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Profesor Patrocinante
Dra. Ana María Zárraga Olavarría
Instituto de Bioquímica y Microbiología
Facultad de Ciencias
IDENTIFICACION DE LA PROTEINA CODIFICADA POR EL GEN
HIPOTETICO Mb1767 DE Mycobacterium bovis AF2122/97, EN
CULTIVOS SOMETIDOS A ESTRÉS.
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
JESÚS ANTONIO LLANQUINAO SANDOVAL
VALDIVIA-CHILE
2012
Dedicado a mis padres y tía
Antonio Llanquinao Canio, Marta Sandoval Sandoval
Fresia Llanquinao Canio.
Por su afecto, incondicionalidad y amor
AGRADECIMIENTOS
De manera muy especial a la Dra. Ana María Zárraga, por guiarme en el camino
profesional, su respaldo para desarrollar este trabajo científico. Hago extensivo mis
agradecimientos a los profesores colaboradores, doctores Joel Asenjo, Sergio Leiva, Alex
Romero y Alejandro Yañez por su ayuda, disposición y facilitarme las herramientas en el trabajo
experimental. Al equipo de trabajo del laboratorio por su amistad, ayuda y enriquecimiento
intelectual, compuesto por Pablo Santibáñez, Alejandro Albornoz, Álvaro Figueroa, Marcos
Mancilla, Marcos Ulloa, Carlos Tejeda, Carlos Díaz y Christopher Stepke.
Esta Tesis fue realizado con el financiamiento del proyecto FONDOSAG C5-100-10-23
i
INDICE
ÍNDICE DE FIGURAS v
1. RESUMEN 1
1.1 SUMMARY 2
2.- INTRODUCCION 3
2.1 Tuberculosis 3
2.2 Mycobacterium bovis. 5
2.3 Estadios de la infección 7
2.4 Genoma de Mycobacterium bovis 11
2.5 El regulón DosR de Mycobacterium 13
2.6 Proteínas hipotéticas conservadas 16
2.7 Hipótesis de trabajo 18
3. MATERIALES Y MÉTODOS 20
3.1 Materiales 20
3.1.1 Reactivos 20
3.1.2 Equipos 21
3.1.3 Oligonucleótidos: 21
3.1.4 Plásmidos 23
3.1.5 Material Biológico 25
3.1.6 Sistemas informáticos 25
3.2 MÉTODOS 25
3.2.1 Análisis Bioinformática 25
3.2.2 Cultivo microbiológico 26
ii
3.2.2.1 Cultivo bacteriano de rutina 26
3.2.2.2 Cultivo de M. bovis 26
3.2.2.3 Cultivo en condiciones de estrés 26
3.2.3 Extracción de ácidos nucleicos bacterianos 27
3.2.3.1 Extracción de DNA plasmidial de E. coli a pequeña escala 27
3.2.4. Extracción orgánica y precipitación del DNA 27
3.2.5 Cuantificación de ácidos nucleicos 28
3.2.6 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa 28
3.2.7 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS- PAGE) 28
3.2.8 Preparación del extracto crudo de proteínas de Mycobacterium sp. 29
3.2.9 Generación de plásmidos recombinantes. 29
3.2.9.1 Amplificación del gen Mb1767 de M.bovis por PCR 29
3.2.9.2 Clonación de los productos PCR en el vector pJET1.2/blunt 30
3.2.9.3 Liberación del fragmento clonado en pJET1.2/blunt 31
3.2.9.4 Linealización del vector pET15b. 31
3.2.9.5 Subclonación en el plásmido pET15b 32
3.2.10 Transformación de células bacterianas 32
3.2.10.1. Preparación de células competentes de E. coli JM109 y E. coli BL21 32
3.2.10.2. Transformación de E. coli JM109 y E. coli BL21 DE3 33
3.2.11. Expresión y purificación de la proteína Mb1767 de M.bovis. 33
3.2.11.1 Inducción cualitativa de la proteína Mb1767 con IPTG. 33
3.2.11.2 Expresión cuantitativa de la proteína Mb1767 33
3.2.11.3 Lisis bacteriana. 34
iii
3.2.11.4 Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico 34
3.2.11.5 Cromatografía de afinidad en columna Sefarosa-níquel. 36
3.2.12 Western Blot 36
3.2.12.1 Western blot anticuerpo anti-His conjugado a HRP. 36
3.2.12.2 Método de ensayo en gota (Dot blot) 37
3.2.12.3 Western blot anticuerpo Mb1767. 37
3.2.13 Anticuerpo 38
3.2.13.1 Gallinas 38
3.2.13.2 Preparación de proteína Mb1767 e inmunización de gallinas 38
3.2.13.3 Obtención y purificación de inmunoglobulina Y (IgY) desde yema de huevo. 38
4. RESULTADOS 40
4.1 Estudio bioinformatico del locus narK2-Mb1767 del genoma de M. bovis AF2122/97. 40
4.2 Estudio in silico de las características de la proteína codificada por el gen hipotético Mb1767.
42
4.3 Amplificación, clonamiento y subclonamiento de la secuencia codificante del gen Mb1767 de
M. bovis 51
4.4 Expresión y purificación de la proteína Mb1767 recombinante. 53
4.5 Caracterización del anticuerpo anti-Mb1767 de M.bovis. 55
4.6 Identificación de la proteína endógena Mb1767. 59
5.- Discusión 61
5.1 Locus narK2-Mb1767 del genoma de M. bovis AF2122/97. 61
5.2 Estudio in silico de las características de la proteína codificada por el gen hipotético Mb1767.
62
iv
5.3 Identificación de la proteína endógena Mb1767. 64
5.4 Futuros estudios para la proteína Mb1767. 66
6.- CONCLUSIONES 68
7.- BIBLIOGRAFÍA 69
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Alineamiento locus narK2-Mb1767 entre M. bovis AF2122/97 12
y M. tuberculosis H37Rv.
Figura 2. Curva de calibración para la determinación de proteínas 35
Figura 3: Contexto genómico del gen Mb1767 en M. bovis AF2122/27 41
Figura 4: Análisis filogenético y secuencia del gen Mb1767 46
Figura 5. Predicción de la estructura secundaria de las proteínas Mb1767 48
Figura 6: Estructura cuaternaria de la proteína Mb1767 50
Figura 7: Generación de vectores recombinantes 52
Figura 8: Purificación y caracterización de la proteína Mb1767 recombinante 54
Figura 9: Cuantificación de proteínas totales a partir de la yema de huevos 56
de gallinas inmunizadas.
Figura 10: Caracterización del anticuerpo anti-Mb1767 58
Figura 11: Identificación de la proteína endógena Mb1767 60
vi
INDICE DE TABLAS
Tabla I. Partidores utilizados en este estudio 22
Tabla II. Plásmidos usados en este estudio 24
Tabla III. Propiedades generales predichas por análisis bioinformático de la
Proteína Mb1767 a partir de su estructura primaria. 43
Tabla IV. Composición aminoacidica y abundancia relativa de la proteína Mb1767 44
vii
LISTA DE ABREVIATURA
BCA ácido bicinconínico
BCG Bacilo de Calmette-Guérin
H2Odd agua doblemente desionizada
dNTPs desoxinucleótidos trifosfatos
DETA/NO aducto dietilenetriamina / óxido nítrico
DNA ácido desoxirribonucleico
D.O. Densidad óptica
EDTA ácido etilén-diamino-tetra-acético
h horas
IPTG isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido
ISP Instituto de Salud Pública
ORF marco de lectura abierto
pb pares de bases
PCR reacción en cadena de la polimerasa
seg segundos
SDS dodecil sulfato de sodio
SNP polimorfismo de un solo nucleótido
Tm temperatura de fusión
UFC unidades formadoras de colonias
viii
1
1. RESUMEN
La tuberculosis (TB) es una enfermedad bacteriana crónica de los animales y del hombre,
causada por Mycobacterium bovis, bacilo del Complejo Mycobacterium tuberculosis (Manual de
la OIE, 2008). La transmisión de TB al hombre presenta un problema de salud pública global, ya
que un tercio de la población mundial está infectada de TB. M. bovis, el agente etiológico de TB
bovina, contribuye con un 10% a los casos de TB humana, al que infecta principalmente por vía
digestiva, a través de alimentos de origen bovino contaminados. M. bovis se encuentra
ampliamente distribuido en los países de América latina, causando importantes pérdidas
económicas. Se estima que las pérdidas a nivel mundial superan los 3 billones de dólares
anuales. A nivel genético, M. bovis y M. tuberculosis muestran un alto grado de identidad
genómica, superior al 99.95%, con 2437 polimorfismos de secuencia única (SNPs) (Garnier et
al., 2003). Además, M. bovis no posee genes únicos, lo que implica que distintos mecanismo de
control génico ocasionan las diferencias fenotípicas y de virulencia entre ambos patógenos.
Estudios comparativo de transcriptomas en condiciones aerobias, demuestran que un 6% de los
genes (258 genes), se expresan diferencialmente entre ambos bacilos, destacando genes
relacionados con el metabolismo intermediario, la pared celular y proteínas hipotéticas (Rehren et
al., 2007). Estudios de expresión a nivel de RNA, en cultivos sometidos a estrés por NO y Etanol
al 5% muestran que el gen Mb1767 aumenta su expresión hasta 50 veces (Palavecino, 2009).
En esta tesis se identificó la proteína codificada por el gen hipotético Mb1767 de M. bovis
y se demostró su expresión cuando el bacilo se somete a condiciones que simulan el
microambiente al interior del macrófago, lo que sugiere un rol de la proteína Mb1767 durante las
etapas post-infección por M. bovis.
2
1.1 SUMMARY
Tuberculosis (TB) is a chronic bacterial disease of animals and humans caused by
Mycobacterium tuberculosis (OIE Manual, 2008). TB transmission represents a global public
health problem, since a third of the world population is already infected with TB. Mycobacterium
bovis, the causative agent of bovine TB, contributes with around 10% to human TB cases. M.
bovis infects primarily via the digestive tract by contaminated foods of bovine origin. M. bovis is
widely distributed in Latin American countries, causing significant economic losses. It is
estimated that worldwide losses exceed US 3 billion annually. At the genetic level, M. bovis and
M. tuberculosis show a high degree of genomic identity, greater than 99.95% with only 2437
sequence polymorphisms (SNPs) (Garnier et al., 2003). Furthermore, M. bovis has not unique
genes, which suggests that different control mechanisms would be responsible for the phenotypic
differences displayed by among both virulent pathogens. Comparative transcriptome studies
among both bacilli grown under aerobic conditions, showed that a 6% of the genes (258 genes),
are differentially expressed. Among these the one related to intermediary metabolism, cell wall
and hypothetical proteins are the most abundant (Rehren et al., 2007). Expression studies
performed on M. bovis grown under NO and ethanol stress conditions showed that the expression
of the hypothetical gene Mb1767 increases 50 times (Palavecino, 2009).
In this thesis, the protein encoded by the hypothetical gene Mb1767 from M. bovis was
identified and its expression was confirmed in cultures grown under stress conditions that mimics
the environment of the bacilli whithin the macrophage. This fact suggested a role for the protein
in M. bovis during post-infection stages.
3
2.- INTRODUCCION
2.1 Tuberculosis
La tuberculosis (TB) es una enfermedad bacteriana crónica que afecta a animales y al
hombre, causada por el Complejo Mycobacterium tuberculosis (Manual de la OIE, 2008).
La TB es considerada la enfermedad infecciosa más importante causada por un solo agente
etiológico y asociado a su padecimiento, existe una alta tasa de mortalidad (Vashishtha 2009).
Solo en el año 2009, la organización mundial de la salud (WHO) estimo 9.4 millones de casos
nuevos de TB, con más de 1.7 millones de personas muertas por TB en el 2009 (WHO Global
tuberculosis control, 2010). El agente principal de esta enfermedad es Mycobacterium
tuberculosis (Mtb), un bacilo ácido-alcohol resistente que se transmite primariamente por vía
respiratoria.
Por otra parte, se ha estimado que entre un 5-10% de los casos de TB humana
corresponden a una tuberculosis zoonótica causada por Mycobacterium bovis (Wilkins, Meyerson
et al. 2008) que es el agente etiológico de tuberculosis bovina (bTB), En muchos países la bTB es
una enfermedad infecciosa importante del ganado vacuno, animales domésticos y algunas
poblaciones de animales salvajes. Además, es causante de una pérdida anual de 3 billones de
dólares en la ganadería. Esto es debido a que la bacteria infecta principalmente al ganado bovino
por exposición a aerosoles del patógeno, disminuyendo la producción de carnes y lácteos.
El control de esta zoonosis es complicado debido a que M. bovis es difícil de detectar de
forma oportuna. La falta de laboratorios debidamente capacitados para la detección del patógeno
mediante técnicas moleculares dificulta la aplicación de medidas de control efectivas, lo que
contribuye a su prevalencia. A lo anterior se suma el aumento de los individuos VIH
4
seropositivos en la población humana, pues estos son susceptibles a manifestar TB, producto de
la disminución de su respuesta inmune. (Ayele y Neill et al. 2004; Shitaye y Tsegaye et al. 2007).
M. bovis, ha sido aislado en personas positivas a VIH en algunos países industrializados, con una
grave complicación adicional de alta resistencia primaria a la isoniazida, pirazinamida y
estreptomicina (Ayele, Neill et al. 2004). En Chile, hasta el año 2008, no se han reportado casos
de tuberculosis zoonótica en humanos por el Instituto de Salud Pública (ISP) (de Kantor,
Ambroggi et al. 2008). Esto puede deberse a que no se utiliza rutinariamente el medio selectivo
necesario para el aislamiento de M. bovis. Actualmente el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG)
ha definido cuatros zonas de ocurrencia de tuberculosis bovina en Chile. El objetivo propuesto
por esta institución es disminuir la prevalencia en las zonas de control y eliminar la enfermedad
en las zonas de erradicación. En países con programas de erradicación de la bTB raramente se
observa evidencia clínica en el ganado, porque la prueba intradérmica de la tuberculina posibilita
el diagnóstico y la eliminación de animales infectados antes de que aparezcan los síntomas.
Las técnicas diagnósticas para la detección e identificación de M. bovis son variadas,
incluyendo la prueba de tuberculina derivada de proteínas purificadas (PPD), la prueba del
interferón gamma, la prueba de proliferación de linfocitos y el enzimoinmunoensayo (ELISA),
los que han resultado ser útiles como pruebas auxiliares en serie (para mejorar la especificidad) y
en paralelo (para mejorar la sensibilidad) en otros animales. La inoculación directa de M. bovis y
M. tuberculosis en cobayos y conejos se ha ensayado como prueba diagnóstica, en la cual sólo
M. bovis mata a los conejos en un plazo de 30-60 días, mostrando lesiones caseosas pulmonares,
extendidas al hígado, bazo y otros órganos (Smith 1898; Thoen, Lobue et al. 2006)
A nivel molecular se aplica PCR para el diagnóstico y diferenciación de los miembros del
complejo TBC con un alto grado de especificidad. Una diferencia importante entre M. bovis y M.
5
tuberculosis es el número de copias para la secuencia de inserción IS6110 (1361 pb) (Thierry,
Brisson-Noel et al. 1990), donde M. tuberculosis presenta entre 6 a 17 copias de esta secuencia,
mientras que M. bovis sólo entre 1 a 6 copias. Esta secuencia de inserción (IS) se ha utilizado
ampliamente como blanco para el diagnóstico y genotipificación, sin embargo su especificidad ha
sido cuestionada ya que el PCR IS6110 no permite diferenciar entre las bacterias pertenecientes
al complejo TBC, ni menos biovariedades de M. bovis. Actualmente, se utilizan técnicas con
mayor poder discriminatorio como el PCR-RFLP, PCR multiplex o ensayos de PCR tiempo real
diseñados específicamente para identificar a miembros del complejo (Zanini, Moreira et al. 2005;
Cardoso, Cardoso et al. 2009).
2.2 Mycobacterium bovis.
M. bovis, agente etiológico de la tuberculosis bovina, es una micobacteria perteneciente al
complejo M. tuberculosis (TBC) el cual está formado por seis especies: M. tuberculosis, causante
de la gran mayoría de los casos de tuberculosis humana; M. africanum, responsable de casos de
tuberculosis humana en África; M. microti, agente de la tuberculosis en roedores silvestres; M.
canettii, una variante que es raramente aislada, pero que puede causar la enfermedad en humanos;
BCG (bacilo de Calmette-Guérin), una variante atenuada de M. bovis y M. bovis, que si bien es el
principal agente de la tuberculosis en bovinos, es también capaz de infectar a un gran número de
especies, siendo este catalogado como un microorganismo infeccioso nivel III.
El complejo M. tuberculosis pertenece al orden de los Actinomycetales, suborden
Corynebacterineae, familia Mycobacteriaceae y género Mycobacterium. Se caracterizan por ser
bacilos rectos, cortos (0,3 - 0,6 x 0,5 - 0,6 μm), inmóviles, que no forman espora, cápsula ni
flagelos, aunque se ha observado en M.bovis BCG que presenta apéndices en su superficie
celular, los que se han relacionado en M.tuberculosis con estructuras tipo pilis de entre 2-3 nm
6
formadas por monómeros de una sola unidad proteica codificada por el gen Rv3312c (Dahl 2005;
Alteri, Xicohtencatl-Cortes et al. 2007). Estos bacilos resisten a la desecación pueden sobrevivir
por largos periodos de tiempo en el suelo, pero son sensibles a la luz solar directa, luz UV y
pasteurización (Peccia y Hernandez 2004).
M. bovis es considerado un organismo Gram positivo, aunque no se tiñe muy bien con
este método, siendo la tinción de Ziehl-Neelsen de elección, debido a las propiedades ácido
alcohol resistencia de su pared celular. Su crecimiento es muy lento en medios artificiales, con
una tasa de división de 22 hrs. Sus colonias son lisas y crece con dificultad (disgónicas) en
medios conteniendo glicerol como única fuente de carbono, además requiere de piruvato en el
medio para su crecimiento. Ambas características se deben a un polimorfismo de secuencia única
(SNP) en el gen pykA que codifica para la enzima piruvato quinasa (PK) que cataliza el paso
irreversible final en la glicolisis. Este SNP inactiva a la enzima PK (Keating, Wheeler et al.
2005). Además, M. bovis es resistente a la droga antituberculosa pirazinamida (PZA) (Niemann,
Richter et al. 2000), pero susceptible a isoniazida y rifampicina. En la actualidad, la especie M.
bovis ha sido subdividida en M. bovis subsp. bovis, resistente a PZA y M. bovis subsp. caprae,
sensible a PZA (Aranaz, Liebana et al. 1999).
M. bovis y M. tuberculosis están estrechamente relacionados, generando cuadros clínicos
en humanos que son indistinguibles entre sí. A nivel bioquímico, ambos patógenos solo pueden
diferenciarse mediante la reacción de reducción de nitratos y la prueba de la niacina, que en
ambos casos es positiva sólo para el bacilo humano. M. bovis es negativo a la reducción de
nitratos, debido a un SNP que silencia la expresión del gen narK2. Este gen codifica para un
transportador de membrana que permite el ingreso de nitratos al interior de la bacteria
(Chauhan, Singh et al. 2010).
7
2.3 Estadios de la infección
La infección con M. tuberculosis y M. bovis ocurre principalmente por vías respiratorias
alcanzando el espacio alveolar de los pulmones. Aquí, los bacilos interactúan con células
dendríticas, macrófagos alveolares y células epiteliales pulmonares, pero son principalmente
fagocitados por los macrófagos alveolares, los cuales son su principal hospedero. Las células
dendríticas juegan un papel importante en las etapas tempranas de la infección, porque son
mejores presentadoras de antígeno que los macrófagos alveolares (Tascon, et al., 2000). Aunque
inicialmente la infección ocurre en los pulmones, el patógeno puede alcanzar cualquier órgano
mediante la diseminación por vía hematógena.
La tuberculosis en muchos casos ha seguido un patrón general que es descrito por
Wallgren, quien dividió la progresión y resolución de la enfermedad en cuatro etapas (Wallgren,
A. 1948). En la primera etapa, entre la tercera a la octava semana, el bacilo se implanta en el
alveolo y se disemina por la circulación linfática hacia las regiones de los nódulos linfáticos en el
pulmón. En este momento ocurre la reactivación de la tuberculina. La segunda etapa que
comienza el tercer mes, el bacilo se disemina por la circulación hematógena a muchos órganos
incluyendo otras partes del pulmón, en algunos individuos la enfermedad puede ser grave e
incluso fatal, ya que puede ocurrir tuberculosis menigitidis o miliary. La pleuresia o inflamación
de la superficie pleural ocurre durante la tercera etapa y puede perdurar del tercer al séptimo mes
causando dolores de pecho, pero esta etapa se puede retrasar hasta dos años. Esta condición es
causada por la diseminación del bacilo por vía hematógena y la liberación de este hacia el espacio
pleural. La bacteria libre o sus componentes interactúan con linfocitos T CD4+ sensibilizados que
son atraídos, proliferan y liberan citoquinas inflamatorias (Kamholz, S. L,. 1996). La última etapa
puede tardar hasta tres años y suele cursar con un desarrollo lento de lesiones extrapulmonares
8
como por ejemplo dolor de espalda crónico. Sin embargo, la mayoría de las personas infectadas
con tuberculosis no presentan progreso de la enfermedad.
El ingreso de la micobacteria al macrófago es por el mecanismo de fagocitosis mediada
por receptor, existiendo para ello dos rutas por la cuales se produce el reconocimiento célula-
bacteria. En la primera, participan moléculas de la superficie bacteriana o proteínas de secreción
que activan a proteínas del complemento presentes en el espacio alveolar, las cuales serán
reconocidas por receptores de complemento (CRs) sobre los macrófagos que median la
fagocitosis (Schlesinger 1993). En la segunda ruta, los macrófagos alveolares reconocen residuos
de manosa de las micobacteria, particularmente lipoarabinomanana (LAM). Así la bacteria entra
directamente por medio de su unión a receptores de manosa (MR) presentes en el macrófago
(Fenton 2005).
Seguido al proceso de fagocitosis, la bacteria reside en el interior de vesículas conocidas
como fagosomas. Estos fagosomas maduran adquiriendo un pH ácido, hidrolasas degradativas e
intermediarios reactivos de oxígeno/ nitrógeno se fusionan con los lisosomas formando los fago-
lisosomas, estructuras en las cuales Mycobacterium se ve expuesto a la acción de enzimas
hidrolíticas, proteasas, superóxido dismutasa y lisozimas. Sin embargo, la bacteria puede evadir
la acción lítica de estas enzimas evitando la maduración del fagosoma, mediante una restricción
de la acidificación y la fusión de éste organelo con los lisosomas pre-formados, escapando así a
los mecanismos citotóxicos de defensa iniciales de los macrófagos. Esto le permite al bacilo
sobrevivir al interior de los fagosomas hasta que los mecanismos defensivos del hospedero se
debiliten y permitan la replicación bacteriana (Vergne, Chua et al. 2003; Russell 2007).
Otro mecanismo dentro del amplio abanico de supervivencia de la micobacteria, propone
que el bacilo es capaz de inhibir la apoptosis de los macrófagos infectados (Zhang, Jiang et al.
9
2005). El incremento en la producción de la interleuquina 10 (IL- 10), Bcl-2 y la reducción en la
producción de IL-12 y TNF-α por parte del macrófago infectado con M. bovis es fundamental
para promover la inhibición del proceso de muerte celular programada. Esto demuestra que las
micobacterias virulentas son capaces de modular las complejas vías internas de señalización
celular de una manera dependiente de la cantidad de bacterias intracelulares, lo cual beneficia su
crecimiento y posterior diseminación a las células vecinas. (Widdison, Schreuder et al. 2006;
Rodrigues, Barsante et al. 2009). Los macrófagos infectados que pueden entrar en apoptosis
liberan su contenido intracelular en forma de cuerpos apoptóticos, los cuales contienen antígenos
micobacteriales que luego son engullidos por células dendríticas no infectadas, procesados y
presentados vía el complejo mayor de histocompatibilidad tipo I (MHC-I). El resultado es la
activación de las células T CD8+ citotóxicas, las cuales destruirán a las células que presenten los
antígenos micobacteriales adecuados (Schaible, Winau et al. 2003). Se asume que la fagocitosis
de los cuerpos apoptóticos permite la eliminación de la célula muerta y de la bacteria contenida
en ella, con alteraciones mínimas en el tejido circundante. De esta forma se evita la liberación del
contenido intracelular al medio extracelular y la respuesta inflamatoria correspondiente,
controlando así la infección. Por el contrario, la necrosis favorece el crecimiento y diseminación
de Mycobacterium, exacerbando la inflamación y alterando el tejido circundante.
Se ha demostrado que para el control de la infección producida por M. bovis, es de
particular importancia la respuesta inmune vinculada con la producción de interferón gamma
(IFN-γ) por parte de los linfocitos T. El IFN- γ estimula la producción de intermediarios
reactivos de oxígeno y de nitrógeno, responsables de matar a las micobacterias al interior del
macrófago y además atenúa la respuesta proinflamatoria mediada por el factor de necrosis
tumoral alfa (TNF-α) secretado por los macrófagos infectados. En el ganado, las células T CD4+
10
son la población celular predominante en la producción de IFN-γ, el cual contribuye a la
inhibición del crecimiento intracelular del bacilo dentro del macrófago. La generación de células
epiteliales gigantes de Langhans. Posteriormente formarán el granuloma. Por otra parte, las
células T CD8+ se encargarán de lisar las células infectadas con M. bovis. Además, la interleucina
IL-12 promueve la producción de IL-8 por parte de los macrófagos activados, responsable de la
atracción y reclutamiento de células polimorfonucleares (PMNs) al sitio de infección.
A nivel tisular, el contacto inicial bacilo-hospedero se transforma en la lesión primaria,
caracterizada por ser una lesión amorfa, abundante en bacilos y con un infiltrado de células
mononucleares y neutrófilos. Conforme se desarrolla la respuesta inmune, aparece una lesión
secundaria que limita la dispersión de la bacteria, la cual se caracteriza por la presencia de células
gigantes multinucleadas y el reclutamiento de nuevos macrófagos y linfocitos. Ésta lesión está
circundada por células fibroblastoides, estructura conocida como granuloma o tubérculo. Su
función es controlar la diseminación de la infección a otros sitios del pulmón.
La transmisión de M. bovis puede ocurrir entre animales, de animales a humanos,
viceversa y raramente entre humanos (Evans, Smith et al. 2007). Las rutas por las cuales el
ganado bovino puede ser infectado son influenciadas por factores como la edad, ambiente y
prácticas agrícolas. La vía más frecuente de infección es por la inhalación de la bacteria presente
en aerosoles, toses y secreciones de animales enfermos y por ingestión de alimento contaminado.
En el ganado adulto, la tuberculosis se presenta como una enfermedad respiratoria, provocando
lesiones en los nódulos linfáticos del tracto respiratorio y en los pulmones. Cuando la vía
principal de infección es por la alimentación, las lesiones pueden presentarse en nódulos
linfáticos de la cabeza, cuello, mesenterio, hígado e intestinos (Pollock, Rodgers et al. 2006). Se
ha demostrado que sólo basta con una dosis infectante muy baja (entre 6-10 bacilos viables)
11
administrada vía intra-traqueal para generar la patología tuberculosa bovina típica (Dean, Rhodes
et al. 2005).
2.4 Genoma de Mycobacterium bovis
M. bovis y M. tuberculosis presentan un alto grado de identidad genómica, superior al
99.95%, con 2437 polimorfismos de secuencia única (SNPs) (Garnier, Eiglmeier et al. 2003).
Además, M. bovis no posee genes únicos, lo que implica que sus diferencias fenotípicas y
virulentas respecto a M. tuberculosis se deben a una expresión génica diferencial (Rehren,
Walters et al. 2007). A nivel de transcriptoma, en condiciones aerobias, un 6% (258 genes) se
encuentra diferencialmente expresado entre estas dos especies, destacando genes relacionados
con el metabolismo intermediario, la pared celular y proteínas hipotéticas. Entre estas últimas,
resulta particularmente interesante los patrones de expresión del gen Mb1767 de M. bovis y su
ortólogo Rv1738 en M. tuberculosis, que codifican para una proteína hipotética conservada.
Resultados obtenidos en nuestro laboratorio, en la cepa AF2122/97 de M. bovis muestran que el
gen Mb1767 se activa sobre 50 veces, bajo estrés por óxido nítrico. En tanto que su ortólogo
Rv1738 en M.tuberculosis H37Rv es activado entre 3 a 5 veces por hipoxia u óxido nítrico
(Palavecino, 2009). En el genoma de M. bovis, el gen Mb1767 se localiza contiguo al operón
narK2X codificado en sentido opuesto, separados por una región intergénica de 286 pb (Figura
1).
El locus narK2-Rv1738 codifica para un trasportador de nitratos y una proteína hipotética,
respectivamente. La región intergénica que separa ambos genes presenta 3 motivos de
12
Figura 1: Alineamiento locus narK2-Mb1767 entre M. bovis AF2122/97 y M. tuberculosis
H37Rv. Línea vertical presente en area roja de alta similitud de secuencia indica el SNP en la
región intergénica del locus.
13
unión al regulador transcripcional DosR, siendo necesaria la interacción de la proteína reguladora
en los 3 sitios para una inducción completa de la actividad promotora divergente de Rv1738 y
narK2, lo que permite la transcripción en ambos sentidos (Chauhan y Tyagi 2008). Para ambos
genes, los autores sólo detectaron la inducción de la actividad promotora bajo condiciones de
hipoxia, no así bajo condiciones aeróbicas. Además, al menos un motivo de unión a dormancy
survival regulator (DosR) que se encuentra sobrepuesto con el elemento promotor -35, lo que
probablemente permite algún tipo de interacción con la RNA polimerasa bacteriana (Chauhan y
Tyagi 2008).
La mutación puntual presente en la región intergénica narK2-Mb1767 es clave para la
inducción del gen hipotético Mb1767 en cultivos estresados con óxido nítrico (Santibañez, 2012).
2.5 El regulón DosR de Mycobacterium
M. tuberculosis y M. bovis, a pesar de ser aerobios obligados, tienen la capacidad de
sobrevivir en medios hipóxicos debido a un cambio en su estado de crecimiento aerobio a un
estado de persistencia no replicativa o estado de latencia (Wayne and Hayes 1996; Hutter and
Dick 1999). Al estudiar las variaciones de los perfiles de expresión génicos producidos en
cultivos hipóxicos, se han identificado más de 100 genes que modifican rápidamente su expresión
(Sherman, Voskuil et al. 2001). La mayoría de los genes cuya expresión se reprime están
relacionados con el metabolismo aerobio y anabolismo (Voskuil, Schnappinger et al. 2003). En
contraparte, aproximadamente 50 genes activan su expresión en condiciones hipóxicas. De estos,
al menos 48 genes son igualmente activados en cultivos de bacterias sometidas a estrés oxidativo
con oxido nítrico (NO). Estos genes constituyen el regulón de latencia controlado por el factor
transcripcional DosR (dormancy survival regulator), una proteína de ~26 KDa (Park, Guinn et al.
2003). Los genes pertenecientes a este regulón son co-regulados por el factor DosR, mediador de
14
la activación de un programa genético inducido por hipoxia, NO y monóxido de carbono. Estas
condiciones inhiben reversiblemente la respiración aeróbica y previenen la replicación del bacilo,
permitiendo o facilitando a la bacteria entrar en un estado de latencia o persistencia no replicativa
in vivo conocido como dormancy en experimentos in vitro (Voskuil, Schnappinger et al. 2003).
En esta etapa el bacilo adquiere una viabilidad que puede abarcar períodos prolongados de
tiempo y resistencia a agentes anti-micobacteriales.
El clúster de genes del regulón DosR se expresa también tempranamente dentro de
macrófagos estimulados con IFN-γ y células dendríticas infectadas de ratones y cerdos de guinea
(Schnappinger, Ehrt et al. 2003; Karakousis, Yoshimatsu et al. 2004). La inducción del regulón es
reprimida en macrófagos no activados o deficientes de la enzima inducible NO sintasa (iNOS), lo
que es consistente con la inducción de este regulón por NO observada in vitro. Ratones
deficientes de iNOS no son capaces de sobrevivir a una infección por M. tuberculosis.
Recientemente se ha demostrado que un mutación puntual en el gen de la iNOS humana
influencia la susceptibilidad a contraer tuberculosis en el hombre (Gomez, Anaya et al. 2007).
Mycobacterium utiliza un sistema atípico de tres componentes conocido como
DosS/DosT/DosR para medir la tensión de oxígeno, monóxido de carbono, el estado redox del
ambiente intracelular y la presencia de óxido nítrico. Este sistema está encargado de regular el
programa genético involucrado presumiblemente en la respuesta adaptativa a las condiciones
hipóxicas y de estrés encontradas en los tejidos in vivo. (Roberts, Liao et al. 2004; Saini,
Malhotra et al. 2004). El gen Rv2027c (devT) y Rv3132c (devS) codifican para proteínas de
membrana tipo quinasas autofosforilables dependientes de ATP conocidas como DosT y DosS,
respectivamente (~62 KDa cada una). La primera funciona como un sensor no inducible de la
tensión de oxígeno y la segunda actúa como un sensor del tipo redox inducible por hipoxia,
15
siendo el O2, NO y CO los ligandos modulares de sus actividades histidina-quinasa (Kumar,
Toledo et al. 2007). Bacterias mutantes que pierden ambos sensores son incapaces de activar la
expresión de los genes pertenecientes al regulón DosR y no pueden adaptarse a ambientes
hipóxicos. La deleción de un sensor a la vez ha demostrado que DosS y DosT contribuyen de
igual forma y de manera independiente a la inducción del regulón DosR, constituyendo un
mecanismo de activación redundante (Roberts, Liao et al. 2004).
En el modelo de “sense and lock” propuesto por Kumar (Kumar, Toledo et al. 2007) los
ligandos CO y NO se unen al átomo de fierro del grupo hem de la proteína sensora en la forma
Fe2+
y no a la forma Fe3+
. DosT en su estado inactivo (Fe3+
) puede sensar la tensión de oxígeno
(hipoxia) y DosS el balance redox. Ambos pueden activarse (Fe2+
) en caso de poca disponibilidad
de O2 o en presencia de un agente reductor no identificado, respectivamente. La unión del ligando
induce un cambio conformacional del sensor que se traduce en autofosforilación de un residuo
conservado de histidina acoplado a la hidrólisis de ATP. Luego, mediante la actividad fosforil-
transferasa, el sensor puede transferir el grupo fosfato a un residuo Asp54
del regulador DosR
(también llamado DevR de differentially expressed genes in the virulent M. tuberculosis).
El factor DosR es inducible por múltiples agentes de estrés, como hipoxia, NO, H2O2 y
etanol (Kendall, Movahedzadeh et al. 2004). La fosforilación de DosR aumenta su afinidad de
unión a un motivo de DNA consenso conocido como DosR box (G4G5G6A7C8T9), el cual está
presente en la región promotora río arriba de los genes pertenecientes al regulón DosR (Park,
Guinn et al. 2003). La interacción del DNA con este factor transcripcional ha sido demostrada.
En este modelo, tres aminoácidos (Lys179
, Lys182
y Asn183
) del dominio C-terminal interactúan
con cuatro bases conservadas del motivo DosR (G4G5G6 y C8), permitiendo la inducción de la
transcripción de los genes blanco localizados río debajo (Wisedchaisri, Wu et al. 2005).
16
El regulón DosR está altamente conservado entre las diferentes especies de
Mycobacterium (Alvarez, Estrada-Chavez et al. 2009; Bartek, Rutherford et al. 2009) y su
inducción es rápida y transitoria en cultivos hipóxicos, retornando aproximadamente la mitad de
los genes de este regulón a su nivel de expresión basal dentro de 24 horas post inducción (Rustad,
Harrell et al. 2008). Se ha propuesto que este regulón es clave para la recuperación rápida del
crecimiento de Mycobacterium a partir de un estado no replicativo inducido por estrés con NO o
anaerobiosis (Leistikow, Morton et al. 2010) y que sus proteínas codificadas son parte de una
estrategia programada empleada por el bacilo en ausencia de respiración aerobia para asegurar el
suministro de energía en condiciones de estrés. Por otra parte, el papel de este regulón en la
virulencia de Mycobacterium es incierto, los estudios son poco concluyentes y controversiales
dependiendo del modelo animal usado (Florczyk, McCue et al. 2003), (Malhotra, Sharma et al.
2004). Estos resultados, sumados a otros estudios, han llevado a plantear que mutantes para dosR
presentan tan sólo un pequeño defecto en el crecimiento normal del bacilo (Converse, Karakousis
et al. 2009) por lo que se piensa que DosR jugaría un papel clave en los mecanismos de
virulencia de Mycobacterium (Parish, Smith et al. 2003; Hu, Movahedzadeh et al. 2006).
2.6 Proteínas hipotéticas conservadas
Cuando se determinó la secuencia del genoma de M. tuberculosis, los autores asignaron la
función a los genes de acuerdo a comparaciones por similitud con diversas bases de datos,
incluyendo EMBL, TREMBL y SWISSPROT (Cole, Brosch et al. 1998). Esta metodología
permitió asignar inicialmente una función a alrededor del 40% de las proteínas predichas. Un
44% mostró alguna similitud o información relacionada con proteínas conocidas. El 16% restante
correspondió a proteínas desconocidas que podrían relacionarse con funciones específicas de las
micobacterias.
17
La categoría proteínas conservadas reúne aquellos genes que codifican para proteínas de
función desconocidas, pero que presentan cierta similitud con proteínas conocidas. Los resultados
del análisis transcripcional comparativo mostraron que 19 de los genes con mayor expresión en
M. bovis pertenecen a este grupo, lo que corresponde a un 20% del total estudiado. En M.
tuberculosis, 22 de los genes identificados, es decir un 13,5% del total, corresponde a esta
categoría. Este resultado enfatiza la necesidad de asignar una función a estas proteínas, lo que
permitiría determinar la participación que este grupo de genes pudiese tener las diferencias
fenotípicas descritas entre ambos bacilos.
18
2.7 Hipótesis de trabajo
El gen hipotético Mb1767 se expresa a niveles basales en cultivos normales, induciéndose
significativamente su expresión a nivel de transcrito por sobre 50 veces ante la exposición de M.
bovis a NO, en tanto que su ortólogo en M. tuberculosis se activa entre 3 a 5 veces en iguales
condiciones (Palavecino, 2009). La localización del gen Mb1767 es contigua al operón narK2X,
codificado en sentido opuesto y separado por una región intergénica de 286 pares de bases, la
cual contendría hipotéticamente la región promotora y elementos reguladores con motivos de
unión al factor de transcripción DosR. La mutación puntual (SNP) presente en la región
intergénica narK2-Mb1767 es clave para la inducción del gen hipotético Mb1767 en cultivos
estresados con óxido nítrico (Santibañez, 2012).
Teniendo en cuenta lo anterior y dada la importancia que pueden tener los genes
hipotéticos en la virulencia de M. bovis, esta tesis propone identificar la proteína codificada por el
gen hipotético Mb 1767 de M. bovis y evaluar su expresión en condiciones de estrés con NO para
simular la exposición del bacilo al ambiente interno del macrófago.
19
Hipótesis
El gen hipotético Mb1767 codifica para una proteína que se expresa en la cepa virulenta de
Mycobacterium bovis AF2122/97.
Para la validación de la hipótesis se plantean los siguientes objetivos:
Objetivo general
Caracterizar e identificar la proteína del gen hipotético Mb1767 de Mycobacterium bovis
AF2122/97.
Objetivos específicos
Establecer in silico las propiedades y características de la proteína hipotética codificada
por el gen Mb1767 a partir de una secuencia descrita previamente en un banco de datos.
Expresar la proteína recombinante en E. coli para desarrollar anticuerpos específicos que
permitan la identificación de la proteína
Detectar la proteína Mb1767 a través del anticuerpo anti-Mb1767 en cultivos de M.bovis
AF2122/97 crecidos en condiciones normales y bajo estrés.
20
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
3.1.1 Reactivos
Becton Dickinson: Suplemento AODC (ácido oleico, albumina, dextrosa y catalasa)
BiosChile: Puntas plásticas micropipetas Axygen y tubos eppendorf de 0.6 y 1.5 ml Axygen
Difco: Medios de cultivo 7H9, Medio LB, Tween 80.
Invitrogen: Enzimas Taq platinum DNA polimerasa, SuperScript II, protein standard novex
Sharp prestained
Fermentas: Marcadores de peso molecular GeneRuler de 100 pb y 1 Kb, dNTPs, Buffer de carga
6X, enzimas de restricción BamHI, NdeI.
Omega Bio-Tek: Plasmid Miniprep Kit II, Plasmid Midiprep Kit, DNA Clean Up concentrator
Kit, DNA Microelute Kit
Merck: Etanol grado biología molecular, SDS, cloruro de sodio, fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico 25:24:1, glicina, imidazol, buffer TAE10X, buffer Tris-SDS10X, PBS10X.
TCL: Tubos falcons de 15 y 50 ml, filtros de acetato de 0,2 µM, pipetas desechables de 10 y 25
ml.
Thermo Scientific: Pierce BCA protein assay, nanodrop 2000, termociclador Thermo Hybaid
modelo Px2, diaminobenzidina(DAB), membrana de nitrocelulosa, anticuerpo de conejo contra
IgY de gallina conjugado a peroxidasa,
USBiological: Ampicilina, IPTG
21
Winkler: Metanol, reactivo de Bradford, azul de metileno, azul de bromofenol, N,N,N,´N´-
tetrametiletilendiamina(Temed), tween20.
3.1.2 Equipos
Termociclador G-STORM, Agilents tecnologic FPLC Akta prime plus General Electric, Ultralum
Mega.
3.1.3 Oligonucleótidos:
En la tabla I se indica las secuencias de los partidores utilizados en este estudio.
22
Tabla I: Partidores utilizados en este estudio:
PCR Partidores Secuencia Origen
Clonación
gen
Mb1767 de
M.bovis
Mb1767f 5´-TTCATATGATGTGCGGCGACCAGTCGGAT-3´ Este estudio
Mb1767r
5´-TTGGATCCTCAATACAACAATCGCGCCG-3´ Este estudio
Verificación
Clon
pJET-1767
pJET1.2f 5´-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3´
Este estudio
pJET1.2r
5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’
Este estudio
Verificación
Clon
pET15b-
1767
pet_f 5´-TTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCC3´ Este estudio
pet_r 5´-GATCTTCCCCATCGGTGATGTCG3´ Este estudio
23
3.1.4 Plásmidos
En la tabla II se indican los plásmidos utilizados en este estudio.
24
Tabla II. Plásmidos usados en este estudio:
Plásmido Característica Origen
pJET-1767 AmpR, eco47IR, PlacUV5, promotor T7, rep(pMB1). Este estudio
pET15b-
1767
AmpR, T7lac, His.Tag, Trombina.
Este estudio
25
3.1.5 Material Biológico
Cepas de referencia:
Mycobacterium bovis AF2122/97 (ISP)
Escherichia coli JM109 (Promega)
Escherichia coli BL21 (Promega)
3.1.6 Sistemas informáticos
Vector NTI 10 (Invitrogen)
Image J 1.44p (National Institutes of Health, USA)
Herramientas disponibles en el servidor expasy (http://expasy.org/proteomics )
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Análisis Bioinformática
Para el diseño de partidores del gen Mb1767 de M.bovis, se utilizó el programa
computacional Vector NTI (v.10.3.0) con una base de datos creada con el genoma de
Mycobacterium bovis AF2122/97 descargada de GenBank. Con este programa se realizó ensayo
de restricción in silico, almacenamiento de secuencias y diseño de plásmidos recombinantes.
Los alineamientos de regiones del genoma de M. bovis AF2122/97 (NP_855419.1) con el
de M. tuberculosis H37Rv (NP_216254.1) se realizaron con la aplicación disponible en la base
de datos Xbase (http://www.xbase.ac.uk/mycodb/ ).
El análisis de la proteína hipotética Mb1767 se realizó con herramientas disponibles del
programa Vector NTI y aplicaciones de libre acceso disponibles en el servidor Expasy
proteomics (http://expasy.org/ ).
26
3.2.2 Cultivo microbiológico
3.2.2.1 Cultivo bacteriano de rutina
Los cultivos de E. coli JM109 se realizaron en medio líquido de Luria-Bertani (LB)
(triptona 1%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 1%, estéril por autoclave) o en medio sólido LB
con agar al 1.5% final. Para el medio líquido o sólido selectivo, se adicionó ampicilina (Amp+) a
100 µg/ml. Los cultivos líquidos se realizaron a 37°C por ~12 horas con una agitación fuerte de
~300 rpm, a partir de colonias aisladas crecidas en placas, o bien de stocks almacenados a -80°C.
Las placas se incubaron por toda la noche a 37°C. Los medios líquidos y placas se almacenaron a
4°C hasta su utilización.
3.2.2.2 Cultivo de M. bovis
El trabajo con M. bovis AF2122/97 se realizó en un laboratorio de contención nivel III.
Las placas se prepararon con Middlebroock 7H10, suplementado con 10% de AODC, 0.5% de
piruvato, agar 1,5% y se incubaron por 3-4 semanas a 37°C. Los cultivos líquidos se realizaron
en medio Middlebroock 7H9, suplementado con AOCD al 10% final, Tween 80 al 0.05% y
piruvato al 0.5%. Los cultivos se incubaron a 37°C y 100 rpm de agitación por aproximadamente
9 días para la extracción de proteínas totales.
3.2.2.3 Cultivo en condiciones de estrés
M. bovis se cultivó en pares de cultivos líquidos independientes, en las condiciones ya
descritas. Los cultivos fueron ajustados a una misma D.O540
e incubados durante 2 horas, para
luego adicionar a uno de ellos, el dador de óxido nítrico DETA/NO a una concentración final de
50 μM. En los experimentos de estrés, los cultivos se incubaron durante 40 min con NO y por 90
27
min con SDS. Al término del período de incubación, los cultivos fueron centrifugados a 4000 g
por 3 min a 37°C y el sedimento se congeló rápidamente en hielo seco, para luego ser
almacenado a -80°C hasta su procesamiento. Una vez inoculados, los tubos se cerraron
firmemente y se envolvieron con parafilm para generar hipoxia. Los cultivos se incubaron a 37º C
en agitador magnético Biostir 4 Heavy Duty (Wheaton Science) a 120 r.p.m.
3.2.3 Extracción de ácidos nucleicos bacterianos
3.2.3.1 Extracción de DNA plasmidial de E. coli a pequeña escala
Colonias transformadas de E. coli se cultivaron en 5 ml de medio LB con el antibiótico de
selección requerido (Amp+) por ~12 horas a 37°C y 300 rpm. Las células se sedimentaron por
centrifugación a 4000 rpm por 10 min a 4°C eliminándose el sobrenadante. Para la extracción del
DNA plasmidial a partir del sedimento se utilizó el kit Plasmid Miniprep Kit II (Omega bio-tek,
Inc) siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA así obtenido se utilizó para reacciones de
PCR y ensayos de restricción.
3.2.4. Extracción orgánica y precipitación del DNA
La muestra cruda de DNA se mezcló por vortex con un volumen de fenol: cloroformo:
alcohol isoamílico (25:24:1) y se centrifugó a 13000 rpm por 5 min. La fase acuosa superior se
transfirió a un tubo limpio y se mezcló con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1).
La muestra se centrifugó a 13000 rpm por 5 min, recuperándose la fase superior. El DNA se
precipitó con 0.6 volúmenes de isopropanol/ 0,12 M de acetato de sodio y se incubó a -20°C por
30 min. El DNA se sedimentó por centrifugación a 15000 rpm a 4°C por 30 min. El pellet se lavó
2 veces con etanol 75% y una vez seco al aire se resuspendió en 50 µL de agua PCR.
28
3.2.5 Cuantificación de ácidos nucleicos
La concentración de ácidos nucleicos se midió a partir de 1 µL de la muestra en un
espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) a una longitud de onda de 260 y 280 nm,
asumiendo que 1 unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 50 µg/ml de DNA de doble hebra y
a 40 µg/ml de RNA. La relación D.O260/D.O280 permitió ver el grado de pureza de las
suspensiones respecto a la contaminación con fenol o proteínas.
3.2.6 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Los geles de agarosa se prepararon al 1% en tampón TAE 1X (Tris-acetato 40 mM,
EDTA 1 mM) para visualizar DNA plasmidial y al 1.5% para los productos PCR. El tampón de
corrida fue TAE 1X y el buffer de carga fue azul de bromofenol 0,25%, xilen cianol 0,25% y
glicerol 30% y intercalante fluorescente (red gel) 1X en agua. Las muestras se corrieron entre 80
a 100 voltios por 30 a 45 min y la visualización se realizó en un transiluminador UV. Las
imágenes se capturaron con un sistema de fotodocumentación.
3.2.7 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS- PAGE)
SDS-PAGE se realizó por el método descrito por Laemmli (1970). Se utilizó el sistema de
electroforesis “Mini Protean Tetra Cell” de Bio-Rad en placas de 1,5 mm de espesor. El gel
separador se preparó a una concentración final del 15% de acrilamida/bisacrilamida (29/1) en una
solución amortiguadora de Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; SDS 10%; persulfato de amonio al 10% y
TEMED puro. Posteriormente, se agregó el gel espaciador a una concentración final del 10%
acrilamida/bisacrilamida (29/1) en una solución amortiguadora de Tris-HCl 1,5 M pH 6,8; SDS
10%; persulfato de amonio al 10% y TEMED puro. Los geles se cargaron con 50 μg de muestra
en un volumen final de 50 μl. Con 5 μl de buffer de carga 10X (Tris-HCl 62,5mM pH6,8; SDS
2%; glicerol 2%; β-Mercaptoetanol y Azul de bromofenol 0,01%) y se denaturaron las proteínas
29
a 99°C por 10 min. La corrida electroforética se realizó con los geles inmersos en buffer de
corrida 1X (Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM y SDS 0,1%) a 27 mA por 120 min. Las proteínas
en el gel se tiñeron con una solución de azul de Coomasie R 0,2% disuelto en isopropanol 25% y
acido acético 10% durante 60 min. Para eliminar exceso de coloración, se utilizó solución de
desteñido con isopropanol 15% y acido acético 10%.
3.2.8 Preparación del extracto crudo de proteínas de Mycobacterium sp.
El cultivo secundario se centrifugó a 2000 rpm por 5 min y el sedimento se resuspendió
en 500 µL de buffer salino (PBS1X). Luego se centrifugó 3 veces a 4000 rpm por 5 min
resuspendiendo cada vez con buffer salino. El último sedimento se resuspendió en 500 µL de
buffer de lisis (50 mM Tris; 5 mM EDTA; 0,6% SDS y 1/25 PMSF) y se sonicó 5 veces por 15
seg. Finalmente, la muestra se centrifugó a 13000 rpm por 20 min a 4 °C recuperándose la
fracción soluble.
3.2.9 Generación de plásmidos recombinantes.
3.2.9.1 Amplificación del gen Mb1767 de M.bovis por PCR
Se realizó la amplificación por PCR del gen Mb1767 a partir de ~10 ng de DNA
genómico de M. bovis AF2122/97. La mezcla de reacción fue: 1X buffer PCR (Tris-HCl 20 mM
pH 8,4; KCl 500 mM), 2 mM de MgCl2, mix de dNTPs (0,2 mM C/U), 1 unidad de Taq DNA
polimerasa (Promega), 0,2 µM de cada partidor específico en un volumen final de 20 µl. El
programa en el termociclador consistió de una etapa de denaturación inicial a 95ºC por 10 min,
seguida de 30 ciclos de denaturación a 94º C por 45 segundos, hibridación a 68º C por 50
segundos y extensión a 72º C por 60 segundos. La extensión final se hizo a 72º C por 5 min. Los
productos generados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
30
3.2.9.2 Clonación de los productos PCR en el vector pJET1.2/blunt
La amplificación del gen Mb1767 generado por PCR, se ligaron al vector de clonación
pJET1.2/blunt siguiendo el siguiente protocolo :
Componentes de la reacción de ligación a pJET1.2/blunt
La mezcla se centrifugó de 3-5 segundos. Posteriormente, se incubó a 70 ºC por 5 min y luego se
enfrió en hielo y se adicionó los componentes indicados a continuación:
Componente reacción Volumen
pJET1.2/blunt 1 µL (50 ng)
T4 DNA ligasa 1 µL
Volumen total = 20 µL
La mezcla de ligación final se incubó a temperatura ambiente (22 ºC) por 5 min.
La cantidad de producto PCR agregado para la ligación va a depender de la razón óptima usada,
la cual se ajustó con la siguiente fórmula:
Componente reacción Volumen (X1)
Buffer de ligación 2X 10 µL (1X)
Producto PCR X*
DNA Blunting Enzyme 1 µL
Agua PCR 6 µL
31
Para la transformación se utilizaron células competentes E. coli JM109 con 10 µL de la mezcla
de ligación. La selección de transformantes se realizó por PCR.
3.2.9.3 Liberación del fragmento clonado en pJET1.2/blunt
Los clones de E. coli JM109 con el vector pJET1.2/blunt con el inserto clonado,
confirmado previamente por PCR y análisis de restricción, se cultivaron en medio LB/Amp+, a 37
°C por ~18 hrs, 300 rpm. La extracción de DNA plasmidial a pequeña escala se llevó a cabo con
una alícuota de 10 mL de estos cultivos. El plásmido así aislado (~1 µg) se sometió a doble
digestión primero con 1 unidad de la enzima de restricción NdeI a un volumen final de 50 µL con
buffer de enzima 10X y agua PCR. La mezcla se incubó toda la noche a 37 °C y se inactivó a 65
°C por 20 min. Luego, el plásmido fue digerido con 1 unidad de BamHI y se llevó a un volumen
final de 100 µL con buffer de enzima 10X y agua PCR. Se incubó la mezcla toda la noche a 37
°C. La totalidad de la muestra anterior se cargó en un gel de agarosa al 1,5%. El fragmento
escindido del vector se purificó desde el gel utilizando un kit comercial (Omega Bio-tek) y
resuspendido en agua PCR para su almacenamiento a -20°C hasta su uso.
3.2.9.4 Linealización del vector pET15b.
El vector pET15b se propagó previamente en E. coli JM109. Una alícuota de cultivo
líquido de esta cepa se utilizó para extracción del DNA plasmidial a pequeña escala. El vector
purificado se linealizó como se describe en 2.2.9.3 y se analizó por electroforesis en gel de
agarosa al 1%. Confirmada la restricción, se procedió a purificar el DNA utilizando el kit Clean-
up Concentrator (Omega Bio-Tek).
32
3.2.9.5 Subclonación en el plásmido pET15b
El vector pET15b linealizado se utilizó para subclonar el fragmento purificado de la doble
digestión del vector pJET1.2/blunt con NdeI y BamHI generados en 2.2.9.3. Para ello, se
mezclaron los componentes:
Componentes de la reacción de ligación a pET15b.
X*: Volumen de solución con inserto agregado para la ligación.
La optimización de la cantidad de inserto requerido para la reacción se calculó con la misma
fórmula del punto 3.2.9.2. La mezcla de reacción se incubó a 15°C por ~18 horas. Luego se
guardó la mezcla a 4°C hasta ser utilizada para transformar células competentes de E.coli BL21.
3.2.10 Transformación de células bacterianas
3.2.10.1. Preparación de células competentes de E. coli JM109 y E. coli BL21
A partir de un cultivo primario de 5 ml de caldo LB incubado toda la noche a 37°C se
inoculó 1 ml a 100 ml de medio LB. El caldo inoculado se incubó a 37°C con agitación fuerte por
2-3 hrs o hasta que la D.O590nm sea 0,375. Después de enfriar el cultivo por 30 min sobre hielo, se
centrifugó a 5000 rpm por 10 min a 4°C. El sedimento se resuspendió con 15 ml de CaCl2 frío al
Componente reacción Volumen
Buffer de ligación 10X 1 µL
pET15b lineal/cohesivos 1 µL (50 ng)
Inserto purificado X*
T4 DNA ligasa 1 µL
Agua PCR Completar a 10 µL final
33
0,1 M y se incubó por 20 min más sobre hielo. Luego, la suspensión se centrifugó nuevamente y
se lavó el sedimento con 10 ml de CaCl2. Después de sedimentar las células, éstas se
resuspendieron en una solución de CaCl2 0,1 M/ 15% glicerol. Volúmenes de 100 µL de las
bacterias competentes se alicuotaron en viales para ser almacenados a -80°C hasta su uso.
3.2.10.2. Transformación de E. coli JM109 y E. coli BL21 DE3
Un volumen de 10 µL de la reacciones de ligación vector-inserto o ~ 50 ng de vector
circularizado, se incubaron sobre hielo con 90 µL de E. coli competentes por 30 min. Luego se
aplicó un shock térmico a 42°C por 90 seg y se incubó la mezcla 2 min sobre hielo. Al mismo
tubo con la reacción, se le agregó 800 µL de medio LB y se incubó 1 h a 37°C con agitación
suave. Un volumen de 100 µL de las células transformadas se sembró en placas de agar LB con
ampicilina (100 µg/ml). Las placas se incubaron toda la noche a 37°C.
3.2.11. Expresión y purificación de la proteína Mb1767 de M.bovis.
3.2.11.1 Inducción cualitativa de la proteína Mb1767 con IPTG.
Para la inducción de la proteína Mb1767 células de E.coli BL21 DE3 se transformaron
como se describe en 2.2.10.2, luego se picó una colonia y se inoculó en 2 ml de medio LB y se
incubó toda la noche a 37 °C a 200 rpm. De este precultivo se tomó 400 µL y se inocularon a 1,6
ml de caldo LB con ampicilina (100 µg/ml) agregándose 0,4 mM de IPTG final. El cultivo se
incubó por 4 horas a 37°C a 200 r.p.m. La confirmación de la inducción cualitativa de la proteína
hipotética Mb1767 se hizo por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 15% con 10 µL del
cultivo.
3.2.11.2 Expresión cuantitativa de la proteína Mb1767
Para la expresión de la proteína Mb1767, células de E.coli BL21 DE3 se transformaron
con el clon pET-Mb1767, como se describe en 3.2.10.2, luego se picó una colonia y se inoculó en
34
50 ml de medio LB incubándose toda la noche a 37 °C a 200 rpm. El precultivo se centrifugó por
7 min a 7000 rpm a 4º C. El sedimento se resuspendió en 50 ml de medio LB-Tris 20mM pH 7.5.
Se inoculó en un matraz con 1L de medio LB-Tris pH 7.5 y ampicilina (100 µg/ml) con 10 ml de
la suspensión anterior. Este cultivo se incubó a 37º C con una agitación de 250 rpm por 12 h.
Luego se agregó el inductor IPTG a una concentración 0,4 mM final. Para inducir la expresión de
la proteína, el cultivo se incubó por 4 h con una agitación constante de 250 rpm. a 37ºC.
3.2.11.3 Lisis bacteriana.
Las células se colectaron por centrifugación a 7000 rpm. por 7 min y 4º C, el sedimento
celular se resuspendió en 300 ml de solución tampón de unión (imidazol 40 mM, NaCl 4 M, Tris-
HCl 160 mM, pH 7,5) conteniendo además Tritón X-100 0,4 % y 2 mM de PMSF. La lisis
celular se realizó en hielo por 4 h con agitación esporádica. Posteriormente, la suspensión se
sonicó con 15 golpes de 10 seg a una intensidad de un 60%.
3.2.11.4 Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico
La concentración de proteínas totales se determinó con el kit BCA protein assay (Pierce).
Un volumen de 100 µL de cada ELC se mezcló con 1 ml de la solución de trabajo (Reactivo A:
Reactivo B, 50:1) y se incubó por 30 min a 37°C para luego ser medida su absorbancia a 562 nm.
La concentración de proteínas de cada muestra se estimó en base a su absorbancia medida e
interpolada en una curva de calibración con seroalbúmina bovina diluida en Tris-HCl pH 8
mostrada en la figura 2.
35
Figura 2. Curva de calibración para la determinación de proteínas. La curva representa
diluciones seriadas de un stock de 2 mg/ml de seroalbúmina bovina en Tris-HCl pH8 y su
respectiva D.O562nm
Concentración BCA (mg/ml)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
A 5
62
nm
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
36
3.2.11.5 Cromatografía de afinidad en columna Sefarosa-níquel.
La purificación de la proteína Mb1767 se realizó con una cromatografía de afinidad en
columna Sefarosa-níquel a temperatura constante de 4ºC. Para ello, el producto de la lisis
bacteriana se sometió a centrifugación por 30 min a 10.000 rpm. y 4ºC. El sobrenadante se cargó
en una columna de cromatografía que contenía 15 ml de la resina Sefarosa-níquel. Esta columna
se equilibró previamente en tampón de unión (Tris HCl 20mM, EDTA 0,1mM, Imidazol 5mM,
pH 7.5). Posteriormente, la columna se lavó con 5 volúmenes de solución tampón de unión,
seguido de 5 lavados con 60 ml de la solución tampón de lavado, que contenía 60 mM imidazol.
Finalmente, la proteína Mb1767 se eluyó con 15 ml de solución tampón de elución que contenía
Tris HCl 20mM, EDTA 0,1mM e Imidazol 200mM, pH 7.5.
3.2.12 Western Blot
3.2.12.1 Western blot anticuerpo anti-His conjugado a HRP.
Finalizado el SDS-PAGE como se describe en 2.2.7, las proteínas se electrotransfirieron a
una membrana de nitrocelulosa con el sistema de transferencia “Mini Trans-Blot Cell” de Bio-
Rad. Se utilizó buffer de transferencia (100 ml de Tris-Glicina 10X; 200 ml de metanol en 700 ml
de H2Od) y fuente poder a 400 mA por 90 min. La transferencia se verificó con rojo Ponceau al
0,1%. La membrana se incubó por 60 min en solución de bloqueo (6 ml de caseína-alkali 5X en
24 ml de H2Od), luego se lavó 2 veces por 10 min con solución TBSTT (500 mM NaCl; 20 mM
Tris-HCl; 0,2% v/v triton X-100; 0,05% v/v tween 20 pH= 7,5) y se lavó una vez con solución de
TBS por 10 min (150mM NaCl y 20 mM Tris-HCl). La membrana se incubó por 60 min con el
anticuerpo anti-His conjugado a HRP. Luego, se lavó 2 veces por 10 min con solución TBSTT y
una vez con solución de TBS por 10 min. Finalmente, la señal se detectó por
37
quimioluminiscencia con los sustratos luminol/enhancers y peróxido estable en un equipo
Ultralum MEGA.
3.2.12.2 Método de ensayo en gota (Dot blot)
Se determinó el título del anticuerpo purificado por medio del método Dot blot.
Brevemente, 100 ng de la proteína Mb1767 recombinante y 50 ng de BSA se fijaron a una
membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó por 1 h en solución de bloqueo (PBS; tween
20 0,3% y leche descremada al 5%) a temperatura ambiente y agitación constante. A
continuación, la membrana se incubó a diferentes diluciones del anticuerpo anti-Mb1767 en
solución de bloqueo por 2 h a temperatura ambiente y agitación constante. Luego se lavó 3 veces
por 5 min con solución de lavado (PBS y tween 20 0,3%) y una vez en PBS por 5 min, para
eliminar el anticuerpo no unido. Finalmente, la inmunorreacción se visualizó utilizando una
solución reveladora (0,15% H2O
2, DAB 0,5 mg/ml, Tween 20 0,3% en PBS).
3.2.12.3 Western blot anticuerpo Mb1767.
Se empleó el mismo método de electrotransferencia de las proteínas descrito en 2.2.12.1.
La membrana se incubó por 30 min en solución de bloqueo (PBS; tween 20 0,3% y leche
descremada al 5%) a temperatura ambiente y agitación constante. A continuación, la membrana
se incubó por 12 h el anticuerpo Mb1767 en una dilución de 1/500 en solución de bloqueo, luego
se lavó 3 veces por 5 min con solución de lavado (PBS y tween 20 0,3%) y una vez en PBS por 5
min. Como anticuerpo secundario se utilizó anti IgY de gallina hecho en conejo por 2 h
conjugado a HRP en una dilución de 1/10000. Posteriormente, la membrana se lavó 3 veces con
solución de lavado y una vez en PBS por 5 min. Finalmente, la señal se detectó por
quimioluminiscencia como se describe en 3.2.12.1.
38
3.2.13 Anticuerpo
3.2.13.1 Gallinas
Se utilizaron 2 gallinas de raza Lohmann, mantenidas en jaulas individuales con alimento
y agua ad libitum en el vivero para aves del Instituto de Patología Animal dependiente de la
Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Austral de Chile.
3.2.13.2 Preparación de proteína Mb1767 e inmunización de gallinas
Por cada inmunización se utilizaron 200 μg de la proteína y una relación de coadyuvante
titermax y proteína es de 1/1. Para la inoculación, se retiró el embolo de una jeringa de 3 ml y en
su interior se realizó la mezcla de la proteína y el coadyuvante. La mezcla se homogenizó con 5
pulsos de 15 seg en un sonicador. Se inyectó por vía intramuscular en el músculo pectoral de
cada gallina. El periodo entre la primera y segunda inmunización fue de 19 días y los huevos se
recolectaron diariamente, antes y después de la inmunización, rotulándose con fecha y jaula. Los
huevos se almacenaron a 4ºC.
3.2.13.3 Obtención y purificación de inmunoglobulina Y (IgY) desde yema de huevo.
Una vez obtenidos los huevos, los anticuerpos IgY anti-Mb1767 se purificaron a partir de
la yema de huevo de acuerdo al método descrito por Akita y Nakai (1992), modificado como se
describe a continuación. El procedimiento se llevó a cabo a 4 ºC. Se realizó la separación de la
yema del huevo, la yema se lavó cuidadosamente con H2Od en un vaso precipitado y se secó en
papel adsorbente. Luego se puncionó la membrana vitelina, dejando caer la yema en una probeta
donde se diluyó 10 veces con H2Od. Posteriormente, la solución obtenida se transfirió a un vaso
precipitado ajustándose a pH 5,2 con HCl 0,1N. Esta solución se dejó en reposo a 4ºC, para
producir la emulsión de la solución y la aparición de microesferas de lípidos, lo cual acelera el
39
proceso de filtración. La filtración se realizó con papel filtro Watman N°2. Las proteínas de la
solución resultante se precipitaron dos veces con sulfato de amonio a distintos porcentajes. La
primera precipitación se realizó agregando a la solución 19,4 g de sulfato de amonio en 100 ml de
solución (35%) y se incubó por 30 min con agitador magnético a 4ºC. Después de centrifugar a
10.000 rpm por 25 min a 4ºC, el sobrenadante se precipitó nuevamente con sulfato de amonio al
65% (18,4 g en 100 ml de solución) por 30 min en agitador magnético a 4ºC. Después de
centrifugar a 10.000 rpm por 25 min a 4ºC El sobrenadante fue eliminado y el precipitado se
resuspendió en 15 ml de tampón de reconstitución pH 7,6 (NaCl 0,25 M; NaH2PO4 2,9 mM;
Na2HPO4 7,1 mM; albumina de suero bovino (BSA) 15mM). Una alícuota de 5 ml de esta
solución se utilizó por yema de huevo. Para extraer el exceso de sulfato de amonio, la solución se
dializó en 2L de tampón de reconstitución pH 7.6, pero sin BSA, durante 24 h con agitación y
4ºC. Durante el transcurso de este paso se realizó un cambio de solución de diálisis muestra se
almacenó en alícuotas de 1,5 ml a -20ºC.
40
4. RESULTADOS
4.1 Estudio bioinformatico del locus narK2-Mb1767 del genoma de M. bovis AF2122/97.
El gen Mb1767 está localizado entre las coordenadas 1951054 – 1951338, en el genoma
de la cepa de referencia Mycobacterium bovis AF2122/97 con un tamaño de 285pb (Figura 3).
Este gen se encuentra orientado de forma divergente al gen nark2 (transportador de nitratos)
compartiendo una región intergénica de 286 pb. Esta región contiene los elementos reguladores
que controlan la expresión de ambos genes. Río abajo del gen Mb1767 se encuentra el gen
Mb1768c orientado en sentido opuesto, el cual codificaría probablemente un transportador de
transmembrana de sulfato. La búsqueda de secuencias similares a Mb1767 a través de la
herramienta BLASTN en el buscador disponible en el sitio web de National Center for
Biotechnology Information (NCBI), identificó al gen Rv1738 de M. tuberculosis como ortólogo
de Mb1767. Ambos genes de secuencia codificante de 285 pb, tienen un 100% de identidad a
nivel de secuencia nucleotídica y los dos codifican para proteínas hipotéticas de función
desconocida de 94 aminoácidos cada una.
41
Figura 3: Contexto genómico del gen Mb1767 en M.bovis AF2122/27. El gen se encuentra
orientado de forma divergente al gen narK2 y rio arriba del gen Mb1768c. Ambos genes están
separados por una región intergénica (RI) de 286 pb, donde se encuentra los elementos
reguladores que controlan la expresión de ambos genes.
RI
42
4.2 Estudio in silico de las características de la proteína codificada por el gen hipotético
Mb1767.
El gen Mb1767 codifica para una proteína hipotética (Garnier, Eiglmeier et al. 2003). Para
tener una primera aproximación de su estructura y función, diferentes análisis informáticos se
realizaron usando aplicaciones disponibles en el servidor Expasy proteomics
(http://expasy.org/PSIPRED). Los resultados sugieren que la proteína no tiene una función
celular en bacterias Gram positivas, no presentaría modificaciones post-traduccionales, ni
dominios transmembrana. El análisis con SignalP y pSORTb sugiere que la proteína no es de
secreción, sino citoplasmática. La Tabla III y IV muestran las propiedades generales de la
proteína Mb1767.
43
Tabla III. Propiedades generales predichas por análisis bioinformatico de la proteína Mb1767 a
partir de su estructura primaria.
Análisis Proteína
Largo 94 aá
Peso molecular 10605.57 Da
1 microgramo = 94.290 pMoles
Coeficiente de extinción molar 12780 M-1
cm-1
1 A [280] corr. to 0.83 mg/ml
Punto isoeléctrico 6.20
Carga a pH 7 -1.79
44
Tabla IV. Composición aminoacidica y abundancia relativa de la proteína Mb1767
Aminoácido Cantidad Porcentaje Aminoácido Cantidad Porcentaje
Ala (A) 8 8.5% Lys (K) 4 4.3%
Arg (R) 9 9.6% Met (M) 2 2.1%
Asn (N) 2 2.1% Phe (F) 0 0.0%
Asp (D) 8 8.5% Pro (P) 3 3.2%
Cys (C) 1 1.1% Ser (S) 5 5.3%
Gln (Q) 3 3.2% Thr (T) 4 4.3%
Glu (E) 7 7.4% Trp (W) 2 2.1%
Gly (G) 6 6.4% Tyr (Y) 1 1.1%
His (H) 5 5.3% Val (V) 8 8.5%
Ile (I) 4 4.3% Pyl (O) 0 0.0%
Leu (L) 12 12.8% Sec (U) 0 0.0%
45
La figura 4A muestra el resultado del alineamiento de secuencias de las ORFs indicando
que las secuencias codificantes los genes Mb1767 y Rv2632c comparten un 70% de identidad
nucleotídica. La Figura 4B muestra el alineamiento realizado con BLASTP (NCBI) de la
secuencia aminoacidica mostró un 51% de identidad con la proteína codificada por el gen
Rv2632c. La proteína Rv2632 tiene un dominio de función desconocida encontrado en proteínas
bacterianas hipotéticas pertenecientes a la familia de proteínas DUF1876 (pfam08962). La
proteína Rv2632 es el único miembro de esta familia con su estructura resuelta por cristalografía.
A pesar del moderado porcentaje de identidad, el plegamiento predicho para las proteínas
Mb1767 y Rv2632 es idéntico, debido a que muchas de las diferencias encontradas en sus
estructuras primarias corresponden a sustituciones aminoacídicas sin pérdida de función, lo que
no afectaría el patrón de plegamiento. El análisis realizado a la secuencia aminoacídica, no
detectó dominios proteicos conocidos.
46
A
Figura 4: Análisis filogenético y secuencia del gen Mb1767. A) Árbol filogenético de la
proteína hipotética Mb1767. B) Alineamiento de las secuencia nucleotídica del gen Mb1767 y
Rv2632c presenta un 70% de identidad entre ambos. C) Alineamiento de las secuencias de
aminoácidos predichas a partir del gen Mb1767, Rv1738 y Rv2632c.
B
C
47
La Figura 5.A muestra las estructura secundaria predicha para la proteína Mb1767,
observándose un plegamiento tipo beta hacia el extremo amino terminal y una alfa hélice hacia el
extremo carboxilo terminal que se ilustra en la (Figura 5B). Esta estructura secundaria es idéntica
a la propuesta para la proteína Rv2632.
48
Figura 5. Predicción de la estructura secundaria de las proteínas Mb1767. A) Predicción de
motivos de la proteína Mb1767 (aplicación PSIPRED). (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/). B)
Disposición de dominios alfa hélice y el plegamiento beta de la proteína Mb1767.
49
La estructura cuaternaria, como es de esperar, resultó similar entre las proteínas Mb1767 y
Rv2632. Este resultado se ilustra en la figura 6 donde se muestra la forma monomérica y
dimérica de la proteína Mb1767. Debido a la alta similitud entre ambas secuencias, es de esperar
que la proteína Mb1767 presente un arreglo macromolecular similar que puede estar relacionado
con algún papel biológico dentro de la micobacteria.
50
Figura 6: Estructura cuaternaria de la proteína Mb1767. Izquierda: Forma monomérica de la
proteína Mb1767. COO- terminal: Hélice α, NH2 terminal: Cadena β. Derecha: Estructura
cuaternaria de la proteína Mb1767.
51
4.3 Amplificación, clonamiento y subclonamiento de la secuencia codificante del gen
Mb1767 de M. bovis
El análisis bioinformatico del gen Mb1767 indica que tiene un tamaño de 285 pb, la
amplificación de la secuencia codificante del gen Mb1767 se realizó mediante PCR, usando los
partidores descritos anteriormente (ver Materiales y Métodos 3.1.3, Tabla I). La amplificación del
fragmento esperado se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % resultado que
concuerda con lo esperado en la Figura 7B (ver Materiales y Métodos 3.2.6). El tamaño del
fragmento obtenido fue de 285 pb aproximadamente (carril 1), lo cual concuerda con la
predicción. Este fragmento se clonó en el vector pJET 1.2/blunt utilizando E.coli JM109
generando el plásmido (ver Materiales y Métodos 3.1.4, Tabla II). La presencia de colonias
portadoras del plásmido recombinante se confirmó mediante PCR con los partidores Mb1767f y
Mb17671.2r, así como también con una PCR con los partidores pJET1.2 que flanquean el sitio de
clonamiento múltiple (Figura 7B, carriles 2 y 3, respectivamente).
Una vez clonada la región codificante del gen Mb1767 en el plásmido pJET 1.2, el inserto
se liberó por medio de las enzimas de restricción NdeI y BamHI. El producto de digestión fue
purificado y subclonado en el vector de expresión pET15b (ver Materiales y Métodos 3.2.9.3 y
3.2.9.5) para producir el plásmido (ver Materiales y Métodos 3.1.4, Tabla II). La transformación
se llevó a cabo en la cepa BL21 (DE3) de E. coli. Colonias con el plásmido recombinante se
confirmaron mediante PCR utilizando partidores que flanquean el sitio de clonamiento múltiple
del plásmido pET15b. El producto esperado de 678 pb se observa en la figura 7B, carril 4. Estos
resultados confirman el clonamiento y subclonamiento de la secuencia codificante del gen
Mb1767 de M. bovis en los vectores respectivos.
52
Figura 7: Generación de vectores recombinantes. Panel A: Diagrama indica las
construcciones genéticas y la posición de los partidores utilizados. Panel B: Verificación de las
construcciones genéticas por PCR, utilizando como templado DNA de los clones recombinantes.
Carriles 2-3-4: Fragmento generados con los partidores A1-A2-A3 respectivamente indicados en
A. Carril 1: Control positivo templado DNA de M. bovis AF2122/97 con partidores A1. Carril
5: Control negativo sin templado.
A
B
53
4.4 Expresión y purificación de la proteína Mb1767 recombinante.
La cepa BL 21 (DE3) de E. coli se utilizó para expresar en altos niveles la proteína
Mb1767 recombinante. La designación DE3 indica que la cepa BL21 contiene el lysogen DE3
que contiene el gen para la RNA polimerasa del fago T7 bajo el control del promotor lacUV5. La
molécula inductora del sistema de expresión de proteínas recombinantes correspondió al
isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). La proteína recombinante generada posee un
segmento de seis residuos histidina en su extremo amino terminal (6His-Mb1767), así como
también un sitio de corte para trombina. La purificación de la proteína 6His-Mb1767 produjo
alrededor de 1,1 mg de la proteína recombinante por litro de cultivo. La figura 8A muestra los
pasos de purificación de la proteína analizados mediante SDS-PAGE al 15%. La proteína
recombinante obtenida, de masa molecular aproximada de 13 kDa, representa la proteína
hipotética endógena de M. bovis AF2122/97. El sistema utilizado representa una excelente opción
para expresar y purificar la proteína recombinante en forma soluble, rápida y eficiente. No se
observaron agregación ni proteólisis. La proteína recombinante en las distintas fracciones de la
cromatografía se identificó por medio de Western blot utilizando el anticuerpo comercial anti-
TagHis conjugado a HRP, resultado que se muestra en la Figura 8B. El tamaño molecular
obtenido concuerda con la proteína observada en el gel SDS-PAGE.
54
B
Figura 8: Purificación y caracterización de la proteína Mb1767 recombinante. Panel A:
Purificación de la proteína Mb1767 por cromatografía de afinidad a níquel. Carril 1: Cultivo 12 h
E.coli BL21/ pET15b-Mb1767 inducido con IPTG. Carril 2: Eluato 1er
lavado. Carril 3: Eluato
2do
lavado con imidazol 60 mM. Carril 4: Elución con imidazol 200 mM. Panel B:
Inmunodetección de la proteína Mb1767 recombinante con anticuerpo anti-TagHis.
55
4.5 Caracterización del anticuerpo anti-Mb1767 de M.bovis.
La inmunoglobulina Y (IgY) contra la proteína Mb1767 es el mayor anticuerpo producido
en gallinas (Gallus domesticus), luego de ser esta inmunizada. La IgY se sintetiza continuamente
contra la proteína recombinante, es secretada hacia la sangre y es transferida a la yema de huevo
donde se acumula (Warr et al, 1995). Se observó un notorio aumento de la concentración de
proteínas de la yema de huevos después de la primera y segunda inmunización, resultado que se
muestra en la figura 9.
56
0
2
4
6
8
10
12
14
Pre-inmune Inmunización 1 Inmunización 2
Co
nce
ntr
ació
n d
e P
rote
ínas
mg/
mL
Gallina 1
Gallina 2
Figura 9: Cuantificación de proteínas totales a partir de la yema de huevos de gallinas
inmunizadas.
57
El título y la especificidad del anticuerpo producido se muestra en la figura 10. En el
panel A se muestran los resultados del Dot Blot. Se observa que la reactividad de 100 ng de la
proteína recombinante Mb1767 se mantiene constante para un amplio rango de diluciones del
anticuerpo anti-Mb1767. Estos resultados permitieron determinar la dilución de trabajo del
anticuerpo, la que finalmente se estableció en 1:500. Esta dilución se utilizó para la
inmunodetección de la proteína endógena en M. bovis en los ensayos de Western blot. La figura
10 B muestra la especificad del anticuerpo generado, el que no da reacción cruzada incluso con
proteínas de otros microorganismos relacionados filogenéticamente.
58
Figura 10: Caracterización del anticuerpo anti-Mb1767. Panel A: Título del anticuerpo por
medio de Dot blot. De izquierda a derecha, inmunodetección con distintas diluciones (1:10, 1:50,
1:100 y 1:500) del anticuerpo anti-Mb1767 contra la proteína Mb1767 recombinante y BSA
como control negativo. Panel B: Especificidad del anticuerpo anti-Mb1767 por medio de
Western blot utilizando diferentes extractos proteicos bacterianos. Carril 1-2-3-4: Diluciones de
la Proteína Mb1767 recombinante. Carril 5: M. smegmatis ATCC 607. Carril 6: M. bovis BCG.
Carril 7: E. coli BL21.
1 2 3 4 5 6 7
13 kDa
59
4.6 Identificación de la proteína endógena Mb1767.
La figura 11A muestra la caracterización del perfil de proteínas totales en condiciones
normales y bajo estrés mediante SDS-PAGE en gradiente del 10 al 15%. Carril 1 se cargó 2,5 μg
de la proteína recombinante, carriles 2 al 6 se cargó 50 μg de proteínas totales. Carril St,
marcador de proteínas preteñido de (10 a 170) kDa, tinción azul de Coomasie. La figura 11B
muestra la inmunodetección de la proteína endógena en los cultivos estresados con 12 h
DETA/NO y 4h a 12 h en estrés con etanol al 5% con el anticuerpo anti-Mb1767, en cultivo de
condiciones aeróbicas y estrés por 4 DETA/NO la proteína no se expresa, por lo tanto la proteína
no se expresa en condiciones de aerobiosis, pero si en condiciones de estrés. En base a los
resultados, podemos decir que el gen hipotético Mb1767 codifica para una proteína de 94
aminoácidos con una masa de 13 kDa que se expresa en condiciones de estrés al NO de forma
tardía, mientras que en presencia de etanol 5% la respuesta es más rápida y progresa en el tiempo
60
DETA/NO 12 h Etanol 5% 4h Etanol 5% 12 h
Control + 200 μg 100 μg 50 μg 50 μg 100 μg 50 μg 200 μg Control -
Figura 11: Identificación de la proteína endógena Mb1767. Panel A: Perfil de proteínas de
cultivos de M. bovis AF2122/97 crecidos en condiciones normales y bajo estrés por DETA/NO y
etanol 5%. Carril 1: Control positivo proteína Mb1767 recombinante. Carril 2: M. bovis aerobio.
Carril 3: M. bovis DETA/NO 4 h. Carril 4: M. bovis DETA/NO 12 h. Carril 5: M. bovis Etanol 4
h. Carril 6: M. bovis Etanol 12 h. Carril St: Marcador de proteínas de 10 a 170 kDa. Panel B:
Inmunodetección de la proteína Mb1767 endógena con el anticuerpo anti-Mb1767 por medio de
Western blot. Panel C: Titulación proteína Mb1767 endógena por Western blot, control positivo
(+): Proteína Mb1767 recombinante, control negativo (-): M. bovis aerobio.
A
B
C
61
5.- Discusión
5.1 Locus narK2-Mb1767 del genoma de M. bovis AF2122/97.
El gen Mb1767 pertenece al regulón DosR, el cual agrupa 48 genes que se activan durante
latencia en respuesta a la unión del regulador transcripcional DosR a motivos de unión presentes
en los promotores de dicho genes. Esta unión es independiente del estado de fosforilación, lo que
explica la expresión basal de un número mínimo de copias de los transcritos del gen Mb1767,
como se ha demostrado previamente con otros genes de este regulón (Chauhan y Tyagi 2008a).
Esta teoría se ve reforzada por dos experimentos previos a este estudio realizados en nuestro
laboratorio (Palavecino, 2009). En cultivos expuestos a condiciones normales de oxígeno,
mediante PCR tiempo real, se detectó de forma endógena pocas copias del transcrito Mb1767 en
comparación al número de copias del ortólogo Rv1738 en M. bovis y M. tuberculosis,
respectivamente. Chauhan y Tyagi demostraron que en M. bovis, esta única transición de TC
en la región intergénica narK2-Mb1767 es la responsable de que el bacilo bovino presente un
fenotipo negativo a la prueba bioquímica de la reducción de nitratos, vale decir nuestros
resultados concordaron con lo esperado (Figura 2). La razón radica en que afecta los motivos
canónicos del promotor en el silenciamiento de la expresión del gen narK2 en M. bovis, el cual
codifica para un transportador de nitratos encargado de suministrar el sustrato necesario para que
la enzima nitrato reductasa (NR) reduzca del nitrato. La expresión de esta enzima es constitutiva
no inducible y se encuentra codificada por el operón narGHIJ (Sohaskey and Wayne 2003). La
principal fuente de nitratos en M. tuberculosis es el óxido nítrico (NO) producido por el
macrófago en respuesta a la infección para reprimir la replicación del bacilo. Este hecho abre un
importante interrogante que aún no ha sido respondida respecto al metabolismo anaerobio de M.
62
bovis. Tanto M. bovis y M. bovis BCG no expresan el transportador de nitratos narK2 (Honaker,
Stewart et al. 2008; Chauhan, Singh et al. 2010), por lo que no son capaces de suministrar
sustrato para la NR. M. bovis no posee otros genes metabólicos respecto a M. tuberculosis, lo que
indica la existencia de un sistema distinto entre ambos bacilos para generar energía en la
condición crítica de anaerobiosis.
Además de esta diferencia descrita en el locus narK2-Mb1767, la expresión de los genes
Rv1738 y Mb1767 es muy dispar. Se sabe que el gen narK2 y Rv1738 son inducibles por el
programa de dormancy en M. tuberculosis (Voskuil, Schnappinger et al. 2003). Mientras que en
M. bovis no se expresa narK2, el gen Mb1767 asociado al locus se induce en una razón de
cambio mayor que Rv1738. En nuestro laboratorio se demostró que en respuesta a pulsos de NO,
el gen Rv1738 de M. tuberculosis se induce a nivel de transcrito entre 0,5 veces más, mientras
que su ortólogo en M. bovis, Mb1767 se induce ~50 veces (Palavecino, 2009). En el mismo
estudio se evaluó la actividad promotora de la región intergénica narK2-Rv1738 (pRv1738) y
narK2-Mb1767 (pMb1767) en M. bovis mediante un ensayo β-galactosidasa. Para el mutante
pRv1738 no se observó inducción de la actividad promotora, mientras que para el mutante
pMb1767 hubo una inducción cercana a tres veces bajo estrés con óxido nítrico respecto al
control aerobio (Palavecino, 2009).
5.2 Estudio in silico de las características de la proteína codificada por el gen hipotético
Mb1767.
La proteómica juega un rol clave en la caracterización y determinación funcional de las
proteínas expresadas, pero los experimentos de proteómica típica, así como técnicas de análisis
más complejas, deben ser sustentados por estudios genéticos previos que proveen la idea original
del posible producto codificado por el gen, así como análisis in silico de la proteína o péptido.
63
Esto tiene como objetivo establecer las características básicas del péptido que facilitarán los
procesos de separación, identificación y estudio.
La secuencia nucleotídica del gen Mb1767 es de 285 pares de bases, las cuales codifican
para una proteína hipotética de 94 aminoácidos de función desconocida, cuyo ortólogo en M.
tuberculosis, el gen Rv1738, tiene un 100% de identidad aminoacídica. Estudios in silico
preliminares determinaron que se trata de una proteína pequeña de 94 aminoácidos, con un punto
isoeléctrico de 6.2 y un peso de 10,1 kDa. La búsqueda de secuencia ortólogas en otras especies y
géneros no arrojó información sobre su función. Su identidad más cercana se encuentra en la
familia de proteínas DUF1876 (Domain Unkown Family), la cual está presente en muchos
géneros de bacterias, sin asociarse aún alguna función biológica para ellas. Dentro de esta
familia, la proteína Rv2632 de M. tuberculosis ha sido cristalizada y visualizada mediante
experimentos de difracción de rayos X con una resolución de 2 angstroms. Las estructuras
secundarias de las proteínas Mb1767 y Rv2632, presentan un alto grado de identidad (51%), una
α-hélice hacia el extremo carboxilo terminal y un dominio de hoja plegada β hacia el extremo
amino terminal de la proteína Mb1767. La estructura tridimensional de la proteína Mb1767
presenta similitud con la de la proteína Rv2632, lo que sugiere que esta presenta un ensamble
macromolecular similar. Análisis de localización celular predicen que esta proteína podría ser
citoplasmática.
Para corroborar las predicciones realizadas por la herramienta bioinformatica, se estudió
la localización de la proteína Mb1767 endógena del bacilo. Para ello se realizaron extracciones de
proteínas totales de distintas fracciones, localizándose la proteína por Western blot en la fracción
citosólica. Esta conclusión queda claramente establecida con los resultados mostrados en la figura
12. Otro punto a corroborar fue la masa molecular de la proteína endógena, la cual correspondió a
64
13 kDa aproximadamente, lo que no concuerda con el tamaño de 10,1 kDa predicho in silico.
Para clarificar esta diferencia en la masa molecular de la proteína se requieren estudios con
técnicas más sensibles o bien buscar la diferencia a nivel de modificación postraduccional.
5.3 Identificación de la proteína endógena Mb1767.
Para la expresión de la proteína recombinante, se utilizó como hospedero la cepa BL21
(DE3) de E.coli y el vector de expresión pET15b. Uno de los puntos a estudiar fue la
concentración y tiempo del inductor IPTG, ya que este induce al promotor lacUV5 que controla
la expresión del gen polimerasa T7 en la cepa BL21 (DE3). Cada proteína presenta un sistema de
expresión diferente, por lo cual se debe evitar la toxicidad de la bacteria debido a la alta actividad
de la RNA polimerasa T7, donde puede ocurrir un nivel de expresión basal del gen de interés en
células no inducidas por IPTG. Esto crea problemas en caso de que el gen de interés sea tóxico a
la célula bacteriana. En estos casos, la expresión del gen tóxico bajo condiciones no inducidas
provoca la selección de células que expresan niveles más bajo del gen tóxico. Estas células son
frecuentemente incapaces de expresar altos niveles del gen de interés bajo la inducción de IPTG.
Como alternativa a este problema, se utilizan las cepa BL21 (DE3) pLysS o pLysE. Estas dos
cepas producen lisozima, la que ayuda a reducir el nivel basal de RNA polimerasa T7. En esta
tesis, los resultados muestran que el producto del gen Mb1767 no es tóxico para la cepa BL21 de
E. col, ya que se obtuvo un buen nivel de expresión.
Otro punto a considerar son los cuerpos de inclusión, que son frecuentes en bacterias
recombinantes que producen proteínas heterólogas bajo el control de promotores fuertes, y por
tanto representan un problema importante en procesos biotecnológicos destinados a la producción
de proteínas de alto valor añadido (como hormonas, enzimas y otros polipéptidos de interés
farmacológico). En años recientes, se ha avanzado mucho en el conocimiento de la naturaleza de
65
los cuerpos de inclusión. Diversos análisis, tanto cinéticos como estructurales, han demostrado
que estas estructuras no son el resultado de una deposición pasiva de proteínas agregadas, sino de
un mecanismo celular activo y dirigido, integrado en el sistema de control de calidad proteico.
Este sistema, formado por una treintena de las llamadas proteínas de choque térmico
(mayoritariamente chaperonas y proteasas), mantiene las proteínas insolubles en depósitos
celulares localizados y poco citotóxicos, y los procesa para replegarlas o degradarlas a medida
que las proteasas y chaperones dejan de ser limitantes. Por tanto, los cuerpos de inclusión se
reconstruyen constantemente por un equilibrio entre agregación y desagregación proteica que
tienen lugar simultáneamente (Villaverde y Carrio, 2003). De esta manera su formación es
reversible, desintegrándose casi en su totalidad cuando se acaba la síntesis de proteínas
recombinantes. Por lo mencionado anteriormente es necesario estudiar el rol del IPTG en la cepa
bacteriana de expresión de proteínas, en el caso puntual de la proteína recombinante la
concentración de IPTG es de 0,4 mM para un litro de cultivo, por un tiempo de 4 h. Nuestros
resultados indican que la expresión de la proteína Mb1767 no conduce a la formación de cuerpos
de inclusión en el sistema de expresión utilizado.
Una vez obtenida la proteína recombinante, esta se utilizó para producir anticuerpos. El
uso de gallinas para la producción de anticuerpos policlonal proporciona varias ventajas en la
producción y el modo de uso de los animales. Una de sus ventajas es la recolección del
anticuerpo, ya que no es invasiva, lo que contrasta con los métodos convencionales donde los
animales son sacrificados para recolectar una mayor cantidad de sangre para la obtención de
anticuerpos. La producción de anticuerpos en gallinas solo requiere de la recolección de huevos,
los que a su vez pueden guardarse por periodos prolongados manteniendo los títulos. De esta
forma se reduce la necesidad de realizar varias inmunizaciones. Otra ventaja importante es la
66
distancia filogenética que existe entre aves y bacterias. Los anticuerpos producidos en gallinas
contra proteínas altamente conservadas en bacterias requiere de una menor cantidad de antígeno
para inducir una respuesta inmune eficiente. La inmunización en una gallina produce más de
22500 mg de IgY por año, el cual es equivalente a la producción de 4,3 conejos en el curso del
año (Xu, et al., 2011).
La concentración total de anticuerpos anti-Mb1767 obtenida por gallina fue de 11 mg/ml
después de cada purificación. Mediante ensayo de Dot blot se determinó el título del anticuerpo,
que mostró inmunorreacción positiva con una preparación de las distintas diluciones de la
proteína recombinante. No se observó unión a antígenos con el tamaño esperado de la proteína en
diferentes extractos de proteínas totales de cepas de micobacterias y E. coli, lo cual demuestra la
especificidad del anticuerpo generado. El análisis de Western blot de muestras de extractos de
proteínas totales de cultivos estresados a diferentes horas con el aducto de NO (DETA/NO) y
etanol al 5% mostró una banda de 13 kDa sólo para los extractos de proteínas estresados. Esta
banda no se detectó en el cultivo aerobio de M. bovis AF2122/97 y en el cultivo estresado por 4 h
de DETA/NO, ni tampoco con el extracto proteínas de un cultivo aerobio de M. bovis BCG
(Figura 11, carril 6), lo que concuerda con lo esperado para un gen de M. bovis que se expresa en
condiciones de estrés. Por lo tanto, los resultados de esta tesis demuestran que la proteína
Mb1767 se expresa de forma endógena en M. bovis. Además, esta proteína estaría asociada a la
respuesta tardía a NO y a etanol en M. bovis, hecho que se deduce de los resultados obtenidos en
la figura 11.
5.4 Futuros estudios para la proteína Mb1767.
Debido a que el tamaño molecular experimental de la proteína endógena Mb1767 difiere
del predicho por herramientas bioinformáticas, una alternativa para dilucidar estructuralmente
67
esta diferencia sería utilizar espectrometría de masa. Esta técnica proporciona una gran cantidad
de información para la investigación en proteómica, enzimología y química de las proteínas en
general. Los métodos espectrométricos requieren una cantidad mínima de muestra. Por lo tanto,
se podría aplicar una pequeña cantidad de proteína extraída de un gel de electroforesis
bidimensional para la determinación exacta de la masa molecular. A su vez, está técnica también
serviría para confirmar la secuencia aminoacídica de la proteína Mb1767, información útil para
predecir la estructura tridimensional, su localización celular y eventualmente su función con
mayor exactitud. La comparación de la secuencia con otras secuencias de proteínas conocidas
previamente cristalizadas de la misma familia de proteínas aportará nuevos datos acerca de sus
características estructurales y funcionales. Cabe mencionar que los miembros de una familia de
proteínas son generalmente idénticos en un 25% o más de sus secuencias y así estas proteínas
pueden compartir las características anteriormente mencionadas. De esta forma se corroboraría la
secuencia aminoacídica de la proteína detectada por Western blot con la secuencia aminoacidica
entregada por el banco de datos.
La estructura de la proteína Mb1767 predicha por la herramienta bioinformática
PSIPRED arrojó una hélice alfa y tres láminas beta en su forma de monómero. La hélice alfa es la
estructura secundaria más frecuente en las proteínas y es de gran importancia en los motivos
estructurales de unión al DNA, como son los motivos H-L-H y dedos de zinc. Para entender si
esta proteína interacciona con ácidos nucleicos, así como también a otras proteínas, se necesita
realizar estudios de interacción de dicha proteína con DNA. Para ello, uno de los estudios más
utilizados para verificar esta interacción es la técnica ensayo de movilidad electroforética
(EMSA). Los ensayos de interacción proteína-proteína como pull-down, co-inmunoprecipitación,
nos entregarán mayor información para determinar eventualmente la función.
68
6.- CONCLUSIONES
1. El análisis in silico indicó que Mb1767 codifica una proteína de 10.1 kDa, pI= 6.2, con una
estructura secundaria que incluye tres cadenas beta y una hélice alfa.
2. La proteína recombinante Mb1767 expresada representa la proteína hipotética endógena de M.
bovis AF2122/97. La caracterización de su masa molecular fue de 13 kDa aproximadamente. No
se observó agregación, ni tampoco proteólisis.
3. El anticuerpo anti-Mb1767 es policlonal, pero muy específico. No se observó inmunorreacción
cruzada con extractos proteicos de otros microorganismos relacionados filogenéticamente.
4. Finalmente, concluimos que el gen hipotético Mb1767 codifica para una proteína citosólica, de
94 aminoácidos y con una masa molecular de 13 kDa que sólo se expresa en cultivos estresados
con DETA/NO y etanol al 5%. El estrés con NO simula el ambiente intra-fagosomal, lo que
sugiere una función durante las etapas post-infección del marófago por M. bovis.
69
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