Identification de gènes impliqués dans le développement des lymphomes cutanés primitifs CD30+ Laboratoire dHistologie et Pathologie Moléculaire des Tumeurs

Identification de gènes impliqués

dans le développement des

lymphomes cutanés primitifs

CD30+Laboratoire d’Histologie et Pathologie Moléculaire des

Tumeurs

EA 2406 - Université Victor Ségalen Bordeaux 2

Directeur de thèse : Jean Philippe Merlio

Thèse présentée par Emilie Loreau

Lymphomes

Introduction

Conclusion

Banque SSHCriblage banque

Validation candidats

DéfinitionProlifération maligne de lymphocytes B ou T

Localisation principale dans les tissus lymphoïdes

Monoclonalité

Lymphoproliférations CD30+Lymphome cutané primitif (LCP) CD30+

Papulose lymphomatoïde (Ply)

Lymphome systémique CD30+

Peau

Ganglion

Antigène de surface CD30

Introduction

Conclusion



Expressions

- Lymphocytes T activés sanguins (15%)

- Lymphoproliférations CD30+

Famille du TNF-R

Fonction Récepteur transmembranaire (120 kDa)

NF-KB

CD30L

CD30Membrane plasmique

MAPK

TRAF

Lymphome cutané primitif CD30+

Introduction

Conclusion



Classification 9 % des lymphomes cutanés primitifs (EORTC)

Clinique Tumeur cutanée, régression spontanée, récidive

Age 60 à 70 ans

Pronostic Survie à 5 ans 95%, si extension extra-cutanée 25%

Histologie Non épidermotrope, infiltrat dense

Phénotype Lymphocytes T exprimant le CD30+ (70 %)

Génotype Réarrangement clonal du gène du TcR : (70 %)

Lymphome cutané primitif CD30+

Introduction

Conclusion



Epiderme

Derme

Prolifération tumorale

LCP CD30+

Patient

Peau Saine

Hypoderme

Derme

Epiderme

Papulose lymphomatoïde / LCP CD30+

Introduction

Conclusion



Ply type A Ply type CAutre cas frontière

LCP CD30+

HistologieCellules CD30+

Cellules inflammatoires

disperséesnombreuses

en amas+/- rares

disperséesnombreuses

en amas+/- rares

CliniqueLésions

Distribution

EvolutionRégression spontanée

Atteinte extra-cutanée

toujoursexceptionnell

e

toujoursexceptionne

lle

50 %rare

30 %25 %

papule>nodulegénéralisée

nodule>tumeurloco-régionale

L. systémique CD30+ / LCP CD30+

Introduction

Conclusion



L. systémique CD30+ LCP CD30+

Age Bimodal : 20 et 70 ans 60 à 70 ans

Clinique

AgressifAtteinte extra-ganglionnaire, osseuse ou cutanée (20/30

%)

Non agressifTumeur cutanée souvent

localiséeAtteinte extra-cutanée, ganglionnaire (25 %)

Histologie Infiltrat diffus détruisant l’architecture du ganglion

Infiltrat dense non épidermotrope

Phénotype T, nul ou rarement B, CD30+

T ou nul, CD30+

Génotype Réarrangement clonal du TcR t(2;5) > 50 %

Réarrangement clonal du TcR

Pronostic : survie à 5

ans

77 % chez le sujet jeune54 % pour les sujets âgés

95 %Extension extra-cutanée : 25

%

Gènes et cancers

Introduction

Conclusion



OncogèneActivation du cycle cellulaire

Inhibition de l’apoptose

Mutation dominante

Gène suppresseur de tumeur

Inhibition du cycle cellulaire

Activation de l’apoptose

Mutation récessive

Colon sain

Cancer + Métastase

s

Cancer

APC

K-Ras

DCC

p53

…

Objectif

Introduction

Conclusion



Oncogenèse du LCP CD30+ ?

Aide au diagnostic

Cible thérapeutique

Voies de transduction

Etude du transcriptome

Etude du transcriptome

Introduction

Conclusion



Approches globalesPuce à ADNc

mRNA differential display

SSH « Substractive Suppressive Hybridization »

Approches cibléesRT-PCR

RT-PCR en temps réel

Stratégie

Introduction

Conclusion



Banque soustraite

Macro-array

RQ-PCR

?

Réalisation de banques par

SSH

Criblage des banques

Validation des gènes candidats

Principe de la SSH

IntroductionConclusio

nBanque

SSHCriblage banque


Diatchenko et al, 1996

Comparaison de deux populations cellulaires différentes :

tester et driver

Gènes spécifiques de la population cellulaire tester

ButMise en évidence de gènes spécifiques d’une population cellulaire

Normalisation entre les ARNm fortement ou faiblement représentés

Suppression des gènes présents dans les deux populations

Etapes de la SSH


nBanque

SSHCriblage banque


AAAA

tester ou driver

tester

RT

RsaI

Ligatio

n

PCR

Clonage

Hybridations

SSH


nBanque

SSHCriblage banque


PCR2PCR1

a, c et d

b

Tester 1

Tester 2R

Driver

H1b

H1a

a b c d

a b c d +

e

H2

Ex

a b c d

e

Choix des échantillons


nBanque

SSHCriblage banque


Prélèvement de la tumeur cutanée

Lymphocytes tumoraux

ARN totaux

Prise de sang

Lymphocytes sanguins

ARN totaux

DriverTester

18S

28S

ARN dégradés

SSH


nBanque

SSHCriblage banque


Etapes critiques


nBanque

SSHCriblage banque


Digestion des ADNc par RsaI (tester et driver)

1 2 3 4 5Gel d’agarose 2 % w/v

1. Marqueur PM 100 pb

2. Tester 1, lié

3. Tester 1, lié ou non

4. tester 2R, lié

5. tester 2R, lié ou non

1 2

Gel d’agarose 1,2 % w/v

1. ADNc non digéré

2. ADNc digéré

Ligation des adaptateurs pour créer deux populations tester

S NS S NS M

Validation d’une banque SSH


nBanque

SSHCriblage banque


S NS

18 23 28 33 18 23 28 33

Soustrait Non Soustrait

Clonage dans le pGEM T vector

8 SSH réalisées

3 SSH validées

4 SSH criblées

PCR1 PCR2

Efficacité de soustraction

Criblage des banques soustraites


nBanque SSH

Criblage banque


Organisation des banques

sur membranes

Clonage

T C G A G T C A

SéquençageHybridation des sondes

radioactives

ButDiminuer le nombre

de faux positifs

S NS

PCR2

A partir des clones


nBanque SSH

Criblage banque


Sonde tumoral

e

Sonde non tumorale

Organisation des clones en deux boites homologues : grille à 228 positions

Transfert des bactéries sur membrane de nylon

Fixation de l’ADN des bactéries sur les membranes

Hybridation des sondes radio-marquées

Par Dot Blot


nBanque SSH

Criblage banque


Tumeur Non tumeur

Organisation des clones dans des plaques de 96 puits

PCR à partir des clones en suspension (amorces M13)

Fixation des produits de PCR sur deux membranes de nylon par Dot Blot

Hybridation des sondes radio-marquées

Résultats du criblage


nBanque SSH

Criblage banque


2230 spots 349 clones

Criblage

118 gènes candidats

Séquençage

Dot Blot : 15 gènes

THW

Humanine

Bibliographie : 16 gènes

PTTG1

Bcl11B CIN85

SPARC p120 cat

+ Validation RQ-PCR

Résultats du criblage


nBanque SSH

Criblage banque


Kératine 6Annexes cutanéesSurexpression dans un environnement prolifératif

ARN 18STrack de ASurexpression dans les cellules tumorales

CMH IIFortement exprimé dans les lymphocytes T activés

Importance du choix des échantillons

Validation des candidats


nBanque SSH

Criblage banque


PCR en temps réel ou RQ-PCR

Normalisation par PO (gène de ménage)

Quantification relative (tumeur par rapport à non tumeur)

Augmenter le nombre d’échantillons testés

But Vérifier par une autre technique les variations d’expressions



nBanque SSH

Criblage banque


Transcription inverse 2 g

11 cas de LCP CD30+

7 tumeurs initiales

3 récidives

1 ganglion

2 cas de L. systémique CD30+

7 lymphocytes sanguins sains

Echantillons testés



nBanque SSH

Criblage banque


Amplification avec des amorces spécifiques du gène d’intérêt

Utilisation d’un intercalent fluorescent : le SYBR-Green

Mesure de la fluorescence en fin d’élongation

Intensité de fluorescence quantité de cible

Amplification par PCR

T-

3 mM

5 mM

4 mM

Cinétiq

ueCt

Exemple de résultats


nBanque SSH

Criblage banque


T-3 mM

4 mM

5 mM

Courbe de

fusion

[MgCl2] pour le

gène PO

Choix d’un gène de ménage


nBanque SSH

Criblage banque


Choix des amorces : GAPDH, G6PD, PO, -actine

Etude sur 14 échantillons dont 4 tumeurs LCP CD30+

Travail en duplicate et en Ct

0

5

10

15

20

25

30

35

P1 P3 P10E P11 LP8 LPx LPy Lc Ld L1 L2 LP3 LP4 Plhu

Echantillon

Ct

PO actine G6PD

GAPDH GAPDH3

Choix d’un gène de ménage


nBanque SSH

Criblage banque


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2


actine/GAPDH3 PO/GAPDH3 G6PD/GAPDH3

Gène de ménage

GAPDH

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2


PO/actine G6PD/actine GAPDH3/act

Gène de ménage

actine

Analyse des résultats de RQ-PCR


nBanque SSH

Criblage banque


x

RQ-PCR en duplicate sur chaque échantillon

Moyenne des Ct des duplicates (0,3)

Gamme de dilution [concentration arbitraire]

Normalisation : [Gène d’intérêt]

[PO]

Gènes d’intérêts

Gène de ménage PO

Résultats RQ-PCR relative


nBanque SSH

Criblage banque


THW (11) p120 caténine (7)

SPARC (5) PTTG1 (9)

Surexpressions31 candidats étudiés sur 13 échantillons

Sousexpressions

Humanine (9) CIN85 (7) Bcl11B (7)

Gènes Surexprimés - THW


nBanque SSH

Criblage banque


Hildebrandt et al, 2000 et 2001

Perte d’hétérozygotie fréquente en 6q

Mélanome sans métastase : 10 à 20 %

Mélanome avec métastases : 50 %

THW et kératine 6 : même profil d’expression

!

THW fortement exprimé dans les cellules épidermiques

Gène

suppresseur de

tumeur

MP

p120

E-cadhérine

cat

actine

cat

Gènes Surexprimés - p120 caténine


nBanque SSH

Criblage banque


Surexpression : cancer gastrique

Sousexpression : autres cancers

Noyau

?Kasio

Xp120

Quels sont les gènes inhibés dans les lymphocytes T ?

Anastasiadis et Reynolds, 2001

Gènes Surexprimés


nBanque SSH

Criblage banque


Oncogène

s

JUN-B surexprimé dans LCP CD30+

Tumeurs initiales (facteur 4)

Récidives (facteur 8 à 15)

c-junSPARC

AP1

SPARC

Briggs et al, 2002. Mao et al, 2003

Glycoprotéine MEC

Surexpression : certains cancers

Surexpression :

Lymphoproliférations T (70 %)

Ségrégation des chromatides (mitose)

PTTG1Tumeurs initiales

Pey et Melmed, 1997. Saez et al, 2002

Gènes sousexprimés


nBanque SSH

Criblage banque


Protéine doigt de zinc nucléaire

Cerveau, système immunitaire

Lymphomes du thymus (souris) :

Délétions homozygotes

Bcl11B

Wakabayashi et al, 2003

Gène

suppresseur de

tumeur

Protéine adaptatrice

Prolifération/apoptose ?

PI3KCIN 85 Apoptose (neurones)

CIN85

Take et al, 2000. Gout et al, 2000

Hashimoto et al, 2001. Guo et al, 2003

Peptide anti-apoptotique (24 aa)

Séquence homologue à l’ARN 16S

HumanineOncogène

Humanine Apoptose

Bax

Conclusion

IntroductionConclusi

onBanque SSH

Criblage banque


Trois gènes sousexprimés

Bcl11B : gène suppresseur de tumeur

CIN85

Humanine

Quatre gènes surexprimés dans les LCP CD30+

SPARC et PTTG1 : oncogènes

p120 caténine

THW : biais expérimental (choix des échantillons de départ)

Fonction

oncogénique ou

phénotype

Perspectives

IntroductionConclusi

onBanque SSH

Criblage banque


Augmenter le nombre des échantillons analysés : Marqueurs ?

ISH ou microdissection : localisation des ARNm

Immunohistochimie : localisation et niveau d’expression protéique

SSH et CGH ?Voies de signalisations impliquant les différents

gènes

CIN85 : recherche des partenaires - immunoprécipitation (prolifération ou apoptose)

JUN-B et SPARC

p120 et Kasio

Ce travail a été réalisé sous la direction du Pr. Jean Philippe Merlio

Financement : Programme de Recherche Clinique d’Aquitaine

Pr. Jacques Emile Bonnet

Pr. Gilles Favre

Pr. Pierre Brousset

Remerciements

Pr. Marie Beylot Barry

Dr. Béatrice Vergier

Dr. Marie Parrens

Laboratoire du Pr. Merlio

Dr. Nathalie Carrère

Jackie Ferrer

Dr. Edith ChevretLaboratoire du Pr. De

Mascarel

Mme Beau

Labo Bio Mol

Endocube

Et aussi !

Christine Bartoli

Michelle Turmo

Jean Christophe Garoste

Jean Christophe Cometta

Martina Prochazkova

Alexis Groppi

Henri Gomez

Pierre Dubus

Marc Antoine Belaud Rotureau

Nicolas Bitteau

Brigitte Tauzin

Christophe Barthe

Fanny Pelluard

Armelle Bolzec

Lilian

Sylvain Caillol

Ma famille et mes amis pour leur soutien permanent

Cédric Barrière

Peyo

Dominique Bertheau

Documents

Identification de gènes impliqués dans le développement des lymphomes cutanés primitifs CD30+ Laboratoire dHistologie et Pathologie Moléculaire des Tumeurs