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Universidad Autónoma del Estado de México
Facultad de Medicina
Departamento de Estudios Avanzados
Maestría en Ciencias de la Salud
“Identificación de actinobacterias halófilas con capacidad
para degradar hidrocarburos policíclicos aromáticos”
TESIS
Que para Obtener el Grado de
Maestra en Ciencias de la Salud
Presenta:
Q.F.B. Lorna Catalina Can Ubando
Comité de Tutores
Dra. Ninfa Ramírez Durán
Tutora Académica
Dr. Martín Pablo Antonio Moreno Pérez
Tutor Interno
Dr. Ángel Horacio Sandoval Trujillo
Tutor externo
Toluca, Estado de México 2018
2
INDICE
No. página
Resumen 4
Summary 5
1. Antecedentes
1.1 Actinobacterias. 6
1.1.1 Actinobacterias extremófilas. 6
1.1.2 Actinobacterias halófilas. 7
1.2 Ambientes extremos 7
1.2.1 Ex lago de Texcoco 8
1.3 Hidrocarburos. 9
1.3.1 Generalidades. 9
1.3.2 Contaminación con hidrocarburos. 10
1.3.3 Hidrocarburos aromáticos. 11
1.3.4 Hidrocarburos policíclicos aromáticos. 11
1.3.4.1 Antraceno. 12
1.3.4.2 Fenantreno. 12
1.3.4.3 Fluoranteno. 13
1.3.4.4 Pireno. 13
1.3.5 Daños a la salud. 13
1.4 Biorremediación. 14
1.4.1 Biorremediación en ambientes salinos 15
1.5 Estudios antecedentes. 16
2. Planteamiento del Problema. 18
3. Hipótesis. 18
4. Objetivos. 19
5. Justificación. 20
6. Material y Métodos.
6.1. Diseño de estudio. 22
6.2. Criterios de inclusión, exclusión y
eliminación.
22
6.3. Procedimientos. 22
6.4. Variables de Estudio. 32
6.5. Implicaciones Bioéticas. 34
7. Resultados
3
7.1 Nombre del artículo 34
7.1.1 Carta de envío 35
7.1.2 Resumen 36
7.1.3 Abstract 36
7.1.4 Introducción 37
7.1.5 Apartados del artículo 40
8. Resultados adicionales 63
8.1 Puntos de muestreo 63
8.2 Caracterización morfológica 64
8.3 Tolerancia a Hidrocarburos Policíclicos
Aromáticos
74
9. Conclusiones
9.1 Conclusiones Generales 75
9.2 Limitaciones 76
9.3 Recomendaciones 76
10. Referencias Bibliográficas. 76
4
RESUMEN
Los hidrocarburos policíclicos aromáticos son un grupo de contaminantes orgánicos
que impiden el intercambio gaseoso de las áreas en las que se encuentran,
provocando así un daño al ecosistema. Los procesos de biorremediación son la
primera opción para el tratamiento de áreas contaminadas con hidrocarburos
policíclicos aromáticos; así mismo, las actinobacterias halófilas son una alternativa
eficaz para los ambientes salinos.
El objetivo de la presente investigación fue el aislamiento y la identificación de
actinobacterias halófilas y halotolerantes provenientes del territorio sódico salino
perteneciente al ex lago de Texcoco; con el fin de determinar su posible capacidad de
degradación de hidrocarburos policíclicos aromáticos (antraceno, fenantreno,
fluoranteno y pireno). Las cepas aisladas fueron caracterizadas morfológica y
fisiológicamente para su posterior selección. También se les realizó una prueba
colorimétrica de biodegradación para identificar a las cepas con potencial degradador.
Como resultado de este estudio, se aislaron 43 cepas de actinobacterias halófilas y
halotolerantes; de las cuales, se seleccionaron 6 cepas que presentaron un resultado
positivo en la prueba colorimétrica de biodegradación (de azul a incoloro); el cambio
en la coloración se evalúo a través de espectrofotometría Uv-vis. De igual forma, la
prueba demuestra que las cepas seleccionadas son capaces de utilizar los
hidrocarburos policíclicos aromáticos estudiados como única fuente de carbono.
Esta investigación sugiere que el ex lago de Texcoco es un ecosistema en el cual se
puede encontrar una amplia diversidad de actinobacterias con potencial
biotecnológico que podrían ser utilizadas en la biorremediación de ambientes salinos
y alcalinos contaminados con hidrocarburos policíclicos aromáticos.
5
SUMMARY
Polycyclic aromatic hydrocarbons are a group of organic pollutants that prevent the
gas exchange of the areas in which they are found, thus causing damage to the
ecosystem. Bioremediation processes are the first option for the treatment of areas
contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons; likewise, halophilic
actinobacteria are an effective alternative for saline environments.
The objective of the present investigation was the isolation and identification of
halophilic and halotolerant actinobacteria coming from the saline sodium territory
belonging to the former lake of Texcoco; in order to determine their possible
degradation capacity of polycyclic aromatic hydrocarbons (anthracene, phenanthrene,
fluoranthene and pyrene). The isolated strains were characterized morphologically and
physiologically for their later selection. Also, they underwent a colorimetric
biodegradation test to identify the strains with degrading potential. As a result of this
study, 43 strains of halophilic and halotolerant actinobacteria were isolated; of which,
6 strains were selected that showed a positive result in the colorimetric biodegradation
test (from blue to colorless); the change in coloration was evaluated through Uv-vis
spectrophotometry. Alike, the test shows that the selected strains are capable of using
the aromatic polycyclic hydrocarbons studied as the only carbon source.
This research suggests that the former lake of Texcoco is an ecosystem in which a
wide diversity of actinobacteria with biotechnological potential can be found that could
be used in the bioremediation of saline and alkaline environments contaminated with
polycyclic aromatic hydrocarbons.
6
1. Antecedentes
1.1. Actinobacterias
Las actinobacterias son un grupo de bacterias trascendente en la ecología del suelo
porque llevan a cabo la función de reciclar la materia orgánica acumulada. Producen
una amplia gama de enzimas extracelulares y una vasta variedad de metabolitos
secundarios (Medina, y col., 2011).
Estas bacterias tienen una extensa variedad morfológica y genética, así como un alto
contenido de Guanina-Citosina en su ADN. Crecen formando filamentos delgados,
parecidos a los de los hongos, pero de menor diámetro. Su pH ideal de crecimiento
va desde neutral hasta un ambiente alcalino (Sharma y col., 2012)
Las actinobacterias son bacterias Gram positivas, especializadas y de gran
importancia económica. Estas bacterias son encontradas principalmente en suelos.
Por otro lado, algunas actinobacterias pueden ser patógenas para los seres humanos;
son encontradas principalmente en la cavidad oral de humanos y animales (McKinney,
2004).
1.1.1. Actinobacterias extremófilas
El término extremófilo fue usado por primera vez por MacElroy en 1974; es un término
relativo, ya que los ambientes que pueden ser extremos para un organismo, pueden
ser esenciales para la supervivencia de otro (MacElroy, 1974)
Los microorganismos aislados de ecosistemas extremos tienen la capacidad de
adaptarse a ambientes poco favorables, lo que puede indicar un potencial
biotecnológico (Morozkina, 2010).
Las actinobacterias extremófilas se clasifican en función de las características
fisicoquímicas del ambiente en el que su crecimiento fue óptimo. Se clasifican en
varias categorías: a) termófilas: crecimiento óptimo a temperaturas ≥50°C; b) halófilas:
requieren del 3% - 30% de concentración de sal para crecer; c) psicrófilas; el
7
crecimiento es en temperaturas menores a 15 °C; d) alcalófilas: exhiben un
crecimiento ideal a valores de pH alrededor de 9; e) acidófilas: crecimiento ideal en
pH ≤3; f) piezofilas: requieren de altas presiones hidrostáticas (Durvasula, 2018).
Así mismo, las actinobacterias extremotolerantes y extremoresistentes se clasifican
en: a) metalotolerantes: toleran altas concentraciones (>1 mM) de metales pesados
en su ecosistema; b) radioresistentes: son capaces de proteger sus proteínas
citosólicas de la oxidación, toleran alta radiación ionizante y resisten la desecación
prolongada (Rampelotro, 2016).
1.1.2. Actinobacterias halófilas
Las actinobacterias halófilas se categorizan como halófilas extremas (concentración
de sal de 2.5 – 5.2 M), límite de halófilas extremas (contenido de sal de 1.5 – 4 M),
halófilas moderadas (concentración de sal de 0.5 – 2.5 M) y halotolerantes, que no
requieren la presencia de sal para su crecimiento pero pueden desarrollarse en este
ambiente (Hamedi, 2013)
Existen dos formas en las que las actinobacterias halófilas son capaces de resistir la
influencia de altas concentraciones de sal. La primera involucra la creación de sal en
el citoplasma, esto significa que existe una acumulación de iones inorgánicos dentro
de la célula, cuya concentración es comparable con la que se encuentra en el exterior,
regulando así la presión osmótica. La segunda forma es a través de la acumulación
de moléculas orgánicas conocidas como solutos compatibles (Morozkina, 2010)
1.2. Ambientes extremos
Los ambientes extremos se encuentran localizados alrededor del mundo; sus
características son variables y se destacan por tratarse de lugares en los que no es
posible la supervivencia de cualquier organismo.
8
La piezósfera del mar profundo abarca el volumen del mar a una profundidad de 1000
metros, con una presión hidrostática de 10 MPa; representa aproximadamente el 75%
del volumen total del océano. Se han hallado microorganismos Piezófilos en el mar
profundo de los principales océanos, excepto en el océano Ártico (Fang, 2010)
El sistema hidrotermal Yellowstone consiste en más de 10000 variaciones termales,
incluyendo geiseres y muelles sin erupción. Las descargas de corriente de aguas
termales contienen elevadas concentraciones de Cloro, Sodio y Silicio (Lowenstern,
2016). Las aguas hidrotermales alcanzan temperaturas de hasta 175°C (Smith, 2018).
Cerca del 85% de la biosfera se encuentra expuesta a temperaturas por debajo de los
5°C. La mayor fracción de estos ambientes con baja temperatura es representada por
la región profunda del mar (90% del volumen del océano se encuentra a temperaturas
menores a 5°C); seguida por la nieve (35% de la superficie de la tierra), el permafrost
(24% de la superficie de la tierra), hielo marino (13% de la superficie de la Tierra) y los
glaciares (10% de la superficie de la tierra) (Margesin, 2011).
El Mar Muerto, ubicado al oriente del Mediterráneo, es un lago hipersalino (235 g/kg)
caracterizado por condiciones meteorológicas cambiantes, particularmente por
vientos inestables. La radiación solar decrece con la profundidad (a 2 metros, la
radiación solar es solo del 10%) (Kischa, 2017).
1.2.1. Ex lago de Texcoco
El ex lago de Texcoco se encuentra al noreste de la Ciudad de México; el suelo es
salino-sódico con un pH entre 8.5 y 10.5 y un porcentaje de sodio de entre 60% y 80%
(Soto-Padilla, 2014). La estructura es granular en la capa superior del suelo y
prismática en el subsuelo, y el contenido de materia orgánica varía desde 20 hasta 50
g/kg (Alcántara-Hernández, 2009). Se han aislado microorganismos que han sido
capaces de adaptarse a estas condiciones extremas, tanto de suelo como de agua
(Valenzuela-Encinas, 2008).
9
Se han planteado hipótesis en los que se cree que la naturaleza salina- sódica del
lago es resultado de la intensa actividad volcánica y abruptos cambios climáticos
durante la formación del complejo lagunar; al ser desecado para la implementación de
obras hidraúlicas durante casi medio siglo, dejó expuesto un amplio lecho salitroso
(González, 2014).
Los microorganismos adaptados a estas condiciones extremas de pH y salinidad
pueden tener características metabólicas importantes en el área biotecnológica. Sin
embargo, la continua expansión de la Ciudad de México y otros factores
antropogénicos han cambiado las características del suelo del lago (Valenzuela-
Encinas, 2009).
1.3. Hidrocarburos
1.3.1. Generalidades
Los hidrocarburos son moléculas compuestas de átomos de carbono e hidrógeno y
representan una de las clases más significantes de compuestos orgánicos. Los
átomos de carbono se pueden alinear en cadenas abiertas o pueden formar anillos. A
su vez, éstas alineaciones de hidrocarburos se subdividen en saturados e insaturados
(Olah, 2003), como se muestra en la figura 1.
10
Figura 1. Clasificación de hidrocarburos.
1.3.2. Contaminación con hidrocarburos
La movilización de los hidrocarburos en el ambiente depende de las propiedades de
cada uno de ellos. En el aire están presentes como vapores o se encuentran adheridos
a las superficies de pequeñas partículas sólidas; pueden viajar largas distancias antes
de regresar a la tierra en forma de agua de lluvia o por asentamientos de partículas
(Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades, 2016).
La contaminación por hidrocarburos impide el intercambio gaseoso de las áreas en
las que se encuentren (suelos, mares, etc.) provocando así un daño al ecosistema.
Esto se ve reflejado en la alteración y muerte de diferentes especies, tanto animales
como vegetales, presentes en el sitio contaminado (Cui, 2014).
Los hidrocarburos derivados del petróleo son una fuente importante de contaminación
ambiental en cualquier etapa de su obtención, refinamiento y transporte. Los
ecosistemas más afectados por los derivados de petróleo son comúnmente lugares
con una alta concentración de sal, en los cuales se vuelve más complicado usar
técnicas de biorremediación (Le Borgne, y col., 2008).
11
La contaminación por hidrocarburos derivados del petróleo puede darse debido a los
derrames que ocurren durante su refinamiento, transporte o producción de éste. Uno
de los principales ambientes que sufren este tipo de contaminación son los mares,
considerados ambientes extremos por las bacterias usadas en la biorremediación
convencional (Cui, 2014).
Se debe de considerar que los hidrocarburos están menos biodisponibles en
ambientes hipersalinos que en los que no lo son. Esta es una consecuencia del efecto
“salting out”: las sales solubles reducen la solubilidad de los compuestos orgánicos en
agua, la concentración alta de sal en fase acuosa aumenta la tendencia de absorber
compuestos orgánicos en la matriz sólida (Martins da Silva, 2012).
1.3.3. Hidrocarburos aromáticos
Estos compuestos tienen por lo menos un anillo de 6 átomos de carbono, el cual
presenta un sistema continuo de dobles enlaces conjugados (Higgins, 1978).
Los hidrocarburos aromáticos obtenidos del petróleo y del carbón pueden ser sólidos
o líquidos a temperatura ambiente, tóxicos y, en algunos casos, carcinogénicos para
los mamíferos. Son de mayor importancia en la producción de polímeros, colorantes,
fármacos y surfactantes (Higgins, 1978).
1.3.4. Hidrocarburos policíclicos aromáticos
La unión de dos o más anillos bencénicos forma este tipo de compuestos. Algunos de
estos se han investigado extensivamente en relación a sus propiedades cancerígenas
(Botello, y col., 2005).
Los hidrocarburos policíclicos aromáticos son contaminantes ambientales de origen
natural y antropogénico como erupciones volcánicas, la fundición del aluminio,
producción y preservación de creosota. El origen antropogénico típicamente es el
resultado de la combustión incompleta de sustancias orgánicas (Jiménez, 2005).
12
El comportamiento de estos compuestos depende en gran medida de su número de
anillos. Presentan una fuerte adsorción de materia orgánica y pueden ser
biodegradados (Jiménez, 2005).
Algunos de estos hidrocarburos han demostrado ser dañinos para el ambiente y,
principalmente, para la salud del ser humano; como es el caso del antraceno, el
fenantreno, el fluoranteno y el pireno.
1.3.4.1. Antraceno
El antraceno (C14H10) se encuentra en estado físico como cristales blancos. La
sustancia se descompone al calentarla intensamente, en contacto con luz solar, bajo
la influencia de oxidantes fuertes, produciendo humos acres y tóxicos, causando
peligro de incendio o explosión (Red de Intercambio de Información Química).
Es una sustancia peligrosa para el ambiente y tiene la capacidad de bioacumularse
en organismos como especies acuáticas y plantas. En el ser humano, se puede
absorber por inhalación, a través de la piel y por ingestión. Si la exposición es de corta
duración se produce una irritación en los ojos, la piel, el tracto respiratorio y el tracto
intestinal; si la exposición es prolongada o repetida puede producir sensibilización de
la piel (Ministerio de Agricultura y Medio Ambiente).
Interviene en la fabricación de colorantes. Se encuentra como componente de cortinas
de humo y cristales para contadores de escintilación (Jiménez, 2005).
1.3.4.2. Fenantreno
El fenantreno (C14H10) es uno de los hidrocarburos más frecuentes en el ambiente,
considerado un contaminante prioritario ya que contribuye con más del 49% del total
de los hidrocarburos policíclicos aromáticos en el ambiente. Se emplea
frecuentemente para desarrollar estudios sobre el metabolismo de hidrocarburos
policíclicos aromáticos con efecto carcinogénico (Otero y col., 2013).
13
1.3.4.3. Fluoranteno
El fluoranteno (C16H10) es una sustancia que posee un color amarillo claro y es apolar.
Se absorbe por inhalación, ingestión o a través de la piel, pero de manera lenta.
Provoca efectos tóxicos agudos en los animales acuáticos y su bioconcentración es
moderada (Ministerio de Agricultura y Medio Ambiente).
Se produce en el proceso pirolítico de materia orgánica verde, hulla y petróleo a altas
temperaturas. Se produce en la biosíntesis de plantas (Jiménez, 2005).
1.3.4.4. Pireno
El pireno (C16H10) es un sólido amarillo claro o incoloro que se descompone al
calentarlo intensamente, produciendo humos irritantes. La sustancia se puede
absorber por inhalación, a través de la piel y por ingestión. La exposición al sol puede
provocar un efecto irritante del pireno en la piel y puede llegar a un descoloramiento
crónico de la piel (Fichas Internacionales de Seguridad Química). Se emplea en
investigación bioquímica.
1.3.5. Daños a la salud
El ser humano está expuesto a estos hidrocarburos a través de la inhalación, contacto
con la piel e ingestión. En el organismo, los hidrocarburos policíclicos aromáticos son
altamente liposolubles se absorben rápidamente en tejidos lipídicos como los riñones,
hígado y tracto gastrointestinal. El metabolismo de estos compuestos tiene lugar en el
tejido nasal, glándulas mamarias, bazo, folículos cerebrales, eritrocitos, plaquetas,
leucocitos, placenta y útero. (Nwinyi, y col., 2016)
Enoch Olando y col. Estudiaron en el año 2016 la relación entre la exposición
constante a este tipo de hidrocarburos y la tos crónica. Encontraron un incremento en
el signo tos en personas con enfermedades crónicas del sistema respiratorio, así
como tos pasajera en personas clínicamente sanas.
14
Varios hidrocarburos policíclicos aromáticos han causado tumores en animales de
laboratorio, entre estos se encuentra el antraceno, el pireno y el fluoranteno. Estos
hidrocarburos se transforman en el cuerpo en sustancias químicas que pueden
adherirse a otras sustancias en el cuerpo; la presencia de éstos puede medirse en los
tejidos del cuerpo o en la sangre después de ocurrida la exposición a los mismos;
también pueden medirse en orina (Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de
Enfermedades).
1.4. Biorremediación
La práctica de biorremediación consiste en utilizar organismos biológico naturales o
modificadas genéticamente, como plantas (fitorremediación), hongos y bacterias, con
el fin de transformar sustancias tóxicas para disminuir su toxicidad o para volverlas
inocuas. Las bacterias son los microorganismos más utilizados para el tratamiento por
biorremediación (Benavides, 2006).
Los hidrocarburos policíclicos aromáticos pueden degradarse en productos de larga
duración al reaccionar con la luz solar y otras sustancias presentes en el aire,
generalmente durante un periodo que dura de días a semanas. La degradación en el
suelo y en el agua toma generalmente entre semanas y meses y es causado
principalmente por la acción de microorganismos (Agencia para Sustancias Tóxicas y
el Registro de Enfermedades, 2016).
La interacción entre una especie bacteriana y el petróleo crudo es un proceso
bioquímico complejo. La bacteria puede tener efectos directos o indirectos sobre las
propiedades del aceite: induce cambios fisicoquímicos que ayudan a la degradación,
o por medio de las enzimas que producen las especies bacterianas (Eda Acikgoz,
2015).
El mecanismo de adaptación microbiana para la degradación de compuestos
aromáticos como el fenol, se explica por la inducción de enzimas intracelulares. La
degradación microbiana del fenol bajo condiciones aeróbicas usualmente procede por
una hidroxilación inicial para generar catecol que se escinde por las rutas de fisión
15
meta u orto. La escisión orto es catalizada por catecol-1,2-dioxigenasa que dirige la
formación del semialdehído 2-hidroximuconico (Eda Acikgoz, 2015).
Los microorganismos aislados de la matriz del área contaminada son capaces de
mejorar la velocidad y rango de descomposición del contaminante en cuestión. Esto
es porque tienen un potencial metabólico versátil, ya que pueden poseer habilidades
como degradación de hidrocarburos policíclicos aromáticos, producción de
biosurfactantes y tolerancia a metales pesados, entre otras (Eda Acikgoz, 2015).
1.4.1. Biorremediación en ambientes salinos
Se considera que al menos un 5% del total de los efluentes en el mundo son altamente
salinos. La concentración de sal en estos ambientes puede variar de 3.5% de sal
disuelta, como en el agua de mar, a concentraciones cercanas a la saturación (35%)
(Le Borgne y col., 2008).
La biodegradación es la primera alternativa usada en el tratamiento de áreas
contaminadas con hidrocarburos debido a su costo-beneficio. Sin embargo, en
ambientes salinos e hipersalinos los tratamientos microbiológicos convencionales no
funcionan, ya que las altas concentraciones de sal inhiben el crecimiento y la actividad
degradadora de las bacterias (Guo, 2016).
La alta salinidad de las superficies contaminadas puede provocar desnaturalización
de proteínas y deshidratación de células, lo cual es letal para microorganismos
utilizados comúnmente en biorremediación (Benavides, 2006).
El flujo global de hidrocarburos policíclicos aromáticos en ambientes marinos es
controlado, en parte, por la degradación microbiana que impide la acumulación de
estas moléculas en el ecosistema (Le Borgne y col., 2008).
16
1.5. Estudios antecedentes de biodegradación de hidrocarburos
Se han realizado estudios para contrarrestar el problema de la contaminación por
hidrocarburos alrededor de todo el mundo.
En el continente asiático, Xue y col. identificaron y caracterizaron a Gordonia
paraffinivorans como nueva especie degradadora de hidrocarburos. El hallazgo fue
hecho en 2003 en China; la actinobacteria fue aislada de un pozo petrolero.
Una nueva especie del género Actinopolyspora fue hallada en la península Arábiga.
Esta nueva especie es halófila extrema y posee la capacidad de degradar
hidrocarburos. El hallazgo fue hecho por Al-Mueini y col. en 2007.
En China en el año 2009, Hao y Lu fueron capaces de aislar una especie bacteriana
de tipo cocoide, la cual es una especie halófila y es capaz de metabolizar varias
moléculas orgánicas de alto y bajo peso molecular.
Zhou y col. estudiaron a bacterias del género Sphingomonas, las cuales fueron
capaces de utilizar hidrocarburos policíclicos aromáticos como fuente de carbono y
energía; los resultados de este estudio realizado en China se publicaron en el año
2016.
En el mismo año, Zhu y col. (China) aislaron Stenotrophomonas sp. y Pseudomonas
sp. de plantas que crecieron en suelos contaminados; estas especies fueron capaces
de degradar naftaleno, fluoranteno, pireno y fenantreno cuando las exponen a estos
de manera individual o en mezcla.
En África, en el año 2016, Obinna y col., estudiaron en Nigeria a varias especies
bacterianas del género Pseudomonas. Tras analizar la capacidad
hidrocarbonaclástica de estos microorganismos, concluyeron que Pseudomonas
plecoglossicida y Pseudomonas sp tienen la capacidad de degradar parcialmente los
hidrocarburos policíclicos aromáticos a los que se vieron expuestos: naftaleno,
fluoranteno, pireno y criseno.
17
Por otro lado, en Ámerica, se estudió la habilidad de bacterias del género Haloferax
de metabolizar compuestos aromáticos, incluyendo hidrocarburos policíclicos
aromáticos en una variedad de ambientes hipersalinos. La investigación fue realizada
por Bonfá y col. en Brasil en 2011.
Revelo y col., en Colombia, realizaron un estudio en 2013 en el que caracterizaron
bacterias marinas hidrocarbonaclásticas. Este estudio resultó en la descripción de
cuatro principales géneros bacterianos: Pseudomonas sp., Bacillus sp., Halomonas
sp. Y Haererehalobacter sp. La capacidad de degradar aceites se observó en esta
comunidad y se dedujo la potencial producción de biosurfactantes por la degradación
de hidrocarburos por acción de estas bacterias.
En 2016, Lara-Severino y col., analizaron la capacidad de algunas actinobacterias
halotolerantes de degradar antraceno. El resultado de esta investigación fue que las
bacterias K. rosea, K. palustris, M. testaceum y N. farcinica son capaces de usar y
transformar el antraceno. Las bacterias analizadas fueron aisladas de áreas con
actividad petrolera, ya que se ha comprobado que las especies nativas son las más
aptas para la biorremediación.
18
2. Planteamiento del Problema
La contaminación ambiental por hidrocarburos impide el intercambio gaseoso; esto
afecta a diferentes ecosistemas dañando flora, fauna y, principalmente, la salud del
ser humano.
Algunos de los métodos de tratamiento de áreas contaminadas por hidrocarburos son
costosos y no siempre efectivos, ya que existe la posibilidad de que los productos de
degradación sean más tóxicos que la molécula original.
Debido a esto, la biorremediación puede ser una alternativa viable para enfrentar este
problema.
Las bacterias usadas comúnmente en los procesos de biorremediación no son aptas
para el tratamiento de áreas hipersalinas contaminadas con hidrocarburos, por lo que
se buscan microorganismos capaces de desarrollarse en estos ambientes y que
conserven sus propiedades de degradación.
Pregunta investigación
¿Las actinobacterias halófilas son capaces de degradar hidrocarburos policíclicos
aromáticos?
3. Hipótesis
Hipótesis alterna:
Las actinobacterias halófilas aisladas son capaces de degradar al menos uno de los
hidrocarburos policíclicos aromáticos a los que se van a exponer.
Hipótesis nula:
Las actinobacterias halófilas aisladas no son capaces de degradar los hidrocarburos
policíclicos aromáticos a los que se va a exponer.
19
4. Objetivos
4.1 Objetivo General
Identificar actinobacterias halófilas con la capacidad para degradar hidrocarburos
policíclicos aromáticos.
4.2 Objetivos Específicos
• Realizar un muestreo en el ex lago de Texcoco para búsqueda y aislamiento
de actinobacterias halófilas.
• Evaluar la capacidad de degradación de hidrocarburos policíclicos aromáticos
por acción de actinobacterias halófilas.
• Identificar genéticamente a las actinobacterias halófilas con capacidad para
degradar hidrocarburos policíclicos aromáticos.
20
5. Justificación
De acuerdo con los datos reportados por Petróleos Mexicanos (PEMEX) en 2016, en
agosto se produjeron 2144 miles de barriles por día de petróleo crudo. Dentro del
petróleo que se considera pesado, 360 barriles se distribuyeron en refinerías y 1009
a terminales de exportación (Petróleos Mexicanos, 2016).
El manejo inadecuado de petróleo y sus derivados genera un importante problema de
contaminación de suelos, agua y, eventualmente, aire.
Los hidrocarburos policíclicos aromáticos son compuestos químicos de alta toxicidad
que afectan la vida y la salud del ser humano.
El ser humano está expuesto a estos hidrocarburos a través de la inhalación, contacto
con la piel e ingestión. En el organismo, los hidrocarburos policíclicos aromáticos son
altamente liposolubles, se absorben rápidamente en tejidos lipídicos como los riñones,
hígado y tracto gastrointestinal. El metabolismo de estos compuestos tiene lugar en el
tejido nasal, glándulas mamarias, bazo, folículos cerebrales, eritrocitos, plaquetas,
leucocitos, placenta y útero.
Debido a que los métodos de tratamiento de áreas contaminadas con hidrocarburos
suelen ser poco efectivos, se plantea la opción de usar sistemas biológicos como
método alternativo para enfrentar este problema.
La biorremediación es una alternativa eficaz para el tratamiento de áreas
contaminadas. Consiste en el uso de organismos como plantas, hongos o bacterias
para reducir la toxicidad de los compuestos o volverlos inocuos.
Los metabolitos secundarios producidos por bacterias, así como las enzimas
extracelulares, son de gran valor en la descontaminación de áreas dañadas por
hidrocarburos debido a su actividad surfactante y a sus propiedades bioemulsificantes.
La alta concentración de sal en ambientes contaminados con hidrocarburos inhibe el
crecimiento bacteriano, ya que puede provocar la desnaturalización de proteínas y la
21
deshidratación del organismo. Por otro lado, disminuye la producción de metabolitos
secundarios y enzimas extracelulares, afectando así su capacidad degradadora.
Las actinobacterias halófilas son capaces de soportar elevadas concentraciones de
sal y pH básico, por lo que pueden desarrollarse en ambientes en los que otros
microorganismos no podrían hacerlo. Así mismo, estos microorganismos producen
una serie de enzimas hidrolíticas extracelulares como amilasas, lipasas, proteasas,
nucleasas y esterasas; las cuales son clave en la biodegradación de residuos tóxicos
y contaminantes industriales.
22
6. Material y Métodos
6.1. Diseño de Estudio
Experimental. Cuantitativo
Universo: Microorganismos aislados del ex lago de Texcoco
Método de muestreo: Por conveniencia.
Muestra: Actinobacterias halófilas degradadoras de hidrocarburos policíclicos
aromáticos
6.2. Criterios de inclusión, exclusión y eliminación
Criterios inclusión
Actinobacterias halófilas y halotolerantes que degraden hidrocarburos.
Criterios exclusión
Bacterias que no sean de la familia de las actinobacterias.
Actinobacterias que no sean halófilas o halotolerantes
Criterios eliminación
Actinobacterias halófilas que no presenten tolerancia a hidrocarburos
policíclicos aromáticos
6.3. Procedimiento
6.3.1 Muestreo
El muestreo se realizó en el territorio perteneciente al ex lago de Texcoco. Se tomaron
muestras de tierra de 7 puntos diferentes. De cada punto se tomaron muestras de
23
agua, sedimento y suelo, en bolsas de polietileno y tubos estériles. Se transportaron
al laboratorio bajo condiciones de refrigeración.
6.3.2 Caracterización fisicoquímica de las muestras
Se determinaron las características fisicoquímicas de pH y porcentaje de salinidad de
las muestras, para lo cual se colocó un gramo de suelo seco, previamente pulverizado,
en un tubo de ensayo que contenía 9 mL de agua destilada. Se agitó en vórtex durante
10 minutos para conseguir homogeneidad. El mismo procedimiento se realizó para las
muestras de sedimento. La mezcla se dejó filtrar durante toda la noche utilizando papel
filtro Whatman número 1. Las muestras de agua también se sometieron al proceso
de filtrado.
El filtrado se sometió al análisis de pH y % de salinidad; para estas se utilizaron un
potenciómetro y un refractómetro (MASTER-S/Millα).
6.3.3 Aislamiento y purificación de cepas
Para el aislamiento se utilizaron 3 diferentes medios de cultivo:
Medio para halófilos moderados (MH) (Quesada y col., 1983): contiene 10 g/L
de extracto de levadura, 5 g/L de proteosa peptona, 1 g/L de dextrosa y 18 g/L
de agar.
Medio Sauton-UAM (Sandoval y col., 1997): contiene 4 g/L de asparagina, 2
g/L de ácido cítrico, 0.5 g/L de K2HPO4, 0.5 g/L de MgSO4, 0.05 g/L de citrato
férrico amoniacal, 0.1 g/L de ZnSO4, 0.5 g/L de CaCl2, 0.1 g/L de CuSO4, 10
g/L de hojuelas de papa, 60 g/L de glicerol, 5 g/L de carbón activado, 0.1 g/L
de cicloheximida, 0.05 g/L de estreptomicina, 0.05 g/L de eritromicina, 0.05 g/L
de kanamicina y 18 g/L de agar.
Medio Czapek (Becton Dickinson, No. de catálogo: 211776): se resuspenden
50 g del medio deshidratado por cada litro de agua.
Todos los medios se prepararon con solución salina al 10% y se les ajustó el pH a 9.
Los medios fueron esterilizados en autoclave a 121°C durante 15 minutos;
posteriormente, se dejaron enfriar a 45°C y se vertieron en cajas Petri estériles.
24
Se elaboraron soluciones con suelo y sedimento a una concentración de 0.1 mg/mL,
utilizando agua destilada como solvente y asegurando una completa homogeneidad.
Para las muestras de agua, la concentración fue de 0.1 mL/mL.
Se realizaron diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 para inocular las cajas Petri con los
diferentes medios de cultivo. Se tomaron 200 μL de cada dilución, la muestra se colocó
en el centro de la caja y se distribuyó de forma radial con una varilla de vidrio. Las
cajas se incubaron a 37°C durante 7 a 10 días. Posteriormente, se eligieron las
colonias que por su morfología macroscópica indicaban ser cepas de actinobacterias
(tamaño, color, aspecto, forma, textura, crecimiento radial, presencia de micelio aéreo,
producción de pigmento) (Manual de Bergey, 2012) y se procedió a aislarlas para su
purificación.
6.3.4 Caracterización morfológica.
Morfología macroscópica.
Se describió la morfología macroscópica de las cepas de acuerdo a las siguientes
características: tamaño, color, aspecto, forma, textura, elevación de la colonia,
presencia de micelio aéreo y pigmento difusible en el medio de cultivo.
Morfología microscópica.
Se realizó un frotis a las cepas purificadas y se procedió a efectuar una tinción de
Gram. Los frotis teñidos se observaron en un microscopio óptico de la marca y modelo
OLYMPUS U-5RE-2, se buscaron bacilos Gram positivos en formación de filamentos
ramificados.
6.3.5 Caracterización fisiológica.
Determinación de la concentración de NaCl para el crecimiento óptimo de las cepas
aisladas.
25
El rango y la concentración de NaCl óptimo para el crecimiento de las cepas se
determinaron sembrando cada cepa en el medio de cultivo MH a diferentes
concentraciones de NaCl (0, 0.5, 3, 5, 10, 15, 20, 25 y 30%) a pH de 7. La siembra se
realizó por estría y se incubaron a 37°C. El crecimiento fue observado diariamente
durante 10 días y se interpretó como (-) cuando fue nulo, (+) cuando fue muy escaso,
(++) cuando fue escaso, (+++) cuando fue moderado y (++++) cuando fue óptimo.
Determinación del valor de pH para el crecimiento óptimo de las cepas aisladas.
El rango y pH óptimo para el crecimiento de las cepas se determinaron sembrando
cada cepa en el medio de cultivo MH, ajustando la concentración de NaCl de acuerdo
al crecimiento óptimo. El pH se ajustó a los valores de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12. Se
inoculó por estría y se incubó a 37°C. El crecimiento fue observado diariamente
durante 10 días y se interpretó como (-) cuando fue nulo, (+) cuando fue muy escaso,
(++) cuando fue escaso, (+++) cuando fue moderado y (++++) cuando fue óptimo.
6.3.6. Distribución de las cepas de acuerdo a las características
fisiológicas
Las cepas se distribuyeron de acuerdo al rango de crecimiento óptimo en porcentaje
de NaCl de la siguiente manera: a) halotolerantes (crecen tanto en presencia como en
ausencia de NaCl en el medio); b) halófilas débiles (0.5 – 5%); c) halófilas moderadas
(10 – 20%) y d) halófilas extremas (≥25%).
Así mismo, se realizó una distribución considerando el rango de pH para el crecimiento
óptimo: a) alcalotolerantes (pH de 5 – 12); b) alcalófilas (pH de 9 – 12)
6.3.7. Biodegradación de los hidrocarburos policíclicos aromáticos:
antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno
Las actinobacterias aisladas se inocularon en medio líquido MH suplementado con
10% NaCl y ajustado a pH 8. Se incubaron a 37°C y 120 rpm durante 7 días.
26
Posteriormente se transfirió un inóculo de 200 μL del cultivo bacteriano, equivalente a
6x107 células (2 McFarland) a un tubo con rosca que contenía 5 mL de Medio Mínimo
de Sales (MSM: (NH4)2SO4, 1000mg/L; Na2HPO4, 800mg/L; K2HPO4, 200mg/L;
MgSO4 ⋅7H2O, 200mg/L; CaCl2⋅2H2O, 100mg/L; FeCl3⋅H2O, 5mg/L;
(NH4)6Mo7O24⋅H2O, 1mg/L) (Sang, 2009) suplementado con 10% NaCl y ajustado a
pH 8, conteniente de 0.5 ppm del hidrocarburo a probar (antraceno, fenantreno,
fluoranteno o pireno) y 50 μL del indicador redox 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) a
una concentración de 0.5 mg/mL. La presencia del indicador tornó al cultivo de color
azul. Cada prueba se realizó por triplicado. La disminución en la intensidad del color
azul inicial indicó un resultado positivo a la prueba de biodegradación.
Los cultivos bacterianos que dieron un resultado positivo en la prueba, se volvieron a
preparar de la manera indicada anteriormente y se incubaron a 37oC por 48h. A los
tiempos 0 h, 24 h y 48 h post incubación se tomaron 3 mL de sobrenadante y se
centrifugaron. A la solución se le registró el espectro visible de absorción entre (400-
800) nm con un espectrofotómetro Perkim Elmer, utilizando cubeta de cuarzo de 1 cm
de paso óptico. La capacidad de biodegradación de las cepas para cada hidrocarburo
se determinó como la relación de la absorbancia a 600 nm entre el tiempo 0 h y las 48
h. Se prepararon muestras controles que consistieron en 5 mL de medio mínimo de
sales suplementado con 10% NaCl y ajustado a pH 8, conteniente de 0.5 ppm del
hidrocarburo a evaluar (25 μL de una solución madre de 100 ppm) y 50 μL del
indicador redox 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) a una concentración de 0.5 mg/mL,
y muestras de medio mínimo de sales suplementado con 10% NaCl y ajustado a pH
8 contenientes de 50 μL del indicador redox 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) a una
concentración de 0.5 mg/mL . Estas muestras controles también se incubaron a 37oC
por 48h y sus espectros visibles de absorción se registraron a los mismos tiempos y
en las mismas condiciones que las muestras.
6.3.8 Tolerancia a Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos
Para realizar la prueba de tolerancia a los hidrocarburos policíclicos aromáticos
elegidos fue necesario inocular las cepas de Actinobacterias en medio para halófilas
moderadas MH complementado con diferentes concentraciones de los mismos.
27
Primero se realizaron soluciones de los hidrocarburos de interés, antraceno,
fenantreno, fluoranteno y pireno; las concentraciones fueron de 1000 ppm, 100 ppm y
1 ppm.
Para cada solución de 1000 ppm se pesaron 0.2 g del hidrocarburo y se diluyeron en
20 mL de metanol.
Posteriormente, se tomó una alícuota de 2 mL de la solución de 1000 ppm y se llevó
a un volumen de 20 mL en metanol para obtener una solución de 100 ppm.
Finalmente, de ésta última solución se tomó una alícuota de 0.2 mL y se llevó a un
volumen de 20 mL en metanol para obtener una solución de 1 ppm.
Por otro lado, se preparó medio de cultivo para halófilas moderadas MH de la siguiente
forma:
Extracto de Levadura: 1.75 g
Proteosa Peptona: 0.875 g
Glucosa: 0.175 g
Agar: 3.15 g
Solución Salina al 10%: 87.5 mL
pH: 9
Para poder vaciar el medio de cultivo en las cajas petri fue necesario incluir las
soluciones de hidrocarburos diluidas en agua destilada previamente esterilizada. Las
concentraciones quedaron de acuerdo a la siguiente tabla:
Tabla 1.
Concentración de Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos en medio de cultivo para
halófilas moderadas (MH)
Concentración
inicial de HPA
Solución de
HPA
Agua
destilada
Medio de
cultivo MH
Volumen
final
Concentración
final de HPA
1000 ppm 17.5 mL 70 mL 87.5 mL 175 mL 100 ppm
100 ppm 17.5 mL 70 mL 87.5 mL 175 mL 10 ppm
100 ppm 1.75 mL 85.75 mL 87.5 mL 175 mL 1 ppm
1 ppm 17.5 mL 70 mL 87.5 mL 175 mL 0.1 ppm
1 ppm 1.75 mL 85.75 mL 87.5 mL 175 mL 0.01 ppm
28
Se midieron 25 mL de medio de cultivo adicionado con Hidrocarburos Policíclicos
Aromáticos para cada caja petri. Así mismo, en cada caja se inocularon 6 cepas y se
revisó su crecimiento en los siete días de incubación posteriores.
6.3.9. Identificación genética
Obtención de biomasa.
Las cepas aisladas se inoculan en el medio líquido MH, para obtener biomasa se
utiliza la siguiente metodología:
1. Se inoculan las cepas aisladas en matraces de 125 mL conteniendo 30 mL
de medio de cultivo líquido MH.
2. Cuando se observa crecimiento suficiente, se transfiere el medio líquido y
la biomasa a tubos Falcón de 15 mL estériles y se centrifugan durante 15
minutos, se retira el sobrenadante y el pellet se transfiere a tubos eppendorf
de 1.5 mL, se centrifugan los tubos a 14000 rpm por 5 minutos; se retira el
sobrenadante y se inicia el protocolo de extracción de ADN con el pellet
bacteriano.
Extracción de ADN
Se realiza utilizando el kit Promega Wizard® Genomic:
1. Se resuspende el pellet bacteriano con 480 μL de EDTA 0.5 M.
2. Se agregan 120 μL de lisozima, se mezcla cuidadosamente con una pipeta.
3. Se incuba la muestra a 37°C por 60 minutos, se centrifuga a 14000 rpm durante
2 minutos y se retira el sobrenadante.
4. Posteriormente, se agregan 600 μL de solución nuclear de lisis del kit de
purificación de ADN “Promega Wizard® Genomic” mezclando cuidadosamente.
5. Se incuba a 80°C durante 5 minutos y se deja enfriar a temperatura ambiente.
6. Se agregan 3 μL de solución de RNAsa del kit de purificación de ADN “Promega
Wizard® Genomic”; el tubo se mezcla por inversión de 2 a 3 veces.
29
7. Se incuba el tubo a 37°C por 60 minutos y se deja enfriar a temperatura
ambiente.
8. Se agregan 200 μL de solución de precipitación de proteínas del kit de
purificación de ADN “Promega Wizard® Genomic” al lisado tratado con RNAsa,
se agita vigorosamente en un vortex durante 20 segundos para mezclar.
9. Se incuba la mezcla en hielo durante 5 minutos.
10. Posteriormente, se centrifuga a 14000 rpm por 3 minutos y se transfiere el
sobrenadante a un tubo eppendorf estéril de 1.5 mL que contenga 600 μL de
isopropanol.
11. Se mezcla suavemente por inversión hasta que se observa la formación de
hebras de ADN visibles.
12. Se centrifuga a 14000 rpm por 2 minutos.
13. Se retira cuidadosamente el sobrenadante y el tubo se golpea suavemente
sobre un papel absorbente. Se adicionan 600 μL de etanol al 70%, se invierte
el tubo con el pellet de ADN de 2 a 3 veces.
14. Se centrifuga a 14000 rpm durante 2 minutos, se retira cuidadosamente el
etanol y se deja secar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
15. En el último paso, se agregan 100 μL de solución de rehidratación del kit de
purificación de ADN “Promega Wizard® Genomic” y se incuba en refrigeración
a 4°C por 12 horas.
16. Se almacena en congelación hasta su utilización.
El ADN se visualiza por medio de una electroforesis en gel de agarosa al 1% con los
productos de extracción de ADN para observar la presencia y la calidad del ADN; se
utiliza la siguiente metodología:
1. En un matraz de 200 mL se colocan 0.25 g de agarosa y 25 mL de solución
TAE 1X.
2. Se agita suavemente y se calienta en un horno de microondas por 40 segundos,
y dos veces más por 20 segundos.
3. Previamente, se arma la cámara de electroforesis y se vierte la agarosa sobre
el molde. Se deja solidificar la agarosa por 15 minutos y se retira el peine.
4. Se cubre el gel con solución TAE 1X.
30
5. Se mezclan 7 μL de muestra con buffer de carga y se depositan en los pozos
del gel. Se depositan 7 μL de marcador de peso molecular.
6. Se cierra la cámara de electroforesis y se programa a 120 Volts y 300
microAmperes por 45 minutos.
7. Transcurrido este tiempo, se retira el gel y se revela en una solución de bromuro
de etidio por 15 segundos.
8. Se captura la imagen en un fotodocumentador.
Amplificación del marcador filogenético
A las cepas aisladas se les amplificó el marcador filogenético de 350 pares de bases
(pb) localizado en el gen rRNA 23S, por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), las secuencias que se utilizaron como iniciadores fueron:
23R insF: 5’-(AC)AGCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3’
23S insR: 5’-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3’
La reacción se llevó a cabo utilizando Taq AND polimerasa commercial. Las
condiciones del ciclo térmico fueron: un ciclo de predesnaturalización 5 minutos
(94°C), desnaturalización 30 segundos (94°C), acoplamiento 20 segundos (50°C),
elongación 40 segundos (72°C), repetir 29 ciclos y un ciclo post-elongación de 7
minutos (72°C). Los fragmentos amplificados se observaron por medio de una
electroforesis en un gel de agarosa al 2%, revelado en bromuro de etidio por 7
segundos.
Amplificación del gen rRNA 16S
Se realiza por medio de la PCR y se utilizan las siguientes secuencias de nucleótidos
(cebadores):
27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’
518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’
1492R: 5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’
800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’
31
La reacción se lleva a cabo utilizando Taq ADN polimerasa comercial. Las condiciones
del ciclo térmico son: un ciclo de pre-desnaturalización de 5 minutos (94°C),
desnaturalización por 60 segundos (94°C), acoplamiento por 30 segundos (59°C),
elongación por 60 segundos (72°C), se repiten 30 ciclos y posteriormente un ciclo de
post-elongación de 10 minutos (72°C). Los productos amplificados se visualizan en
gel de agarosa al 1% y se revela con bromuro de etidio por 7 segundos.
Ribotipificación mediante PCR-RFLP de 16S rRNA
En un tubo Eppendorf estéril, se digirieron 10 μL de los amplicones de PCR con la
enzima MspI (Promega, N° de catálogo: R6401). La mezcla de reacción consistió en
7.6 μL de agua libre de nucleasas (Merck Milipore, N° de catálogo: LSKNF0500), 2 μL
de Buffer B 10X (Promega, N° de catálogo: R002A), 0.2 μL de Albúmina sérica bovina
acetilada (Promega, N° de catálogo: R396D) y 0.2 μL de la enzima de restricción. El
volumen final de la reacción fue de 20 μL. De igual forma, se digirieron 10 μL de los
amplicones de PCR con la enzima RsaI (Promega, N° de catálogo: R6371).
Para ambas enzimas, la digestión de restricción se llevó a cabo durante 1 hora a 37°C;
posteriormente, se inactivó la enzima por calentamiento 15 minutos a 72°C. 10 μL del
producto de digestión fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1.5% en
Buffer TAE (Invitrogen, N° de catálogo: 24710-030), teñido con bromuro de etidio; el
proceso se realizó a 120V durante 80 minutos. Se utilizó un marcador de peso
molecular de ADN 1 kb (Thermo scientific, N° de catálogo: 5M0311). Los geles se
visualizaron bajo luz UV y se fotodocumentaron electrónicamente.
Los patrones de restricción generados se analizaron de acuerdo con el número de
bandas y posición respecto al marcador de peso molecular utilizado. Para el análisis
de agrupamiento se incluyeron los perfiles que presentaron al menos 2 bandas. Los
patrones se analizaron con el programa PyElph 1.4 basado en el algoritmo Neighbour
Joining.
32
Purificación
Los fragmentos amplificados del gen rRNA 16S se filtraron con el equipo de
purificación de PCR Amicon Ultra 0.5 mL (Merck milipore, No. de catálogo
UFC503096), siguiendo la metodología del proveedor)
Secuenciación.
Los productos amplificados serán enviados al servicio de secuenciación de Macrogen
Maryland, U.S.A.
Identificación de cepas.
Las secuencias obtenidas son revisadas y corregidas. Las secuencias consenso se
construyen a partir de los fragmentos forward y reverse utilizando el programa BioEdit
versión 7.0.9.
Las secuencias consenso se comparan con las secuencias ya depositadas en las
bases de datos del GenBank a través del programa BLAST del National Center of
Biotechnology (NCBI) para determinar el porcentaje de semejanza.
Las secuencias consenso y las secuencias obtenidas del GenBank se alinean con el
programa BioEdit sequence aligmment editor versión 7.0.9.
6.4. Variables de Estudio
Independientes:
Actinobacterias halófilas
Dependientes:
Tolerancia a hidrocarburos policíclicos aromáticos.
Eliminación de hidrocarburos policíclicos aromáticos.
33
Tabla 2. Variables
Variable Definición
conceptual
Definición operacional Tipo de variable Escala de
medición
Análisis estadísticos
Actinobacterias
halófilas.
Bacterias Gram
positivas,
filamentosas, con alta
capacidad de producir
enzimas
extracelulares.
Débiles: 0.5-10% [NaCl].
Moderadas: 10-20% [NaCl].
Extremas: más del 20%
[NaCl].
Independiente.
Cuantitativa.
Porcentaje de
crecimiento óptimo
en NaCl.
No aplica
Tolerancia a los
hidrocarburos.
Capacidad de los
microorganismos de
crecer y desarrollarse
en ambientes
contaminados con
hidrocarburos.
Cinética de crecimiento de
las actinobacterias.
Dependiente.
Cuantitativa
dicotómica.
Presente 1
Ausente 0
Modelo logístico
Degradación de
hidrocarburos.
Descomposición o
reducción de
compuestos orgánicos
formados por átomos
de Carbono e
Hidrógeno.
Medición de la
concentración por
Cromatografía de gases.
Dependiente
Cuantitativa
Por concentración. ANOVA
34
6.5 Implicaciones Bioéticas
Convenio sobre la diversidad biológica de las Naciones Unidas, suscrito en Río
de Janeiro en junio de 1992.
Los objetivos del convenio son:
La conservación de la diversidad biológica.
El uso sostenible de componentes de la diversidad biológica.
El reparto justo y equitativo de los beneficios derivados de la utilización de
recursos genéticos.
El Convenio establece que sus firmantes deberán evitar o minimizar el impacto
negativo resultante del uso de los recursos biológicos.
7. RESULTADOS
7.1. Nombre del artículo enviado
BÚSQUEDA RÁPIDA DE ACTINOBACTERIAS HALÓFILAS Y
HALOTOLERANTES CON CAPACIDAD PARA DEGRADAR
HIDROCARBUROS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS
SEARCHING FOR HALOPHILIC AND HALOTOLERANT ACTINOBACTERIA
WITH CAPACITY TO DEGRADE POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS
7.1.1. Carta de envío
35
36
7.1.2. Resumen
Introducción: Las actinobacterias son bacterias de gran versatilidad metabólica.
Las actinobacterias halófilas y halotolerantes combinan su capacidad productora
de enzimas con su resistencia a la salinidad, por lo que son de interés para
procesos de biorremediación incluida la remoción de hidrocarburos policíclicos
aromáticos (HPA). Las bacterias halófilas y halotolerantes se aíslan de
ambientes salinos como lo es el ex lago de Texcoco. Hasta el momento no hay
reportes del aislamiento de actinobacterias halófilas y halotolerantes con la
capacidad de degradar HPA de este ambiente. El objetivo de este trabajo fue
aislar actinobacterias halófilas de suelos, sedimentos y aguas del ex lago de
Texcoco potencialmente útiles en procesos de biorremediación.
Metodología: Se tomaron 9 muestras de agua, 8 de sedimento y 12 de suelos,
de 7 zonas diferentes del ex Lago de Texcoco. Las muestras se cultivaron en 3
medios diferentes y las actinobacterias aisladas se caracterizaron
fisiológicamente de acuerdo al requerimiento y tolerancia a % NaCl y pH para su
crecimiento. La capacidad de degradar antraceno, fenantreno, fluoranteno y
pireno se determinó por UV-Vis utilizando el indicador colorimétrico 2, 6-
dicloroindofenol (DCPIP). La tolerancia a diferentes concentraciones de los HPA
también fue evaluada.
Resultados: Se aislaron 43 actinobacterias, de la cuales 35 fueron halófilas y 8
halotolerantes. De ellas, 6 mostraron capacidad para degradar a alguno de los
hidrocarburos estudiados. Las bacterias degradadoras sin embargo, no
resultaron ser las más tolerantes.
Conclusión: existen actinobacterias halófilas y halotolerantes potencialmente
utilizables en procesos de biorremediación de HPA en el ex lago de Texcoco.
7.1.3. Abstract
Introduction: Actinobacteria are bacteria of great metabolic versatility. Halophilic
and halotolerant actinobacteria combine their enzyme production capacity with
their resistance to salinity, which is why they are of interest for bioremediation
37
processes including the removal of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH).
Halophilic and halotolerant bacteria are isolated from saline environments such
as the former lake of Texcoco. So far there are no reports of the isolation of
halophilic and halotolerant actinobacteria with the ability to degrade HPA in this
environment. The objective of this work was to isolate halophilic actinobacteria
from soils, sediments and waters of the former Texcoco Lake potentially useful in
bioremediation processes.
Methodology: 9 water samples, 8 sediment samples and 12 soil samples were
taken from 7 different areas of the former Lake of Texcoco. The samples were
cultured in 3 different media and the isolated actinobacteria were characterized
physiologically according to the requirement and tolerance to% NaCl and pH for
their growth. The ability to degrade anthracene, phenanthrene, fluoranthene and
pyrene was determined by UV-Vis using the colorimetric indicator 2,6-
dichloroindophenol (DCPIP). Tolerance to different PAH concentrations was also
evaluated.
Results: 43 actinobacteria were isolated, of which 35 were halophilic and 8 were
halotolerant. Of these, 6 showed the capacity to degrade some of the
hydrocarbons studied. The degrading bacteria, however, did not turn out to be
the most tolerant.
Conclusion: there are halophilic and halotolerant actinobacteria potentially usable
in bioremediation processes of PAH in the former lake of Texcoco.
Palabras claves: biodegradación, actinomicetos, método UV-Vis, tolerancia,
antraceno, fenantreno, fluoranteno, pireno.
7.1.4. Introducción
Los hidrocarburos son moléculas compuestas por átomos de carbono e
hidrógeno y representan un amplio conjunto de compuestos orgánicos de gran
importancia. Dentro de estos, los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA)
son de gran interés (Olah 2003). Estos compuestos que son el resultado de la
unión de dos o más anillos bencénicos en forma lineal, angular o en clúster
38
(Abdel-Shafy y Mansour 2016). Los HPA se caracterizan por ser persistentes en
el medio ambiente, presentar diversas estructuras y diferentes niveles de
toxicidad (Rengarajan et al. 2015).
Los HPA se encuentran en el medio ambiente de manera natural o
antropogénica, llegan a este debido a la combustión incompleta de estas fuentes
(naturales o antropogénicas). Dentro de las fuentes naturales se encuentran:
incendios forestales, actividad volcánica, síntesis bacteriana y de algas, filtración
del petróleo, erosión de rocas sedimentarias que contienen petróleo y
descomposición vegetativa. Las fuentes antropogénicas fundamentales son:
craqueo del petróleo, combustión incompleta en incineradores y procesos
industriales, emisiones provenientes de automóviles, de la cocción de alimentos,
de estufas de leña, del humo de cigarros y tabacos, de derrames petroleros, del
lodo de agua residual, de basura alquitranada, etc (Abdel-Shafy y Mansour
2016).
El ser humano está expuesto a estos hidrocarburos a través de la inhalación,
contacto con la piel e ingestión. En el organismo, los HPA son altamente
liposolubles se absorben rápidamente en tejidos lipídicos como los riñones,
hígado y tracto gastrointestinal. El metabolismo de estos compuestos tiene lugar
en el tejido nasal, glándulas mamarias, bazo, folículos cerebrales, eritrocitos,
plaquetas, leucocitos, placenta y útero; y ocurre a través del sistema de oxidasa
de función mixta mediada por el citocromo P450 con oxidación o hidroxilación
como primer paso. (Abdel-Shafy y Mansour 2016, Nwinyi et al. 2016). La
exposición a estos compuestos produce inmunosupresión y efectos
carcinogénicos y mutagénicos (Rengarajan et al. 2015, Abdel-Shafy y Mansour
2016). Por tanto, la presencia y acumulación de ellos en el ambiente es
potencialmente un problema de salud.
Varias tecnologías han sido evaluadas para tratar de eliminar a los HPA del
medio ambiente. Entre ellas, las basadas en la biorremediación son
prometedoras debido a su seguridad y relación costo-efectividad. La práctica de
biorremediación consiste en utilizar organismos biológicos naturales o
modificados genéticamente, como plantas (fitorremediación), hongos, algas y
39
bacterias, con el fin de transformar sustancias tóxicas en otras inocuas o de
menor toxicidad. Las bacterias son los microorganismos más utilizados para
tratamientos por biorremediación (de Mesa et al. 2006).
Las bacterias inducen cambios fisicoquímicos que ayudan a la degradación de
estos los HPA. Por ejemplo, aumentan la solubilidad de estos mediante la
producción de biosurfactantes, o producen cambios en su estructura química por
medio de la acción de enzimas (Acikgoz y Ozcan 2015).
Las actinobacterias son bacterias filamentosas Gram positivas, conocidas por su
versatilidad metabólica y producción de enzimas extracelulares de gran
importancia biotecnológica y médica. Esta versatilidad metabólica les facilita la
supervivencia en condiciones de estrés o desfavorables para el resto de las
bacterias. (Nawani et al. 2013). Estos microorganismos participan en la
estabilización de residuos orgánicos en el suelo, principalmente. También se
pueden encontrar en ríos y lagos o donde existan los nutrimentos adecuados
para su desarrollo. Requieren menor cantidad de nitrógeno para su crecimiento
que el resto de las bacterias, por lo que tienden a metabolizar las formas más
resistentes de materia orgánica (McKinney 2004).
Las actinobacterias halófilas representan un reducido grupo de actinobacterias
que, al combinar su capacidad productora con su resistencia a las condiciones
extremas de salinidad, resultan microorganismos de gran interés como fuente
productora en el área industrial, farmacéutica, cosmética y biotecnológica
(Ramírez et al. 2003). Particularmente en procesos de biorremediación resultan
prometedoras para ambientes contaminados de alta salinidad, donde el resto de
los microorganismos tendrían condiciones difíciles de supervivencia ya que las
altas concentraciones de sal inhiben el crecimiento y la actividad metabólica
(Guo 2016).
La principal vía de biodegradación aeróbica de hidrocarburos es la oxidación de
los anillos aromáticos por acción de enzimas producidas por los
microorganismos como la catecol-dioxigenasa (Obi et al. 2016). Estas
reacciones de oxidación pueden ser fácilmente detectadas a través de métodos
40
colorimétricos, con el uso de indicadores aceptores de electrones, como es el
caso del 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP). La reducción del DCPIP se detecta
por el cambio de color en el medio, de azul a incoloro (Bučková et al. 2013). En
estudios in vitro sobre la capacidad biodegradadora de microorganismos, el
antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno son de los HPA más utilizados como
moléculas modelo.
El objetivo del estudio fue aislar actinobacterias halófilas de suelos, sedimentos
y aguas del ex lago de Texcoco (ambiente de alta salinidad y alcalinidad)
potencialmente útiles en procesos de biorremediación. Para ello se determinó
mediante el indicador DCPIP la capacidad para transformar antraceno,
fenantreno, fluoranteno y pireno de las cepas aisladas.
7.1.5. Apartados del artículo
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de las muestras
Se realizó un muestreo por conveniencia en el ex lago de Texcoco. Se
tomaron muestras de agua, suelo y sedimento en 7 zonas diferentes. Las
muestras fueron recolectadas y transportadas al laboratorio en bolsas de
polietileno y tubos estériles bajo condiciones de refrigeración.
Caracterización fisicoquímica de las muestras
Se prepararon dispersiones de suelo y sedimento a una concentración de 0.1
g/mL, utilizando agua destilada como fase dispersante y asegurando
completa homogenización. Tanto las dispersiones preparadas como las
muestras de agua colectadas se filtraron durante toda una noche utilizando
papel filtro Whatman número 1. Al filtrado obtenido se le determinó el pH y el
% de salinidad por medio de un potenciómetro (Condutronic, modelo pH10)
y un refractómetro (MASTER-S/Millα), respectivamente.
41
Medios de cultivo y aislamiento
Se prepararon 3 diferentes medios de cultivo para el aislamiento de las
actinobacterias. (i) Medio para bacterias halófilas moderadas (MH): 10 g/L de
extracto de levadura, 5 g/L de proteosa peptona, 1 g/L de dextrosa y 18 g/L
de agar. (ii) Medio Sauton-UAM: 4 g/L de asparagina, 2 g/L de ácido cítrico,
0.5 g/L de K2HPO4, 0.5 g/L de MgSO4, 0.05 g/L de citrato férrico amoniacal,
0.1 g/L de ZnSO4, 0.5 g/L de CaCl2, 0.1 g/L de CuSO4, 10 g/L de hojuelas de
papa, 60 g/L de glicerol, 5 g/L de carbón activado, 0.1 g/L de cicloheximida,
0.05 g/L de estreptomicina, 0.05 g/L de eritromicina, 0.05 g/L de kanamicina
y 18 g/L de agar. (iii) Medio Czapek (Becton Dickinson, No. de catálogo:
211776). Los medios fueron complementados con solución salina al 10 % y
se les ajustó el pH a 9. Los medios fueron esterilizados en autoclave a 121
°C durante 15 minutos; posteriormente, se dejaron enfriar a 45 °C y se
vertieron en cajas Petri estériles.
Para aislar las actinobacterias de las muestras colectadas, se prepararon
dispersiones de suelo y sedimento a una concentración de 0.1 g/mL,
utilizando agua destilada como fase dispersante y asegurando una completa
homogenización. Para inocular las cajas Petri contenientes de los diferentes
medios de cultivo, se realizaron diluciones 1:10, 1:100, 1:1000 de las
dispersiones de suelo y sedimentos y de las muestras iniciales de agua. Se
tomaron 200 μL de cada dilución y se colocaron en el centro de las cajas
Petri, posteriormente se distribuyeron de forma radial con una varilla de vidrio.
Las cajas se incubaron a 37 °C durante 7 a 10 días. Posteriormente, se
eligieron las colonias que por su morfología macroscópica (tamaño, color,
42
aspecto, consistencia, crecimiento radial, presencia de micelio aéreo,
producción de pigmento) indicaban ser cepas de actinobacterias y se
procedió a aislarlas para su purificación. Las cepas se purificaron
resembrándolas en el mismo medio del cual fueron aisladas.
Caracterización morfológica
Se describió la morfología macroscópica de las cepas purificadas de acuerdo
a las siguientes características: tamaño, color, forma, textura, aspecto,
elevación de la colonia, presencia de micelio vegetativo o aéreo y pigmento
difusible en el medio de cultivo. Para la morfología microscópica, se realizó
un frotis a las cepas purificadas y se procedió a efectuar una tinción de Gram.
Los frotis teñidos se observaron en un microscopio óptico (OLYMPUS, U-
5RE-2)
Caracterización fisiológica
Se determinó el rango de % NaCl en el cual se observa crecimiento
bacteriano, así como el valor de concentración dentro del rango en el cual se
observa el crecimiento óptimo de las cepas aisladas. Para ello se sembró
cada cepa en el medio de cultivo MH a diferentes concentraciones de NaCl
(0, 0.5, 3, 5, 10, 15, 20, 25 y 30) % y a pH 7. La siembra se realizó por estría
y se incubaron a 37 °C. El crecimiento fue observado diariamente durante 10
días y se interpretó como (-) cuando fue nulo, (+) cuando fue muy escaso,
(++) cuando fue escaso, (+++) cuando fue moderado y (++++) cuando fue
óptimo.
43
Para conocer el rango de pH en el cual hay crecimiento bacteriano, así como
el requerido para lograr el mayor crecimiento, cada cepa se sembró en el
medio de cultivo MH suplementado con la concentración de NaCl requerida
para el óptimo crecimiento. Los valores de pH evaluados fueron 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11 y 12. Se inoculó por estría y se incubó a 37 °C. El crecimiento fue
observado diariamente durante 10 días y se interpretó como (-) cuando fue
nulo, (+) cuando fue muy escaso, (++) cuando fue escaso, (+++) cuando fue
moderado y (++++) cuando fue óptimo.
Biodegradación de los hidrocarburos policíclicos aromáticos:
antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno y tolerancia a los mismos
Prueba de biodegradación
Las actinobacterias aisladas se inocularon en medio líquido MH
suplementado con 10 % NaCl y ajustado a pH 8. Se incubaron a 37 °C y 120
rpm durante 7 días. Posteriormente se transfirió un inóculo equivalente a
6x107 células (Tubo 2 del Nefelómetro de McFarland) a un tubo con rosca
que contenía 5 mL de Medio Mínimo de Sales (MMS: (NH4)2SO4, 1000 mg/L;
Na2HPO4, 800 mg/L; K2HPO4, 200 mg/L; MgSO4 ⋅7H2O, 200 mg/L;
CaCl2⋅2H2O, 100 mg/L; FeCl3⋅H2O, 5 mg/L; (NH4)6Mo7O24⋅H2O, 1 mg/L)
suplementado con 10 % NaCl y ajustado a pH 8, conteniente de 0.5 g/mL
del hidrocarburo a probar (antraceno, fenantreno, fluoranteno o pireno) y 50
μL del indicador redox 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) a una
concentración de 0.5 mg/mL. La presencia del indicador tornó al cultivo de
color azul. Cada experimento se realizó por triplicado. La actinobacteria se
44
clasifica como biodegradadora si el medio de cultivo se decolora a azul claro
o a incoloro.
Los cultivos bacterianos en los que visualmente se detectó una degradación
del color azul inicial, se volvieron a preparar de la manera indicada
anteriormente y se incubaron a 37 oC por 48 h. A los tiempos 0 h, 24 h y 48
h post incubación se tomaron 3 mL de sobrenadante y se centrifugaron. A la
solución se le registró el espectro visible de absorción entre (400-800) nm
con un espectrofotómetro Perkim Elmer, utilizando cubeta de cuarzo de 1 cm
de paso óptico. La capacidad de biodegradación de las cepas para cada
hidrocarburo se determinó como la relación de la absorbancia a 600 nm entre
el tiempo 0 h y las 48 h.
Se prepararon 3 muestras controles que consistieron en: (Control 1) muestras
de 5 mL de medio mínimo de sales suplementado con 10 % NaCl y ajustado
a pH 8 contenientes de 50 μL del indicador redox 2,6-diclorofenol indofenol
(DCPIP) a una concentración de 0.5 mg/mL; (Control 2) el mismo control 1 el
cual contiene además 0.5 g/mL del hidrocarburo a evaluar; (Control 3) el
mismo control 1 el cual fue inoculado con un equivalente a 6x107 células
(Tubo 2 del Nefelómetro de McFarland). Estas muestras controles también
se incubaron a 37 oC por 48 h y sus espectros visibles de absorción se
registraron a los mismos tiempos y en las mismas condiciones que las
muestras.
Prueba de tolerancia
45
Se inocularon las cepas de actinobacterias en medio para halófilas
moderadas MH el que contenía 10 % NaCl y se ajustó a pH 8. El medio fue
complementado además con diferentes concentraciones de los hidrocarburos
policíclicos aromáticos antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno. Para ello
se prepararon soluciones concentradas de los mismos, utilizando metanol
como solvente, y se añadió el volumen suficiente de manera tal que la
concentración final del hidrocarburo en el volumen del medio MH fuera 1
g/mL, 100 g/mL, 1000 g/mL y 5000 g/mL. El medio de cultivo adicionado
con los hidrocarburos policíclicos aromáticos se distribuyó equitativamente
en cajas Petri. Asimismo, en cada caja se inocularon 6 cepas y se revisó su
crecimiento en los siete días de incubación posteriores. El crecimiento se
interpretó como (-) cuando fue nulo, (+) cuando fue muy escaso, (++) cuando
fue escaso, (+++) cuando fue moderado y (++++) cuando fue óptimo.
RESULTADOS
Muestreo.
La recolección de muestras se realizó en el ex lago de Texcoco, obteniendo
un total de 29 muestras de 7 zonas diferentes: Zona 1. N 19° 28' 36.581'' O
98° 57' 8.571''. Zona 2. N 19° 28' 5.484'' O 98° 56' 57.033''. Zona 3. N 19° 27'
7.837'' O 98° 58' 48.691''. Zona 4. N 19° 27' 53.201'' O 98° 59' 24.507''. Zona
5. N 19° 27' 31.43" O 98° 59' 55.38". Zona 6. N 19° 27' 55.78" O 99° 0' 42.70".
Zona 7. N 19° 28' 33.82" O 98° 57' 5.66". Las 29 muestras están distribuidas
de la siguiente forma: 9 muestras de agua, 8 muestras de sedimento y 12
muestras de suelo.
46
Determinación de pH y % de salinidad de las muestras.
El cuadro I muestra la caracterización fisicoquímica de las muestras
colectadas, así como las coordenadas de la zona de donde se tomó la
muestra.
Cepas aisladas de actinobacterias.
Se aislaron un total de 43 cepas de actinobacterias, las cuales fueron
elegidas por su morfología tanto macroscópica como microscópica.
Macroscópicamente se escogieron por la presencia del micelio aéreo,
consistencia dura y crecimiento radial, y microscópicamente si presentaban
bacilos Gram positivo en formación filamentosa. De las 43 cepas aisladas, 1
cepa fue aislada de muestras de agua, 17 de muestras suelo y 25 de
muestras de sedimentos. Las cepas fueron nombradas como LTXMN-ZZZ
donde N es un número del 1 al 29 que indica de cuál de las 29 muestras fue
aislada la bacteria (la tabla 1 detalla zona y tipo de muestra de las 29
muestras) y ZZZ es una numeración corrida comenzando en 001 que
identifica al número de cepa aislada. Aquellas cepas que no correspondieron
con actinobacterias fueron descartadas del estudio.
Características fisiológicas de las actinobacterias.
Las actinobacterias aisladas se clasificaron de acuerdo a su requerimiento de
%NaCl para el crecimiento óptimo. Se obtuvieron 8 cepas halotolerantes
(crecimiento en presencia y ausencia de % NaCl), 11 cepas halófilas débiles
(requieren entre 0.5 %-15 % de NaCl para su crecimiento) y 24 cepas
halófilas moderadas (requieren entre 0 %-29 % de NaCl para su crecimiento).
47
Asimismo, se realizó la clasificación de acuerdo con el pH para el crecimiento
óptimo; obteniendo un total de 35 cepas alcalotolerantes (crecen en un rango
de pH) y 8 cepas alcalófilas (crecen a un valor de pH mayor a 7). El cuadro
II muestra el rango de % NaCl y pH que permitieron crecimiento bacteriano,
así como los valores de % NaCl y pH para el crecimiento óptimo de cada una.
Se muestra la clasificación fisiológica por cepa y el tipo de muestra de la cual
se aisló cada una.
De las 11 actinobacterias halófilas débiles, 5 son alcalófilas y 6
alcalotolerantes. De las 24 halófilas moderadas, 2 son alcalófilas y 22
alcalotolerantes. De las 8 halotolerantes, 1 es alcalófila y 7 alcalotolerantes.
Dado que todas las cepas crecieron a 10 % NaCl, y este valor además fue
óptimo para la mayoría de ellas, el resto de los experimentos se realizó
suplementado el medio de cultivo a 10 % de NaCl. De manera similar, todas
las cepas crecieron a un valor de pH 8, por lo tanto el resto de los
experimentos se realizó ajustando el pH a este valor.
Biodegradación de los hidrocarburos policíclicos aromáticos:
antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno y tolerancia a los mismos
Las 43 cepas aisladas de actinobacterias fueron incubadas en presencia del
indicador redox 2, 6 diclorofenol indofenol (DCPIP) y de los hidrocarburos
antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno. De ellas, 6 cepas (13.9 %) fueron
capaces de cambiar el color de al menos uno de los 4 medios suplementados
con los hidrocarburos de azul intenso a azul claro (prácticamente incoloro).
48
A estas 6 cepas se les determinó entonces la capacidad de degradación de
cada hidrocarburo (antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno) mediante el
cálculo de la relación de las absorbancias registradas a las 0 y 48 h. El
cuadro III muestra los resultados obtenidos.
Aquellas cepas que tuvieron un CD48 mayor a 1.8 se considera que tienen
una alta capacidad para degradar hidrocarburos (valores menores a 1.2
indican ausencia de degradación). En el cuadro III se muestra el CD48
obtenido para las 6 cepas estudiadas con los 4 hidrocarburos evaluados.
Las cepas LTXM10-001 y LTXM23-002 mostraron alta capacidad de
degradación para los cuatro hidrocarburos evaluados. Las cepas LTXM14-
006 y LTXM15-005 presentan alta capacidad de degradación para los
hidrocarburos de alto peso molecular como son el fluoranteno y pireno. La
cepa LTXM24-005 mostró alta capacidad de degradación para el fluoranteno
y la cepa LTXM14-005 mostró una baja capacidad de degradación para los
hidrocarburos evaluados.
Finalmente se determinó la tolerancia a los cuatro hidrocarburos estudiados
de las 43 cepas de actinobacterias aisladas. El cuadro IV muestra las 6
cepas que mostraron la mayor tolerancia a los hidrocarburos estudiados, y la
tolerancia encontrada en las cepas detectadas como degradadoras de
hidrocarburos.
49
Como se puede apreciar en el cuadro IV, no hay coincidencia entre las cepas
de mayor tolerancia y las degradadoras. Las cepas LTXM14-006 y LTXM23-
002 toleran pireno en una alta concentración (5000 g/mL) y son las cepas
con mayor capacidad de degradación para este hidrocarburo. Sin embargo,
la cepa LTXM15-005 tiene una bajísima tolerancia al pireno y una alta
capacidad de degradación de este.
Las cepas con mayor tolerancia a los hidrocarburos fueron aisladas y se
clasifican como: LTXM6-010 (suelo, halotolerante y alcalotolerante), LTXM7-
007 (suelo, halófila débil, alcalotolerante), LTXM15-001 (sedimento, halófila
débil, alcalófila), LTXM23-003 (sedimento, halófila moderada,
alcalotolerante), LTXM24-004 (sedimento, halófila moderada,
alcalotolerante) y LTXM29-002 (suelo, halófila moderada, alcalotolerante).
Ninguna cepa degradadora fue aislada de suelo, 5 de ellas fueron aisladas
de sedimento y una de agua. En el caso de las que presentaron mayor
tolerancia a los hidrocarburos, 3 fueron aisladas de suelo y tres de sedimento.
DISCUSIÓN
Los ambientes hipersalinos se encuentran ampliamente extendidos alrededor
del mundo, generalmente en regiones que se caracterizan por su alta
temperatura (Ramírez et al. 2004). El ex lago de Texcoco en México es uno
de estos ambientes; entre sus características fisicoquímicas se encuentran
una elevada salinidad y alcalinidad. Estas características fueron confirmadas
en este trabajo (Cuadro I). Dichas características propician la supervivencia
50
de organismos extremófilos, capaces de adaptarse a condiciones en las que
pocos pueden persistir. En este trabajo se evaluaron 2 condiciones extremas,
la salinidad y el pH. En total se aislaron 43 cepas de actinobacterias de las
cuales 35 fueron halófilas (73 %) y 8 alcalófilas (19 %), demostrando la
diversidad de organismos extremófilos presentes en este ecosistema (ex lago
de Texcoco).
Tres medios de cultivos suplementados con 10 % NaCl y pH 9 se utilizaron a
fin de ampliar al máximo las posibilidades de asilar actinobacterias halófilas
y alcalófilas. Una vez realizada la caracterización fisiológica de las cepas
aisladas, se mantuvo la concentración de 10 % de NaCl para el resto de los
experimentos, y el pH se ajustó a 8, pues en este pH hubo mejor crecimiento.
Las actinobacterias halófilas combinan su capacidad de producir enzimas
extracelulares con su resistencia a la salinidad, lo que las convierte en
microorganismos con alto potencial biotecnológico. Un ejemplo de ello es
que, 6 de las aisladas del ex lago de Texcoco son capaces de degradar
hidrocarburos policíclicos aromáticos como se muestra en el cuadro III.
El diclorofenol indofenol (DCPIP) es un indicador redox que cambia su color
de azul a incoloro cuando acepta electrones. El control 1 no mostró
degradación, indicando que el medio mínimo de sales suplementado con 10
% de NaCl y a pH 8 no decolora al indicador. Este control al igual que los
otros se incubaron a 37 oC como las 6 cepas evaluadas, y la presencia de la
temperatura tampoco lo decoloró. El control 2 tampoco mostró decoloración,
51
indicando que la presencia de los hidrocarburos en el medio tampoco afecta
el color del indicador. El control 3 tampoco mostró decoloración, indicando
que las actinobacterias solo en presencia del medio mínimo de sales no
decoloran al indicador, es decir no hay reacción de oxidación entre los
microrganismos y el medio o entre los microrganismos y el propio indicador.
Por lo tanto, si la actinobacteria se encuentra en el medio de sales mínimo
con el indicador sin ninguna otra fuente de carbono que el hidrocarburo,
entonces un cambio de color en el medio indica que hay electrones
liberándose debido a la oxidación del hidrocarburo (sustrato), es decir por un
proceso de biodegradación.
Las actinobacterias halófilas aisladas del ex lago de Texcoco presentaron alta
tolerancia a los hidrocarburos policíclicos aromáticos a los que se vieron
expuestos (antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno). Pero como se
muestra en el cuadro IV, una alta tolerancia a los HPA no asegura una
capacidad de degradación, como pudiera erróneamente asociarse.
El problema de contaminación por hidrocarburos policíclicos aromáticos
crece paulatinamente en todo el mundo. En México se producen miles de
barriles de petróleo crudo al día (Petróleos Mexicanos 2016), por lo que existe
un riesgo elevado de derrames causados por accidentes durante la
extracción o distribución del mismo. El uso de actinobacterias halófilas que
demuestran capacidad para degradar hidrocarburos policíclicos aromáticos
es una alternativa viable al creciente problema de contaminación, a través de
la biorremediación. Este trabajo demuestra que un ecosistema para encontrar
52
tales bacterias es el ex Lago de Texcoco. No hay trabajos anteriores donde
se reporte actinobacterias con esta capacidad aisladas de este ecosistema.
CONCLUSIONES
El ex lago de Texcoco es una fuente de actinobacterias halófilas y
halotolerantes degradadoras de hidrocarburos policíclicos aromáticos
potencialmente utilizables en procesos de biorremediación de ambientes
salinos.
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55
CUADRO I. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LAS MUESTRAS 1
COLECTADAS, TIPO DE MUESTRA Y ZONA DE MUESTREO. 2
Código de
la muestra
pH % de salinidad Tipo de muestra Zona de
aislamiento
LTXM1 9.95 24 Suelo Zona 1
LTXM2 9.81 10 Suelo Zona 1
LTXM3 9.92 14 Suelo Zona 2
LTXM4 9.62 3 Suelo Zona 2
LTXM5 9.15 2 Suelo Zona 2
LTXM6 10.1 10 Suelo Zona 3
LTXM7 9.85 3 Suelo Zona 3
LTXM8 7.29 8 Suelo Zona 4
LTXM9 9.76 53 Agua Zona 5
LTXM10 9.81 53 Agua Zona 5
LTXM11 9.85 50 Agua Zona 5
LTXM12 9.83 52 Agua Zona 5
LTXM13 9.4 9 Sedimento Zona 5
LTXM14 9.22 3 Sedimento Zona 5
LTXM15 9.38 10 Sedimento Zona 5
LTXM16 9.44 5 Sedimento Zona 5
LTXM17 9.43 90 Agua Zona 6
LTXM18 9.50 85 Agua Zona 6
LTXM19 9.47 87 Agua Zona 6
LTXM20 9.5 92 Agua Zona 6
56
LTXM21 9.5 92 Agua Zona 6
LTXM22 9.51 7 Sedimento Zona 6
LTXM23 9.43 7 Sedimento Zona 6
LTXM24 9.27 5 Sedimento Zona 6
LTXM25 9.37 5 Sedimento Zona 6
LTXM26 9.43 6 Suelo Zona 7
LTXM27 8.84 2 Suelo Zona 7
LTXM28 9.77 10 Suelo Zona 7
LTXM29 9.91 14 Suelo Zona 7
3
57
CUADRO II. CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA DE LAS CEPAS DE ACTINOBACTERIAS AISLADAS
Clave de
la cepa
Rango de
crecimiento
(%NaCl)
%NaCl
óptimo
Clasificación por
%NaCl óptimo
Rango de
crecimiento
(pH)
pH
óptimo
Clasificación por
pH óptimo
Origen de la
muestra
LTXM3-004 0.5 – 10% 5% Halófila débil 6 – 12 7 – 8 Alcalotolerante Suelo
LTXM3-005 0 – 15% 5% Halotolerante 7 – 9 7 Alcalotolerante Suelo
LTXM6-005 0.5 – 15% 3 – 5% Halófila débil 5 – 12 8 Alcalotolerante Suelo
LTXM6-010 0 – 15% 10% Halotolerante 7 – 9 7 Alcalotolerante Suelo
LTXM7-007 0.5 – 15% 3% Halófila débil 6 – 12 8 Alcalotolerante Suelo
LTXM10-001 0 – 20% 5 – 15% Halotolerante 5 – 12 7 – 9 Alcalotolerante Agua
LTXM14-001 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM14-002 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM14-003 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
58
LTXM14-004 0 – 20% 3 – 10% Halotolerante 5 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM14-005 0.5 – 20% 10 – 15% Halófila moderada 5 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM14-006 3 – 15% 10% Halófila débil 5 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM15-001 5 – 10% 5% Halófila débil 8 – 12 9 Alcalófila Sedimento
LTXM15-002 0 – 10% 3% Halotolerante 8 – 12 9 Alcalófila Sedimento
LTXM15-005 0.5 – 15% 5 – 10% Halófila débil 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM15-006 0.5 – 20% 10% Halófila moderada 5 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM15-007 0 – 10% 5% Halotolerante 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM16-002 3 – 20% 10 – 15% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM22-001 3 – 20% 10 – 15% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM22-002 10% 10% Halófila moderada 8 – 12 10 Alcalófila Sedimento
LTXM23-001 3 – 20% 5 – 15% Halófila débil 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM23-002 0.5 – 10% 3% Halófila débil 8 – 12 9 Alcalófila Sedimento
LTXM23-003 3 – 20% 10 – 15% Halófila moderada 5 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM24-001 3 – 20% 10% Halófila moderada 5 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
59
LTXM24-003 0 – 10% 3 – 5% Halotolerante 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM24-004 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM24-005 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM24-006 5 – 10% 5% Halófila débil 8 – 12 9 Alcalófila Sedimento
LTXM24-008 3 – 15% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM25-002 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM25-003 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Sedimento
LTXM26-002 0.5 – 10% 5% Halófila débil 8 – 12 9 Alcalófila Suelo
LTXM26-003 0 – 10% 5% Halotolerante 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
LTXM27-006 3 – 10% 5% Halófila débil 8 – 12 9 Alcalófila Suelo
LTXM28-001 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
LTXM28-003 3 – 20% 10% Halófila moderada 5 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
LTXM28-004 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
LTXM28-005 10% 10% Halófila moderada 8 – 12 10 Alcalófila Suelo
LTXM28-006 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
60
4
LTXM28-007 10% 10% Halófila moderada 7 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
LTXM28-008 3 – 15% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
LTXM28-009 3 – 15% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
LTXM29-002 3 – 20% 10% Halófila moderada 6 – 12 8 – 9 Alcalotolerante Suelo
61
CUADRO III. CEPAS CON CAPACIDAD PARA DEGRADAR A LOS
HIDROCARBUROS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS ANTRACENO,
FENANTRENO, FLUORANTENO Y PIRENO.
Capacidad de
Degradación(CD48) por UV-Vis
Clasificación
fisiológica
Aislada
de Cepa Antrace
-no
Fenan
-treno
Fluoran
-teno
Pire-
no
Control
1 1.2
Control
2 1.1 1.1 1.1 1.1
Control
3 1.1 1.1 1.1 1.1
LTXM10
-001 2.0 2.2 2.6 2.3
Haloalcalotolerant
e
Agua
LTXM14
-005
1.6 1.4 1.4 1.4
Halófila
moderada,
alcalotolerante
Sediment
o
LTXM14
-006 1.1 1.6 2.2 3.5
Halófila débil,
alcalotolerante
Sediment
o
LTXM15
-005 1.4 1.5 1.9 2.0
Halófila débil,
alcalotolerante
Sediment
o
LTXM23
-002 2.0 1.8 2.3 2.7
Halófila débil,
alcalófila
Sediment
o
62
LTXM24
-005
1.4 1.5 2.0 1.4
Halófila
moderada,
alcalotolerante
Sediment
o
CUADRO IV. CEPAS CON MAYOR TOLERANCIA A LOS HIDROCARBUROS
EVALUADOS Y TOLERANCIA A LOS HIDROCARBUROS DE LAS CEPAS
DEGRADADORAS.
Cepas con mayor
tolerancia (ppm)
Tolerancia en cepas
degradadoras (ppm)
Cepa Antra-
ceno
Fenan-
treno
Fluoran-
teno
Pire
-no
Antra-
ceno
Fenan
-treno
Fluoran-
teno
Pire
-no
LTXM6
-010
5000 5000 5000 500
0
LTXM10
-001
100 1000 100 100
LTXM7
-007
5000 5000 5000 500
0
LTXM14
-005
100 5000 100 100
LTXM15
-001
5000 5000 1000 500
0
LTXM14
-006
<1 1000 1000 500
0
LTXM23
-003
5000 1000 5000 500
0
LTXM15
-005
1000 1000 1000 < 1
LTXM24
-004
5000 1000 5000 500
0
LTXM23
-002
< 1 1000 < 1 500
0
LTXM29
-002
5000 5000 5000 500
0
LTXM24
-005
< 1 5000 < 1 100
63
8. RESULTADOS ADICIONALES
8.1. Puntos de muestreo
Fuente: Elaboración propia con base en datos de CONABIO
64
8.2. Caracterización morfológica de las cepas
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA
CLAVE DE LA CEPA MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
LTXM3-004 TAMAÑO: 2-3 mm COLOR: Blanca FORMA: Estrellada BORDES: Filamentosos ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo
LTXM3-005 TAMAÑO: 3-5 mm COLOR: Blanca FORMA: Estrellada BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo. Forman filamentos (Actinobacteria)
LTXM6-005 TAMAÑO: 3-5 mm COLOR: Beige FORMA: Circular BORDES: Filamentosos ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo que forman filamentos (Actinobacteria)
LTXM6-010 TAMAÑO: 5-10 mm COLOR: Blanca FORMA: Estrellada BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Lisa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM7-007 TAMAÑO: 2-3 mm COLOR: Beige FORMA: Circular BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Plana
Cocos Gram positivo.
65
SUPERFICIE: Filamentosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
LTXM10-001 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Beige, esporas blancas FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Pulvinata SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM14-001 TAMAÑO: 5 – 10 mm COLOR: Blanca FORMA: Ovalada BORDES: Irregulares ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM14-002 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Beige FORMA: Ovalada BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM14-004 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Beige, esporas blancas FORMA: Circular BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Umbonada SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
66
LTXM14-005 TAMAÑO: 1 – 2 mm COLOR: Beige, esporas blancas. FORMA: Puntiforme BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM14-006 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Beige FORMA: Circular BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Pulvinata SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM15-001 TAMAÑO: 2 – 3 mm COLOR: Beige FORMA: Puntiforme BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Lisa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM15-002 TAMAÑO: 5 – 10 mm COLOR: Verde, esporas blancas FORMA: Estrellada BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: Si, verde CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
67
LTXM15-005 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Beige FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Lisa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM15-006 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Beige, esporas blancas FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM15-007 TAMAÑO: 5 – 10 mm COLOR: Verde, esporas blancas FORMA: Estrellada BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: Si, verde CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM16-002 TAMAÑO: 1 – 2 mm COLOR: Beige, esporas blancas FORMA: Puntiforme BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Lisa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
68
LTXM22-001 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Beige FORMA: Ovalada BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM22-002 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Beige FORMA: Estrellada BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM23-001 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM23-002 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Verde, esporas blancas FORMA: Circular BORDES: Irregulares ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: Si, verde CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
69
LTXM23-003 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Irregulares ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM24-001 TAMAÑO: 5 – 8 mm COLOR: Blanca FORMA: Ovalada BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM24-003 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Beige FORMA: Circular BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Lisa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filmentos.
LTXM24-004 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Blanca FORMA: Ovalada BORDES: Irregulares ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
70
LTXM24-005 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Blanca FORMA: Ovalada BORDES: Irregulares ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM24-006 TAMAÑO: 1 – 2 mm COLOR: Beige, esporas blancas FORMA: Puntiforme BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Lisa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM24-008 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Beige FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM25-002 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
71
LTXM25-003 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Irregulares ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM26-002 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Beige FORMA: Estrella BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM26-003 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Beige FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Lisa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM27-001 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Beige FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Lisa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
72
LTXM27-006 TAMAÑO: 2 – 3 mm COLOR: Beige FORMA: Estrella BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM28-001 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Beige, esporas blancas FORMA: Circular BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Húmeda LUZ REFLEJADA: Brillante LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Cremosa
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM28-003 TAMAÑO: 5 – 10 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM28-004 TAMAÑO: 2 – 4 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Umbonada SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
73
LTXM28-005 TAMAÑO: 1 – 3 mm COLOR: Beige FORMA: Estrella BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM28-006 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Lobulados ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM28-007 TAMAÑO: 2 – 3 mm COLOR: Café, esporas blancas FORMA: Estrella BORDES: Aserrados ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM28-008 TAMAÑO: 1 – 3 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Irregulares ELEVACIÓN: Plana SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
74
LTXM28-009 TAMAÑO: 3 – 5 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Convexa SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Dura
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
LTXM29-002 TAMAÑO: 1 – 3 mm COLOR: Blanca FORMA: Circular BORDES: Definidos ELEVACIÓN: Umbonada SUPERFICIE: Rugosa ASPECTO: Seca LUZ REFLEJADA: Mate LUZ TRANSMITIDA: Opaca PRODUCCIÓN DE PIGMENTO: No CONSISTENCIA: Friable
Bacilos Gram positivo, forman filamentos.
8.3. Tolerancia a Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos
Clave de la cepa Antraceno Fluoranteno Fenantreno Pireno
LTXM3-004 0 ppm 0 ppm 0 ppm 0 ppm
LTXM3-005 0 ppm 0 ppm 0 ppm 0 ppm
LTXM6-005 100 ppm 100 ppm 100 ppm 100 ppm
LTXM6-010 5000 ppm 5000 ppm 5000 ppm 5000 ppm
LTXM7-007 5000 ppm 5000 ppm 5000 ppm 5000 ppm
LTXM14-001 100 ppm 100 ppm 5000 ppm 100 ppm
LTXM14-002 100 ppm 100 ppm 100 ppm 100 ppm
LTXM14-003 100 ppm 0 ppm 5000 ppm 100 ppm
LTXM14-004 100 ppm 0 ppm 5000 ppm 100 ppm
LTXM14-005 100 ppm 100 ppm 5000 ppm 100 ppm
LTXM14-006 0 ppm 1000 ppm 1000 ppm 5000 ppm
LTXM15-001 5000 ppm 1000 ppm 5000 ppm 5000 ppm
LTXM15-002 5000 ppm 1000 ppm 1000 ppm 5000 ppm
LTXM15-005 1000 ppm 1000 ppm 1000 ppm 0 ppm
LTXM15-006 100 ppm 1000 ppm 1000 ppm 5000 ppm
LTXM15-007 5000 ppm 1000 ppm 1000 ppm 0 ppm
LTXM16-002 100 ppm 100 ppm 1000 ppm 100 ppm
LTXM22-001 100 ppm 100 ppm 100 ppm 100 ppm
LTXM22-002 0 ppm 0 ppm 0 ppm 5000 ppm
LTXM23-001 5000 ppm 0 ppm 1000 ppm 5000 ppm
75
LTXM23-002 0 ppm 0 ppm 1000 ppm 5000 ppm
LTXM23-003 5000 ppm 5000 ppm 1000 ppm 5000 ppm
LTXM24-001 5000 ppm 100 ppm 1000 ppm 100 ppm
LTXM24-003 100 ppm 100 ppm 1000 ppm 100 ppm
LTXM24-004 5000 ppm 5000 ppm 1000 ppm 5000 ppm
LTXM24-005 0 ppm 0 ppm 5000 ppm 100 ppm
LTXM24-006 0 ppm 0 ppm 0 ppm 0 ppm
LTXM24-008 5000 ppm 5000 ppm 1000 ppm 100 ppm
LTXM25-002 5000 ppm 1000 ppm 0 ppm 100 ppm
LTXM25-003 100 ppm 100 ppm 5000 ppm 100 ppm
LTXM26-002 0 ppm 0 ppm 5000 ppm 0 ppm
LTXM26-003 100 ppm 100 ppm 100 ppm 100 ppm
LTXM27-006 100 ppm 100 ppm 1000 ppm 100 ppm
LTXM28-001 100 ppm 100 ppm 5000 ppm 100 ppm
LTXM28-003 1000 ppm 1000 ppm 5000 ppm 1000 ppm
LTXM28-004 0 ppm 100 ppm 5000 ppm 100 ppm
LTXM28-005 0 ppm 0 ppm 5000 ppm 0 ppm
LTXM28-006 1000 ppm 1000 ppm 5000 ppm 5000 ppm
LTXM28-007 5000 ppm 0 ppm 0 ppm 0 ppm
LTXM28-008 1000 ppm 0 ppm 1000 ppm 5000 ppm
LTXM28-009 100 ppm 0 ppm 5000 ppm 0 ppm
LTXM29-002 5000 ppm 5000 ppm 5000 ppm 5000
9. CONCLUSIONES
9.1. Conclusiones Generales
El espectro salino y el espectro de pH permitieron distribuir a las bacterias en la
clasificación de halófilas, halotolerantes, alcalófilas y alcalotolerantes. Se aislaron 43
cepas de Actinobacterias, de las cuales, 8 son haloalcalófilas, 8 son
haloalcalotolerantes y 27 son halófilas y alcalotolerantes.
La concentración máxima de hidrocarburos policíclicos aromáticos que toleraron las
Actinobacterias fue de 5000 ppm. El hidrocarburo en el que existió mayor crecimiento
bacteriano fue el fenantreno. La tolerancia fue menor en el caso del fluoranteno.
Seis de las cepas de actinobacterias demostraron tener la capacidad de degradar los
hidrocarburos policíclicos aromáticos antraceno, fenantreno, fluoranteno y pireno, en la
76
prueba colorimétrica de biodegradación. Sin embargo, no fueron las mismas cepas que
toleraron la mayor concentración de estos hidrocarburos.
La capacidad de tolerancia de las actinobacterias a los hidrocarburos policíclicos
aromáticos no asegura el potencial de biodegradación de los mismos.
9.2. Limitaciones
Una de las limitantes de la presente investigación fue el periodo de tiempo en el que se
realizó, así como la carencia de equipos de química analítica necesarios para la
cuantificación de la degradación de los hidrocarburos.
9.3. Recomendaciones
Se sugiere dar seguimiento a la investigación a través de un análisis cuantitativo de la
degradación de hidrocarburos, así como la identificación de los productos de la misma.
10. Referencias Bibliográficas:
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