RT) at a 1:50 dilution. E2F1 was detected via a mouse monoclonal antibody (sc‐251, 

Santa  Cruz  Biotechnology)  applied  ON  at  RT  at  a  1:20  dilution.  For  both  antibodies,  optimal 

working  dilution  was  defined  on  the  basis  of  titration  experiments.  The  secondary  antibody 

solution and streptavidin‐biotin, both from the AFN600‐IFU kit (ScyTek, Logan, UT), were applied 

according to the manufacturer’s instructions. Finally, 3‐amino‐9‐ethylcarbazide (AEC substrate kit, 

ScyTek, Logan, UT) was used as the final chromogen. Mayer’s haematoxylin was used for nuclear 

counterstaining. Negative controls for each tissue section were prepared by omitting the primary 

antibody. 

To  increase  the  number  of  samples  to  be  evaluated,  208‐sample  Tissue Micro  Arrays 

(TMA) of cervical carcinoma cases (US Biomax CR2088, Rockville, MD), containing 181 squamous 

cervical carcinoma samples with I‐III grading, 9 cervical adenocarcinoma samples (not evaluated) 

plus 16 normal cervix samples as negative controls, were stained for CDC25A and E2F1 expression 

following the procedures described above. 

The total number of evaluable squamous cervical carcinoma samples was 219. 

Sco r i ng   and   quant i f i ca t i on   o f   gene   exp re s s i on   and  immunoreac t i v i t y  

Gene  expression.  qPCR  reaction  data  were  analyzed  using  the  HTqPCR  Bioconductor  package 

software  (version 1.4.0)  for the R statistical computing environment, version 2.12.1  (Dvinge and 

Bertone,  2009).  Ct  values  were  normalized  by  the  deltaCt  method  on  the  average  of  the 

endogenous controls. The normalization stability score of  these control RNAs was confirmed by 

the  GeNorm  software.  Data  not  acquired  (N/A) were  assigned with  a  default  Ct  value  of  40. 

Differential  expression  analysis was  conducted  using  the  functions  from  the  R  limma  package 

(Smyth et al, 2005), after having removed the Ct values corresponding to the endogenous controls 

8

and  those  with  an  Inter  Quartile  Range  ≤1.5.  P‐values  were  corrected  for  multiple  testing 

following Benjamini and Hochberg (Benjamini and Hochberg, 1995). 

Immunoreactivity.  Three  examiners  (MC,  EP  and  MGP)  independently  evaluated  the  staining 

pattern  of  Cdc25A  and  E2F1  in  the  same  cervical  carcinoma  case  series  employed  for mRNA 

expression (42 cases) plus in an independent set of squamous cervical carcinomas on TMA slides 

(181  cases).  The  final  score  derived  from  the  independent  analysis  of  the  examiners,  with 

subsequent discussion  for  the cases  in which divergent diagnoses were given. According  to  the 

amount  of  specific  staining,  cases  were  classified  in  tertiles  as  follows:  a)  negative/low;  b) 

medium; c) high. 

Cervical  cancer  samples  staining  positive  for  E2F1  displayed  an  immunoreactivity 

characterized  by  a  distinct  nuclear  staining  with  or  without  diffuse  cytoplasmic  staining.  IHC 

results for E2F1 were expressed as a percentage of the positive number of nuclear or cytoplasmic 

cells separately, counted  in 10 microscope cellular fields (x40). Tumors were defined positive for 

E2F1 when 20% or more tumor cells showed unequivocal nuclear or cytoplasmic staining. Cases 

with  faint, uncertain  cytoplasmic and/or nuclear  staining were  regarded as negative.  In normal 

cervical epithelium, nuclear staining appeared confined to the basal and parabasal layers. 

CDC25A displayed a diffuse or granular cytoplasmic staining highly specific for carcinoma 

cells. IHC results were expressed as a percentage of the positive cells, counted  in 10 microscope 

cellular  fields  (40x).  Tumors were defined positive  for CDC25A when  20% or more  tumor  cells 

showed unequivocal staining. Cases with  faint, uncertain staining were regarded as negative.  In 

normal cervical epithelium, nuclear staining was limited to the intermediate and superficial layers. 

S ta t i s t i ca l  ana l y s i s  

To  analyze  differential  expression  of  ΔCt  levels  in  single  pairwise  comparisons  (for 

example Control vs. HSIL or Control vs. Carcinoma), the non‐parametric Mann‐Whitney U‐test was 

9

applied  to  evaluate  statistical  significance.  All  categorical  variables,  such  as  tumor  stage  or 

International Federation of Gynecology and Obstetrics (Fédération Internationale de Gynécologie 

et d'Obstétrique, FIGO) stage, were  tested  for statistical significance by using  the Fisher’s exact 

test  applied  to  contingency  tables, where  expression  levels,  for both mRNA  and protein, were 

divided into three groups. 

For  all  statistical  tests,  a  two‐tailed  P‐value  <  0.05  was  considered  as  statistically 

significant. 

Hierarchical  clustering  and  Principal  Component  Analysis  (PCA)  of  samples  were 

computed by the Multi Experiment Viewer ver. 4.6 (Saeed et al, 2006) 

 

10

Resu l t s  

Choice of the genes to be assayed and of the cervical samples to be analyzed 

A number of genes were chosen after a thorough survey of the published literature was 

carried  out. We  sought  for  those  whose  mRNA  and/or  protein  expressions  that  significantly 

correlated with  histopathological  score  and  other  clinical  parameters  in  cervical  dysplasia  and 

cancer. Other genes were chosen according to data derived from our in vitro studies on protein‐

protein  interactions  involving  HPV‐16  oncoproteins  and  host  cell  factors  (Mileo  et  al, 

2006;Severino et al, 2007;Mileo et al, 2009;Mileo et al, 2013) or preliminary qPCR data in HPV‐16 

E7‐expressing  HaCaT  immortalized  human  keratinocytes  (data  not  shown).  The  final  output 

consisted  of  a  list  containing  88  genes,  plus  6  housekeeping  genes  chosen  for  normalization, 

whose amount was thus determined in a supervised analysis. The complete list of assayed genes, 

respective protein name and references or data employed for their selection, is displayed in Table 

S1 (Supplementary Material). mRNA expression for the supervised set of these 88 genes has been 

thus determined  in FFPE archival human specimens for a total of 127  individuals subdivided  into 

four cohorts by the pathologists,  i.e. Control (22 cases), LSIL (35 cases), HSIL (27 cases), Cervical 

Cancer (43 cases). 

Gene expression Analysis (qPCR) 

Raw data on the expression of 88 genes in all the analyzed samples are reported in Table 

S2  (Supplementary Material). Results are  shown  in Figure 1 and expressed as  log2 Fold Change 

(FC).  Assuming  an  arbitrary  cutoff  value  of  1.75  Log2FC,  the  expression  of  40  genes  appeared 

significantly  modulated  in  LSIL,  HSIL  and  cervical  carcinoma,  when  compared  with  controls 

(samples of normal cervical tissue). Genes were categorized as follows: 

11

• Up‐regulated  at  all  stages,  from  Control  (baseline)  to  LSIL, HSIL  and  Carcinoma:  PAK6  and 

MKI67. Up‐regulation  of  these  genes was  linked  to  a  pathological  state  of  the  cervix  uteri 

(dysplasia or carcinoma). 

• Down‐regulated at all stages, from Control (baseline) to LSIL, HSIL and Carcinoma: MYC, SIVA1, 

BCL2,  SNAI1, PTGS2  and  FOS. Down‐regulation of  these  genes was  linked  to  a pathological 

state of the cervix uteri (dysplasia or carcinoma). Among these, FOS, SNAI1 and BCL2 displayed 

the most evident down‐regulation. 

• Progressively  up‐regulated,  from  LSIL  to  HSIL  and  Carcinoma:  E2F1,  CCNE2,  FOXM1,  TP73, 

CDC25A, BIRC 5 and TOP2A. Their expression  increased significantly  in dysplastic  lesions and 

even more  in  carcinomas. Among  these genes,  it  is worth noting  the  consistent  increase  in 

expression between HSIL and carcinoma found in BIRC5, CDC25A and E2F1. 

• Progressively down‐regulated, from LSIL to HSIL and Carcinoma: RAD52, CAT, PKM2,  IGFBP5, 

MAPK3, EDNA, CAV1, GSN, ABCB1, PFKM, PTGES, VIM, CTNNB1, APC, TOP2B and LMNA. Their 

expression decreased significantly  in dysplastic  lesions and even more  in carcinomas. Among 

these  genes,  it  is  worthy  to  note  the  consistent  drop  in  expression  between  HSIL  and 

carcinoma found in IGFBP5, EDNRA and CAV1. 

• Up‐regulated  in HSIL  and  Carcinoma  only:  CCNE1, MMP8  and CCNB1.  These  genes  are  up‐

modulated solely in high‐grade dysplasias and carcinomas. 

• Up‐regulated  in LSIL  (or HSIL), but down‐regulated  in Carcinoma: EDN3, CST6, BCL2L1, KLK5, 

KRT10 and CDH1. Their expression was lower in carcinomas than in dysplastic lesions, even if 

often higher  than  in controls. Among  these genes,  it  is  important to consider the consistent 

drop in expression observed in EDN3, KRT10 and KLK5. 

A  further  analysis  outlined  a  set  of  4  genes  (TOP2A,  CTNNB1,  PFKM  and GSN) whose 

expression, when dysplastic samples (LSIL and HSIL) were grouped (dysplasia), appeared strongly 

12

correlated with  the  overall  patient  status  or  diagnosis.  These  genes were  selected  as  a  highly 

differentially expressed small subset by Mann‐Whitney U‐test  (10‐11 < P < 10‐5) between sample 

groups  in  all  possible  pairwise  comparisons  (Control  vs.  Dysplasia,  Control  vs.  Carcinoma, 

Carcinoma  vs.  Dysplasia).  In  this  analysis, we  considered  three  group  samples:  Control  cases, 

Dysplasia and Cervical Carcinoma.  In Figure 2 A, Principal Component Analysis (PCA) of samples, 

based on the expression values of TOP2A, CTNNB1, PFKM and GSN, showed a clear segregation 

between normal tissues and cervical carcinomas, while dysplastic samples gave scattered values. 

Figure  2  B  shows  hierarchical  clustering  and  heat map  representing  the  level  of  expression  of 

TOP2A, CTNNB1, PFKM and GSN across the samples analyzed. TOP2A expression levels appeared 

to be clearly on  the rise along with  the severity of  the disease, while  the opposite occurred  for 

GSN, CTNNB1 and PFKM. Also  in this case, the same 4‐gene set strongly discriminated between 

normal  and  cancer  samples,  while  dysplastic  samples  (LSIL  plus  HSIL)  once  again  gave 

heterogeneous results. Data are expressed as  log2 Fold Change (FC)  in comparison with controls 

(normal cervical epithelium).  Interestingly,  the analysis of  the data obtained  from our cohort of 

squamous  cervical  cancer  patients  outlined  a  significant  correlation  between  low  levels  of 

CTNNB1 mRNA expression and the presence of lymph node dissemination (Fisher’s exact test P = 

0.005). 

Protein expression analysis (IHC) 

We focused our attention on the genes that, among the 40 genes differentially regulated, 

showed  a  significantly  increased  expression  between  the  dysplastic  (LSIL  +  HSIL)  and  the 

cancerous status, with the aim to perform a determination of the amount of protein products in 

cancer  samples by means of  IHC. This  choice  appeared  justified by  the  fact  that  the  transition 

between  dysplasia  and  cancer  is  conceptually  and  clinically  central,  allowing  to  generate 

potentially  new  information  about  viral  carcinogenesis  processes  and  patient  diagnosis  and 

prognosis as well. Another key point, in order to facilitate a swift transition from research to clinic, 

13

was  the  choice of  genes which  appeared up‐regulated during  the  transition between dysplasia 

and cancer.  In  fact, when  IHC  is used  for determination, up‐regulation toward controls  is easier 

and  safer  to  asses  than  down‐regulation. On  these  bases,  the  genes  significantly  up‐regulated 

during  the  transition  between  dysplasia  and  carcinoma were:  TOP2A,  FOXM1,  BIRC5,  CCNE2, 

CDC25A,  TP73  and  E2F1.  Among  those,  we  chose  to  assay  for  protein  expression  E2F1  and 

CDC25A,  two  genes whose mRNA  expression was  significantly  increased  in  squamous  cervical 

carcinomas  and  for which  IHC  data  are  not  yet  available  in  the  literature. We  examined  the 

expression of these two gene products in 42 cases of cervical carcinoma belonging to the samples 

from which mRNA was  extracted  and  analyzed.  In  addition,  the  samples  contained  in  a  tissue 

microarray consisting  in 181 cases of squamous cervical carcinoma were  included,  for a total of 

223 carcinomas evaluated. 

Positive  staining  for  E2F1  significantly  correlated with histopathological  grade  (Fisher’s 

exact test P = 0.031), being lower in high‐grade carcinomas. No significant differences were found 

when considering tumor stage (T), lymph node stage (N0 or N1) or tumor stage according to FIGO 

classification (Stage I to IV). Analyzing the same parameters, positive staining for CDC25A reached 

statistical significance only for lymph node stage (Fisher’s exact test P = 0.03), where N1 samples 

showed higher protein content than the N0 ones (Table 1). 

Examples  of  IHC  staining  for  E2F1  and  CDC25A  in  normal  and  cervical  squamous 

carcinomas are shown in Figure 3. 

14

Di s cus s i on  

This  study  aimed  at  identifying  the  key  factors  involved  in  cervical  dysplasia  and 

carcinoma  in  order  to  recognize  the  molecular  processes  implicated  in  these  HPV‐induced 

pathologies  and  to  use  the  expression  of  specific  cellular  factors  to more  accurately  address 

important clinical issues. 

The  results  reported herein allow  identify a cluster of genes and gene products whose 

expression  is modulated during the transition from normal epithelium to dysplasia and cancer in 

HPV‐generated  cervical  pathologies.  Most  of  our  findings  are  evidently  consistent  with  the 

literature data we used  to build up  the dataset of genes analyzed  in our samples  (see Table S1 

Supplementary  Data).  The  results  found  on  other  genes  are  strongly  in  accordance  with  the 

findings reported  in our previous studies  (Severino et al, 2007;Mileo et al, 2013). Finally, out of 

the 88 assayed genes, a cluster of  four genes  (Figure 2), when evaluated concomitantly, appear 

capable  to  discriminate  between  normal  and  cancer  cervical  tissues:  TOP2A,  GSN,  PFKM  and 

CTNNB1. 

TOP2A  mRNA  expression  was  significantly  higher  in  cervical  carcinoma  samples,  in 

accordance with protein expression as evaluated by IHC (Branca et al, 2008;Guo et al, 2011;Brown 

et al, 2012). 

GSN mRNA expression was significantly lower in cervical carcinoma samples. Our previous 

study  shows  a  reduced  gelsolin  cleavage  by  caspase‐3  in  the  presence  of  the  HPV‐16  E7 

oncoprotein (Mileo et al, 2013), which  is  in agreement with a decreased GSN mRNA synthesis  in 

cervical carcinomas. 

PFKM  mRNA  expression  was  significantly  lower  in  cervical  carcinoma  samples. 

Phosphofructokinase M  is a master  regulator enzyme  in  the glycolytic process. While  there are 

several studies describing the effect of the  interplay between HPV  infection and pyruvate kinase 

15

M2  (PKM2)  in  increasing  tumor  glycolysis  and  enhancing  the Warburg  effect  (Zwerschke  et  al, 

1999;Mazurek et al, 2001;Tamada et al, 2012), to our knowledge, this is the first report in which 

mRNA expression of PFKM, another key glycolytic regulator enzyme, appears modulated  in HPV‐

expressing cervical pathologies. 

CTNNB1 mRNA expression was significantly  lower  in cervical carcinoma samples. Data  in 

literature  outline  an  inverse  correlation  between  IHC‐determined  beta‐catenin  expression  and 

tissue  differentiation,  as well  as  low  expression  in  cervical  carcinoma  cases with  lymph  node 

dissemination (Cheng et al, 2012). The data herein presented are definitely consistent with these 

results. 

In  spite of  the high  statistical  significance of  the differences  in mRNA expression  in  this 

panel of  four selected genes (TOP2A, GSN, PFKM and CTNNB1), even pooling the two dysplastic 

forms LSIL and HSIL was impossible to stratify the dysplastic cases, while cervical carcinomas were 

found  to be efficiently  segregated  from normal  samples  (Figure 2, panels A and B). The  reason 

why the  intermediate, dysplastic state did not segregate successfully could also be explained by 

the  intrinsic  variability  found  in  these  FFPE  specimens due  to  their occasionally  small  size  and 

consequent possible contamination with unpredictable amounts of adjacent peri‐lesional tissue. 

On  the other hand, the significant variation of E2F1 determination via  IHC according to 

histopathological  grade,  being  lower  in high‐grade  samples,  is not  surprising.  E2F1  is  the most 

investigated member  of  the  E2F  family  of  transcription  factors  that  actively  promote  the  cell 

entrance into the S phase. It binds to the “pocket” region of the Retinoblastoma oncosuppressor 

protein, and of its related suppressor factors p107 and pRb2/p130, to be functionally inactivated 

and thus unable to stimulate the cell to enter the S phase (Ewen, 1994;Weinberg, 1995;Paggi et al, 

1996;Mulligan and Jacks, 1998;Paggi and Giordano, 2001). In the presence of HPV‐16 E7, E2F1  is 

displaced  from  the Retinoblastoma protein,  thus being able  to exert  its  trans‐activating activity 

16

(Chellappan et al, 1992;Morris et al, 1993;Bellacchio and Paggi, 2013). However, at the same time, 

it becomes substrate of the specific proteases devoted to its turnover (Hateboer et al, 1996). 

In  our  cohort  of  patients,  strong  IHC  staining  for  CDC25A  appeared  significantly 

correlated with  the  evidence of  lymph‐node dissemination  in  the patient.  Indeed,  the CDC25A 

tyrosine phosphatase  is a key  factor  in cell cycle progression and  its up‐regulation  is associated 

with  carcinogenesis.  In particular,  the E7 oncoprotein  from HPV‐16  is  able  to  increase CDC25A 

protein levels (Nguyen et al, 2002;Gao et al, 2009).  

Now, it is important to consider that the majority of these assays detect the expression of 

surrogate markers of aberrations in cell proliferation genes and that these tests cannot be swiftly 

employed  in  a  clinical  setting,  even  after  a  stronger  statistical  validation,  due  to  the  intrinsic 

complexity of the non‐routine procedures utilized. Nevertheless, these results outline genes and 

gene products whose expression, appearing critical in discriminating between normal and cancer 

cervical  tissues,  can be of great value  in  recognizing key HPV‐induced molecular derangements 

that are hallmarks of a transformed phenotype. 

In  the near  future, we plan  to  increase  the number of specimens to be assayed and to 

perform  phosphoproteomic  analysis  by  Reverse‐Phase  Protein Microarrays  (RPPM)  in  order  to 

explore  the  activation  status  of  several  signal  transduction  components  in  fresh,  surgically 

obtained  cervical  cancer  samples. Activated  signaling  profiles will  highlight  potentially  relevant 

molecular biomarkers, thus generating novel classification ranks and identifying druggable targets 

as well. 

Indeed, grasping  further knowledge of  the molecular mechanisms employed by HPV  in 

inducing and maintaining the cancerous state will be vital  in understanding these processes and 

toward selecting effective therapies in defeating the HPV oncogenic machinery. 

17

 

Acknowledgment s  

The  authors  thank Daniela  Panichi  for  the preparation of  the  FFPE  archival  specimens 

Manuela Natoli for her help in qPCR mRNA determinations and Tania Merlino for English language 

editing. 

18

References Abbruzzese,C., Mattarocci,S., Pizzuti,L., Mileo,A.M., Visca,P., Antoniani,B., Alessandrini,G., Facciolo,F., Amato,R., D'Antona,L., Rinaldi,M., Felsani,A., Perrotti,N., and Paggi,M.G. (2012) Determination of SGK1 mRNA in non-small cell lung cancer samples underlines high expression in squamous cell carcinomas. J.Exp.Clin.Cancer Res., 31:4. Bellacchio,E. and Paggi,M.G. (2013) Understanding the targeting of the RB family proteins by viral oncoproteins to defeat their oncogenic machinery. J.Cell Physiol, 228:285-291. Benjamini,Y. and Hochberg,Y. (1995) Controlling the False Discovery Rate - A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B-Methodological, 57:289-300. Branca,M., Ciotti,M., Giorgi,C., Santini,D., Di Bonito,L., Costa,S., Benedetto,A., Bonifacio,D., Di Bonito,P., Paba,P., Accardi,L., Syrjanen,S., Favalli,C., and Syrjanen,K. (2008) Predicting high-risk human papillomavirus infection, progression of cervical intraepithelial neoplasia, and prognosis of cervical cancer with a panel of 13 biomarkers tested in multivariate modeling. Int.J Gynecol.Pathol., 27:265-273. Brown,C.A., Bogers,J., Sahebali,S., Depuydt,C.E., De,P.F., and Malinowski,D.P. (2012) Role of protein biomarkers in the detection of high-grade disease in cervical cancer screening programs. J.Oncol., 2012:289315. Chellappan,S., Kraus,V.B., Kroger,B., Munger,K., Howley,P.M., Phelps,W.C., and Nevins,J.R. (1992) Adenovirus E1A, simian virus 40 tumor antigen, and human papillomavirus E7 protein share the capacity to disrupt the interaction between transcription factor E2F and the retinoblastoma gene product. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 89:4549-4553. Cheng,Y., Zhou,Y., Jiang,W., Yang,X., Zhu,J., Feng,D., Wei,Y., Li,M., Yao,F., Hu,W., Xiao,W., and Ling,B. (2012) Significance of E-cadherin, beta-catenin, and vimentin expression as postoperative prognosis indicators in cervical squamous cell carcinoma. Hum.Pathol., 43:1213-1220. de Martel C., Ferlay,J., Franceschi,S., Vignat,J., Bray,F., Forman,D., and Plummer,M. (2012) Global burden of cancers attributable to infections in 2008: a review and synthetic analysis. Lancet Oncol.,[Epub ahead of print]. Dvinge,H. and Bertone,P. (2009) HTqPCR: high-throughput analysis and visualization of quantitative real-time PCR data in R. Bioinformatics., 25:3325-3326. Ewen,M.E. (1994) The cell cycle and the retinoblastoma protein family. [Review]. Cancer & Metastasis Rev., 13:45-66. Fehrmann,F. and Laimins,L.A. (2003) Human papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation. Oncogene, 22:5201-5207. Felsani,A., Mileo,A.M., and Paggi,M.G. (2006) Retinoblastoma family proteins as key targets of the small DNA virus oncoproteins. Oncogene, 25:5277-5285. Gao,G., Peng,M., Zhu,L., Wei,Y., and Wu,X. (2009) Human papillomavirus 16 variant E7 gene induces transformation of NIH 3T3 cells via up-regulation of cdc25A and cyclin A. Int.J.Gynecol.Cancer, 19:494-499. Guo,M., Baruch,A.C., Silva,E.G., Jan,Y.J., Lin,E., Sneige,N., and Deavers,M.T. (2011) Efficacy of p16 and ProExC immunostaining in the detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma. Am.J.Clin.Pathol., 135:212-220. Hateboer,G., Kerkhoven,R.M., Shvarts,A., Bernards,R., and Beijersbergen,R.L. (1996) Degradation of E2F by the ubiquitin-proteasome pathway: Regulation by retinoblastoma family proteins and adenovirus transforming proteins. Genes Dev., 10:2960-2970. Helt,A.M. and Galloway,D.A. (2003) Mechanisms by which DNA tumor virus oncoproteins target the Rb family of pocket proteins. Carcinogenesis, 24:159-169. Mattarocci,S., Abbruzzese,C., Mileo,A.M., Visca,P., Antoniani,B., Alessandrini,G., Facciolo,F., Felsani,A., Radulescu,R.T., and Paggi,M.G. (2009) Intracellular presence of

19

insulin and its phosphorylated receptor in non-small cell lung cancer. J.Cell Physiol, 221:766-770. Mazurek,S., Zwerschke,W., Jansen-Durr,P., and Eigenbrodt,E. (2001) Effects of the human papilloma virus HPV-16 E7 oncoprotein on glycolysis and glutaminolysis: role of pyruvate kinase type M2 and the glycolytic-enzyme complex. Biochem J, 356:247-256. McLaughlin-Drubin,M.E. and Munger,K. (2009) The human papillomavirus E7 oncoprotein. Virology, 384:335-344. Mileo,A.M., Abbruzzese,C., Mattarocci,S., Bellacchio,E., Pisano,P., Federico,A., Maresca,V., Picardo,M., Giorgi,A., Maras,B., Schinina,M.E., and Paggi,M.G. (2009) Human papillomavirus-16 E7 interacts with glutathione S-transferase P1 and enhances its role in cell survival. PLoS.ONE., 4:e7254. Mileo,A.M., Abbruzzese,C., Vico,C., Bellacchio,E., Matarrese,P., Ascione,B., Federico,A., Della,B.S., Mattarocci,S., Malorni,W., and Paggi,M.G. (2013) The Human Papillomavirus-16 E7 oncoprotein exerts anti-apoptotic effects via its physical interaction with the actin-binding protein Gelsolin. Carcinogenesis, doi: 10.1093/carcin/bgt192. Mileo,A.M., Piombino,E., Severino,A., Tritarelli,A., Paggi,M.G., and Lombardi,D. (2006) Multiple interference of the human papillomavirus-16 E7 oncoprotein with the functional role of the metastasis suppressor Nm23-H1 protein. J Bioenerg.Biomembr., 38:215-225. Morris,J.D., Crook,T., Bandara,L.R., Davies,R., LaThangue,N.B., and Vousden,K.H. (1993) Human papillomavirus type 16 E7 regulates E2F and contributes to mitogenic signalling. Oncogene, 8:893-898. Mulligan,G. and Jacks,T. (1998) The retinoblastoma gene family: cousins with overlapping interests. Trends Genet., 14:223-229. Munger,K., Baldwin,A., Edwards,K.M., Hayakawa,H., Nguyen,C.L., Owens,M., Grace,M., and Huh,K. (2004) Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis. J.Virol., 78:11451-11460. Munger,K., Basile,J.R., Duensing,S., Eichten,A., Gonzalez,S.L., Grace,M., and Zacny,V.L. (2001) Biological activities and molecular targets of the human papillomavirus E7 oncoprotein. Oncogene, 20:7888-7898. Nguyen,D.X., Westbrook,T.F., and McCance,D.J. (2002) Human papillomavirus type 16 E7 maintains elevated levels of the cdc25A tyrosine phosphatase during deregulation of cell cycle arrest. J.Virol., 76:619-632. Paggi,M.G., Baldi,A., Bonetto,F., and Giordano,A. (1996) Retinoblastoma protein family in cell cycle and cancer: A review. J.Cell.Biochem., 62:418-430. Paggi,M.G. and Giordano,A. (2001) Who Is the Boss in the Retinoblastoma Family? The Point of View of Rb2/p130, the Little Brother. Cancer Res., 61:4651-4654. Saeed,A.I., Bhagabati,N.K., Braisted,J.C., Liang,W., Sharov,V., Howe,E.A., Li,J., Thiagarajan,M., White,J.A., and Quackenbush,J. (2006) TM4 microarray software suite. Methods Enzymol., 411:134-193. Severino,A., Abbruzzese,C., Manente,L., Avivar Valderas,A., Mattarocci,S., Federico,A., Starace,G., Chersi,A., Mileo,A.M., and Paggi,M.G. (2007) Human papillomavirus-16 E7 interacts with Siva-1 and modulates apoptosis in HaCaT human immortalized keratinocytes. J Cell Physiol, 212:118-125. Siegel,R., Naishadham,D., and Jemal,A. (2013) Cancer statistics, 2013. CA Cancer J.Clin., 63:11-30. Smyth,G.K., Michaud,J., and Scott,H.S. (2005) Use of within-array replicate spots for assessing differential expression in microarray experiments. Bioinformatics., 21:2067-2075. Tamada,M., Suematsu,M., and Saya,H. (2012) Pyruvate kinase m2: multiple faces for conferring benefits on cancer cells. Clin.Cancer Res., 18:5554-5561. Weinberg,R.A. (1995) The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell, 81:323-330. Whiteside,M.A., Siegel,E.M., and Unger,E.R. (2008) Human papillomavirus and molecular considerations for cancer risk. Cancer, 113:2981-2994.

20

zur Hausen,H. (2009) The search for infectious causes of human cancers: where and why (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed Engl., 48:5798-5808. Zwerschke,W., Mazurek,S., Massimi,P., Banks,L., Eigenbrodt,E., and Jansen-Durr,P. (1999) Modulation of type M2 pyruvate kinase activity by the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein. Proc.Natl.Acad Sci U.S.A, 96:1291-1296.

21

Legends to Figures Figure 1  Supervised  gene  expression  in  LSIL, HSIL  and  squamous  cervical  carcinomas  from 

FFPE  samples. Genes  significantly modulated  in Cervical Lesions: comparison with 

Controls. mRNA analysis was performed in four cohorts for a total of 127 patients, i.e. 

Control  (22 cases), LSIL  (35 cases), HSIL  (27 cases), Cervical Cancer  (43 cases) and  is 

expressed  as  log2  Fold  Change  (FC)  in  comparison  with  control  (normal  cervical 

epithelium)  (Red  color  scale  =  up‐regulation  toward  control;  Green  color  scale  = 

down‐regulation toward control). For each gene listed, a statistical significance of P < 

0.05 was achieved at least in one pathological class. 

Figure 2  mRNA expression of a set of 4 genes (TOP2A, CTNNB1, PFKM and GSN)  is strongly 

correlated  with  the  overall  patient  status  or  diagnosis.  A. Principal  Component 

Analysis (PCA) of expression values of patient samples. The dataset used for clustering 

is  composed of normalized ΔCt expression values of genes, TOP2A, CTNNB1, PFKM 

and GSN for all the samples. The color code shows how the samples segregate in the 

plot,  particularly  along  the  PCA1  axis,  according  to  diagnostic  category:  Control, 

Dysplasia,  Carcinoma.  The  color  code  is  the  same  as  in  the  heat  map  plot.  B.

Hierarchical clustering and heat map of expression values of patient samples, using 

Euclidean  distance metric  and  average  linkage.  The  dataset  used  for  clustering  is 

composed of expression values of genes TOP2A, CTNNB1, PFKM and GSN for all the 

samples. Values are mean centered normalized ΔCt, where for each gene the mean is 

calculated across all the samples. On the bottom of the diagram, a color code shows 

how the samples segregated in the cluster, according to diagnostic category: Control, 

Dysplasia, and Carcinoma. In both panels, genes were selected given their extremely 

different expression values  in the three groups, as shown by the p‐value <10‐6  in all 

pairwise non‐parametric  tests  (Mann‐Whitney U‐test) between  the groups  (Control 

vs. Dysplasia, Control vs. Carcinoma, Dysplasia vs. Carcinoma). The color code, green 

for Control, ochre for Dysplasia and purple for Carcinoma, is the same in both panels. 

Figure 3  Immunohistochemical  staining  for  E2F1  and  CDC25A  in  cervical  squamocellular 

carcinoma  and  in  normal  cervical  tissue.  Representative  samples  of  squamous 

cervical  carcinoma  and  normal  cervical  tissue which  appear  positive  for  E2F1  and 

CDC25A  staining  in  IHC.  E2F1  staining  is  essentially  nuclear,  with  or  without 

22

cytoplasmic  staining. CDC25A  staining  appears  as  a diffuse or  granular  cytoplasmic 

staining, highly specific for carcinoma cells. Original magnification = x20. 

 

 

23

       

24

Figure 1

25

Figure 2

26

Figure 3