Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
if)
v©
Oh
EESTIVABARIIK
PATENDIAMET
(.i) EE-EP 1615 952 Bl(51) Int.CI.
A61K 38/00 (2006.01)
A61K 39/395 (2006.01)
A61P 29/00(2006.01)
C07K 7/00(2006.01)
C07K 14/515 (2006.01)
C07K 16/22(2006.01)
C07K 19/00(2006.01)
(i2)EESTISKEHTIVAEUROOPA PATENDI
PATENDIKIRJELDUSE TOLGE
(10) Registreeringu number:
(11) Patendikirjelduse tdlke
number:
(30) Prioriteediandmed:
(96) Euroopa patenditaotluse
esitamise kuupaev:
(96) Euroopa patendi
taotluse number:
(97) Euroopa patendi valjaand-
misest teatamise kuupaev:
(97) Euroopa patendi number:
Patendikirjelduse tdlke
esitamise kuupaev:
Patendikirjelduse tdlke
avalikustamise kuupSev:
E006260
EE-EP 1615 952
09.04.2003
US 410998
08.04.2004
04759343.9
02.11.2011
EP 1 615 952
01.02.2012
16.04.2012
(73) Patendiomanik:
AMGEN INC.
One Amgen Center Drive,
Thousand Oaks, CA 91320-1799, US
(72) Leiutise autorid:
OLINER, Jonathan, Daniel
959 Golden Crest Avenue,
Newbury Park, CA 91320, US
MIN, Hosung
3875 Conner Court,
Newbury Park, CA 91320, US
(74) Patendivolinik:
Leevi Markus
Patendibflroo KSosaar & Co OU
TShe 94,50107 Tartu, EE
(54) Poletikuliste haiguste ravimeetodid, kasutades inimese angiopoietiin-2 spetsiifilisi sideaineid
EE-EP 1 615 952 Bl
EE - EP1615952 B1
Põletikuliste haiguste ravimeetodid, kasutades inimese angiopoietiin-2 spetsiifilisi sideaineid
See patenditaotlus taotleb täiendust USA patenditaotlusele seerianumbriga
10/269,695, mis registreeriti 10. oktoobril 2002, mis omakorda taotleb täiendust
USA patenditaotlusele seerianumbriga 60/414,155, mis registreeriti 27. septembril 5
2002, ja USA patenditaotlusele seerianumbriga 60/328,624, mis registreeriti 11.
oktoobril 2001.
TEHNIKAVALDKOND
Käesolev leiutis käsitleb spetsiifilisi sideaineid, mis tunnevad angiopoietiin-2 (Ang-
2) ja sellele seonduvad. Veel täpsemalt käsitleb leiutis Ang-2 spetsiifiliselt siduvate 10
spetsiifiliste sideainete ja nende fragmentide tootmist, diagnostilist ja terapeutilist
kasutamist.
TEHNIKA TASE
Angiogenees ehk olemasolevatest veresoontest uute moodustumine on oluline
paljudeks füsioloogilisteks ja patoloogilisteks protsessideks. Tavaliselt on 15
angiogenees pro- ja anti-angiogeensete faktorite poolt rangelt reguleeritud, aga
haiguste nagu vähk, silma neovaskulaarhaigused, artriit ja psoriaas puhul võib see
protsess valesti minna. Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31 (1995).
Usutavasti mängib angiogenees olulist rolli põletikulise koe (pannuse) laienemise
jätkamisel reumatoidartiidi puhul (Walsh et al, Artriit Res., 3:147-153 (2001). 20
Tegelikult on hulga haiguseid, mis usutavasti on seotud reguleerimata või
soovimatu angiogeneesiga. Vaata Carmeliet et al, Nature, 407:249-257 (2000).
Taoliste haiguste seas on muuhulgas silma neovaskularisatsioon, nagu
retinopaatiad (sealhulgas diabeetiline retinopaatia), kollatähni ealine taandareng,
psoriaas, hemangioblastoom, hemangioom, arterioskleroos, põletikulised 25
haigused nagu reumaatiline või reumaatiline põletikuline haigus, eriti artriit
(sealhulgas reumatoidartriit) ja teised kroonilised põletikulised häired nagu
krooniline astma, arteriaalne või siirdamisjärgne ateroskleroos, endometrioos ning
neoplastilised haigused, näiteks niinimetatud tahked kasvajad ja vedelad (või
EE - EP1615952 B1 2
hematopoeetilised) kasvajad (nagu leukeemiad ja lümfoomid). Soovimatu
angiogeneesiga seotud teised haigused on antud valdkonnas pädevatele isikutele
ilmsed.
Kuigi paljusid signaali ülekande süsteeme on angiogeneesi reguleerimisse
kaasatud, hõlmab üks paremini iseloomustatud ja kõige endoteelsemaid raku 5
selektiivsüsteeme Tie-2 retseptor-türosiini kinaasi (nimega „Tie-2“ või „Tie-2R“
(samuti nimega „ORK“), hiirte Tie-2 (on ka nimega „tek“) ja selle ligandid
angiopoietiinid (Gale, N. W. ja Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066).
Teadaolevalt on 4 angiopoietiini: angiopoietiin-1 („Ang-1“) kuni angiopoietiin-4
(„Ang-4“). Neid angiopoietiine kutsutakse ka nimega „Tie-2 ligandid“. (Davis, S., et 10
al, Cell, 87:1161-1169; Grosios, K., et al, Cytogenet Cell Genet, 84:118-120;
Holash, J., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625;
Koblizek, T. I., et al, Current Biology, 8:529-532 ; Lin, P., et al, Proc Natl Acad Sci
USA, 95:8829-8834; Maisonpierre, P. C., et al, Science, 277:55-60;
Papapetropoulos, A., et al, Lab Invest, 79:213-223; Sato, T. N., et al, Nature, 15
375:70-74; Shyu, K. G., et al, Circulation, 98:2081-2087; Suri, C., et al, Cell,
87:1171-1180; Suri, C., et al, Science, 282:468-471; Valenzuela, D. M., et al, USA
ajakiri Proceedings of the National Academy of Sciences, 96:1904-1909;
Witzenbichler, B., et al, J Biol Chem, 273:18514-18521). Kui Ang-1 sidumist Tie-2-
le stimuleerib retseptori fosforüülimist kasvatatud endoteeli rakkudes, on Ang-2 20
puhul täheldatud Tie-2 retseptori nii fosforüülimise talumist kui ka pärssimist
(Davis, S., et al, supra; Maisonpierre, P.C., et al, supra; Kim, I., J.H. Kim, et al,
Oncogene 19 (39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P.C.
Maisonpierre, et al, Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)).
Geneetiliselt modifitseeritud Tie-2 ja Ang-1 hiirte fenotüübid on sarnased ning 25
viitavad, et Ang-1-stimuleeritud Tie-2 fosforüülimine vahendab tekkivate
veresoonte ümberkujundamist ja stabiliseerimist in utero endoteeli rakutoe
adhesiooni hoidmise kaudu (Dumont, D. J., et al, Genes & Development, 8:1897-
1909; Sato, T. N., et al, Nature, 376:70-74; Suri, C., et al, supra). Ang-1 rolli
veresoonte stabiliseerimisel peetakse kaitstuks täiskasvanutes, kus seda 30
laialdaselt ja konstitutiivselt ekspresseeritakse (Hanahan, D., Science, 277:48-50;
Zagzag, D., et al, Experimental Neurology, 159:391-400). Seevastu Ang-2
EE - EP1615952 B1 3
ekspressioon on võimalik peamiselt vaskulaarse ümberkujunemise kohtadel, kus
see arvatavasti blokeerib Ang-1 funktsioneerimist, põhjustades seeläbi
vaskulaarse plastilisuse staadiumi, mis soodustab angiogeneesi (Hanahan, D.,
supra; Holash, J., et al, Science, 284:1994-1998; Maisonpierre, P. C., et al, supra).
Paljud avaldatud uuringud on arvatavasti näidanud veresoon-selektiivse Ang-2 5
ekspressiooni angiogeneesiga seotud haigusseisundites. Nende patoloogiliste
tingimuste seas on näiteks psoriaas, kollatähni taandareng ning vähk (Bunone, G.,
et al, American Journal of Pathology, 155:1967-1976; Etoh, T., et al, Cancer
Research, 61:2145-2153; Hangai, M., et al, Investigative Ophthalmology & Visual
Science, 42:1617-1625; Holash, J., et al, supra; Kuroda, K., et al, Journal of 10
Investigative Dermatology, 116:713-720; Otani, A., et al, Investigative
Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920; Stratmann, A., et al, American
Journal of Pathology, 153:1459-1466; Tanaka, S., et al, J Clin Invest, 103:34-345;
Yoshida, Y., et al, International Journal of Oncology, 15:1221-1225; Yuan, K., et
al, Journal of Periodontal Research, 35:165-171; Zagzag, D., et al, supra). 15
Enamus neist uuringutest on keskendunud vähile, mille puhul paljud kasvajatüübid
oletatavasti väljendavad vaskulaarset Ang-2 ekpressiooni. Vastupidiselt selle
ekpressioonile patoloogilises angiogeneesis on Ang-2 ekpressioon normaalsetes
kudedes äärmiselt piiratud (Maisonpierre, P. C., et al, supra; Mezquita, J., et al,
Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498). Tavalises 20
täiskasvanus on kolm peamist angiogeneesi kohta munasarjad, platsenta ja
emakas; need on peamised koed normaalsetes (st mitte-vähilises) kudedes, kus
Ang-2 mRNA on täheldatud.
Teatud funktsionaaluuringud näitavad, et Ang-2 osaleb oletatavasti kasvaja
angiogeneesis. Ahmad et al (Cancer Res., 61:1255-1259) kirjeldavad Ang-2 25
üleekspressiooni ning näitavad, et seda seostatakse arvatavasti kasvaja arengu
laienemisega hiire ksenografti mudelil. Vaata ka Etoh et al, supra, ning Tanaka et
al, supra, kus andmed on oletatavasti esitatud nii, et need seostavad Ang-2
üleekspressiooni kasvaja veresoonte hulga suurenemisega (hypervascularity). Ent
seevastu Yu et al (Am. J. Path., 158:563-570 ) on esitanud andmeid, mis näitavad, 30
et Ang-2 üleekspressioon Lewise kopsukartsinoomis ja TA3 rinnakartsinoomi
EE - EP1615952 B1 4
rakkudes arvatavasti pikendas vastavate transfektantidega süstitud hiirte
ellujäämist.
Viimastel aastatel on mitmed väljaanded soovitanud Ang-1, Ang-2 ja/või Tie-2
võimaliku sihtmärgina vähivastaseks raviks. Näiteks USA patendid nr 6,166,185,
5,650,490 ja 5,814,464 kõik avaldavad anti-Tie-2 ligandi antikehade ja 5
retseptorkehade kontseptsiooni. Lin et al (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:8829-
8834) süstisid hiirtele adenoviirust ekspresseerivat lahustuvat Tie-2; lahustuv Tie-2
alandas arvatavalt hiirte tekitatud kasvajate arvu ja suurust. Sellega seotud
uuringus Lin et al (J. Clin. Invest., 100:2072-2078) süstisid rottidele lahustuval
kujul Tie-2; see ühend arvatavalt alandas rottidel kasvaja suurust. Siemeister et al 10
(Cancer Res., 59: 3185-3189) lõid inimese melanoomi rakuliini, mis
ekspresseerisid Tie-2 rakuvälist domeeni, süstisid neid rakuliine puutumata
hiirtesse ning järeldasid, et lahustuv Tie-2 arvatavasti põhjustas kasvaja arengut ja
kasvaja angiogeneesi „märkimisväärset pidurdumist“. Selle informatsiooni
valguses ja arvestades, et nii Ang-1 kui ka Ang-2 seonduvad Tie-2-le, ei selgu 15
nendest uuringutest, kas Ang-1, Ang-2 või Tie-2 oleksid soovitud sihtmärgiks
vähivastaseks raviks.
Teatud peptiidide sulandumist stabiilsele plasma proteiinile nagu Ig konstantne
piirkond, et nende molekulide poolestusaega parandada on kirjeldatud näiteks
PCT avalikustuses WO 00/24782, mis avaldati 4. mail 2000. 20
Proteiini või selle fragmendi sulandumist stabiilsele plasma proteiinile nagu Ig
konstantne piirkond, et nende molekulide poolestusaega parandada on kirjeldatud
erinevalt (vaata näiteks USA patenti 5,480,981; Zheng et al, J. Immunol.,
154:5590-5600, (1995); Fisher et al, N. Engl. J. Med., 334:1697-1702, (1996); Van
Zee, K. et al, J. Immunol., 156:2221-2230, (1996); USA patent 5,808,029, 25
väljastati 15. septembril 1998; Capon et al, Nature, 337:525-531, (1989); Harvill et
al, Immunotech. 1:95-105, (1995); WO 97/23614, avaldati 3. juulil 1997;
WO/9828427, avaldati 2. juulil 1998; Linsley, J. Exp. Med., 174:561-569, (1991);
WO 95/21258, avaldati 10. augustil 1995). WO/57901, mis avaldati 5. oktoobril
2000, avalikustab neutraliseerivate Anti Ang-2 antikehade kasutamise vaskulaarse 30
permeaabluse alandamiseks ja/või plasma lekkimise kontrollimiseks.
EE - EP1615952 B1 5
Tõhus anti-Ang-2 ravi võib kasu saada vähipatsientide suurest hulgast, sest
enamus tahkeid kasvajaid vajavad neovaskularisatsiooni, et diameetris kasvada
suuremaks kui 1-2 millimeetrit. Taoline ravi võib leida laiemat kasutust ka teiste
angiogeneesiga seotud haiguste puhul nagu retinopaatiad, artriit ja psoriaas.
Praegu on vastamata vajadus tuvastada uusi aineid, mis Ang-2 spetsiifiliselt 5
tunnevad ja seovad. Taolised ained oleksid kasulikud diagnostilisteks uuringuteks
ja terapeutiliseks sekkumiseks haigusstaadiumides, mida seostatakse Ang-2
aktiivsusega.
Seetõttu on käesoleva leiutise eesmärgiks pakkuda Ang-2 spetsiifilisi sideaineid,
mis moduleerivad Ang-2 tegevust. Käesoleva leiutise taolised ained on 10
peptikehade (peptibodies) kujul, st teistele molekulidele nagu antikeha Fc domeen
ühendatud peptiidid, kus peptiidi osa seondub spetsiifiliselt Ang-2-le.
LEIUTISE KOKKUVÕTE
Käesolev leiutis on ühes variandis suunatud peptiididele (nimetatakse siin ka
polpüpeptiidideks), mis seonduvad Ang-2-le ja hõlmavad järjestust, nagu on 15
esitatud JÄRJESTUSE ID-nr-s: 25 koos põletikuvastase ainega, põletikulise
haiguse ravimeetodis kasutamiseks.
Käesoleva leiutise polüpeptiidid võivad olla kanduritele kinnitunud.
Peptiidid võivad olla ühendatud Fc domeenidele, võimaldades seeläbi
peptikehasid. 20
On mõistetav, et leiutis võib käsitleda sulandpolüpeptiidi, mis sisaldab vähemalt
ühte peptiidi, nagu on siin kirjeldatud, ja kandurit, kus polüpeptiid suudab Ang-2-le
seonduda, ning selle füsioloogiliselt sobivaid soolasid. Sulandpolüpeptiidis on
kandur vähemalt üks Fc domeen, polüetüleenglükool, lipiid, kolesteroolrühm,
süsivesik ja oligosahhariid. Teised sobivad kandurid nagu albumiin ja muu 25
sarnane on antud valdkonnas pädevatele isikutele mõistetavad ning kuuluvad
antud leiutise ulatusse.
Antud valdkonnas pädevad isikud mõistavad, et erinevaid molekule on võimalik
spetsiifilise sideaine struktuuri sisestada. Järelikult võib teatud molekuli sisestada
EE - EP1615952 B1 6
näiteks peptiidi ja spetsiifilise sideaine kanduri osade vahele või peptiidi osa enda
sisse, säilitades samas spetsiifilise sideaine soovitud toime. Võimalik on ka lisada
näiteks molekule nagu Fc domeen või selle fragment, polüetüleenglükool või
teised seotud molekulid nagu dekstraan, rasvhape, lipiid, kolesteroolrühm, väike
süsivesik, peptiid, tsütotoksiline aine, kemoterapeutiline aine, siin kirjeldatud 5
tuvastatav osa (sealhulgas fluorestsentsained, radiomärgistused nagu
radioisotoobid), oligosahhariid, oligonukleotiid, polünukleotiid, interferentsi (või
muu) RNA, ensüümid, hormoonid ja muu sarnane. Sellisel moel lisamiseks
sobivad teised molekulid on antud valdkonnas pädevatele isikutele teada ning
kuuluvad leiutise ulatusse. See hõlmab näiteks soovitud molekuli sisestamist kahe 10
järjestikuse aminohappe vahele, mis on soovitatavalt sobiva linkeriga ühendatud.
Näiteks Con4(C) peptikeha järjestuses:
M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (JÄRJESTUSE ID-NR: 23)
suudab antud valdkonnas pädev isik lihtsalt sisestada soovitud molekuli näiteks
kahe kõrvuti asetseva glutamiini („QQ“) jäägi vahele, et saavutada soovitud 15
struktuur ja/või funktsioon, säilitades samaaegselt peptiidi võime Ang-2 siduda.
Järelikult võib seda järjestust järgnevalt modifitseerida:
M-Fc-GGGGGAQ-[molekul]-QEECEWDPWTCEHMLE
Soovi korral võib lisada sobivaid linkeri molekule. Samas on mõistetav, et molekuli
võib sisestada mitmesse kohta molekulil, sealhulgas sobivatele kõrvalahelatele 20
kanduri ja peptiidi järjestuse vahele järgnevalt:
M-Fc-[molekul]-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE
või mis tahes teisele kohale, mida antud valdkonnas pädev isik soovib. Teised
sobivad variandid on antud valdkonnas pädevale isikule ilmselged.
On mõistetav, et leiutis käsitleb leiutise peptikeha kasutamist põletikulise haiguse 25
ravimeetodites, kasutades spetsiifilisi sideaineid, mida on siin kirjeldatud, ning
hõlmab veel vähemalt ühe põletikuvastase aine manustamist. Teatud eelistatud
variandis võib põletikuvastane aine sisaldada DMARD, SAARD ja NSAID seast
vähemalt ühte. Järgmises eelistatud variandis võib põletikuvastane aine sisaldada
vähemalt ühte TNF inhibiitorit, IL-1 inhibiitorit, TACE inhibiitorit, COX-2 inhibiitorit 30
ja P-38 inhibiitorit. Ent eelistatud lisavariandis sisaldab TNF inhibiitor vähemalt
ühte etanertsepti, adalimumaabi, pegsunertsepti (PEG sTNF-R1), onertsepti ja
EE - EP1615952 B1 7
infliksimaabi. Veel ühes eelistatud variandis võib IL-1 inhibiitor olla vähemalt üks
anakinra, IL-1 TRAP, IL-1 antikeha ja lahustuv IL-1 retseptor.
Nagu ka siin kirjeldati, on mõistetav, et manustamine võib olla samaaegne või
mitte-samaaegne.
Leiutis käsitleb peptikeha, mis hõlmab JÄRJESTUSE ID-NR-ga: 25 esitatud 5
aminohappe järjestust, kasutamist põletikulise haiguse ravimeetodis, mis hõlmab
seda vajavale patsiendile terapeutiliselt tõhusas koguses peptiidi või peptikeha
manustamist, et Ang-2 siduda. Kasutamine hõlmab ka vähemalt ühe
põletikuvastase aine manustamist. Manustamine võib olla samaaegne või mitte-
samaaegne. 10
Leiutise teised variandid on lihtsasti mõistetavad käesolevaga esitatud
avalikustusest.
JOONISTE LOETELU
Joonisel Fig 1 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)
sõltuvuse kohta A-431 kasvajaga hiirtel, keda raviti käesoleva leiutise peptikehaga 15
TN8-Con4-C või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Üksikasju on
kirjeldatud näidetes.
Joonisel Fig 2 on toodud diagramm peptikeha kontsentratsiooni (y-telg) ja
doosijärgse aja (x-telg) sõltuvuse kohta metsiktüüpi hiirtel, keda raviti 2xCon4-C,
L1-7-N või L1-21-N peptikeha 50mg-lise annusega. Üksikasju on kirjeldatud 20
näidetes.
Joonisel Fig 3 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja (x-telg) aja
sõltuvuse kohta A431 kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga 2xCon4-C
vastavalt käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või
kontrollpeptikehaga. Üksikasju on kirjeldatud näidetes. 25
Joonisel Fig 4 on toodud diagramm, milles on esitatud in vitro kasvatatud
peptikehaga Con4-C vastavalt käesolevale leiutisele, kontroll-peptikehaga ravitud
või töötlemata A431 rakkude areng. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.
EE - EP1615952 B1 8
Joonisel Fig 5 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)
sõltuvuse kohta Colo205 kasvajarakkudes, mida raviti peptikehaga Con4-C,
peptikehaga L1-7-N, peptikehaga L1-21-N või peptikehaga 2xCon4-C vastavalt
käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS), anti-Ang-2
antikehaga (Ab536) või Fc-ga. Üksikasju on kirjeldatud näidetes. 5
Joonisel Fig 6 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)
sõltuvuse kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti erinevates
annustes peptikehaga 2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või
fosfaatpuhverdatud soolalahuse (PBS) või Fc-ga. Üksikasju on kirjeldatud
näidetes. 10
Joonisel Fig 7 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)
sõltuvuse kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga
2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või kontroll-peptikehadega. Joonisel Fig
7 on ka toodud diagramm nende peptikehadele mõeldud CD31 märgistatud
ala/kasvaja kogu ala. Üksikasju on kirjeldatud näidetes. 15
Joonisel Fig 8 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)
sõltuvuse kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga
2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega
(PBS) või kontroll-peptikehaga. Üksikasju on kirjeldatud näidetes. See diagramm
näitab, et anti-Ang-2 peptikehad suudavad inhibeerida Colo205 kasvaja arengut 20
annustamise algusest sõltumata.
Joonisel Fig 9 on toodud kokkuvõte täielike vastuste (CR) tasemetest, mis saadi
emastel puutumata hiirtel, kasutades antikeha Ab536 või peptikeha 2xCon4-C nii
A431 kui ka Colo-205 ksenografti mudelitel. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.
Joonisel Fig 10A on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg) 25
sõltuvuse kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga
2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või 2xCon4-C ja taksoteeri (Taxotere)
kombinatsiooniga või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või PBS ja
taksoteeriga. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.
EE - EP1615952 B1 9
Joonisel Fig 10B on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)
taksoteeri kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga
2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või 2xCon4-C ja 5-FU kombinatsiooniga
või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või PBS ja 5-FU-ga. Üksikasju on
kirjeldatud näidetes. 5
Joonisel Fig 11A on esitatud käpa tursumise tasemete (AUC±SE) diagramm
adjuvandiga esilekutsutud artriidi mudelil rottidel, keda raviti peptikehaga 2xCon4-
C vastavalt käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või
kontrollpeptikehaga või normaalsete või artriitkontrollidega. Üksikasju on
kirjeldatud näidetes. 10
Joonisel Fig 11B on esitatud käpa luutiheduse (BMD) diagramm adjuvandiga
esilekutsutud artriidi mudelil rottidel, keda raviti peptikehaga 2xCon4-C vastavalt
käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või
kontrollpeptikehaga või normaalsete või artriitkontrollidega. Üksikasju on
kirjeldatud näidetes. 15
Joonisel Fig 11C on esitatud kehamassi muutuse diagramm adjuvandiga
esilekutsutud artriidi mudelil rottidel, keda raviti peptikehaga 2xCon4-C vastavalt
käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või
kontrollpeptikehaga või normaalsete või artriitkontrollidega. Üksikasju on
kirjeldatud näidetes. 20
Joonisel Fig 12 on kaks diagrammi, kus on esitatud rottidel VEGF-ga tekitatud
sarvkesta angiogeneesi inhibeerimine. Esimesel diagrammil on toodud veresoonte
arv, mis mõõdeti hiirtel, keda raviti veise seerumi albumiiniga (BSA), VEGF ja
fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või VEGF ja leiutise peptikehaga Con4-
C. Teisel diagrammil on esitatud veresoonte pind (mm2) rottidel, keda raviti BSA-25
ga, VEGF ja fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või VEGF ja leiutise
peptikehaga Con4-C. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.
Joonistel Figs 13A, 13B ja 13C on esitatud täispika Ang-2 (hAng-2) jaoks mõeldud
epitoobi kaardistamise andmed (välisdiameeter 370) inimese hAng-2 N-otsale ning
hAng-2 C-otsale vastavalt peptikehade TN8-Con4-C, L1-7-N ja 12-9-3-C jaoks 30
EE - EP1615952 B1 10
vastavalt leiutisele ning ka kontrollpeptikeha, Tie2-Fc, C2B8 või 5B12 jaoks.
Üksikasju on kirjeldatud näidetes.
Joonis Fig 14 on esitatud (KD) 2xCon-4-C vastavalt leiutisele sidumise afiinsus,
kasutades firma Sapidyne KinExA analüüsi. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.
Joonisel Fig 15 on esitatud peptikeha 2xCon4(C) ja põletikuvastase aine PEG 5
sTNF-R1 toime käpa tursumisele roti adjuvandi artriidis. Üksikasju on kirjeldatud
näidetes.
Joonisel Fig 16 on ka esitatud peptikeha 2xCon4(C) ja põletikuvastase aine PEG
sTNF-R1 toime AUC käpa tursumisele roti adjuvandi artriidis. Üksikasju on
kirjeldatud näidetes. 10
Joonisel Fig 17 on ka esitatud peptikeha 2xCon4(C) ja põletikuvastase aine PEG
sTNF-R1 toime kehamassile roti adjuvandi artriidis. Üksikasju on kirjeldatud
näidetes.
LEIUTISE ÜKSIKASJALIK KIRJELDUS
Siin kasutatud tekstiosade pealkirjad on mõeldud ainult struktureerimiseks ning 15
neid ei tohi tõlgendada kui kirjeldatud teemat kitsendavana.
Rekombinantse DNA molekulide, proteiinide ja antikehade valmistamiseks ning
koekultuuri ja raku muundamiseks võib kasutada standardvõtteid. Ensüümsed
reaktsioonid ja puhastusvõtted sooritatakse tavaliselt vastavalt tootja juhistele või
nagu tavaliselt antud valdkonnas tehakse, kasutades tavaprotseduure, nagu on 20
esitanud Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) või nagu on siin kirjeldatud. Kui
ei ole antud konkreetseid definitsioone, on siin kirjeldatud analüütilise keemia,
sünteetilise orgaanilise keemia ning meditsiini- ja farmaatsiakeemiaga seoses
kasutatud nomenklatuur ning nende laboratoorsed protseduurid ja võtted antud 25
valdkonnas teadaolevad ja tavapäraselt kasutatavad. Standardvõtteid võib
kasutada keemilisteks sünteesideks, keemilisteks analüüsideks, ravimite
valmistamiseks, formuleerimiseks ja kohaletoimetamiseks ning patsientide
ravimiseks.
EE - EP1615952 B1 11
Definitsioonid
Selles spetsifikatsioonis läbivalt kasutatud termid on määratletud järgnevalt, kui
teatud juhtudel ei ole teisiti öeldud.
Termin „Ang-2“ tähistab polüpeptiidi, mis on esitatud USA patendi nr 6,166,185
(„Tie-2 ligand-2“) joonisel Fig 6, või selle fragmente ning ka seonduvaid 5
polüpeptiide, mille seas on alleelsed variandid, ühendatud variandid, derivaadid,
asendused, kustutused ja/või lisamisvariandid, sulandpeptiidid ja –polüpeptiidid
ning liikidevahelised homoloogid. Ang-2 polüpeptiid võib hõlmata või ei pea
hõlmama täiendavaid terminaalseid jääke nt liiderjärjestused, märklaud-järjestus,
amino-otsa metioniin, amino-otsa metioniini ja lüsiini jäägid ja/või märgise või 10
sulandproteiinide järjestused, sõltuvalt viisist, kuidas neid valmistatakse.
Termin „bioloogiliselt aktiivne“ Ang-2 või Ang-2 spetsiifilise sideainega seoses
kasutamisel tähistab peptiidi või polüpeptiide, millel on Ang-2 või Ang-2 spetsiifilise
sideaine vähemalt üks toimeomadus. Ang-2 spetsiifilisel sideainel võib olla
agonist, antagonist või neutraliseeriv või blokeeriv toime seoses Ang-2 vähemalt 15
ühe bioloogilise toimega.
Termin „spetsiifiline sideaine“ tähendab molekuli, soovitatavalt valgulist molekuli,
mis spetsifiiliselt seob Ang-2, ning selle variante ja derivaate, nagu on siin
kirjeldatud. Spetsiifiline sideaine võib olla proteiin, peptiid, nukleiinhape, süsivesik,
lipiid või väikse molekulmassiga ühend, mis eeskätt Ang-2-le seondub. Eelistatud 20
variandis on spetsiifiline sideaine vastavalt käesolevale leiutisele peptiid või
peptikeha ning ka selle fragmendid, variandid või derivaadid kas eraldi või koos
teise aminohappe järjestusega, mida saab teadaolevate võtetega. Taoliste võtete
seas on muuhulgas ensüümne lõhestamine, keemiline lõhestamine, peptiidi
süntees või rekombinantsed võtted. Käesoleva leiutise anti-Ang-2 spetsiifilised 25
sideained suudavad siduda Ang-2 osi, mis moduleerivad, nt inhibeerivad või
soodustavad Ang-2 bioloogilist aktiivsust ja/või muid Ang-2-ga seotud toimeid.
Siin kasutatud termin „variandid“ hõlmab neid peptiide ja polüpeptiidide, kus
aminohappe jäägid lisatakse looduslikult esinevasse (või vähemalt teadaolevasse)
EE - EP1615952 B1 12
aminohappe järjestusse, kustutatakse sellest ja/või asendatakse selles sideaine
jaoks. Leiutise variantide seas on sulandvalgud, nagu kirjeldatakse allpool.
„Derivaatide“ seas on need sideained, mida on keemiliselt modifitseeritud moel,
mis erineb lisamise, kustutamise või asenduse variantidest.
„Spetsiifiliselt seob Ang-2“ tähistab käesoleva leiutise spetsiifilise sideaine (nagu 5
peptikeha või selle peptiidi osa) võimet tunda ja siduda inimese küpseid täispikki
või osalise pikkusega Ang-2 polüpeptiide või selle ortoloogi, kus selle afiinsus
(nagu on määratleti nt ELISA afiinsuse või BIAcore analüüsidega, nagu on siin
kirjeldatud) või neutraliseerimisvõime (nagu määratleti nt ELISA neutraliseerimise
analüüsidega, mida on siin kirjeldatud, või sarnaste analüüsidega) on vähemalt 10 10
korda suurem, aga soovi korral 50 korda suurem, 100, 250 või 500 korda suurem
või isegi vähemalt 1000 suurem nagu samasugune afiinsus või
neutraliseerimisvõime mis tahes muu angiopoietiini või muu peptiidi või
polüpeptiidi jaoks, kus peptikeha peptiidi osa ühendatakse esmalt inimese Fc
osale taolises analüüsis hindamiseks. 15
Termin „epitoop“ tähistab mis tahes molekuli osa, mida spetsiifiline sideaine, nt
peptikeha, suudab tunda või siduda sideaine ühel või mitmel antigeeni sidumisalal.
Epitoobid koosnevad tavaliselt molekulide keemiliselt aktiivsetest pinna
klassifikatsioonidest, nagu näiteks aminohapetest või süsivesiku kõrvalahelatest,
ning neil on spetsiifilised kolmedimensioonilised omadused ja spetsiifilised laengu 20
omadused. Siin kasutatud epitoobid võivad olla omavahel ühendatud või
omavahel mitte ühendatud.
Termin „inhibeeriv ja/või neutraliseeriv epitoop“ on epitoop, kus selle spetsiifilise
sideaine nagu peptikeha poolt sidumise tagajärjel kaob (või vähemalt alaneb)
molekuli, raku või taolist epitoopi sisaldava organismi bioloogiline aktiivsus in vivo, 25
in vitro või in situ. Käesoleva leiutise kontekstis asub neutraliseeriv epitoop Ang-2
bioloogiliselt aktiivsel alal või on sellega seotud. Teisel juhul tähendab termin
„aktiveeriv epitoop“ epitoopi, mis leiutise spetsiifilise sideaine, nagu antikeha, poolt
sidumisel põhjustab Ang-2 aktiveerimise võib vähemalt bioloogiliselt aktiivse
ühtlustumise püsimise. 30
EE - EP1615952 B1 13
Termin „peptikeha fragment“ tähistab peptiidi või polüpeptiidi, mis sisaldab vähem
kui tervet, puutumata peptikeha.
Termin „looduslikult esinev“ seoses bioloogiliste materjalidega nagu nukleiinhappe
molekulid, polüpeptiidid, peremeesrakud ja muu sarnane kasutamisel tähistab
neid, mida looduses leidub ja ei ole inimeste poolt muudetud. 5
Termin „eraldatud“ seoses Ang-2 või Ang-2 spetsiifilise sideainega kasutamisel
tähistab ühendit, mis on vaba vähemalt ühest saastavast polüpeptiidist, või ühend,
mida leidub selle looduslikus keskkonnas ning mis soovitatavalt on vaba mis tahes
muust saastavast imetaja polüpeptiididist, mis häiriks selle terapeutilist või
diagnostilist kasutust. 10
Termin „küps“ seoses Ang-2 peptikeha või selle fragmendiga või mis tahes muu
Ang-2 valgulise spetsiifilise sideainega kasutamisel tähistab peptiidi või
polüpeptiid, millel puudub liider- või signaaljärjestus. Kui leiutise sideainet
ekspresseeritakse näiteks prokarüootses peremeesrakus, võib „küps“ peptiid või
polüpeptiid hõlmata ka aminohappe täiendavaid järjestusi (ent liiderjärjestus ikkagi 15
puudub) nagu amino-otsa metioniin või ühte või mitut metioiini ja lüsiini jääki.
Sedasi loodud peptiidi või polüpeptiidi võib kasutada nii, et need täiendavad
aminohappe jäägid on või ei ole eemaldatud.
Terminid „tõhus kogus“ ja „terapeutiliselt tõhus kogus“ seoses Ang-2 spetsiifilise
sideainega kasutamisel tähistab spetsiifilise sideaine kogust, mis on kasulik või 20
vajalik märgatava muutuse soodustamiseks ühe või mitme Ang-2 bioloogilise
toime tasemes. Muutus võib olla kas Ang-2 toime taseme tõus või alanemine.
Eelistatavalt on muutuseks Ang-2 toime alanemine.
Termin „peptikeha“ tähistab molekuli, mis sisaldab vähemalt ühele peptiidile
kinnitunud antikeha Fc domeeni. Peptikehade tootmist on üldiselt kirjeldatud PCT 25
avalikustuses WO 00/24782, mis avaldati 4. mail 2000.
Siin kasutatud termin „variandid“ hõlmab neid molekule nagu peptiidi või peptiidi-
kandurite kombinatsioone nagu käesoleva leiutise peptikehad, kus aminohappe
jäägid taoliste molekulide jaoks lisatakse aminohappe järjestusse, kustutatakse
EE - EP1615952 B1 14
neist ja/või asendatakse nendes. Variandid, millele on lisatud üks või mitu
aminohapet, hõlmavad sulandvalke, nagu on allpool kirjeldatud.
„Derivaatide“ seas on need peptiidid ja/või peptiidi-kandurite kombinatsioonid nagu
peptikehad, mida on keemiliselt modifitseeritud moel, mis erineb lisamise,
kustutamise või asendamise variantidest. 5
Termin „fragment“ tähistab peptiidi või peptiidi-kandurit kombinatsioonis, mis
sisaldab taoliste peptiidide ja/või peptiidi-kandurite kombinatsioonide vähem kui
täispikkuses aminohappe järjestust. Taoline fragment võib tekkida näiteks amino-
otsal kärpimisest, karboksü-otsast kärpimisest ja/või jäägi(kide) sisemisest
kustutamisest peptiidi või peptiidi-kandurite kombinatsiooni aminohappe 10
järjestusest. Fragmendid võivad tekkida alternatiivsest RNA jätkamisest või in vivo
või in vitro proteaasi toimest. Taolisi fragmente võib konstrueerida ka keemilise
peptiidi sünteesi meetoditega või modifitseerides polünukleotiidi, mis kodeerib
peptiidi, peptiidi-kanduri kombinatsiooni või Fc osa ja/või peptikeha peptiidi osa.
Termin „Fc“ tähistab käesoleva leiutise ühte liiki kandurit ning sisaldab antikeha 15
mitte-antigeeni siduva fragmendi järjestust, mis tuleneb terve antikeha
proteolüütilisest lagundamisest monomeersel või multimeersel kujul. Fc allikas
käesolevas leiutises on soovitatavalt täielikult inimese Fc ning võib olla mis tahes
immunoglobuliin, kuigi eelistatakse IgG1 ja IgG2. Ent Fc, mis on osaliselt inimese
omad või saadud mitte-inimeselt, on ka siia kaasatud. Fc-d koosnevad 20
monomeersetest polüpeptiididest, mis võivad olla ühendatud dimeersetele või
multimeersetele kujudele kovalentse (st disulfiidi sidemete) ja mittekovalentse
seosega. Molekulidevaheliste disulfiidi sidemete arv looduslike Fc molekulide
monomeersete üksuste vahel on vahemikus 1 kuni 4, sõltuvalt klassist (nt IgG,
IgA, IgE) või alaklassist (nt IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 IgGA2). Loodusliku Fc üks 25
näide on disulfiidiga seotud dimeer, mis tuleneb IgG papaiini lagunemisest [vaata
Ellison et al (1982), Nucl. Acids. Res. 10: 4071-9]. Siin kasutatud termin „looduslik
Fc“ üldistab monomeerseid, dimeerseid ja multimeerseid vorme.
Termin „Fc domeen“ hõlmab looduslikke Fc ja Fc variandi molekule ja järjestusi,
nagu määratleti eespool. Nagu Fc variantide ja looduslike Fc-dega hõlmab termin 30
EE - EP1615952 B1 15
„Fc domeen“ molekule monomeersel või multimeersel kujul tervest antikehast
lagundatuna või teisel moel saaduna.
Termin „multimeer“, nagu on rakendatud Fc domeenidele või molekulidele,
hõlmates ka Fc domeene, tähistab molekule, millel on kaks või mitu polüpeptiidi
ahelat, mis on seotud kovalentselt, mittekovalentselt või nii kovalentsete kui ka 5
mittekovalentsete seostega. IgG molekulid moodustavad tavaliselt dimeere, IgM,
pentameere, IgD, dimeere ja IgA, monomeere, dimeere, trimeere või tetrameere.
Multimeere võib moodustada järjestuse ning Fc loodusliku Ig allika saadava toime
rakendamisel või (nagu on määratletud allpool) taolise loodusliku Fc
derivatiseerimisel. 10
Termin „dimeer“, nagu on kasutatud Fc domeenide või molekulidega, mis
sisaldavad Fc domeene, tähistavad molekule, millel kaks polüpeptiidi ahelat on
kovalentselt või mittekovalentselt seotud.
Termin „kandur“ tähistab molekuli, mis takistab degradeerumist ja/või tõstab
poolestusaega, alandab mürgisust ja immunogeensust või tõstab terapeutilise 15
proteiini bioloogilist aktiivsust. Näidiskandurite seas on Fc domeen ning lineaarne
polümeer (nt polüetüleenglükool (PEG), polülüsiin, dekstraan jne), hargnenud
ahelaga polümeer (vaata näiteks USA patenti nr 4,289,872 Denkenwalterile et al,
väljastati 15. septembril 1981; USA patenti nr 5,229,490 Tamile, väljastati 20. juulil
1993; WO93/21259 Frechet’ et al poolt, avaldati 28. oktoobril 1993), lipiid, 20
kolesteroolrühm (nagu steroid), süsivesik või oligosahhariid või mis tahes looduslik
või sünteetiline valk, polüpeptiid või peptiid, mis seondub päästeretseptoriga
(salvage receptor). Kandureid kirjeldatakse veel allpool.
Terminid “derivatiseeriv“ ja „derivaat“ või „derivatiseeritud“ hõlmab vastavalt
protseduure ja saadud ühendeid, kus (1) ühendil on tsükliline osa, näiteks 25
ristsidumine tsüsteinüüli jääkide vahel ühendi sees; (2) ühend on ristseotud või
sellel on ristsidumise koht, näiteks on ühendil tsüsteinüüli jääk ja järelikult
moodustab see kasvatamisel või in vivo ristseotud dimeere; (3) üks või mitu
peptidüüli aheldust asendatakse mitte-peptidüüli aheldusega; (4) N-ots
asendatakse -NRR1, NRC(O)R1, - NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, 30
suktsiinimiidi rühmaga või asendatud või asendamata bensüüloksükarbonüül-NH-
EE - EP1615952 B1 16
ga, kusjuures R ja R1 ja ringi asendajad on siin allpool määratletud; (5) C-ots
asendatakse -C(O)R2 või -NR3R4-ga, kusjuures R2, R3 ja R4 on siin allpool
määratletud; ning (6) ühendid, milles individuaalsed aminohappe osad on ravimise
kaudu modifitseeritud ainetega, mis suudavad reageerida valitud kõrvalahelate või
otsa jääkidega. Derivaate on siin veel täiendavalt järgnevalt kirjeldatud. 5
Termin „peptiid“ tähistab molekule, millel on umbes 3 kuni umbes 75 aminohapet,
kus eelistatud on umbes 5 kuni 50 aminohapet, kus veel eelistatum on 8 kuni 40
ning need, millel on umbes 10 kuni 25 aminohapet, on kõige eelistatumad.
Peptiidid võivad olla looduslikult esinevad või tehislikud (st mitte-looduslikult
esinevad) aminohappe järjestused. Näidispeptiide võib luua siin esitatud mis tahes 10
meetoditega, nagu teostatakse peptiidikogudes (nt faagmeetodi kogu), mis
luuakse keemilise sünteesiga, tuletatakse valkude lagundamisega või toodetakse
rekombinantse DNA võtteid kasutades.
Termin „farmakoloogiliselt aktiivne“ tähendab, et sedasi kirjeldatud ainel on
kindlaksmääratud toime, mis mõjutab meditsiinilist parameetrit (nt vererõhk, 15
vereliblede arv, kolesterooli tase) või haiguse staadiumit (nt vähk,
autoimmuunhäired jne).
Terminid „antagonist-peptiid“ või „inhibiitor-peptiid“ tähistab peptiidi, mis blokeerib
või mõnel moel häirib huvialase seonduva proteiini bioloogilist aktiivsust või millel
on bioloogiline toime, mis on võrreldav teadaoleva huvialuse seonduva proteiini 20
antagonisti või inhibiitoriga. Järelikult hõlmab termin „Ang-2-antagonist peptiid“
peptiide, mida on võimalik pidada või saada kui Ang-2-antagonistilikke omadusi
omavaks.
Lisaks on siia kaasatud ka leiutise ühendite füsioloogiliselt sobivad soolad.
„Füsioloogiliselt sobivate sooladega“ on mõeldud mis tahes teadaolevaid või hiljem 25
farmatseutiliselt sobivateks peetud soolasid. Mõned konkreetsed näited on:
atsetaat, trifluoroatsetaat, hüdrohaliidid nagu vesinikkloriid ja vesinikbromiid,
sulfaat, tsitraat, tartraat, glükolaat ning oksalaat, mesülaat ja fosfaat.
EE - EP1615952 B1 17
Peptikehad
Käesoleva leiutise üks aspekt käsitleb Ang-2 peptikehade arengut. Proteiini ligandi
koostoime oma retseptoriga toimub sageli võrdlemisi suurel üleminekukihil. Ent
nagu näidati inimese kasvuhormooni ja selle retseptori puhul, ainult mõned
põhijäägid üleminekukihil soodustavad sidumisenergiast enamikku. Clackson et al, 5
Science 267: 383-6 (1995). Proteiini ligandi hulk kõigest näitab õiges topoloogias
siduvaid epitoope või sooritab sidumisega mitteseotud funktsioone. Järelikult
saavad ainult „peptiidi“-pikkused molekulid (üldiselt 2 kuni 40 aminohapet)
seonduda teatud suure proteiini ligandi retseptor-proteiinile. Taolised peptiidid
võivad imiteerida suure proteiini ligandi („peptiidi agonistid“) bioaktiivsust või 10
konkureeriva sidumise kaudu inhibeerida suure proteiini ligandi („peptiidi
antagonistid“) bioaktiivsust.
Faagmeetodi tehnoloogia on tekkinud võimsa meetodina, et tuvastada taolisi
peptiidi agoniste ja antagoniste. Vaata näiteks Scott et al, Science 249: 386
(1990); Devlin et al, Science 249: 404 (1990); USA patent nr 5,223,409, mis 15
väljastati 29. juunil 1993; USA patent nr 5,733,731, mis väljastati 31. märtsil 1998;
USA patent nr 5,498,530, mis väljastati 12. märtsil 1996; USA patent nr 5,432,018,
mis väljastati 11. juulil 1995; USA patent nr 5,338,665, mis väljastati 16. augustil
1994; USA patent nr 5,922,545, mis väljastati 13. juulil 1999; WO 96/40987, mis
avaldati 19. detsembril 1996; ning WO 98/15833, mis avaldati 16. aprillil 1998 20
(millest igaüks on siia viidetena kaasatud). Peptiidi faagmeetod kogumites on
võimalik suvalisi peptiidijärjestusi näidata kiulise faagi katteproteiinidega
ühendamisel. Esitatud peptiide saab soovi korral retseptori antikeha-
immobiliseeritud rakuvälise domeeni suhtes afiinsena elueerida. Järele jäänud
faagi võib rikastada järjestikku afiinsus-puhastamise ja taaspaljundamisega. 25
Paremad sidumispeptiidid võib järjestada, et ühe või mitme struktuurselt seotud
peptiidi perekondades põhijääke tuvastada. Vaata nt Cwirla et al, Science 276:
1696-9 (1997), kus tuvastati kaks erinevat perekonda. Peptiidi järjestused võivad
ka viidata, milliseid jääke saab ohutult asendada alaniini skaneerimise või
mutageneesiga DNA tasemel. Mutageneesi kogusid võib luua ja analüüsida, et 30
paremate sidujate järjestust täiendavalt optimeerida. Lowman, Ann. Rev. Biophys.
Biomol. Struct. 26: 401-24 (1997).
EE - EP1615952 B1 18
Proteiin-proteiini koostoime strukturaalset analüüsi võib kasutada, et näidata
peptiide, mis imiteerivad suure proteiini ligandide sidumisaktiivsust. Taolises
analüüsis võib kristallstruktuur näidata suure proteiini ligandi, millest võib peptiidi
kujundada, kriitiliste jääkide omapära ja suhtelist orientatsiooni. Vaata nt Takasaki
et al, Nature Biotech 15: 1266-70 (1997). Neid analüütilisi meetodeid võib ka 5
kasutada, et uurida koostoimet retseptori proteiini ja faagmeetodiga valitud
peptiidide vahel, viidates peptiidide edasisele modifikatsioonile, et sidumisafiinsust
tõsta.
Peptiidi uuringutes konkureerivad faagmeetodiga ka teised meetodid. Peptiidi
kogu võib ühendada lac repressori karboksüül-otsaga ning E. colis 10
ekspresseerida. Teine E. coli põhine võte võimaldab faagmeetodit raku
välismembraanil peptidoglükaaniga seotud lipoproteiiniga (PAL) ühendamisega.
Siitpeale nimetatakse neid ja seonduvaid meetodeid ühiselt „E. coli meetodiks“.
Järgmises meetodis peatatakse suvalise RNA translatsioon vahetult enne
ribosoomi vabastamist, mille tulemuseks on polüpeptiidide kogu, kus nende 15
seonduv RNA on endiselt kinnitunud. Siitpeale nimetatakse seda ja seonduvaid
meetodeid ühiselt „ribosoomi meetodiks“. Teised meetodid rakendavad peptiidide
keemilisi sidemeid RNA-le. Vaata näiteks Roberts and Szostak, Proc Natl Acad
Sci USA, 94: 12297-303 (1997). Siitpeale nimetatakse seda ja seonduvaid
meetodeid ühiselt „RNA-peptiidi uuringuks“. Välja on töötatud keemiliselt tuletatud 20
peptiidi kogusid, kus peptiidid on immobiliseeritud stabiilsetel mittebioloogilistel
materjalidel nagu polüetüleeni kepikesed või lahustit läbilaskvad vaigud. Järgmine
keemiliselt tuletatud peptiidi kogu kasutab fotolitograafiat, et klaasslaididele
immobiliseeritud peptiide skaneerida. Siitpeale nimetatakse neid ja seonduvaid
meetodeid ühiselt „keemilise peptiidi uuringuks“. Keemilise peptiidi uuring võib 25
osutuda kasulikuks, sest see võimaldab kasutada D-aminohappeid ning teisi
mittelooduslikke analooge ja mitte-peptiidi elemente. Nii bioloogilisi kui ka keemilisi
meetodeid on uurinud Wells ja Lowman, Curr. Opin. Biotechnol., 3: 355-62 (1992).
Põhimõtteliselt võib mis tahes proteiini peptiidi mimeetikume leida faagmeetodi
ning teiste eespool nimetatud meetodite abil. Neid meetodeid on kasutatud 30
epitoobi kaardistamiseks, kriitiliste aminohapete tuvastamiseks proteiin-proteiini
koostoimes ning uute raviainete avastamiseks. Vaata nt Cortese et al, Curr. Opin.
EE - EP1615952 B1 19
Biotech. 7: 616-21 (1996). Peptiidi kogusid kasutatakse nüüd kõige enam
immunoloogilistes uuringutes nagu epitoopi kaardistamine. Vaata Kreeger, The
Scientist 10(13): 19-20(1996).
Faagmeetodi kogumi uuringuga tuvastatud peptiide peetakse „juhtnöörideks“
raviainete väljatöötamisel, mitte iseenesest raviaineteks. Nagu ka teiste proteiinide 5
ja peptiidide puhul eemaldatakse need tõenäoliselt kiiresti in vivo kas neerude
filtreerimisel, rakuliste puhastusmehhanismide poolt retikuloendoteliaalsüsteemis
või proteolüütilisel degradatsioonil [Francis, (supra)]. Seetõttu kasutatakse peptiide
antud valdkonnas praegu ravimi sihtmärkide kinnitamiseks või alustellingutena
orgaaniliste ühendite, mida keemilise kogu uuringutega nii kergesti või kiiresti ei 10
tuvastata, loomiseks [Lowman, (supra); Kay et al, (supra)]. Antud valdkonnas
oleks kasu protsessist, millega taolised peptiidid palju lihtsamalt annaksid
saaduseks angiogeneesivastaseid raviaineid.
Peptikehade struktuur
Vastavalt antud leiutisele valmistatud aine koostises võib peptiid olla kinnitunud 15
kandurile peptiidi N- või C-otsa kaudu. Järelikult võib antud leiutise kandur-peptiidi
molekule kirjeldada järgneva viie valemiga ja nende multimeeridega:
(X1)a-F1-(X2)b (VALEM I)
X1-F1 (VALEM II)
F1-X2 (VALEM III)
F1-(L1)c-P1 (VALEM IV)
F1-(L1)c-P1-CL2)d-P2 (VALEM V)
kus:
F1 on kandur (soovitatavalt Fc domeen);
X1 ja X2 valitakse kumbki iseseisvana -(L1)c-P1, -(L1)c-P1-(L2)d-P2, -20
(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3 ja -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4 seast;
P1, P2, P3 ja P4 on kumbki iseseisvana farmakoloogiliselt aktiivsete
peptiidide järjestused, nagu on siin kirjeldatud;
L1, L2, L3 ja L4 on kumbki iseseisvana linkerid; ning
„a“, „b“, „c“, „d“, „e“ ja „f“ on kumbki iseseisvana 0 või 1 tingimusel, et 25
„a“ ja „b“ seast vähemalt üks on 1.
EE - EP1615952 B1 20
Peptiidid
Käesolev leiutis peab võimalikuks peptiide, mis selektiivselt või spetsiifiliselt Ang-
2-le seonduvad. Mis tahes koguses taolisi peptiide saab antud leiutisega seoses
kasutada. Just faagmeetod on kasulik käesolevas leiutises kasutamiseks mõeldud
peptiidide loomisel, nagu on ka näidatud, et suvaliste peptiide kogust pärit 5
afiinsuse valikut saab kasutada peptiidid ligandide tuvastamiseks mis tahes
geeniprodukti mis tahes kohale. Dedman et al, J. Biol. Chem. 268: 23025-30
(1993).
Käesolevas leiutises võib peptiide valmistada antud valdkonnas avaldatud mis
tahes meetoditega. Kasutatud on ühetähelisi aminohappe lühendeid. Mis tahes 10
järjestuses „X“ (ja kogu spetsifikatsioonis läbivalt, kui ei ole teatud juhtudel teisiti
öeldud) tähendab, et eksisteerida võib 20 mis tahes looduslikult esinevat
aminohappejääki või mis tahes loodulikult mitte-esinevat aminohapet (mida on
kirjeldatud „Variantide“ juures). Neist iga peptiid võib olla seotud reastikku (st
üksteise järel), koos linkeritega või ilma nendeta ning reastikku seotud näited on 15
esitatud tabelis. Linkerid on loetletud kui „L“ ning need võivad olla mis tahes siin
kirjeldatud linkerid. Reastikku kordused ja linkerid on selguse huvides esitatud
tühikuga eraldatuna. Tsüsteinüüli jääki sisaldav mis tahes peptiid võib olla seotud
teise Cys-sisaldava peptiidiga, millest üks või mõlemad võivad olla kandurile
seotud. Enam kui ühe Cys-jäägiga peptiid võib ka moodustada peptiidisisese 20
disulfiidi sideme. Neist mis tahes peptiidi võib derivatiseerida, nagu on siin
kirjeldatud. Derivaatide, milles karboksüül-ots võib olla kaetud aminorühmaga,
jaoks on kattev aminorühm NH2. Derivaatide, milles aminohappe jäägid on
asendatud aminohappe jääkidest erinevate osadega, on asendused märgitud
tähega S, mis tähistab mis tahes osa, mida on kirjeldanud Bhatnagar et al, J. Med 25
Chem. 39: 3814-9 (1996), ning Cuthbertson et al, J. Med. Chem. 40: 2876-82
(1997), mis on siia ka viidetena kaasatud. Kõik peptiidid on seotud
peptiidisidemetega, kui ei ole teisiti märgitud.
Kandurid
Ühes variandis võimaldab antud leiutis vähemalt ühel peptiidil vähemalt ühele 30
kandurile (F1, F2) kinnituda N-otsa, C-otsa või peptiidi(de) aminohappe jääkide ühe
EE - EP1615952 B1 21
kõrvalahela kaudu. Kasutada võib ka mitmekordseid kandureid, nt Fc-sid igal otsal
või ühte Fc-d ühel otsal ja PEG rühma teises otsas või kõrvalahelal.
Fc domeen on üks eelistatav kandur. Fc domeeni võib ühendada peptiidide N- või
C-otsadele või nii N- kui ka C-otsadele.
Nagu märgiti eespool, Fc variandid on antud leiutise raames sobivad kandurid. 5
Looduslikku Fc-d võib laiaulatuslikult modifitseerida, et moodustada Fc variant
vastavalt antud leiutisele tingimusel, et sidumine päästeretseptorile säilib. Vaata
näiteks WO 97/34631 ja WO 96/32478. Taolistes Fc variantides võib eemaldada
loodusliku Fc ühe või mitu kohta, mis tagavad strukturaalseid omadusi või
funktsionaalset aktiivsust, mida antud leiutise sulandmolekulid ei vaja. Need kohad 10
võib eemaldada näiteks jääkide asendamise või kustutamisega, jääkide lisamisel
antud kohale või seda kohta sisaldavate osade kärpimisel. Lisatud või asendatud
jäägid võivad olla ka muudetud aminohapped nagu peptidomimeetikumid või D-
aminohapped. Fc variante võib olla vaja mitmel põhjusel, millest mitmeid on ka
allpool kirjeldatud. Fc näidisvariantide seas on molekulid ja järjestused, kus: 15
1. Disulfiidi sideme moodustamisse kaasatud kohad eemaldatakse. Taoline
eemaldamine võib vältida reaktsioone teiste tsüsteiini sisaldavate
proteiinidega, mis esinevad peremeesrakus, mida kasutatakse leiutise
molekulide tootmiseks. Selleks võib tsüsteiini sisaldavat segmenti N-otsal
kärpida või tsüsteiini jäägid võib kustutada või asendada teiste 20
aminohapetega (nt alanüül, serüül). Isegi, kui tsüsteiini jäägid
eemaldatakse, võivad üksiku ahela Fc domeenid endiselt moodustada
dimeerse Fc domeeni, mis mitte-kovalentselt koos püsib.
2. Tuvastatakse looduslik Fc, et seda valitud peremeesrakuga ühtivamaks
teha. Näiteks võib eemaldada PA järjestuse tavalise Fc N-otsa lähedal, 25
mille võib ära tunda E. colis oleva seene ensüümiga nagu proliini
iminopeptidaas. Samas võib lisada N-otsa metionüüli jäägi, eriti siis, kui
molekuli ekspresseeritakse rekombinantselt bakterirakus nagu E. coli.
3. Loodusliku Fc N-otsa portsjon eemaldatakse, et vältida N-otsa
heterogeensust, kui seda ekspresseeritakse valitud peremeesrakus. Sellel 30
EE - EP1615952 B1 22
põhjusel võib kustutada mis tahes esimesed 20 aminohappe jääki N-
terminuses, eriti need, mis asuvad 1., 2., 3., 4. ja 5. positsioonil.
4. Üks või mitu glükosüleerimise kohta eemaldatakse. Tavaliselt võivad
glükosüleeritud jäägid (nt aspargiin) pakkuda tsütolüütilist vastust. Taolised
jäägid võib kustutada või asendada glükosüleerimata jääkidega (nt alaniin). 5
5. Täiendusega koostoimesse kaasatud kohad nagu C1q sidumiskoht
eemaldatakse. Näiteks võib kustutada või asendada inimese IgG1 EKK
järjestuse. Lisandusega täiendamine ei pruugi olla kasulik antud leiutise
molekulide jaoks ning järelikult tuleks seda taolise Fc variandi puhul vältida.
6. Eemaldatakse kohad, mis mõjutavad päästeretseptorist erinevatele Fc 10
retseptoritele sidumist. Looduslikul Fc võib olla kohti koostoimeks teatud
valgete verelibledega, mida ei ole vaja käesoleva leiutise sulandmolekulide
jaoks, ning järelikult võib selle eemaldada.
7. Eemaldatakse ADCC koht. ADCC kohad on antud valdkonnas tuntud.
Vaata näiteks Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) seoses ADCC 15
kohtadega IgG1 sees. Ka neid kohti ei ole käesoleva leiutise
sulandmolekulidele vaja ning järelikult võib need eemaldada.
8. Kui looduslik Fc tuletatakse mitteinimese antikehast, võib loodusliku Fc
humaniseerida. Loodusliku Fc inimtaoliseks tegemiseks tavaliselt
asendatakse valitud jäägid mitte-inimese loodusliku Fc jääkides, mida 20
tavaliselt leidub inimese looduslikus Fc-s. Antud valdkonnas teatakse
antikeha humaniseerimiseks mõeldud võtteid.
Alternatiivne kandur oleks proteiin, polüpeptiid, peptiid, antikeha, antikeha
fragment või väike molekul (nt peptidomimeetiline ühend), mis suudab
päästeretseptorile seonduda. Näiteks võib kandurina kasutada polüpeptiidi, nagu 25
kirjeldati USA patendis nr 5,739,277, väljastati 14. aprillil 1998 Prestale et al.
Peptiide saab valida ka faagmeetodiga FcRn päästeretseptorile sidumiseks.
Taolised päästeretseptorit siduvad ühendid on kaasatud ka tähenduses „kandur“
ning kuuluvad leiutise raamesse. Taolised kandurid tuleks valida tõstetud
poolestusea (nt vältides proteaaside poolt tuntavaid järjestusi) ning alanenud 30
EE - EP1615952 B1 23
immunogeensuse (nt soodustades mitte-immunogeenseid järjestusi, nagu avastati
antikeha inimtaoliseks tegemisel) jaoks.
Nagu eespool märgiti, võib polümeer-kandureid ka F1 ja F2 jaoks kasutada.
Praegu on kättesaadavad erinevad vahendid kanduritena kasulike keemiliste
osade kinnitamiseks, vaata nt Patendikoostöölepingu (Patent Cooperation Treaty 5
PCT) rahvusvahelist väljaannet nr WO96/11953, mille nimi on „N-Terminally
Chemically Modified Protein Compositions and Methods“. Selles PCT väljaandes
on muuhulgas esitatud vees lahustuvate polümeeride selektiivne kinnitumine
proteiini N-terminusele.
Eelistatud polümeerkandur on polüetüleenglükool (PEG). PEG-rühm võib olla 10
igasuguse käepärase molekulmassiga ja lineaarne või hargnenud. PEG-i
keskmine molekulmass on soovitatavalt vahemikus umbes 2 kilodaltonit („kDa“)
kuni umbes 100kDa, veel soovitatavamalt umbes 5kDa kuni umbes 50 kDa, kõige
soovitatavamalt umbes 5kDa kuni umbes 10kDa. Üldiselt on PEG-rühmad leiutise
ühenditele kinnitunud atsüülimise või redutseeriva alküülimisega reaktiivse rühma 15
kaudu PEG osal (nt aldehüüd, amino, tiool või esterrühm) reaktiivsele rühmale
leiutise ühendil (nt aldehüüd, amino või esterrühm).
Sünteetiliste peptiidide pegüülimise tõhus strateegia hõlmab peptiidi ja PEG-osa
kombineerimist konjugaatseose moodustamise kaudu lahuses, kus igaüks kannab
erifunktsionaalsust, mis põhjustab omavahelist reaktiivsust. Peptiidide saab lihtsalt 20
valmistada antud valdkonnas teadaoleva tavapärase tahke faasi sünteesiga.
Peptiidid „preaktiveeritakse“ sobiva funktsionaalrühmaga spetsiaalsel kohal.
Prekursorid puhastatakse ja eristatakse täielikult enne PEG-osaga reageerimist.
Peptiidi ligeerimine PEG-iga toimub tavaliselt veefaasis ja seda saab lihtsalt
jälgida pöörfaasilise analüütilise HPLC-ga. Pegüülitud peptiide on võimalik hõlpsalt 25
puhastada preparatiivse HPLC-ga ja eristada analüütilise HPLC-ga, aminohappe
analüüsi ja laserdesorptsiooni massispektromeetriaga.
Polüsahhariid-polümeerid on veel üks liik veeslahustuvaid polümeere, mida võib
proteiini modifitseerimiseks kasutada. Dekstraanid on polüsahharid-polümeerid,
mis koosnevad glükoosi üksikutest allüksustest, mis on peamiselt seotud a1-6 30
sidemetega. Dekstraan on iseenesest kättesaadav mitmesugustes molekulmassi
EE - EP1615952 B1 24
vahemikes ning see on hõlpsasti kättesaadav molekulmassi vahemikus umbes
1kDa kuni umbes 70kDa. Dekstraan on sobiv veeslahustuv polümeer käesolevas
leiutises kasutamiseks kandurina iseseisvalt või koos teise kanduriga (nt Fc).
Vaata näiteks patente WO 96/11953 ja WO 96/05309. Teada on terapeutilistele
või diagnostilistele immunoglobuliinidele konjugeeritud dekstraani kasutamine; 5
vaata näiteks Euroopa patenditaotlust nr 0 315 456, mis on käesolevaga ka viitena
kaasatud. Eelistatakse dekstraani molekulmassiga umbes 1kDa kuni umbes
20kDa, kui dekstraani kasutatakse kandurina vastavalt käesolevale leiutisele.
Linkerid
Mis tahes „linker“-rühm on valikuline. Selle olemasolul ei ole keemiline struktuur 10
kriitiline, kuna see toimib peamiselt ruumitäitena. Linker koosneb soovitatavalt
aminohapetest, mis on kokku ühendatud peptiidisidemetega. Eelistatud
variantides koosneb linker järelikult alates 1 kuni 20 aminohappest, mis on seotud
peptiidisidemetega, kusjuures aminohapped valitakse 20 looduslikult esinevast
aminohappest. Üks või mitu seda aminohapet võivad olla glükosüleeritud, nagu 15
antud valdkonnas pädevad isikud teavad. Rohkem eelistatud variandis valitakse 1
kuni 20 aminohapet glütsiini, alaniini, proliini, aspargiini, glutamiini ja lüsiini seast.
Veelgi soovitatavamalt koosneb linker peamiselt aminohapetest, mis on steeriliselt
pärssimata, nagu glütsiin ja alaniin. Järelikult on eelistatud linkerid polüglütsiinid
(eriti (Gly)5, (Gly)8), poly(Gly-Ala) ja polüalaniinid. Eelistatakse ka Gly ja Ala 20
kombinatsioone nagu ka linkerit, millele siin viidatakse kui K1 ja millel on siin
näidetes esitatud aminohappe järjestus.
Võimalikud on ka mitte-peptiidi linkerid. Näiteks alküüllinkerid nagu -NH-(CH2)s-
C(O)-, kusjuures kasutada saab s=2-20. Neid alküüllinkereid võib veel asendada
mis tahes mitte-steeriliselt pärssiva rühmaga nagu madalam alküül (nt C1-C6) 25
madala matsüül, halogeen (nt Cl, Br), CN, NH2, fenüül jne. Mitte-peptiidi linkeri
näide on PEG-linker ning selle molekulmass on 100 kuni 5000kDa, soovitatavalt
100 kuni 500kDa. Peptiidi linkereid võib derivaate moodustamiseks muuta samal
moel, nagu kirjeldati eespool.
30
EE - EP1615952 B1 25
Variandid ja derivaadid
Spetsiifiliste sideainete variandid ja derivaadid on kaasatud käesoleva leiutise
ulatusse. Variantide hulka on kaasatud lisatavad, kustutatavad või
asendusvariandid. On mõistetav, et käesoleva leiutise konkreetne spetsiifiline
sideaine võib sisaldada ühte, kahte või kõiki kolme liiki varianti. Lisatavad või 5
asendusvariandid võivad sisaldada looduslikke aminohappeid, mittelooduslikke
aminohappeid (nagu on esitatud eespool) või mõlemaid.
Teatud variandis on esitatud lisatavad variandid, kus üks või mitu looduslikult
esineva või mitteloodusliku aminohappe jääki täiendavad peptiidi või peptikeha
aminohappe järjestust. Lisandused võivad asuda ka proteiini ühes või mõlemas 10
otsas või peptikeha aminohappe järjestuse seesmistes piirkondades. Ühes või
mõlemas otsas olevate jääkidega lisatavate variantide seas võivad olla näiteks
sulandvalgud ja valgud, mis hõlmavad aminohappe märgiseid või märgistusi.
Lisamisvariantide seas on peptiidid ja peptikehad, kus peptiidi või peptikeha
aminohappe järjestusele või selle fragmendile lisatakse üks või mitu aminohappe 15
jääki.
Leiutise alternatiivsete produktide seas on ka küpsed peptiidid ja peptikehad,
kusjuures liider- või signaaljärjestused eemaldatakse ning saadud proteiinidel on
täiendavad amino-otsa jäägid, kus aminohapped võivad olla looduslikud või
mittelooduslikud. Võimalikuks peetakse aminohappe positsioonil -1 (Met-1-20
peptikeha) täiendava metionüüljäägiga spetsiifilisi sideaineid (nagu peptikehad),
nagu ka positsioonidel -2 ja -1 (Met-2-Lys-1-) täiendava metioniini ja lüsiini jäägiga
spetsiifilisi sideaineid. Täiendava Met, Met-Lys, Lys jäägiga (üldiselt üks või mitu
põhijääki) variandid on eriti kasulikud täiustatud rekombinantse proteiini
tootmiseks bakteri peremeesrakkudes. 25
Leiutis hõlmab ka spetsiifilise sideaine variante, millel on täiendavad aminohappe
jäägid, mis tekivad spetsiifiliste ekspressioonisüsteemide kasutamisest. Näiteks
kommertsiaalselt kättesaadavate vektorite, mis ekspresseerivad soovitud
polüpeptiidi glutatioon-S-transferaasi (GST) sulandprodukti osana, kasutamine
annab soovitud polüpeptiidi, millel on täiendav glütsiini jääk aminohappe 30
positsioonil -1 pärast GST komponendi lõhustamist soovitud polüpeptiidist.
EE - EP1615952 B1 26
Võimalikuks peetakse ka variante, mis tekivad ekspressiooni tagajärjel teistes
vektorsüsteemides, sealhulgas need, kus polühistidiini märgised on kaasatud
aminmohappe järjestusse tavaliselt järjestuse karboksü- ja/või aminootsa.
Lisamisvariantide seas on sulandvalgud, kus peptiidi või peptikeha amino- ja/või
karboksüots ühendatakse teisele polüpeptiidile, selle fragmendile või 5
aminohapetele, mida tavaliselt ei peeta mingi spetsiifilise proteiini järjestuse osaks.
Taoliste sulandvalkude näited on immunogeensed polüpeptiidid, pika ringleva
poolestusajaga nagu immunoglobuliini konstantsed piirkonnad, markervalgud,
valgud või polüpeptiidid, mis lihtsustavad soovitud peptiidi või peptikeha järjestuste
puhastamist, ning polüpeptiidid, mis soodustavad multimeersete proteiinide 10
moodustumist (nagu leutsiiniharu motiivid, mis on dimeeri
moodustumises/stabiilsuses olulised).
Seda tüüpi lisamisvariant hõlmab tavaliselt kogu või märkimisväärset osa, mis on
N- või C-otsale ühendatud, looduslikust molekulist kuni kogu või osa teist
polüpeptiidi. Näiteks sulandvalgud rakendavad tavaliselt liiderjärjestusi teistest 15
liikidest, et võimaldada valgu rekombinantset ekspressiooni heteroloogses
peremeesorganismis. Järgmine kasulik sulandvalk hõlmab immunoloogiliselt
aktiivse domeeni nagu antikeha epitoop lisamist, et lihtsustada sulandvalgu
puhastamist. Lõhestamiskoha kaasamine sulamispunktis või selle lähedal
lihtsustab välise polüpeptiidi eraldamist pärast puhastamist. Teised kasulikud 20
ühendamised hõlmavad funktsionaaldomeenide ühendust nagu ensüümidest
pärinevad aktiivsed kohad, glükosüleerimise domeenid, rakulised sihtsignaalid või
transmembraani piirkonnad.
Leidub erinevaid kommertsiaalselt kättesaadavaid sulandvalgu ekspressiooni
süsteeme, mida võib käesolevas leiutises kasutada. Eriti kasulike süsteemide 25
seas on muuhulgas glutatioon-S-transferaasi (GST) süsteem (Pharmacia),
maltoosi siduva valgu süsteem (NEB, Beverley, MA), FLAG süsteem (IBI, New
Haven, CT) ning 6xHis süsteem (Qiagen, Chatsworth, CA). Need süsteemid
suudavad anda rekombinantseid peptiide ja/või peptikehasid, millel on ainult väike
arv lisa aminohappeid, mis vähetõenäoliselt peptiidi või peptikeha aktiivsust 30
oluliselt mõjutavad. Näiteks nii FLAG süsteem kui ka 6xHis süsteem lisavad ainult
lühikesi järjestusi, millest kumbki on teadaolevalt vähese antigeensusega ja mis ei
EE - EP1615952 B1 27
mõjuta ebasoodsalt polüpeptiid voltumist selle looduslikuks konformatsiooniks.
Järgmine N-otsa ühildamine, mida kasulikuks peetakse, on Met-Lys dipeptiidi
ühildamine valgu või peptiidide N-otsa piirkonnas. Taoline ühildamine võib anda
soodsat kasvu valgu ekspressioonis või aktiivsuses.
Teised fusioonsüsteemid annavad polüpeptiidi hübriide, kus sulandpartner 5
soovitud peptiidist või peptikehast soovitatavalt eemaldatakse. Teatud variandis on
sulandpartner rekombinantsele peptikehale ühendatud peptiidi järjestusega, mis
sisaldab proteaasile spetsiifilist äratundmisjärjestust. Sobivate järjestuste näited on
need, mida Tobacco Etch Virus proteaas (Life Technologies, Gaithersburg, MD)
või faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA) ära tunneb. 10
Leiutis pakub ka sulandpolüpeptiide, mis sisaldavad käesoleva leiutise kogu või
osa peptikeha või peptiidi koos kärbitud koefaktoriga (truncated tissue factor tTF).
tTF on vaskulaarne märklaudaine, mis hõlmab inimese koagulatsiooni sisaldava
proteiini kärbitud kuju, mis omakorda toimib kasvaja veresoonte hüübiva ainena,
nagu on kirjeldatud USA patentide nr 5,877,289; 6,004,555; 6,132,729; 6,132,730; 15
6,156,321; ja Euroopa patendis nr EP 0988056. tTF ühendamine anti-Ang-2
peptikehale või peptiidile või nende fragmentidele lihtsustab anti-Ang-2
toimetamist sihtrakkudesse.
Asendusvariantide seas on need peptiidid ja peptikehad, kus üks või mitu
aminohappe jääki eemaldatakse ja asendatakse ühe või mitme alternatiivse 20
aminohappega, mis võivad esineda looduslikult või mittelooduslikult.
Asendusvariandid loovad peptiide või peptikehasid, mis on „sarnased“ algsele
peptiidile või peptikehale nii, et neil kahel molekulil on teatud protsendihulgal
identseid aminohappeid. Asendusvariantide seas on 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15,
20, 25 või 30 aminohappe asendused peptiidis või peptikehas, kusjuures 25
asenduste arv võib peptiidi või peptikeha aminohapetest moodustada kuni kümme
protsenti või rohkem. Asendused võivad loomult olla konservatiivsed, ent leiutis
hõlmab ka mitte-konservatiivseid asendusi ja ka mittelooduslikke aminohappeid.
Seonduvate peptiidide ja peptikehade identsust ja sarnasust saab teadaolevate
meetoditega lihtsalt arvutada. Taoliste meetodite seas on muuhulgas need, mida 30
on kirjeldatud raamatutes Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., toim.,
EE - EP1615952 B1 28
Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and
Genome Projects, Smith, D.W., toim., Academic Press, New York (1993);
Computer Analysis of Sequence Data, 1. osa, Griffin, A.M., and Griffin, H.G.,
toim.-d, Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular
Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, 5
Gribskov, M. and Devereux, J., toim.-d, M. Stockton Press, New York (1991); ning
Carillo et al, ajakirjas SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).
Kahe peptiidi või polüpeptiidi või ühe polüpeptiidi ja peptiidi seotuse või identsuse
protsendimäära tuvastamise meetodid on kujundatud andma suurimat sobivust
testitud järjestuste vahel. Identsuse tuvastamise meetodeid on kirjeldatud avalikult 10
kättesaadavates arvutiprogrammides. Kahe järjestuse vahelise identsuse
tuvastamise arvutiprogrammi meetodid hõlmavad muuhulgas GCG programmi
paketti, sealhulgas GAP (Devereux et al, Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984);
Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP,
BLASTN, ning FASTA (Altschul et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). BLASTXi 15
programm on avalikult kättesaadav USA Riikliku Biotehnoloogia Informatsiooni
Keskuselt (NCBI) ja teistest allikatest (BLAST Manual, Altschul et al
NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, supra (1990)). Identsuse
tuvastamiseks võib ka kasutada tuntud Smith-Watermani algoritmi.
Kahe aminohappe järjestuse reastamiseks mõeldud teatud kohakuti 20
reastusskeemide tulemuseks võib olla kahe järjestuse ainult lühikese ala
sobitamine ning sellel väiksel reastatud alal võib olla väga kõrge järjestuse
identsus, kuigi kahe täispika järjestuse vahel ei ole märkimisväärset seost.
Seetõttu on teatud variantides valitud reastusmeetodi (GAP programm)
tulemuseks reastus, mis katab vähemalt kümme protsenti võrreldava sihtmärgist 25
polüpeptiidi täispikkusest, st vähemalt 40 külgnevat aminohapet, kus võrreldakse
vähemalt 400 aminohappe järjestust, 30 külgnevat aminohapet, kus võrreldakse
vähemalt 300 kuni umbes 400 aminohappe järjestust, vähemalt 20 külgnevat
aminohapet, kus võrreldakse vähemalt 200 kuni umbes 300 aminohappe
järjestust, ning vähemalt 10 külgnevat aminohapet, kus võrreldakse vähemalt 30
umbes 100 kuni 200 aminohappe järjestust.
EE - EP1615952 B1 29
Näiteks arvutialgoritmi GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin,
Madison, WI) kasutades reastatakse kaks polüpeptiidi, mille jaoks protsentides
järjestust on vaja tuvastada, nende vastavate aminohapetega optimaalseks
sobivuseks („sobitatud ulatus“, nagu on algoritmiga määratletud). Teatud
variantides kasutatakse koos algoritmiga vahede avamise karistust (gap opening 5
penalty) (mida tavaliselt arvutatakse kui 3x keskmine diagonaal; „keskmine
diagonaal“ on kasutatava võrdlusmaatriksi diagonaali keskmine; „diagonaal“ on
arv või number, mis on igale sobilikule aminohappe paarile teatud võrdlusmaatriksi
poolt määratud) ja vahede pikendamise karistust (gap extension penalty) (mis on
tavaliselt 1/10 korda vahede avamise karistus) ning võrdlusmaatriksit nagu PAM 10
250 või BLOSUM 62. Algoritm kasutab ka standardset võrdlusmaatriksit (vaata
Dayhoff et al, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) PAM 250
võrdlusmaatriksi jaoks; Henikoff et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919
(1992) BLOSUM 62 võrdlusmaatriksi jaoks).
Polüpeptiidi järjestuse võrdluseks mõeldud parameetrite seas on järgnev: 15
algoritm: Needleman et al, J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970);
võrdlusmaatriks: BLOSUM 62 Henikoffilt et al, supra (1992);
vahe karistus: 12
vahe pikkuse karistus: 4
sarnasuse piir: 0 20
GAPi programm võib ülaltoodud parameetritega tõhus olla. Teatud variantides on
eespool mainitud parameetrid polüpeptiidi võrdlusteks mõeldud vaikimisi
parameetrid (kus ei ole otsa vahedele mõeldud karistust) GAPi algoritmi
kasutades.
Polünukleotiidi molekuli järjestusele mõeldud parameetrite (vastupidiselt 25
aminohappe järjestusele) võrdluste seas on järgnev:
algoritm: Needleman et al, supra (1970);
võrdlusmaatriks: sobivused = +10, mittesobivused = 0
vahe karistus: 50
EE - EP1615952 B1 30
vahe pikkuse karistus: 3
GAPi programm võib ülaltoodud parameetritega tõhus olla. Eespool mainitud
parameetrid on polünukleotiidi molekuli võrdluste vaikimisi parameetrid.
Kasutada võib teisi näidisalgoritme, vahe avamise karistusi, vahe pikendamise
karistusi, võrdlusmaatrikseid, sarnasuspiire jne, sealhulgas neid, mis on esitatud 5
Wisconsin Package’i programmi juhendis, 9. versioon, september, 1997.
Konkreetsed sooritatavad valikud on antud valdkonnas pädevatele isikutele ilmsed
ning sõltuvad tehtavast spetsiifilisest võrdlusest nagu DNA-DNA-le, valk-valgule,
valk-DNA-le ning täiendavalt sellest, kas võrdlus tehakse järjestuste teatud
paaride (mille puhul on üldjuhul eelistatud GAP või BestFit) või ühe järjestuse ja 10
järjestuste laia andmebaasi (mille puhul on eelistatud FASTA või BLASTA) vahel.
Siin kasutatud kakskümmend tavapärast aminohapet ja nende lühendit järgivad
tavapärast kasutust. Vaata Immunology: A Synthesis (2. köide, E. S. Golub and D.
R. Gren, toim.-d, Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), mis on siia igal
otstarbel viidetena kaasatud. 15
Aminohapetel võib olla kas L- või D-stereokeemia (välja arvatud Gly, mis ei ole L
ega D) ning käesoleva leiutise polüpeptiidid ja koostised võivad sisaldada
stereokeemia kombinatsioone. Ent eelistatakse L stereokeemiat. Leiutis pakub ka
ümberpööratud molekule, kus amino-ots aminohapete karboksü-otsa järjestusele
on vastupidine. Näiteks normaalse järjestusega X1-X2-X3 molekul oleks 20
ümberpööratult X3-X2-X1. Leiutis pakub veel retro-ümberpööratud molekule, kus
nagu eespoolgi on amino-ots aminohapete karboksü-otsa järjestusele
ümberpööratud ning jäägid, mis on tavaliselt „L“-enantiomeerd, muudetakse „D“-
stereoisomeeri kujule.
Kahekümne tavapärase aminohappe, mitteloodusliku aminohappe nagu α-, α-25
diasendatud aminohappe, N-alküül aminohappe, piimhappe ja teiste
mittetavapäraste aminohapete stereoisomeerid (nt D-aminohapped) võivad olla ka
sobivad komponendid käesoleva leiutise polüpeptiidide jaoks. Mittetavapäraste
aminohapte seas on muuhulgas: aminoadipiinhape, beeta-alaniin, beeta-
aminopropioonhape, aminobutüürhape, piperidiinhape, aminokaproonhape, 30
EE - EP1615952 B1 31
aminoheptaanhape, aminoisobutüürhape, aminopimelhape, diaminobutüürhape,
desmosiin (desmosine), diaminopimelhape, diaminopropioonhape, N-etüülglütsiin,
N-etüülaspargiin, hüdroksülüsiin allo-hüdroksülüsiin, hüdroksüproliin,
isodesmosiin, allo-isoleutsiin, N-metüülglütsiin, sarkosiin, N-metüülisoleutsiin, N-
metüülvaliin, norvaliin, norleutsiin, oritiin, 4-hüdroksüproliin, γ-karboksüglutamaat, 5
ε-N,N,N-trimetüüllüsiin, ε-N-atsetüüllüsiin, O-fosfoseriin, N-atsetüülseriin, N-
formüülmetioniin, 3-metüülhistidiin, 5-hüdroksülüsiin, σ-N-metüülarginiin ning
teised sarnased aminohapped ja aminohapped (nt 4-hüdroksüproliin).
Samuti, kui ei ole teisiti öeldud, siis ühekiulise polünukleotiidi järjestuste
vasakpoolne ots on 5’ ots; kahekiulise polünukleotiidi järjestuste vasakpoolset 10
suunda nimetatakse 5’ suunaks. Tärkava RNA transkriptide 5’ kuni 3’ lisanduste
suunda nimetatakse transkriptisooni suunaks; järjestuste piirkondi DNA kiul, millel
on samasugune järjestus nagu DNA-l ning mis on RNA transkripti 5’ kuni 5’
otsaga, nimetatakse „vastassuunalisteks järjestusteks“; järjestuse piirkondi DNA-l,
millel on sama järjestus nagu RNA-l ja mis on RNA transkripti 3’ kuni 3’ otsaga, 15
nimetatakse „pärisuunalisteks järjestusteks“.
On mõistetav, et aminohappe jääke saab nende ühiste kõrvalahela omaduste
põhjal jagada klassidesse:
1. neutraalsed hüdrofoobsed: alaniin (Ala; A), valiin (Val; V), leutsiin (Leu;
L), isoleutsiin (Ile; I), proliin (Pro; P), trüptofaan (Trp; W), fenüülalaniin (Phe; 20
F) ja metioniin (Met, M).
2. neutraalsed polaarsed: glütsiin (Gly; G); seriin (Ser; S), treoniin (Thr; T),
türosiin (Tyr; Y), tsüsteiin (Cys; C), glutamiin (Glu; Q), aspargiin (Asn; N) ja
norleutsiin.
3. happelised: asparagiinhape (Asp; D), glutamiinhape (Glu; E); 25
4) aluselised: lüsiin (Lys; K), arginiin (Arg; R), histidiin (His; H).
Vaata Lewin, B., Genes V, Oxford University Press (1994), lk 11.
Konservatiivsete aminohappe asenduste seas võivad olla mittetavapärased
aminohappe jäägid, mis lisatakse tavaliselt pigem peptiidi keemilise sünteesiga kui
sünteesiga bioloogilistes süsteemides. Nende seas on muuhulgas 30
EE - EP1615952 B1 32
peptidomimeetikumid ja aminohappe osade vastupidised või ümberpööratud
kujud. Mittekonservatiivsed asendused võivad hõlmata nendest klassidest ühe
liikme väljavahetamist teise klassi liikme vastu.
Taoliste muudatuste tegemisel võib arvestada aminohapete hüdropaatilist indeksi
(hydropathic index). Igale aminohappele on määratud hüdropaatiline indeks selle 5
hüdrofoobsuse ja laengu omaduste põhjal. Nendeks on: isoleutsiin (+4,5), valiin
(+4,2), leutsiin (+3,8), fenüülalaniin (+2,8), tsüsteiin/tsüstiin (+2,5), metioniin (+1,9),
alaniin (+1,8), glütsiin (- 0,4), treoniin (-0,7), seriin (-0,8), trüptofaan (-0,9), türosiin
(-1,3), proliin (-1,6), histidiin (-3,2), glutamaat (-3,5), glutamiin (-3,5), aspartaat (-
3,5), asparagiin (-3,5), lüsiin (-3,9) ja arginiin (-4,5). 10
Antud valdkonnas tuntakse hüdropaatilise aminohappe indeksi olulisust
bioloogilise funktsiooni pakkumisel proteiinile. Kyte et al, J. Mol. Biol., 157:105-131
(1982). On teada, et teatud aminohappeid võib asendada mõne teise
aminohappega, millel on sarnane hüdropaatiline indeks või näitaja, kuid säilitada
sarnast bioloogilist toimet. Hüdropaatilise indeksi põhjal muudatuste tegemisel 15
võib kaasata aminohapete asendused, mille hüdropaatilised indeksid on
vahemikus ±2. Kaasata võib ka neid, mis on vahemikus ±1, ning neid, mis on
vahemikus ±0,5.
Samuti on antud valdkonnas mõistetav, et sarnaste aminohapete asendust saab
tõhusalt teha hüdrofiilsuse põhjal, eriti kus sedasi loodud bioloogiliselt 20
funktsionaalne peptikeha või peptiid on mõeldud immunoloogilistes variantides
kasutamiseks, nagu on see käesoleval juhul. Teatud variantides korreleerub valgu
suurim kohalik keskmine hüdrofiilsus, nagu määravad nende kõrvalasuvate
aminohapete hüdrofiilsus, selle immunogeensuse ja antigeensusega, st valgu
bioloogilise omadusega. 25
Järgnevad hüdrofiilsuse väärtused on määratud nendele aminohappe jääkidele:
arginiin (+3,0), lüsiin (+3,0), aspartaat (+3,0±1), glutamaat (+3,0±1), seriin (+0,3),
asparagiin (+0,2), glutamiin (+0,2), glütsiin (0), treoniin (-0,4), proliin (-0,5±1),
alaniin (-0,5), histidiin (-0,5), tsüsteiin (-1,0), metioniin (-1,3), valiin (-1,5), leutsiin (-
1,8), isoleutsiin (-1,8), türosiin (-2,3), fenüülalaniin (-2,5) ja trüptofaan (-3,4). 30
Sarnaste hüdrofiilsuse väärtuse põhjal muudatuste tegemisel võib kaasata
EE - EP1615952 B1 33
aminohapete asendused, kus hüdrofiilsuse väärtused võivad olla vahemikus ±2,
need, mis võivad olla vahemikus ±1, ning need, mis on vahemikus ±0,5. Samuti
võib epitoope primaarsete aminohappe järjestustest tuvastada hüdrofiilsuse
põhjal. Neid piirkondi nimetatakse ka „epitoopide tuumpiirkondadeks“.
Aminohappe asenduste näited on esitatud tabelis 2 allpool. 5
Tabel 2
Aminohappe asendused
Algsed jäägid Asenduste näidised Eelistatud asendused
Ala Val, Leu, Ile Val
Arg Lys, Gln, Asn Lys
Asn Gln, Glu, Asp Gln
Asp Glu, Gln, Asp Glu
Cys Ser, Ala Glu
Gln Asn, Glu, Asp Asn
Glu Asp, Gln, Asn Asp
Gly Pro, Ala Ala
His Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe,
norleutsiin
Leu
Leu Norleutsiin, Ile, Val, Met,
Ala, Phe
Ile
Lys Arg, 1,4 diamino-
butüürhape, Gln, Asn
Arg
Met Leu, Phe, Ile Leu
Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr, Ala, Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr, Phe Tyr
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala,
norleutsiin
Leu
EE - EP1615952 B1 34
Antud valdkonnas pädev isik suudab teadaolevate võtetega välja selgitada
polüpeptiidi sobivad variandid, nagu on siin esitatud. Antud valdkonnas pädev
isiku oskab tuvastada molekulide sobivad piirkonnad, mida võib aktiivsust
hävitamata muuta, sihtides piirkondi, mida ei peeta aktiivsuse jaoks oluliseks.
Tuvastada saab molekulide jäägid ja osad, mida säilitatakse sarnaste peptiidide 5
või polüpeptiidide seas. Isegi piirkonnad, mis on bioloogiliseks aktiivsuseks või
struktuuriks olulised, võivad läbida konservatiivseid aminohappe asendusi
bioloogilist aktiivsust hävitamata või polüpeptiidi struktuuri ebasoodsalt
mõjutamata.
Lisaks, antud valdkonnad pädev isik suudab analüüsida struktuuri-funktsiooni 10
uuringuid, mis tuvastavad jääke sarnastes polüpeptiidides, mis on aktiivsuse või
struktuuri jaoks olulised. Taolise võrdluse valguses on võimalik prognoosida
aminohappe jääkide olulisust proteiinis, mis vastab sarnastes proteiinides
aktiivsuse või struktuuri jaoks olulistele aminohappe jääkidele. Antud valdkonnas
pädev isik võib valida keemiliselt sarnased aminohappe asendused taoliste 15
prognoositud oluliste aminohappe jääkide jaoks.
Antud valdkonnas pädev isik oskab ka analüüsida kolmedimensioonilist struktuuri
ja aminohappe järjestust selle struktuuriga seoses sarnastes polüpeptiidides.
Taolise informatsiooni valguses võib antud valdkonnas pädev isik prognoosida
antikeha aminohappe jääkide järjestust selle kolmedimensioonilise struktuuriga 20
seoses. Antud valdkonnas pädev isik võib otsustada mitte teha radikaalseid
muudatusi aminohappe jääkidele, mis eeldatavasti on proteiini pinnal, kuna
taolised jäägid võivad osaleda olulistes toimingutes teiste molekulidega. Lisaks
võib antud valdkonnas pädev isik luua testvariandid, mis sisaldavad üksiku
aminohappe asendust igal soovitud aminohappe jäägil. Seejärel võib variante 25
uurida antud valdkonnas pädevatele isikutele teada aktiivsusanalüüsidega. Taolisi
variante saab kasutada sobivate variantide kohta informatsiooni kogumiseks. Kui
näiteks avastatakse, et konkreetse aminohappe jäägile tehtud muudatuse
tagajärjel hävines, soovimatult vähenes või tekkis soovimatu aktiivsus, võib taolise
muutusega variante vältida. Teisisõnu, taoliste tavapäraste katsetega kogutud 30
informatsiooni põhjal võib antud valdkonnas pädev isik lihtsalt tuvastada
EE - EP1615952 B1 35
aminohapped, kus lisaasendusi eraldi või koos teiste mutatsioonidega tuleks
vältida.
Terve hulk teaduspublikatsioone on pühendatud sekundaarstruktuuri
prognoosimisele. Vaata Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou
et al, Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113(2): 211-5
222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978);
Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 ning Chou et al, Biophys. J., 26:367-
384 (1979). Lisaks on praegu kättesaadavad ka arvutiprogrammid, et
sekundaarstruktuuri prognoosimisele kaasa aidata. Üks moodus
sekundaarstruktuuri prognoosimiseks põhineb homoloogia mudeldamisel. Näiteks 10
kahel polüpeptiidil või valgul, mille järjestuse identsus on suurem kui 30% või
sarnasus suurem kui 40%, on sageli sarnased strukturaalsed topoloogiad.
Valkude strukturaalse andmebaasi (PDB) hiljutine areng on võimaldanud
sekundaarstruktuuri paremat prognoositavust, sealhulgas voltide potentsiaalne arv
polüpeptiidis või valgu struktuuris. Vaata Holm et al, Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-15
247 (1999). On soovitatud (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376
(1997)), et teatud polüpeptiidis või valgus on piiratud arv volte ning kui jõutakse
struktuuride kriitilise numbrini, on strukturaalne prognoosimine tunduvalt täpsem.
Sekundaarstruktuuri prognoosimise lisameetodid hõlmavad „keermestamist“
(threading) (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al, 20
Structure, 4(1):15-19 (1996)), „profiili analüüsi“ (Bowie et al, Science, 253:164-170
(1991); Gribskov et al, Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al, Proc.
Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)) ning „evolutsioonilist sidet“ (vaata Holm,
supra (1999), ja Brenner, supra (1997)).
Teatud variantides on peptikeha teisendite seas glükosüleerimise variandid, milles 25
peptikehale on lisatud üks või mitu glükosüleerimise kohta nagu N-seotud
glükosüleerimise koht. N-seotud glükosüleerimise kohale on iseloomulik järjestus:
Asn-X-Ser või Asn-X-Thr, kusjuures aminohappe jääk tähistusega X võib olla mis
tahes aminohappe jääk, välja arvatud proliin. Aminohappe jääkide asendamine või
lisamine selle järjestuse loomiseks võimaldab potentsiaalset uut kohta N-seotud 30
süsivesiku ahela lisamiseks. Teisel juhul asendused, mis selle järjestuse
elimineerivad, eemaldavad olemasoleva N-seotud süsivesiku ahela. Samuti
EE - EP1615952 B1 36
pakutakse ümberseatud N-seotud süsivesiku ahelaid, kus üks või mitu N-seotud
glükosüleerimise kohta (tavaliselt need, mis esinevad looduslikult) on elimineeritud
või luuakse üks või mitu uut N-seotud kohta.
Leiutis pakub ka „derivaate“, mille seas on peptikehad, millel on modifikatsioonist
erinevad või sellele lisanduvad aminohappe jääkide täiendused, kustutused või 5
asendused. Soovitatavalt on modifikatsioonid iseloomult kovalentsed ja hõlmavad
näiteks keemilist sidet polümeeride, lipiidide, teiste orgaaniliste ja anorgaaniliste
osadega. Leiutise derivaate võib valmistada peptikeha tsirkuleeriva poolestusea
tõstmiseks või luua peptikeha sihtimisvõime täiustamiseks soovitud rakkudele,
kudedele või organitele. 10
Näidisderivaatide seas on osad, milles on tehtud üks või mitu järgnevat
modifikatsiooni:
• üks või mitu peptidüüli [-C(O)NR-] ühendust (sidet) on asendatud mitte-
peptidüüli ühendusega nagu -CH2-karbamaadi ühendus [-CH2-OC(O)NR-],
fosfonaadi ühendus, -CH2- sulfoonamiidi [-CH2-S(O)2NR-] ühendus, uurea [-15
NHC(O)NH-] ühendus, -CH2-sekundaarse amiini ühendus või alküülitud
peptidüüli ühenduse [-C(O)NR6-, kus R6 on madalam alküül];
• peptiidid, kusjuures N-ots on derivatiseeritud -NRR1 rühmale, -NRC(O)R
rühmale, -NRC(O)OR rühmale, -NRS(O)2R rühmale, -NHC(O)NHR
rühmale, kus R ja R1 on vesinik või madalam alküül tingimusel, et R ja R1 ei 20
ole mõlemad vesinik; suktsiinimiidi rühmale, bensüüloksükarbonüül-NH-
rühmale, millel on 1 kuni 3 asendajat fenüülringil, mis valitakse rühmast,
kuhu kuuluvad madalam alküül, madalam alkoksü, kloor ja broom; ning
• peptiidid, kusjuures vaba C-ots derivatiseeritakse -C(O)R2-le, kus R2
valitakse rühmast, kuhu kuuluvad madalam alkoksü, ja -NR3R4-le, kus R3 ja 25
R4 valitakse iseseisvana rühmast, kuhu kuuluvad vesinik ja madalam alküül.
„Madalam“ all on mõeldud rühma, millel on 1 kuni 6 süsiniku aatomit.
Lisaks võib leiutise polüpeptiididel või koostistel rakendada individuaalsete
aminohapete modifikatsioone, pannes sihtmärgist peptiidi aminohappe jäägid
EE - EP1615952 B1 37
reageerima orgaanilise derivatiseeriva ainega, mis suudab valitud kõrvalahelaga
või terminaaljääkidega reageerida. Järgnev on näidis:
Lüsinüüli ja amino terminaalsed jäägid võib panna reageerima suktsiin- või teiste
karboksüülhappe anhüdriididega. Nende ainetega derivatiseerimise toimel
pöördub ümber lüsinüüli jääkide laeng. Alfa-aminot sisaldavate jääkide 5
derivatiseerimiseks mõeldud teiste sobivate reagentide seas on imidoestrid nagu
metüül-pikoliinimidaat (methyl picolinimidate), püridoksaal-fosfaat, püridoksaal,
kloroboorhüdriid, trinitrobenseensulfoonhape, O-metüüliso-uurea, 2,4-
pentaandioon ja transaminaas-katalüüsitud reaktsioon glüoksülaadiga.
Arginüüli jääke võib modifitseerida ühe või mitme tavapärase reagendiga 10
reageerimisel, nende hulgas fenüülglüoksaaliga, 2,3-butaandiooniga, 1,2-
tsükloheksaandiooniga ja ninhüdriiniga. Arginiini jääkide derivatiseerimine eeldab,
et guanidiini funktsionaalrühma kõrge pKa tõttu toimuks reaktsioon aluselisteks
tingimustes. Lisaks võib neid reagente panna ka reageerima nii lüsiini rühmade kui
ka arginiini guanidino-rühmaga. 15
Türosüüli jääkide konkreetset modifikatsiooni iseennast on laialdaselt uuritud, kus
erilise huvi all on olnud spketraalmärgiste kasutamine türosüüli jääkides
aromaatsete diasooniumühenditega või tetranitrometaaniga reageerimisel. Kõige
sagedamini võib kasutada N-atsetüülimidasooli ja tetranitrometaani, et
moodustada vastavalt O-atsetüül-türosüüli liike ja 3-nitro derivaate. 20
Karboksüül-kõrvalrühmi (aspartüül või glutamüül) võib selektiivselt modifitseerida
karbodiimiididega (R’=N=C=N-R’) nagu 1-tsükloheksüül-3-(2-morfolinüül-(4-etüül)
karbodiimiid või 1-etüül-3-(4-asoonia-4,4-dimetüülpentüül) karbodiimiid
reageerimisel. Lisaks võib aspartüüli ja glutamüüli jäägid asparginüüli ja
glutaminüüli jääkideks konverteerida ammooniumioonidega reageerimisel. 25
Glutaminüüli ja asparginüüli jäägid deamideeritakse sageli vastavateks glutamüüli
ja aspartüüli jääkideks. Teisel juhul võib need jäägid deamideerida mõõdukalt
happelistes tingimustes. Nende jääkide kumbki vorm jääb antud leiutise ulatusse.
Bifunktsionaalsete ainetega derivatiseerimine on kasulik peptiidi või nende
funktsionaalsete derivaatide ristsidumiseks veeslahustuvaks tugimaatriksiks või 30
EE - EP1615952 B1 38
teisteks makromolekulaarseteks kanduriteks. Tavaliselt kasutatavate ristsiduvate
ainete seas on nt 1,1-bis(diasoatsetüül)-2-fenüületaan, glutaaraldehüüd, N-
hüdroksüsuktsiinimiidi estrid, näiteks 4-asidosalitsüülhappega estrid,
homobifunktsionaalsed imidoestrid, sealhulgas disuktsiinimidüüli estrid nagu 3,3’-
ditiobis (suktsiinimidüülpropionaat) ning bifunktsionaalsed maleimiidid nagu bis-N-5
maleimido-1,8-oktaan. Derivatiseerivad ained nagu metüül-3-[(p-asidofenüül)
ditio]propioimidaat annavad saaduseks fotoaktiveeritavad (photoactivatable)
vahesaadused, mis suudavad valguse juuresolekul ristsidemeid moodustada.
Teisel juhul võib proteiinide immobiliseerimiseks rakendada reaktiivseid
veeslahustuvaid matriitse nagu tsüanogeen bromiidiga aktiveeritud süsivesikud ja 10
reaktiivsed substraadid, mida on kirjeldatud USA patentides nr 3,969,287,
3,691,016, 4,195,128, 4,247,642, 4,229,537 ja 4,330,440.
Teiste võimalike modifikatsioonide seas on proliini ja lüsiini hüdroksüülimine,
serüül- või treonüül-jääkide hüdroksüülrühmade fosforüülimine, väävliaatomi
oksüdeerimine Cys sees, lüsiini, arginiini ja histidiini kõrvalahelate 15
alfaaminorühmade metüüli (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecule
Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, lk 79-86 (1983)), N-terminaalse
amiini atsetüülimine ning mõnel juhul ka C-terminaalsete karboksüülrühmade
amideerimine.
Taolised derivatiseeritud osad soovitatavalt parandavad ühendite ühte või mitut 20
omadust, sealhulgas anti-angioneenset toimet, lahustuvust, absorptsiooni,
bioloogilist poolestusiga ja muud sarnast. Alternatiivselt võivad derivatiseeritud
osad anda ühendeid, millel on samad või põhiliselt samad tunnused ja/või
omadused nagu derivatiseerimata ühendil. Antud osad võivad teisel juhul ühendite
ja muu sarnase mis tahes ebasoodsad kõrvalmõjud kõrvaldada või neid 25
nõrgestada.
Käesoleva leiutise ühendeid võib muuta ka DNA tasemel. Ühendi mis tahes osa
DNA järjestust võib muuta koodoniteks, mis valitud peremeesrakuga paremini
ühtivad. Eelistatava peremeesraku E. coli jaoks teatakse optimeeritud koodoneid.
Koodoneid võib asendada, et eemaldada restriktsioonisaite või kaasata vaikivaid 30
restriktsioonisaite, mis võivad valitud peremeesrakus DNA töötlemisel abiks olla.
Kanduri, linkeri ja peptiidi DNA järjestusi võib modifitseerida, et need hõlmaks mis
EE - EP1615952 B1 39
tahes eelnevaid järjestuse muutusi. Järelikult kehtivad kõik siin käsitletud
modifikatsioonid, asendused, derivatiseerimised jne võrdselt käesoleva leiutise
kõikide aspektidega, muuhulgas peptiididele, peptiidi dimeeride ja multimeeride,
linekrite ja kanduritega.
Lisaks võib antud valdkonnas pädev isik vaadata struktuuri-funktsiooni uuringuid, 5
mis tuvastavad aktiivsuse või struktuuri jaoks olulisi jääke sarnastes peptiidides.
Taolise võrdluse valguses on võimalik prognoosida peptiidis aminohappe jääkide
olulisust, mis vastavad sarnastes peptiidides aktiivsuse või struktuuri jaoks olulisi
aminohappe jääkidele. Antud valdkonnas pädev isik võib peptiidide taolise
prognoositud oluliste aminohappe jääkide jaoks valida keemiliselt sarnase 10
aminohappe asendused.
Antud valdkonnas pädev isik võib analüüsida ka kolmedimensioonilist struktuuri ja
aminohappe järjestust seoses struktuuriga sarnastes polüpeptiidides. Antud
informatsiooni valguses võib antud valdkonnas pädev isik prognoosida peptiidi
aminohappe jääkide järjestust selle kolmedimensioonilise struktuuri suhtes. Antud 15
valdkonnas pädev isik võib otsustada mitte teha radikaalseid muudatusi
aminohappe jääkidele, mis prognoositult on proteiini pinnal, kuna taolised jäägid
võivad osaleda olulistes interaktsioonides teiste molekulidega. Lisaks võib antud
valdkonnas pädev isik koostada testvariante, mis sisaldavad üksiku aminohappe
asendust igal soovitud aminohappe jäägil. Variante võib uurida antud valdkonnas 20
pädevatele isikutele teadaolevate aktiivsusanalüüsidega. Taolisi andmeid võib
kasutada informatsiooni kogumiseks sobivate variantide kohta. Näiteks kui
avastatakse, et konkreetsele aminohappe jäägile tehtud muudatuse tulemuseks oli
hävitatud, ebasoodsalt alanenud võib sobimatu toime, tuleks taolise muudatusega
variante vältida. Teisisõnu, taoliste tavapäraste katsetega kogutud informatsiooni 25
põhjal saab antud valdkonnas pädev isik lihtsalt tuvastada aminohapped, kus
täiendavaid asendusi eraldi või koos teiste mutatsioonidega tuleks vältida.
Hulga teaduslikke publikatsioone on pühendatud sekundaarstruktuuri
prognoosimisele. Vaata Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou
et al, Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113(2): 211-30
222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978);
Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 ning Chou et al, Biophys. J., 26: 367-
EE - EP1615952 B1 40
384 (1979). Veelgi enam, praegu on kättesaadavad ka arvutiprogrammid, et aidata
kaasa sekundaarstruktuuri prognoosimisele. Üks moodus sekundaarstruktuuri
prognoosimiseks põhineb homoloogia modelleerimisel. Näiteks kahel polüpeptiidil
või valgul, mille järjestuse identsus on suurem kui 30% või sarnasus suurem kui
40%, on sageli sarnased strukturaalsed topoloogiad. Valkude strukturaalse 5
andmebaasi (PDB) hiljutine areng on võimaldanud sekundaarstruktuuri paremat
prognoositavust, sealhulgas voltide potentsiaalne arv polüpeptiidis või valgu
struktuuris. Vaata Holm et al, Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). On
soovitatud (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)), et teatud
polüpeptiidis või valgus on piiratud arv volte ning kui jõutakse struktuuride kriitilise 10
numbrini, on strukturaalne prognoosimine tunduvalt täpsem.
Sekundaarstruktuuri prognoosimise lisameetodid hõlmavad „keermestamist“
(threading) (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al,
Structure, 4(1): 15-19 (1996)), „profiili analüüsi“ (Bowie et al, Science, 253:164-
170 (1991); Gribskov et al, Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al, 15
Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987)) ning „evolutsioonilist sidet“ (vaata
Holm, supra (1999), ja Brenner, supra (1997)).
Leiutis hõlmab ka veel tuletatud spetsiifilisi sideaineid, nt peptikehasid, mis on
kovalentselt modifitseeritud, et need sisaldaks ühte või mitut vees lahustuvat
polümeerühendust nagu polüetüleenglükool, polüoksüetüleenglükool või 20
polüpropüleenglükool, nagu on kirjeldatud USA patentides nr: 4,640,835,
4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 ja 4,179,337. Ent teiste antud
valdkonnas kasulike polümeeride seas on monometoksü-polüetüleenglükool,
dekstraan, tselluloos või teised süsivesikupõhised polümeerid, polü-(N-vinüül
pürrolidoon)-polüetüleenglükool, propüleenglükooli homopolümeerid, 25
polüproüleenoksiidi/ etüleenoksiidi kopolümeer, polüoksüetüülitud polüoolid (nt
glütserool) ja polüvinüülalkoholid ning nende polümeeride segud. Eriti eelistatud
on polüetüleenglükooli (PEG) allüksustega kovalentselt modifitseeritud
peptikehad. Veeslahustuvad polümeerid võivad olla seotud teatud positsioonidel,
näiteks peptikehade amino-otsal, või suvaliselt kinnitunud polüpeptiidi ühele või 30
mitmele kõrvalahelale. PEG-i kasutamist terapeutilise võime tõstmiseks
spetsiifiliste sideainete, nt peptikehade ning eriti humaniseeritud antikehade jaoks
EE - EP1615952 B1 41
on kirjeldatud USA patendis nr 6, 133, 426 Gonzalesele et al, väljastati 17.
oktoobril 2000.
Leiutis peab võimalikuks ka ühendite peptiidi ja/või kanduri portsjoni
derivatiseerimist. Taolised derivaadid võivad parandada ühendite lahustuvust,
absorptsiooni, bioloogilist pooliga ja muud sarnast. Osad võivad veel ka ühendite 5
ja muu sarnaste ebasoodsad kõrvalmõjusid kaotada või neid vähendada.
Näidisderivaatide seas on ühendid, kus:
1. Ühend või selle teatud osa on tsükliline. Näiteks võib peptiidi portsjonit
modifitseerida, et see sisaldaks kahte või rohkem Cys-i jääki (nt linkeris),
mida saaks disulfiidi sideme moodustamisega tsükliliseks teha. 10
2. Ühend on ristseotud või tehtud selliseks, et see suudab molekulide vahel
ristsiduda. Näiteks võib peptiidi portsjonit modifitseerida, et see sisaldaks
ühte Cys-i jääki ning seeläbi suudaks sarnase molekuliga
molekulidevahelise disulfiidi sideme moodustada. Ühend võib ka selle C-
otsa kaudu ristseotud olla. 15
3. Üks või mitu peptidüüli [-C(O)NR-] ühendust (sidet) on asendatud mitte-
peptidüüli sidemega. Mitte-peptidüüli ühenduste näited on -CH2-karbamaat
[-CH2-OC(O)NR-], fosfonaat, -CH2-sulfoonamiid [-CH2-S(O)2NR-], uurea [-
NHC(O) NH-], -CH2-sekundaarne amiin ning alküülitud peptiid [-C(O)NR6-,
kus R6 on madalam alküül]. 20
4. N-ots on derivatiseeritud. Tavaliselt võib N-ots olla atsüülitud või
modifitseeritud asendatud amiiniks. N-terminaalsete tuletatud rühmade
näidete seas on -NRR1 (erineb -NH2-st), -NRC(O)R1, -NRC(O)OR1,-
NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, suktsiinimiid või bensüüloksükarbonüül-NH-
(CBZ-NH-), kusjuures R ja R1 on mõlemad sõltumatuna vesinik või 25
madalam alküül ning fenüülring võib olla asendatud 1 kuni 3 asendajaga,
mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad C1-C4alküül, C1-C4alkoksü, kloor ja
broom.
5. Vaba C-ots on derivatiseeritud. Tavaliselt on C-ots esterdatud või
amideeritud. Näiteks võib kasutada antud valdkonnas kirjeldatud 30
meetodeid, et antud leiutise ühenditele C-otsas lisada (NH-CH2-CH2-NH2)2.
EE - EP1615952 B1 42
Samamoodi võib kasutada antud valdkonnas kirjeldatud meetodeid, et
antud leiutise ühenditele C-otsas lisada -NH2. C-terminaalsete tuletatud
rühmade näidete seas on näiteks -C(O)R2, kusjuures R2 on madalam
alkoksü, või -NR3R4, kusjuures R3 ja R4 on sõltumatuna vesinik või C1-
C8alküül (soovitatavalt C1-C4alküül). 5
6. Disulfiidi side asendatakse teise, soovitatavalt tunduvalt stabiilsema
ristsiduva osaga (nt alküleen). Vaata nt Bhatnagar (supra); Alberts et al,
Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9 (1993).
7. Üks või mitu individuaalset aminohappe jääki on modifitseeritud. Mitmed
derivatiseerivad ained teadaolevalt reageerivad spetsiaalselt valitud 10
kõrvalahelate või terminaalsete jääkidega, nagu on allpool üksikasjalikumalt
kirjeldatud.
Lüsinüüli jääke ja amino-terminaalseid jääke võib panna reageerima suktsiin- või
teiste karboksüülhappe anhüdriididega, mis lüsinüüli jääkide laengu ümber
pööravad. Alfa-aminot sisaldavate jääkide derivatiseerimiseks mõeldud teiste 15
sobivate reagentide seas on imidoestrid nagu metüül pikoliinimidaat,
püridoksaalfosfaat, püridoksaal, kloroboorhüdriid, trinitrobenseensulfoonhape, O-
metüül-isouurea, 2,4 pentaandioon ning tramsaminaas-katalüüsitud reaktsioon
glüoksülaadiga.
Arginüüli jääke võib modifitseerida reageerimisel ühe või koos mitme tavapärase 20
reagendiga, sealhulgas fenüülglüoksaaliga, 2,3-butaandiooniga, 1,2-
tsükloheksaandiooniga ja ninhüdriiniga. Arginüüli jääkide derivatiseerimine eeldab,
et reaktsioon toimuks guanidiini funktsionaalrühma kõrge pKa tõttu aluselistes
tingimustes. Lisaks võivad need reagendid reageerida nii lüsiini rühmade kui ka
arginiini epsilon-amino rühmaga. 25
Türosüüli jääkide spetsiifilist modifikatsiooni on laialdaselt uuritud, kus erilise huvi
all on olnud türosüüli jääkidel spektraalmärgiste kasutamine aromaatsete
diasoonium ühendite või tetranitrometaaniga reageerimisel. Enamasti kasutatakse
N-atsetüülimidasooli ja tetranitrometaani, et moodustada vastavalt O-
atsetüültürosüüli erimeid ja 3-nitro derivaate. 30
EE - EP1615952 B1 43
Karboksüül-kõrvalahela rühmi (aspartüül või glutamüül) võib selektiivselt
modifitseerida karbodiimiididega (R’-N=C=N-R’) reageerimisel nagu 1-
tsükloheksüül-3-(2-morfolinüül-(4-etüül)karbodiimiid või 1-etüül-3-(4-asoonia-4,4-
dimetüülpentüül)karbodiimiid. Lisaks võib aspartüüli ja glutamüüli jäägid
ammooniumioonidega reageerimisel asparginüüli ja glutaminüüli jääkideks 5
konverteerida.
Glutaminüüli ja asparginüüli jäägid võib deamideerida vastavateks glutamüüli ja
aspartüüli jääkideks. Teisel juhul amideeritakse need jäägid mõõdukalt happelistes
tingimustes. Nende jääkide kumbki vorm langeb antud leiutise ulatusse.
Tsüsteinüüli jääke saab asendada aminohappe jääkide või teiste osadega, et kas 10
elimineerida disulfiidi side või, vastupidi, stabiliseerida ristsidet. Vaata nt
Bhatnagar, (supra).
Derivatiseerimine bifunktsionaalsete ainetega on tõhus peptiidide või nende
funktsionaalderivaatide ristsidumisel vees lahustumatuks tugimaatriksiks või
teisteks makromolekulaarseteks kanduriteks. Tavaliselt kasutatavate ristisiduvate 15
ainete seas on nt 1,1-bis(diasoatsetüül)-2-fenüületaan, glutaaraldehüüd, N-
hüdroksüsuktsiinimiidi estrid, näiteks 4-asidosalitsüülhappega estrid,
homobifunktsionaalsed imidoestrid, sealhulgas disuktsiinimidüülestrid nagu 3,3’-
ditiobis(suktsiinimidüülpropionaat) ning bifunktsionaalsed maleimiidid nagu bis-N-
maleimido-1,8-oktaan. Derivatiseerivad ained nagu metüül-3-[(p-20
asidofenüül)ditio]propioimidaat annavad saaduseks fotoaktiveeritavaid
vahesaaduseid, mis suudavad valguse juuresolekul ristsidemeid moodustada.
Teisel juhul rakendatakse proteiini immobiliseerimiseks reaktiivseid
veelahustumatuid matriitse nagu tsüanogeen-bormiidiga aktiveeritud süsivesikud
ja reaktiivseid subtraate, mida on kirjeldatud USA patentides nr 3,969,287, 25
3,691,016, 4,195,128, 4,247,642, 4,229,537 ja 4,330,440.
Süsivesiku (oligosahhariidi) rühmasid võib lihtsalt kinnitada kohtadele, mis
teadaolevalt on glükosüleerimiskohad proteiinides. Tavaliselt kinnitatakse O-
seotud oligosahhariidid seriini (Ser) või treoniini (Thr) jääkidele, samas kui N-
seotud oligosahhariidid kinnitatakse asparagiini (Asn) jääkidele, kui need on osa 30
Asn-X-Ser/Thr järjestusest, kus X võib olla mis tahes aminohape, välja arvatud
EE - EP1615952 B1 44
proliin. X on soovitatavalt üks 19 looduslikult esinevast aminohappest, välja
arvatud proliin. N-seotud ja O-seotud oligosahhariidide ning igas tüübis leiduvate
suhkrujääkide struktuur on erinev. Üht liiki suhkur, mida tavaliselt kummaski
leidub, on N-atsetüül-neuraminiinhape (nimega siaalhape). Siaalhape on tavaliselt
nii N-seotud kui ka O-seotud oligosahhariidide terminaalne jääk ning tänu oma 5
negatiivsele laengule võib see glükosüülitud ühendile happelisi omadusi anda.
Taolise(i) koha(ti) võib lisada antud leiutise ühendite linkeritele ning soovitatavalt
on need polüpeptiidi ühendite (nt rakkudes nagu CHO, BHK, COS) rekombinantse
tootmise käigus raku poolt glükosüülitud. Käesolevaid taolisi kohti võib veel
glükosüülida antud valdkonnas teadaolevate sünteetiliste või poolsünteetiliste 10
protseduuridega.
Teiste võimalike modifikatsioonide seas on proliini ja lüsiini hüdroksüülimine,
serüüli või treonüüli jääkide hüdroksüülrühmade fosforüülimine, väävliaatomi
oksüdeerimine Cys-i sees ning lüsiini, arginiini ja histidiini kõrvalahelate alfa-amino
rühmade metüülimine [Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. 15
H. Freeman & Co., San Francisco), lk 79-86 (1983)].
Käesoleva leiutise ühendeid võib ka DNA tasemel muuta. Ühendi mis tahes osa
DNA järjestust võib muuta koodoniteks, mis valitud peremeesrakuga paremini
ühtivad. Eelistatava peremeesraku E. coli jaoks optimeeritud koodonid on antud
valdkonnas teada. Koodoneid võib asendada, et eemaldada restriktsioonisaite või 20
kaasata vaikivaid restriktsioonisaite, mis võivad valitud peremeesrakus DNA
töötlemisel abiks olla. Kanduri, linkeri ja peptiidi DNA järjestusi võib modifitseerida,
et need hõlmaks mis tahes eelnevaid järjestuse muutusi.
Afiinsuse küpsemine
Käesoleva leiutise teatud variant hõlmab „afiinsusküpseid“ peptiide ja 25
peptikehasid. Antud protseduur peab võimalikuks käesoleva leiutise peptiidide ja
peptikehade afiinsuse või bioaktiivsuse tõstmist faagmeetodi või teiste
selekteerimisvõtete abil. Konsensusjärjestuse (mis luuakse seotud peptiidide
kogumi jaoks) põhjal saab luua suunatud sekundaarsed faagmeetodi kogumid,
milles „tuum“-aminohappeid (mis on tuvastatud konsensusjärjestusest) hoitakse 30
konstantsetena või need on esinemissageduses nihkes. Teisel juhul saab
EE - EP1615952 B1 45
kasutada individuaalset peptiidi järjestust, et luua nihkes suunatud faagmeetodi
kogum. Taoliste kogumite pesemine (panning) võib anda täiustatud seotusega
Ang-2-le või täiustatud bioaktiivsusega peptiidid (mida saab peptikehadeks
konverteerida).
Mitte-peptiidi analoogid/ proteiini mimeetikumid 5
Lisaks on võimalikuks peetud ka peptiidide mitte-peptiidi analooge, mis pakuvad
stabiliseeritud struktuuri või vähendatud biolagunemist. Peptiidi mimeetikumide
analooge saab valmistada valitud inhibeeriva peptiidi põhjal ühe või mitme jäägi
asendamisel mitte-peptiidi osadega. Soovitatavalt lasevad mitte-peptiidi osad
peptiidil säilitada oma looduslikku konformatsiooni või stabiliseerida eelistatud nt 10
bioaktiivset konformatsiooni, mis annab võime ära tunda ja siduda Ang-2. Teatud
aspektis on saadud analoogil/mimeetikumil suurem sidumisafiinsus Ang-2-le.
Peptiididest mitte-pepdiidi mimeetikumide analoogide valmistusmeetodi ühte
näidet on kirjeldanud Nachman et al, Regul. Pept. 57:359-370 (1995). Soovi korral
võib leiutise peptiide modifitseerida näiteks glükosüleerimise, amideerimise, 15
karboksüülimise või fosforüülimisega või leiutise peptiidide happe liitsoolade,
amiidide, estrite, eriti C-terminaalsete estrite ning N-atsüüli derivaatide
valmistamisel. Peptikehasid saab ka modifitseerida, et need peptiidide derivaate
looksid, moodustades kovalentseid või mittekovalentseid komplekse teiste
osadega. Kovalentselt seotud komplekse saab valmistada keemiliste osade 20
ühendamisel peptikehasid sisaldavatel aminohapete kõrvalahelatel või N- või C-
otsal olevate funktsionaalrühmadega.
Eeskätt eeldatakse, et peptiide saab konjugeerida reporterrühmale, muuhulgas
radiomärgistusele, fluorestseeruvale märgisele, ensüümile (nt sellele, mis
katalüüsib kolorimeetrilist või fluoromeetrilist reaktsiooni), substraadile, tahkele 25
maatriksile või kandjale (nt biotiin või avidiin). Seega pakub leiutis molekuli, mis
sisaldab peptikeha molekuli, kusjuures molekul hõlmab veel reporterrühma, mis on
valitud rühmast, kuhu kuuluvad radiomärgistus, fluorostseeruv märgis, ensüüm,
substraat, tahke maatriks ja kandur. Taolised märgistused on antud valdkonnas
pädevatele isikutele teada, nt biotiini märgiseid peetakse eriti võimalikuks. Antud 30
valdkonnas pädevad isikud teavad taoliste märgiste kasutamist ning seda on
kirjeldatud nt USA patentides nr 3,817,837, 3,850,752, 3,996,345 ja 4,277,437.
EE - EP1615952 B1 46
Teiste kasulike märgiste seas on muuhulgas radiomärgistused, fluorestseeruvad
märgised ja kemoluminestseeruvad märgised. Taolisi märgiseid puudutavate USA
patentide seas on näiteks patendid nr 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350 ja
3,996,345. Käesoleva leiutise iga peptikeha võib sisaldada ühte, kahte või enamat
taolist märgistust. 5
Peptiidide valmistusmeetodid
Käesoleva leiutise peptiide saab luua mitmesuguseid antud valdkonnas
teadaolevaid võtteid kasutades. Näiteks saab taolisi peptiide lahuses või tahkes
tugiaines sünteesida vastavalt tavapärastele võtetele. Mitmesugused automaatsed
süntesaatorid on kommertsiaalselt kättesaadavad ning neid on võimalik kasutada 10
vastavalt teadaolevatele eeskirjadele. Vaata näiteks Stewart and Young (supra);
Tam et al, J. Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347
(1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, toim.-d,
Academic Press, New York, 1-284; Barany et al, Int. J. Pep. Protein Res., 30:705-
739 (1987); ning USA patent nr 5,424,398, millest igaüks on siia viidetena 15
kaasatud.
Tahke faasi peptiidi sünteesimeetodid kasutavad kopolü(stüreendivinüülbenseeni),
mis sisaldab 0,1-1,0mM amiini/g polümeeri. Need peptiidi sünteesiks mõeldud
meetodid kasutavad alfa-amino rühmade butüüloksükarbonüüli (t-BOC) või 9-
fluorenüülmetüüloksükarbonüüli (FMOC) kaitset. Mõlemad meetodid hõlmavad 20
sammhaaval sünteese, millega igas etapis lisatakse üksik aminohape, alustades
peptiidi C-otsast (vaata Coligan et al, Curr. Prot. Immunol., Wiley Interscience,
1991, 9. peatükk). Keemilise sünteesi lõppemisel saab sünteetiliselt peptiidilt
kaitse eemaldada, et t-BOC või FMOC aminohapet blokeerivaid rühmi eraldada,
ning polümeerist lõhustada happega alandatud temperatuuril töötlemisel (nt vedel 25
HF-10% anisool umbes 0,25 kuni umbes 1 tundi temperatuuril 0 ˚C). Pärast
reagentide aurustumist ekstraktitakse peptiidid polümeerist 1%-lise äädikhappe
lahusega ning seejärel neid lüofiliseeritakse, et anda toormaterjal. Selle saab
tavaliselt puhastada võtetega nagu geelfiltreerimine Sephadex G-15 abil,
kasutades lahustina 5%-list äädikhapet. Kolonni sobivate fraktsioonide 30
lüofiliseerimine annab homogeensed peptiidid või peptiidi derivaadid, mida saab
seejärel eristada standardvõtetega nagu aminohappe analüüs, õhukese kihi
EE - EP1615952 B1 47
kromatograafia, kõrgkvaliteetne vedelkromatograafia, ultraviolett-
absorptsioonspektroskoopia, molaarne rotatsioon, lahustuvus ning kvantifitseerida
tahke faasi Edman lõhustamisega.
Teised meetodid nagu peptiidide valimine faagmeetodi kogust on samuti
kättesaadavad. Kogusid saab valmistada siin kirjeldatud aminohapete 5
komplektidest. Faagmeetod võib olla eriti tõhus vastavalt leiutisele kasulike
peptiidide tuvastamisel. Lühidalt, faagikogu valmistatakse (kasutades nt ml 13, fd
või lambda faagi), näidates lisasid alates 4 kuni 80 aminohappe jäägini. Lisandid
võivad tähistada näiteks täielikult degenereerunud või nihkes jada. Seejärel saab
valida faagi kandvad lisandid, mis soovitud antigeenile seonduvad. Seda protsessi 10
saab korrata soovitud antigeenile seonduva faagi mitme reselekteerimise tsükliga.
Kordusringid viivad faagi kandvate konkreetsete järjestuste rikastumiseni.
Teostada võib DNA järjestuste analüüsi, et ekspresseeritud peptiidide järjestust
tuvastada. Soovitud antigeenile seonduva järjestuse minimaalset lineaarset
portsjonit on võimalik kindlaks määrata. Protseduuri saab korrata nihkes 15
kogumiga, mis sisaldab lisandeid, milles on osa või kogu minimaalne lineaarne
portsjon ning selle üks või mitu lisa degenereerunud jäägi vastassuunda või
pärisuunda. Need võtted võivad tuvastada veel suurema sidumisafiinsusega Ang-
2-le leiutise peptiide kui siin juba tuvastatud ained.
Sõltumata peptiidide valmistusmeetodist, on võimalik luua iga taolist peptiidi ja 20
peptikeha kodeeriv nukleiinhappe molekul, kasutades rekombinantse DNA
standardprotseduure. Taolise DNA molekuli nukleotiidid järjestust saab vastavalt
vajadusele manipuleerida, muutmata nende poolt kodeeritavat aminohappe
järjestust, et põhjendada nukleiinhappe koodi degenereerumist ning koodoni
eelistust teatud peremeesrakkudes. 25
Rekombinantse DNA võtted moodustavad mugava meetodi käesoleva leiutise
täispikkuses peptikehade ja teiste suurte valguliste spetsiifiliste sideainete või
nende fragmentide valmistamiseks. Peptikeha või fragmenti kodeeriva DNA
molekuli võib lisada ekspressioonivektorisse, mille saab omakorda lisada
peremeesrakku, et antikeha või fragmenti toota. 30
EE - EP1615952 B1 48
Üldiselt on võimalik peptiidi või peptikeha kodeeriv DNA molekul saada
protseduuridega, mida on siin näidetes kirjeldatud. Proovid ja tüüpilised
hübridisatsiooni tingimused on need, nagu on esitanud Ausubel et al (Current
Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press). Pärast hübridisatsiooni
saab proovitud laigu pesta sobiva piiratusega, sõltuvalt taolistest faktoritest nagu 5
proovi suurus, proovi eeldatav homoloogia klooniga, vaadeldava kogu liik ning
vaadeldavate kloonide arv. Kõrgpiiranguga analüüside näited on 0,1xSSC ja 0,1
protsendimäär SDS temperatuurivahemikus 50-65 ˚C.
Kasutada võib ka pärmi kaksikhübriidi süsteemi skriinimismeetodeid, et tuvastada
leiutise peptiide, mis Ang-2-le seonduvad. Järelikult saab antigeeni või selle 10
fragmenti kasutada peptiidi kogude skriinimiseks, sealhulgas faagmeetodi kogud,
et tuvastada ja selekteerida käesoleva leiutise Ang-2 sideaineid, nt peptikehasid.
Teisel juhul võib rakendada tervet hulga ekspressiooni vektori/ peremeessüsteemi,
et hoida ja ekspresseerida leiutise peptiide. Need süsteemid hõlmavad muuhulgas
mikroorganisme nagu bakterid, mida on muudetud rekombinantse bakteriofaagi, 15
plasmiidi või kosmiidi DNA ekspressioonivektoritega; pärm, mida on muudetud
pärmi ekspressioonivektoriga; putuka rakusüsteemid, mis on nakatatud viiruse
ekspressioonivektoriga (nt bakuloviirus); taime rakusüsteemid, mis on
transfekteeritud viiruse ekspressioonivektoriga (nt lillkapsa mosaiikviirus CaMV;
tubaka mosaiikviirus TMV) või mida on muudetud bakteri ekspressioonivektoriga 20
(nt Ti või pBR322 plasmiid); või looma rakusüsteemid. Rekombinantse proteiini
tootmises kasulike imetajarakkude seas on muuhulgas VERO rakud, HeLa rakud,
hiina hamstri munasarja (CHO) rakuliinid, COS rakud (nagu COS-7), W138, BHK,
HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 ja 293 rakud. Näidiseeskirju peptiidi
rekombinantseks ekspressiooniks on kirjeldatud siin allpool. 25
Termin „ekspressioonivektor“ tähistab plasmiidi, faagi, viirust või vektorit
polüpeptiidid ekspresseerimiseks DNA (RNA) järjestusest. Ekspressioonivektor
võib hõlmata transkriptsionaalset üksust, milles on komplekt (1) geneetilisest
elemendist või elementidest, millel on reguleeriv roll geeni ekspressioonis, näiteks
promootoritest või tugevdajatest, (2) struktuurist või järjestusest, mis kodeerib 30
mRNA-sse transkribeeritud ja proteiini transleeritud sideainet, ning (3) sobivast
transkriptsiooni algatusest ja lõpetusjärjestusest. Pärmis või eukarüootsetes
EE - EP1615952 B1 49
ekspressioonisüsteemides kasutamiseks mõeldud struktuuriüksused sisaldavad
soovitatavalt liidejärjestust, mis võimaldab transleeritud proteiini rakuvälist eritust
peremeesraku poolt. Teisel juhul, kui ekspresseeritakse rekombinantset proteiini
liider- või transportjärjestuseta, võib see hõlmata amino-otsa metionüüljääki. Jääk
võib või ei pruugi olla järjestikku lõhestatud ekspresseeritud rekombinantsest 5
proteiinist, et lõplikku peptiidiprodukti anda.
Näiteks võib peptiide rekombinantselt pärmis ekspresseerida kommertsiaalselt
kättesaadavat ekspressioonisüsteemi, nt firma Pichia ekspressioonisüsteemi
(Invitrogen, San Diego, CA) kasutades, järgides tootja juhiseid. Süsteem tugineb
ka pre-pro-alfa järjestusel, et suunata sekretsiooni, aga lisandi transkriptsiooni 10
juhib alkoholi oksidaasi (AOX1) promootor pärast esilekutsumist metanooli poolt.
Eritunud peptiid puhastatakse pärmi kasvusöötmest nt meetoditega, mida
kasutatakse peptiidi puhastamiseks bakteri ja imetaja rakusupernatantidest.
Teisel juhul võib peptiidi kodeeriva cDNA kloonida bakuloviiruse
ekspressioonivektoriks pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Seda vektorit võib 15
kasutada vastavalt tootja juhistele (PharMingen), et nakatada liblikarakud
(Spodoptera frugiperda) sF9 proteiinivabas söötmes ning toota rekombinantne
proteiin. Rekombinantse proteiini saab söötmest puhastada ja kontsentreerida,
kasutades hepariin-sefaroosi kolonni (Pharmacia).
Teise võimalusena saab peptiidi ekspresseerida putuka süsteemis. Antud 20
valdkonnas pädevad isikud teavad valgu ekspressiooniks mõeldud
putukasüsteeme. Ühes taolises süsteemis saab kasutada Autographa californica
nukleaarset polühedroosi viirust (AcNPV) vektorina, et ekspresseerida võõrgeene
Spodoptera frugiperda rakkudes või Trichoplusia vastsetes. Peptiidi kodeeriva
järjestuse saab kloonida viiruse vähemolulisse piirkonda nagu polühedriini geen 25
ning asetada polühedriini promootori kontrolli alla. Peptiidi edukas lisamine
muudab polühedriini geeni inaktiivseks ning annab rekombinantse viiruse, millel
puudub kattevalgu kate. Rekombinantseid viiruseid saab kasutada S. frugiperda
rakkude või Trichoplusia vastsete, kus peptiidi ekspresseeritakse, nakatamiseks.
Smith et al, J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al, Proc. Nat. Acad Sci. (USA) 30
91: 3224-7 (1994).
EE - EP1615952 B1 50
Järgmises näites saab peptiidi kodeerivat DNA järjestust võimendada PCR abil ja
kloonida sobivaks vektoriks näiteks pGEX-3X (Pharmacia). pGEX luuakse
glutatioon-S-transferaasi (GST) sisaldava sulandvalgu, mida kodeerib vektor, ja
proteiini, mida kodeerib vektori kloonimissaidile lisatud DNA fragment, tootmiseks.
PCR jaoks mõeldud praimereid saab luua nii, et need kaasaks näiteks sobivat 5
lõhestuskohta. Kui sulandosa kasutatakse ainult ekspressiooni soodustamiseks
või on teisiti vaatlusaluse ühendusena ebasoovitav, võib rekombinantse
sulandvalgu lõhestada sulandvalgu GST osast. pGEX-3X/spetsiifilise sideaine
peptiidi struktuur muudetakse E. coli XL-1 Blue rakkudeks (Stratagene, La Jolla
CA) ning individuaalsed transformandid eraldatakse ja neid kasvatatakse. 10
Plasmiidi DNA individuaalsetest transformantidest saab puhastada ja osaliselt
järjestada automatiseeritud järjestusseadmega, et kinnitada nukleiinhappe lisandit
kodeeriva soovitud spetsiifilise sideaine olemasolu õiges suunitluses.
Käesoleva leiutise teatud peptiid koostised on need, milles peptikeha on
konjugeeritud mis tahes kasvajavastaseks peptiidiks nagu kasvaja nekroosifaktor 15
(TNF). Ühes eriti eelistatud meetodis TNF-spetsiifilise sideaine peptiidide kimäärid
luuakse rekombinantsete ühendustena peptiidi kodeerivate järjestustega, mis on
sulandatud TNF-d (Novagen, Madison, WI) kodeerivatele järjestustele. Peptiid-
TNF cDNA saab kloonida pET-11b vektoriks (Novagen) ning TNF-peptiidide
ekspressiooni BL21 E. colis saab esile kutsuda vastavalt pET11b tootja juhistele. 20
Lahustuvad TNF-peptiidid saab puhastada bakteri lüsaatidest ammooniumsulfaadi
valmistusega, hüdrofoobsete interaktsioonide kromatograafiaga Phenyl-
Sepharose 6 Fast Flow kolonnil, ioonvahetuskromatograafiaga DEAE-Sepharose
Fast Flow kolonnil ning geelfiltratsiooni kromatograafiaga Sephacryl-S-300 HR
kolonnil. 25
Sulandvalgu, mille võib valmistada lahustumatu sisestuskehana bakteris, saab
puhastada järgnevalt. Peremeesrakud saab surmata tsentrifuugimisel, puhastada
0,15M NaCl-s, 10mM-s Tris-is, pH 8, 1mM-s EDTA-s ning neid saab 15 minutit
toatemperatuuril töödelda 0,1mg/ml lüsosüümiga (Sigma, St. Louis, MO). Lüsaadi
saab puhastada ultrahelitöötlusel ning raku jäätmed saab granuleerida 30
tsentrifuugimisel 10 minutit kiirusel 12 000xg. Sulandvalku sisaldava graanuli saab
resuspendeerida 50mM-s Tris-is, pH 8, ja 10mM-s EDTA-s, kanda 50%-lisele
EE - EP1615952 B1 51
glütseroolile ning tsentrifuugida 30 minutit kiirusel 6000xg. Graanuli saab
resuspendeerida standardses fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), kus ei ole
Mg++ ega Ca++. Sulandvalku saab veel puhastada resuspendeeritud graanuli
fraktsioneerimisel denatureerivas SDS-PAGE-s (Sambrook et al, supra). Geeli
saab leotada 0,4M KCl-s, et näha proteiini, mille võib eemaldada ja 5
elektroelueerida geelil töötava puhvriga, milles ei ole SDS. Kui GST/sulandvalk
toodetakse bakteris lahustuva proteiinina, saab selle puhastada
puhastusmooduliga GST Purification Module (Pharmacia).
Sulandvalgu võib lagundamisele edastada, et GST leiutise peptiidist lõhestada.
Lagundamisreaktsiooni (20-40mg sulandvalku, 20-30 ühikut inimese trombiini 10
(4000Ü/mg, Sigma) 0,5ml-s PBS-s saab inkubeerida 16-48 tundi toatemperatuuril
ning seada denatureerivale SDS-PAGE geelile, et reaktsiooniprodukte
fraktsioneerida. Geeli võib immutada 0,4M KCl-s, et valguribasid näha. Valguriba,
mis vastab peptiidi eeldatud molekulmassile, identsust saab kinnitada aminohappe
järjestuse analüüsiga automatiseeritud järjestusseadmega (firma Applied 15
Biosystems mudel 473A, Foster City, CA). Teisel juhul saab identsust kinnitada
peptiidide HPLC ja/või massispektromeetria tegemisel.
Teisel juhul saab peptiidi kodeeriva DNA järjestuse kloonida plasmiidi, mis
sisaldab soovitud promootorit ning soovi korral liiderjärjestust [Better et al, Science
240:1041-43 (1988)]. Antud struktuuri järjestuse saab kinnitada automatiseeritud 20
sekventeerimisega. Plasmiidi saab seejärel E. coli tüveks MC1061 muuta,
kasutades standardseid protseduure, mis rakendavad CaCl2 inkubatsiooni ja
bakteri kuumašoki töötlust (Sambrook et al, supra). Transformeeritud baktereid
saab kasvatada LB söötmes, millele on lisatud karbenitsilliini, ning eeldatud
proteiini tootmise saab esile kutsuda sobivas söötmes kasvamisel. Liiderjärjestuse 25
olemasolul saab see peptiidi erituse käivitada ning seda on võimalik sekretsiooni
käigus lõhestada.
Eritunud rekombinantse proteiini saab bakteri kultuurisöötmest puhastada siin
allpool kirjeldatud meetoditega.
Antud valdkonnas pädevad isikud tunnevad hästi rekombinantse proteiini 30
ekspressiooniks mõeldud imetaja peremeessüsteeme. Peremeesraku tüved võib
EE - EP1615952 B1 52
valida teatud võime tõttu toota ekspresseeritud valku või tuua teatud
translatsioonijärgseid modifikatsioone, mis on kasulikud proteiini aktiivsuse
võimaldamisel. Taoliste proteiini modifikatsioonide seas on muuhulgas
atsetüülimine, karboksüülimine, glükosüleerimine, fosforüülimine, lipiidimine ja
atsüülimine. Erinevatel peremeesrakkudel nagu CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 ja 5
teistel sarnastel on spetsiifilised rakumehhanismid ja iseloomulikud mehhanismid
taolisteks translatsioonijärgseteks toiminguteks ning neid saab valida kasutatud
võõrvalgu õige modifikatsiooni ja töötlemise tagamiseks.
Eelistatakse, et transformeeritud rakke saab kasutada pikaajaliseks saagikaks
valgu tootmiseks ning taolisena soovitakse stabiilset ekspressiooni. Kui taolisi 10
rakke transformeeritakse vektoritega, mis sisaldavad selektsioonimarkereid koos
soovitud ekspressioonikassetiga, võib rakkudel lasta 1-2 päeva rikastatud söötmes
kasvada enne, kui need selektiivsesse söötmesse pannakse. Selektsioonimarker
on loodud pakkuma vastupidavust selekteerimisele ning selle olemasolu
võimaldab kasutatud järjestusi edukalt ekspresseerivate rakkude kasvu ja 15
taastumist. Stabiilselt transformeeritud rakkude resistentseid kogumeid saab
rakule sobivate koekultuuri võtetega paljunema panna.
Mitmeid selektsioonisüsteeme saab kasutada rekombinantse proteiini tootmise
jaoks transformeeritud rakkude taastamiseks. Taoliste selektsioonisüsteemide
seas on muuhulgas HSV tümidiini kinaas, hüpoksantiin-guanidiini 20
fosforibosüültransferaasi ja adeniini fosforibosüültransferaasi geenid vastavalt tk-,
hgprt- või aprt- rakkudes. Samuti saab anti-metaboliidi resistentsust kasutada
selektsiooni alusena DHFR-le, mis annab resistentsuse metotreksaadi suhtes, gpt-
le, mis annab resistentsuse mükofenoolhappe suhtes, neo-le, mis annab
resistentsuse aminoglükosiidi G418 ning klorosulfurooni suhtes, ning hügro-le, mis 25
annab resistentsuse hügromütsiini suhtes. Täiendavate kasulikuks osutuvate
selektiivsete geenide seas on trpB, mis võimaldab rakkudel trüptofaani asemel
indooli rakendada, või hisD, mis võimaldab rakkudel histidiini asemel histinooli
kasutada. Markerite, mis transformantidest visuaalse ülevaate annavad, seas on
antotsüaniinid, β-glükuronidaas ja selle substraat GUS ning lutsiferaas ja selle 30
substraat lutsiferiin.
Spetsiifiliste sideainete puhastamine ja taasvoltimine
EE - EP1615952 B1 53
Mõnel juhul tuleb spetsiifilised sideained nagu antud leiutise peptiidid ja/või
peptikehad „taasvoltida“ ja õigeks tertsiaarstuktuuriks oksüdeerida ning panna
disulfiidi ühendeid looma, et bioloogiliselt aktiivne olla. Taasvoltimine on võimalik
mitme antud valdkonnas teadaoleva protseduuriga. Taoliste meetodite seas on
muuhulgas lahustuvaks tehtud polüpeptiidi aine kokkupuutumine pH-ga, mis on 5
tavaliselt enam kui 7, kaotroopse aine juuresolekul. Kaotroobi valik on sarnane
neile, mida kasutati sisestuskehakese lahustuvaks tegemiseks, ent kaotroopi
kasutatakse tavaliselt madalamal kontsentratsioonil. Kaotroopse aine näidis on
guanidiin. Enamasti sisaldab taasvoltimise/oksüdeerimise lahus ka redutseerivat
ainet ning selle oksüdeeritud kuju teatud suhtes, et luua konkreetne 10
redokspotentsiaal, mis võimaldab tsüsteiini sidemete moodustumiseks disulfiidi
segamisel toimuda. Osa tavaliselt kasutatavate redokspaaride seas on
tsüsteiin/tsüstamiin, glutatioon/ditiobis GSH, vaskkloriid, ditiotreitool DTT/ditiaan
DTT ja 2-merkaptoetanool (bME)/ditio-bME. Enamus juhtudel võib kasutada
kosolventi, et taasvoltimise tõhusust tõsta. Tavaliselt kasutatavate kosolventide 15
seas on erineva molekulmassiga glütserool, polüetüleenglükool ning arginiin.
Võib-olla soovitakse käesoleva leiutise peptiide ja peptikehasid puhastada. Antud
valdkonnas pädevad isikud tunnevad proteiini puhastusvõtteid. Ühel tasandil on
nende võtete seas valguliste ja mittevalguliste fraktsioonide algeline
fraktsioneerimine. Pärast peptiidi ja/või peptikeha eraldamist teistest proteiinidest 20
saab huvialuse peptiidi või polüpeptiidi täiendavalt puhastada kromatograafia ja
elektroforeesi võtetega, et saavutada osaline või täielik puhtus (või puhtus
homogeensuseni). Peptikehade ja peptiidide või käesoleva leiutise valmistamiseks
spetsiaalselt sobitatud analüütilised meetodid on ioonvahetuskromatograafia,
eralduskromatograafia, geelelektroforees polüakrüülamiidis ja isoelektriline 25
fookustamine. Eriti tõhus peptiidide puhastusmeetod on valgu kiire
vedelkromatograafia või isegi HPLC.
Käesoleva leiutise teatud aspektid käsitlevad käesoleva leiutise peptikeha või
peptiidi puhastamist ja teatud variantides nende põhiosas puhastamist. Siin
kasutatud termin „puhastatud peptikeha või peptiid“ on mõeldud tähistama 30
koostisi, mis on teistest komponentidest eraldatavad, kusjuures peptikeha või
peptiid puhastatakse mis tahes tasemeni, mis on seotud selle looduslikult
EE - EP1615952 B1 54
saavutatava kujuga. Järelikult tähendab puhastatud peptiid või peptikeha sellist
peptikeha või peptiidi, mis on vaba keskkonnast, milles see võib looduslikult
esineda.
Üldiselt, „puhastatud“ tähendab peptiidi või peptikeha koostist, mis on läbinud
fraktsioneerimise, et eemaldada erinevaid teisi koostisosi, ning mis põhiliselt 5
säilitab oma ekspresseeritud bioloogilise toime. Kus on kasutatud terminit
„põhiosas puhastatud“, tähendab see määratlus peptiidi või peptikeha koostist, kus
peptikeha või peptiid moodustab enamuse koostise komponendist, nagu
moodustades umbes 50%, umbes 60%, umbes 70%, umbes 80%, umbes 90%,
umbes 95% või rohkem proteiinist koostises. 10
Peptiidi või peptikeha puhastamise taseme kvantifitseerimise erinevad meetodid
on antud valdkonnas pädevatele isikutele teada käesoleva avalikustuse valguses.
Nende seas on näiteks aktiivse fraktsiooni spetsiifilise sidumisaktiivsuse
määramine või peptiidi või peptikeha koguse hindamine fraktsioonis SDS/PAGE
analüüsiga. Peptiidi või peptikeha fraktsiooni puhtuse hindamise eelistatud meetod 15
on arvutada fraktsiooni sidumisaktiivsus, võrrelda seda esialgse ekstrakti
sidumisaktiivsusega ning seeläbi arvutada puhtuse tase, mida on siin hinnatud „-
kordse puhastusnumbriga“. Sidumisaktiivsuse koguse tähistamiseks kasutatud
tegelikud ühikud sõltuvad mõistagi konkreetse analüüsi võtetest, mis valitakse
puhastamise järgimiseks, ning kas peptikehal või peptiidil on või ei ole tuvastatavat 20
sidumisaktiivsust.
Antud valdkonnas pädevad isikud teavad puhastamises kasutamiseks sobivaid
erinevaid võtteid. Nende seas on näiteks ammooniumsulfaadiga, PEG,
antikehadega (immunosadestamine) ja muu sarnasega sadestamine või kuum-
denatureerimisega, millele järgneb tsentrifuugimine, kromatograafia etapid nagu 25
afiinsus-kromatograafia (nt proteiin-A-sefaroos), ioonvahetus-, geelfiltratsiooni,
pöördfaasiline, hüdroksüülapatiit- ja afiinsuskromatograafia, isoelektriline
fookustamine, geel-elektroforees ning taoliste ja teiste võtete kombinatsioonid.
Nagu antud valdkonnas ka teatakse, usutakse, et erinevate puhastusetappide
sooritamise järjekorda võib muuta või on võimalik teatud etappe vahele jätta ning 30
ikkagi saada sobiv meetod tegelikult puhastatud spetsiifilise sideaine
valmistamiseks.
EE - EP1615952 B1 55
Puudub üldnõue, et käesoleva leiutise peptiid või peptikeha oleks alati oma kõige
puhtamal kujul. Tegelikult peetakse võimalikuks, et põhiosas vähem spetsiifilise
sideaine produktidel on teatud variantides ka rakendus. Osalist puhastamist on
võimalik saavutada vähemate puhastusetappide kasutamisel koos või rakendades
sama üldise puhastusskeemi erinevaid vorme. Näiteks on mõistetav, et 5
katioonvahetuse kolonnkromatograafia, mis tehakse HPLC seadmega, annab
üldiselt suurema „-kordse“ puhtuse kui sama võte, mis kasutab madala rõhuga
kromatograafia süsteemi. Suhtelise puhtuse madalama tasemega meetoditel
võivad olla eelised peptiidi või peptikeha kogutaastumises või peptiidi või
peptikeha sidumisaktiivsuse säilitamisel. 10
On teada, et peptiidi või polüpeptiidi liikumine võib SDS/PAGE erinevate
tingimustega ja mõnikord lausa märkimisväärselt varieeruda [Capaldi et al,
Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977)]. Seetõttu on mõistetav, et
erinevates elektroforeesi tingimustes võib puhastatud või osaliselt puhastatud
spetsiifilise sideaine ekspressiooni produktide näiv molekulmass varieeruda. 15
Seondumistestid
Immunoloogilised seondumistestid kasutavad tavaliselt haardeainet (capture
agent), et analüüdi sihtmärgist antigeenile spetsiaalselt seonduda ja sageli
immobiliseerida. Haardeaine on osa, mis analüüdile spetsiaalselt seondub.
Käesoleva leiutise teatud variandis on haardeaine peptiid või peptikeha või selle 20
fragment, mis Ang-2 spetsiaalselt seob. Antud valdkonnas on need
immunoloogilised seondumistestid teada [Asai, toim., Methods in Cell Biology, 37.
kd, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)].
Immunoloogilised seondumistestid kasutavad sageli märgistusainet, mis
haardeaine ja antigeeni moodustatud seondumiskompleksi olemasolust märku 25
annab. Märgistusaine võib olla üks molekulidest, mis hõlmab
seondumiskompleksi, st see võib olla märgistatud spetsiifiline sideaine või
märgistatud anti-spetsiifilise sideaine antikeha. Teisel juhul võib märgistusaine olla
kolmas molekul, tavaliselt mingi muu antikeha, mis seondumiskompleksile
seondub. Märgistusaine võib olla näiteks märgistust kandev anti-spetsiifilise 30
sideaine antikeha. Teisel antikehal, mis on seondumiskompleksile spetsiifiline,
EE - EP1615952 B1 56
võib märgistus puududa, aga selle võib leida neljanda molekuliga, mis on
spetsiifilised antieha liikidele, milles teine antikeha on liige. Näiteks võib teist
antikeha modifitseerida tuvastatava osaga nagu biotiin, mille võib seejärel siduda
neljas molekul nagu ensüüm-märgistusega streptavidiin. Immunoglobuliini
konstantseid piirkondi nagu proteiin A või proteiin G spetsiifiliselt siduda suutvaid 5
teisi proteiine võib samuti märgistusainena kasutada. Need sideained on
streptokoki bakteri rakuseinte normaalsed koostisosad ning neil on tugev mitte-
immunogeenne reaktiivsus mitmetelt liikidelt pärinevate immunoglobuliini
konstantsete piirkondadega. Akerstrom, J. Immunol., 135:2589-2542 (1985);
Chaubert, Mod. Pathol., 10:585-591 (1997). 10
Testide kestel on võib-olla vaja inkubeerimis- ja/või pesemisetappe pärast iga
reagendi kombineerimist. Inkubeerimisetapp võib varieeruda 5 sekundist kuni
mitme tunnini, soovitatavalt umbes 5 minutist kuni umbes 24 tunnini. Ent
inkubeerimisaeg sõltub testi formaadist, analüüdist, lahuse kogusest,
kontsentratsioonidest ja muust sarnasest. Tavaliselt sooritatakse testid 15
ümbritseval temperatuuril, kuigi neid saab teostada mitmesugustel
temperatuuridel.
A. Mittekonkureerivad seondumistestid:
Immunoloogilised seondumistestid võivad olla mittekonkureerivat tüüpi. Nendel
testidel on teatud koguses haaratud analüüti, mida otseselt mõõdetakse. Näiteks 20
teatud eelistatud kihttehnikal põhinevas testis võib haardeaine (antikeha või
peptikeha) siduda otse tahkele substraadile, kus see immobiliseeritakse. Need
immobiliseeritud haardeained haarduvad (seonduvad) seejärel testi proovis
olevale antigeenile. Sedasi immobiliseeritud proteiin seotakse hiljem
märgistusainele nagu teine antikeha, millel on märgistus. Järgmises eelistatud 25
kihttehnikal põhinevas testis teisel antikehal puudub märgistus, aga selle võib
leida märgistatud antikehal, mis on spetsiifiline liikide antikehadele, millest teine
antikeha tuletatakse. Teist antikeha saab samuti modifitseerida tuvastatava osaga
nagu biotiin, millele saab spetsiifiliselt siduda kolmanda märgistatud molekuli nagu
streptavidiin. Vaata Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 14. 30
peatükk, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), mis on siia viidetena
kaasatud.
EE - EP1615952 B1 57
B. Konkureerivad seondumistestid:
Immunoloogilised seondumistestid võivad olla konkureerivat tüüpi. Proovis oleva
analüüdi kogus mõõdetakse otse, mõõtes lisatud analüüdi koguse, mis asendati
või tõrjuti haardeainest (antikeha või peptikeha) välja proovis oleva analüüdi poolt.
Teatud eelistatud konkureerivas seondumistestis lisatakse teadaolevas koguses 5
analüüti, mis on enamasti märgistatud, proovile ja proov viiakse seejärel
haardeainega kokkupuutesse. Antikehale seotud märgistatud analüüdi kogus on
pöördvõrdeline proovis oleva analüüdi kontsentratsiooniga (vaata Harlow and
Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 14. peatükk, lk 579-583, supra).
Teises konkureerivas seondumistestis haardeaine immobiliseeritakse tahkel 10
substraadil. Haardeainele seotud proteiini koguse võib määrata proteiini/antikeha
kompleksis oleva valgu koguse mõõtmisel või hoopis allesjäänud mittekompleksse
proteiini koguse mõõtmisel. Proteiini koguse võib tuvastada märgistatud proteiini
võimaldamisega. Harlow and Lane (supra).
Ent veel ühe eelistatud konkureeriva seondumistestiga kasutatakse hapteeni 15
inhibeerimist. Siin teadaolev analüüt immobiliseeritakse tahkel substraadil.
Proovile lisatakse teadaolevas koguses antikeha ning proov ühendatakse
immobiliseeritud analüüdiga. Immobiliseeritud analüüdile seotud antikeha kogus
on pöördvõrdeline proovis oleva analüüdi kogusega. Immobiliseeritud antikeha
kogust võib tuvastada kas antikeha immobiliseeritud fraktsiooni või lahusesse 20
jääva fraktsiooni tuvastamisel. Tuvastamine võib olla otsene seal, kus antikeha on
märgistatud, või kaudne eespool kirjeldatud antikehale spetsiifiliselt seonduva
märgistatud osa järgneva lisamisel.
C. Konkureerivate seondumistestide rakendamine:
Konkureerivaid seondumisteste saab kasutada ristreaktiivsuse tuvastamiseks, et 25
lasta pädeval spetsialistil kindlaks määrata, kas proteiini või ensüümi kompleks,
mille leiutise peptikeha ära tunneb, on soovitud proteiin ega mitte ristuvalt
reageeriv molekul, või tuvastada, kas peptikeha on antigeeni-spetsiifiline ega ei
seondu kõrvalistele antigeenidele. Seda liiki testides saab antigeeni tahkele toele
immobiliseerida ning testile lisatakse tundmatu proteiinimikstuur, mis konkureerib 30
EE - EP1615952 B1 58
peptikehade sidumisega immobiliseeritud proteiinile. Konkureeriv molekul seondub
samuti ühele või mitmele antigeenile, mis ei ole antigeeniga seotud. Proteiinide
võimet konkureerida peptikehade seondumisega immobiliseeritud antigeenile
võrreldakse sama proteiini, mis tahkele toele immobiliseeriti, seondumisega, et
proteiinisegu ristuvat reaktiivsust tuvastada. 5
D. Teised seondumistestid
Käesolev leiutis pakub ka western blot-meetodeid, et tuvastada või kvantifitseerida
Ang-2 olemasolu proovis. Võte hõlmab üldiselt prooviproteiinide eraldamist geeli-
elektroforeesiva molekulmassi põhjal ning proteiinide viimist sobivale tahkele toele
nagu nitrotselluloosfilter, nailonfilter või derivatiseeritud nailonfilter. Proovi 10
inkubeeritakse peptikehade või nende fragmentidega, mis spetsiifiliselt Ang-2
seovad, ning tuvastatakse saadud kompleks. Neid peptikehasid võib otseselt
märgistada või teisel juhul võib neid järgemööda tuvastada märgistatud
antikehadega, mis spetsiaalselt peptikehale seonduvad.
Diagnostilised testid 15
Tuletatud seondumisaineid nagu käesoleva leiutise peptiidid ja peptikehad või
nende fragmendid on tõhusad seisundite või haiguste diagnoosiks, millele on
iseloomulik Ang-2 või allüksuste ekspressioon, või testides, et vaadelda patsiente,
keda ravitakse Ang-2 põhjustajatega, selle fragmentide, agonistide või Ang-2
toime inhibiitoritega. Ang-2 jaoks mõeldud diagnostiliste testide seas on meetodid 20
peptikeha rakendamiseks ning märgistus Ang-2 tuvastamiseks inimese
kehavedelikes või rakkude või kudede ekstraktides. Käesoleva leiutise
peptikehasid saab kasutada modifitseerimisega või ilma. Eelistatud diagnostilises
testis märgistatakse peptikehasid kinnitamisega, nt märgistus- või
reportermolekuliga. Tuntakse hulga märgistusi ja reportermolekuli, millest osa on 25
siin juba kirjeldatud. Käesolev leiutis on eriti kasulik inimhaiguste diagnoosimiseks.
Antud valdkonnas teatakse hulga eeskirju Ang-2 proteiinide mõõtmiseks,
kasutades vastavale proteiinile spetsiifilisi peptikehasid. Näidete seas on ensüüm-
seotud immunosorbenttest (ELISA), radioimmunoanalüüs (RIA) ja fluorestsentsi
aktiveeritav rakkude sorteerimine (FACS). Eelistatakse kahepoolset 30
EE - EP1615952 B1 59
monoklonaalset immunoanalüüsi, mis rakendab monoklonaalseid antikehasid, mis
on kahe Ang-2-l mitte-sekkuva epitoobi suhtes reaktiivsed, aga kasutada võib ka
konkureerivat seondumistesti. Neid teste on kirjeldanud näiteks Maddox et al, J.
Exp. Med, 158:1211 (1983).
Diagnoosile aluse võimaldamiseks sätestatakse inimese Ang-2 ekspressioonile 5
tavaliselt normaalsed või standardväärtused. Taoline tuvastamine on võimalik
normaalsete subjektide, eelistatavalt inimeste kehavedelike või rakuekstraktide
kombineerimisel peptikehaga Ang-2-le antud valdkonnas teadaolevates
tingimustes, mis sobivad kompleksi moodustumiseks. Standardkompleksi
moodustumise kogust saab kvantifitseerida peptikehade Ang-2 proteiini 10
teadaolevate kogustele seondumise võrdlemisel nii kontroll- kui ka haiguse
proovidega. Seejärel saab normaalsetest proovidest saadud standardväärtuseid
võrrelda väärtustega, mis saadi haigusega potentsiaalselt mõjutatud subjektide
proovidest. Hälve standard- ja subjekti väärtuse vahel viitab Ang-2 rollile haiguse
staadiumis. 15
Diagnostiliseks rakenduseks märgistatakse teatud variantides käesoleva leiutise
peptikehad või peptiidid tavaliselt tuvastatava osaga. Tuvastatav osa võib olla
igasugune, mis suudab kas otseselt või kaudselt tuvastatavat signaali tekitada.
Tuvastatav osa võib näiteks olla radioisotoop nagu 3H, 14C, 32P, 35S või 125I,
fluorestsentne või kemiluminestsentne ühend nagu fluorestseiinisotiotsüanaat, 20
rodamiin või lutsiferiin või ensüüm nagu leelisfosfataas, β-galaktosidaas või
mädarõika peroksidaas. Bayer et al, Meth. Enz., 184: 138-163, (1990).
Haigused
Käesolev leiutis pakub seondumisainet, mis on JÄRJESTUSE ID-NR:25 sisaldav
peptikeha, seondub Ang-2-le ning on kasulik inimhaiguste ja patoloogiliste 25
seisundite ravimiseks. Ang-2 seondumisaktiivsust või muud rakutegevust
moduleerivad ained on mõeldud teiste raviainetega koos kasutamiseks, et nende
ravitoimet parandada või potentsiaalseid kõrvalmõjusid alandada.
Teatud aspektis pakub käesolev leiutis reagente ja meetodeid, mis on kasulikud
haiguste ja seisundite, millele on iseloomulik rakus Ang-2 toime ebasoodsad või 30
EE - EP1615952 B1 60
häiritud tasemed, ravimisel. Nende haiguste seas on vähk ja teised
hüperproliferatiivsed seisundid nagu hüperplaasia, psoriaas, kontaktdermatiit,
immunoloogilised häired ning viljatus.
Farmatseutilised koostised
Käsitletud on Ang-2 spetsiifiliste sideainete nagu peptikehad farmatseutilisi 5
koostiseid. Antikehasid sisaldavaid farmatseutilisi koostiseid on üksikasjalikumalt
kirjeldatud USA patendis 6,171,586, Lamile et al, väljastati 9. jaanuaril 2001.
Taolised koostised sisaldavad terapeutiliselt või profülaktiliselt tõhusas koguses
siin kirjeldatud spetsiifilist sideainet koos farmatseutiliselt sobiva ainega.
Farmatseutilised koostised võivad sisaldada antagonisti spetsiifilisi sideaineid, mis 10
osaliselt või täielikult moduleerivad vähemalt ühte Ang-2 bioloogilist toimet, koos
farmatseutiliselt sobiva ainega. Tavaliselt on spetsiifilised sideained loomale
manustamiseks piisavalt puhastatud.
Farmatseutiline koostis võib sisaldada formulatsioonimaterjale, et modifitseerida,
hoida või säilitada näiteks ühendi pH-d, osmolaarsust, viskoossust, selgust, värvi, 15
isotoonilisust, lõhna, steriilsust, stabiilsust või lahustuvuse kiirust või vabanemist,
imendumist või penetratsiooni. Sobivate formulatsioonimaterjalide seas on
muuhulgas aminohapped (nagu glütsiin, glutamiin, asparagiin, arginiin või lüsiin),
antimikroobikumid, antioksüdandid (nagu askorbiinhape, naatriumsulfit või
naatriumvesiniksulfit), puhvrid (nagu boraat, bikarbonaat, Tris-HCl, tsitraadid, 20
fosfaadid, teised orgaanilised happed), täiteained (nagu mannitool või glütsiin),
kelaadimoodustajad [nagu etüleendiamiin tetra-äädikhape (BDTA)],
kompleksitekitid (nagu kofeiin, polüvinüülpürrolidoon, beeta-tsüklodektsriin või
hüdroksüpropüül-beeta-tsüklodektsriin), täidised, monosahhariidid, disahhariidid ja
teised süsivesikud (nagu glükoos, mannoos või dekstriinid), proteiinid (nagu 25
seerumi albuniin, želatiin või immunoglobuliinid), värvained, maitseained ja
lahjendid, emulgaatorid, hüdrofiilsed polümeerid (nagu polüvinüülpürrolidoon),
madala molekulmassiga polüpeptiidid, soola moodustavad vastasioonid (nagu
naatrium), konservandid (nagu bensalkooniumkloriid, bensoehape, salitsüülhape,
timerosaal, fenetüülalkohol, metüülparabeen, propüülparabeen, kloorheksidiin, 30
sorbiinhape või vesinikperoksiid), lahustid (nagu glütseriin, propüleenglükool või
polüetüleenglükool), suhkrualkoholid (nagu mannitool või sorbitool),
EE - EP1615952 B1 61
suspendeerivad ained, surfaktandid või märgavad ained (nagu Pluronics, PEG,
sorbitaanestrid, polüsorbaadid nagu polüsorbaat 20, polüsorbaat 80, triiton,
trometamiin, letsitiin, kolesterool, tüloksapool), stabiilsust tõstvad ained (sukroos
või sorbitool), toonust tõstvad ained (nagu leelismetalli haliidid (soovitatavalt
naatrium- või kaaliumkloriid, mannitoolsorbitool), kandurid, diluendid, ekstsipiendid 5
ja/või farmatseutilised adjuvandid. (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18.
väljaanne, A.R. Gennaro, toim., Mack Publishing Company, 1990).
Optimaalse farmatseutilise koostise määrab antud valdkonnas pädev isik sõltuvalt
näiteks plaanitavast manustamisviisist, annustamisvormist ning soovitud annusest.
Vaata näiteks Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra. Taolised koostised 10
võivad mõjutada spetsiifilise sideaine füüsilist staadiumi, stabiilsust, in vivo
vabanemise kiirust ning in vivo kliirensi väärtust.
Primaarkandur või kandja farmatseutilises koostises võib olemuselt olla veepõhine
või mitte-veepõhine. Näiteks võib sobiv kandur või kandja olla vesi süstimiseks,
füsioloogiline soolalahus või kunstlik tserebrospinaalvedelik, millele on võimalusel 15
lisatud teisi materjale, mis on parenteraalseks manustamiseks tavapärased.
Neutraalne puhverdatud soolalahus või seerumi albumiiniga segatud soolalahus
on täiendavad näidiskandurid. Teised farmatseutilised näidiskoostised sisaldavad
Tris puhvrit pH-ga umbes 7,0-8,5 või atsetaatpuhvrit pH-ga umbes 4,0-5,5, mis
võib veel sisaldada sorbitooli või selle sobivat asendajat. Sideaine koostiseid võib 20
valmistada säilitamiseks, segades soovitud puhtusastmega valitud koostise
optimaalsete formulatsiooniainetega (Remington’s Pharmaceutical Sciences,
supra) lüofiliseeritud koogi või veelahuse kujul. Lisaks võib sideaine valmistada
lüofilisaadina, kasutades sobivaid ekstsipiente nagu sukroos.
Farmatseutilised koostised võib selekteerida parenteraalseks manustamiseks. 25
Teisel juhul võib koostisi selekteerida inhaleerimiseks või enteraalseks
manustamiseks nagu suukaudne, kuulmismeelte abil, silma kaudu, rektaalne või
vaginaalne. Taoliste farmatseutiliselt sobivate koostiste preparaadid on antud
valdkonnas teada.
EE - EP1615952 B1 62
Formulatsiooni koostisosad esinevad kontsentratsioonidel, mis manustamiskohale
sobivad. Näiteks kasutatakse puhvreid, et hoida koostist füsioloogilisel pH-l või
veidi madalamal pH-l, kus pH on tavaliselt vahemikus umbes 5 kuni umbes 8.
Kui kaalutakse parenteraalset manustamist, võivad antud leiutises kasutamiseks
mõeldud raviained olla pürogeenivabal parenteraalselt sobiva veelahuse kujul, mis 5
sisaldab soovitud spetsiifilist sideainet farmatseutiliselt sobivas kanduris. Eriti
sobiv kandur parenteraalseks süstiks on steriilne destilleeritud vesi, kus sideaine
formuleeritakse steriilse isotoonilise lahusena, mis on õigesti säilitatud. Ent
järgmine preparaat võib kaasata soovitud molekuli formulatsiooni ainega nagu
süstitavad mikrosfäärid, biolagundatavad osad, polümeersed ühendid 10
(polüpiimhape, polüglükoolhape), graanulid või liposoomid, mis soodustavad
produkti kontrollitud või pidevat vabanemist ning sellel võib olla pideva kestuse
soodustamise toime vereringes. Soovitud molekuli kasutamiseks teiste sobivate
võtete seas on siirdatavad ravimi manustamisseadmed.
Järgmises aspektis võib parenteraalseks manustamiseks sobivaid farmatseutilisi 15
formulatsioone koostada veelahuses, soovitatavalt füsioloogiliselt sobivates
puhvrites nagu Hanki lahus, Ringeri lahus või füsioloogiliselt puhverdatud
soolalahus. Veepõhised süstisuspensioonid võivad sisaldada aineid, mis tõstavad
suspensiooni viskoossust nagu naatriumkarboksüülmetüül-tselluloos, sorbitool või
dekstraan. Lisaks võib toimeühendite suspensioone valmistada sobivate 20
süstitavate õlisuspensioonidena. Sobivate lipofiilsete lahustite või kandurite seas
on rasvhapped nagu seesamiõli või sünteetilised rasvhappe estreid nagu
etüüloleaat, triglütseriidid või liposoomid. Mittelipiidsed polükatiooni
aminopolümeere võib samuti manustamiseks kasutada. Soovi korral võib
suspensioon sisaldada ka sobivaid stabilisaatorieid või aineid, et tõsta ühendite 25
lahustuvust ning võimaldada kõrge kontsentratsiooniga lahustite valmistamist.
Farmatseutilise koostise võib inhaleerimiseks formuleerida. Näiteks võib sideaine
formuleerida kuivpulbrina inhaleerimiseks. Samuti võib valmistada polüpeptiidi või
nukleiinhappe molekuli inhaleerimise lahuseid koos propellandiga aerosooli abil
manustamiseks. Ent lisavariandis võivad lahused olla nebuliseeritud. Bronhiaalset 30
manustamist on veel kirjeldatud PCT taotluses nr PCT/US94/001875, mis kirjeldab
keemiliselt modifitseeritud proteiinide kopsu kaudu manustamist.
EE - EP1615952 B1 63
Samuti on kaalutletud, et teatud formulatsioone võib manustada suu kaudu.
Sedasi manustatud sideaine molekule võib formuleerida koos kandjatega või ilma
nendeta, mida tavaliselt kasutatakse tahke annusevormide segamisel nagu
tabletid ja kapslid. Näiteks võib kapsli moodustada nii, et see vabastaks koostise
toimehulka seedetraktis siis, kui biokättesaadavus on maksimaalne ning 5
presüsteemne degradeerimine minimaalne. Täiendavaid aineid võib kaasata, et
lihtsustada sideaine molekuli imendumist. Kasutada võib ka diluente, maitseaineid,
madala sulamispunktiga vahasid, taimeõlisid, suspendeerimisaineid, tabletti
lahustavaid aineid ning sideaineid.
Suukaudseks manustamiseks mõeldud farmatseutilisi koostisi võib samuti 10
valmistada, kasutades antud valdkonnas teadaolevaid farmatseutiliselt sobivaid
kandureid annustes, mis sobivad suukaudseks manustamiseks. Taolised kandurid
võimaldavad farmatseutilisi koostiseid valmistada tablettide, pillide, dražeede,
kapslite, vedelike, geelide, siirupite, segude, suspensioonidena ja muu sarnasena
patsiendile seedimiseks. 15
Suukaudseks manustamiseks mõeldud farmatseutilisi preparaate võib saada
toimeaine kombineerimisel tahke ekstsipiendiga ja saadud graanulite segu (soovi
korral pärast peenestamist) töötlemisel, et saada tableti või dražee sisu. Soovi
korral võib lisada sobivaid abiaineid. Sobivate ekstsipientide seas on süsivesiku
või proteiini täidised nagu suhkrud, sealhulgas laktoos, sukroos, mannitool ja 20
sorbitool, tärklis maisist, nisust, riisist, kartulist või teistest taimedest, tselluloos,
nagu metüültselluloos, hüdroksüpropüülmetüül-tselluloos või naatriumkarboksü-
metüültselluloos, kummid, sealhulgas kummiaraabik ja tragakant, ning proteiinid
nagu želatiin ja kollageen. Soovi korral võib lisada lagundavaid või lahustuvust
parandavaid aineid nagu ristseotud polüvinüülpürrolidoon, agar ning algiinhape või 25
nende sool nagu naatriumalginaat.
Dražee sisu võib kasutada koos sobivate katematerjalidega nagu kontsentreeritud
suhkrulahused, mis võivad sisaldada ka kummiaraabikut, talki,
polüvinüülpürrolidooni, karbopooli geeli, polüetüleenglükooli ja/või titaandioksiidi,
lakilahuseid ning sobivaid orgaanilisi lahuseid või lahustisegusid. Tableti või 30
dražee kattematerjalidele võib lisada värvaineid või pigmente, et toodet tuvastada
või eristada toimeaine, st annuse kogust.
EE - EP1615952 B1 64
Oraalselt kasutatavad farmatseutilised preparaadid hõlmavad ka želatiinist
valmistatud kokkupandavaid (push-fit) kapsleid ning pehmeid tihendatud kapsleid,
mis on valmistatud želatiinist ja kattematerjalist nagu glütserool või sorbitool.
Kokkupandavad kapslid võivad sisaldada toimeaineid, mis on segatud täiteainete
või sideainetega nagu laktoos või tärklised, lubrikandid nagu talk või 5
magneesiumstearaat ning soovi korral stabilisaatoreid. Pehmetes kapslites võib
toimeained lahustada või suspendeerida sobivates vedelikes nagu rasvõlid või
vedel polüetüleenglükool stabilisaatoritega või ilma nendeta.
Järgmine farmatseutiline koostis võib sisaldada tõhusas koguses sideainet koos
mürgitute ekstsipientidega, mis sobivad tablettide valmistamiseks. Tablettide 10
lahustamisel steriilses vees või muus sobivas kanduris võib lahuseid valmistada
annuseühiku kujul. Sobivate ekstsipientide seas on muuhulgas inertsed diluendid
nagu kaltsiumkarbonaat, naatriumkarbonaat või bikarbonaat, laktoos või
kaltsiumfosfaat või sideained nagu tärklis, želatiin või akaatsia või libesteid nagu
magneesiumstearaat, stearhape või talk. 15
Täiendavad farmatseutilised koostised on antud valdkonnas pädevatele isikutele
ilmsed, sealhulgas formulatsioonid, mis hõlmavad sideaine molekule pideva või
reguleeritava manustamisega formulatsioonides. Teiste pideva või reguleeritud
manustamisvõtete nagu liposoomi kandurid, biolagunevad mikroosakesed või
poorsed graanulid ja depoosüstid formuleerimisvõtted on antud valdkonnas 20
pädevatele isikutele samuti teada. Vaata näiteks PCT/US93/00829, mis kirjeldab
poorsete polümeersete mikroosakeste reguleeritud vabanemist farmatseutiliste
koostiste manustamiseks. Pidevalt vabanevate preparaatide lisanäidete seas on
poolläbilaskvad polümeermaatritsid vormitud kujul nt kiled või mikrokapslid.
Pidevalt vabanevate matriitside seas võivad olla polüestrid, hüdrogeelid, 25
polülaktiidid (USA 3,773,919, EP 58,481), L-glutamiinhappe ja etüül-L-glutamaat-
gamma kopolümeerid [Sidman et al, Biopolymers, 22:547-556 (1983)], polü(2-
hüdroksüetüül-metakrülaat) [Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277,
(1981)] ning [Langer et al, Chem. Tech., 12:98-105(1982)], etüleenvinüülatsetaat
(Langer et al, supra) või polü-D(-)-3-hüdroksübutüühape (EP 133,988). Pidevalt 30
vabanevate koostiste seas on ka liposoomid, mida saab valmistada mis tahes
EE - EP1615952 B1 65
antud valdkonnas teadaoleval moel. Vaata nt Eppstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36,676, EP 88,046, EP 143,949.
In vivo manustamiseks mõeldud farmatseutiline koostis peab tavaliselt olema
steriilne. See on saavutatav läbi filtreerimismembraanide filtreerimisega. Kui
koostis lüofiliseeritakse, võib seda meetodit kasutatava steriliseerimise teostada 5
kas enne või pärast lüofilisatsiooni ja taastamist. Parenteraalseks manustamiseks
mõeldud koostist võib hoida lüofiliseeritud kujul või lahuses. Lisaks paigutatakse
parenteraalsed koostised üldiselt mahutisse, millel on steriilne juurdepääsuava,
näiteks intravenoosne lahusekott või kolb, millel on hüpodermilise süstlanõelaga
läbitav sulgur. 10
Pärast farmatseutilise koostise formuleerimist võib seda hoida steriilsetes
anumates lahuse, suspensiooni, geeli, emulsiooni, tahke või dehüdreeritud või
lüofiliseeritud pulbrina. Taolisi formulatsioone võib hoida kas kasutamiseks
valmiskujul või kujul (nt lüofiliseeritud), mis enne manustamist vajab taastamist.
Välja võib töötada komplektid üksikannuse manustamise ühiku tootmiseks. Iga 15
komplekt võib sisaldada nii esimest konteinerit kuiva proteiiniga ja teist konteinerit
veeformulatsiooniga. Komplektid võivad sisaldada üksikuid ja mitmekambrilisi
eeltäidetud süstlaid (nt vedeliku süstlad ja lüofiliseerimisel kasutatavad süstlad
(lyosyringes)).
Terapeutiliseks kasutamiseks mõeldud farmatseutilise koostise tõhus kogus sõltub 20
näiteks ravikontekstist ja eesmärkidest. Antud valdkonnas pädev isik mõistab, et
järelikult varieeruvad ravimiseks sobivad annuse tasemed sõltuvalt osaliselt
manustatud molekulist, näidustusest, mille jaoks sideaine molekuli kasutatakse,
manustamisviisi ning patsiendi suurusest (kehamass, keha pind või organi suurus)
ja seisundist (vanus või üldine tervis). Järelikult võib klinitsist annuse tiitrida ja 25
manustmisviisi modifitseerida, et saada optimaalne ravitoime. Tüüpiline annus
võib olla vahemikus umbes 0,1mg/kg kuni umbes 100mg/kg või rohkem, sõltudes
eespool nimetatud faktoritest. Teistes variantides võib annus olla vahemikus
0,1mg/kg kuni umbes 100mg/kg või 1mg/kg kuni umbes 100mg/kg või 5mg/kg kuni
umbes 100mg/kg. 30
EE - EP1615952 B1 66
Mis tahes ühendile võib terapeutiliselt tõhusa annuse määrata esialgu kas
rakukultuuri analüüsides või loomamudelitel nagu hiired, rotid, jänesed, koerad,
sead või ahvid. Loomamudelit võib kasutada ka sobiva kontsentratsioonivahemiku
ja manustamisviisi määramiseks. Seejärel võib taolist informatsiooni kasutada
inimestel kasulike annuste ja manustamisviiside tuvastamiseks. 5
Täpne annus määratakse ravi vajava subjektiga seotud faktorite valguses. Annust
ja manustamist kohandatakse toimeaine piisavate tasemete võimaldamiseks või
soovitud toime hoidmiseks. Arvestatavate faktorite seas on haigusseisundi
tõsidus, patsiendi üldine tervis, vanus, kehamass ja sugu, manustamise aeg ja
sagedus, ravimi kombinatsioon(de), reaktsiooni tundlikkus ning ravile 10
reageerimine. Pikatoimelisi farmatseutilisi koostiseid võib manustada iga 3 kuni 4
päeva, iga nädala või kord kahe nädala tagant, sõltuvalt konkreetse formulatsiooni
poolestusajast ning kliirensi määrast.
Doseerimise sagedus sõltub kasutatud formulatsioonis oleva sideaine molekuli
farmakokineetilistest parameetritest. Tavaliselt manustatakse koostist seni, kuni 15
saavutatakse doseering, mis annab soovitud toime. Järelikult võib koostist
manustada üksiku annusena või mitmekordsete annustena (samades või
erinevates kontsentratsioonides/doosides) teatud aja jooksul või pideva
infusioonina. Sobivad annused võib kindlaks teha sobivate doosile reageerimise
andmete põhjal. 20
Farmatseutilise koostise manustamisviis vastab teadaolevatele meetoditele, nt
oraalselt, süstiga intravenoosselt, intraperitoneaalselt, intratserebraalselt (intra-
parenhümaalselt), intratserebroventrikaarselt, intramuskulaarselt, silmasiseselt,
intraarteriaalselt, intraportaalselt, intralesionaalselt, intramedullaarselt,
intratekaalselt, intraventrikulaarselt, transdermaalselt, subkutaanselt, 25
intraperitoneaalselt, intranasaalselt, enteraalselt, pindmiselt, sublingvaalselt,
uretraalselt, vaginaalselt või rektaalselt pidevalt vabanevate süsteemidega või
siirdamisseadmetega. Soovi korral võib koostiseid manustada boolussüstina või
pideva infusiooniga või siirdamisseadmetega.
Teisel juhul või täiendavalt võib koostist manustada kohalikult membraani, käsna 30
või muu sobiva materjali siirdamisega, millele soovitud molekul on absorbeeritud
EE - EP1615952 B1 67
või kapseldatud. Kui kasutatakse siirdamisseadet, võib selle siirdada mis tahes
sobivasse koesse või organisse ning soovitud molekuli kohaletoimetamine võib
toimuda difusiooniga, pikaajalise boolusena või pideva manustamisena.
Mõnel juhul soovitakse farmatseutilisi koostisi kasutada ex vivo moel. Taolistel
juhtudel kasutatakse patsiendilt eemaldatud kudedel, rakkudel või organitel 5
farmatseutilisi koostisi, mille järel rakud, koed ja/või organid patsiendile
järgemööda tagasi siirdatakse.
Muul juhul võib käesoleva leiutise sideainet nagu peptikeha manustada teatud
rakkude siirdamisel, mida on geneetiliselt muundatud, kasutades teadaolevaid
meetodeid nagu need, mida on siin kirjeldatud, et ekspresseerida ja eritada 10
polüpeptiidi. Taolised rakud võivad olla looma või inimese rakud ning autoloogsed,
heteroloogsed või ksenogeensed. Soovi korral võivad need rakud olla
inimtaoliseks tehtud. Immunoloogilise reaktsiooni võimalikkuse alandamiseks
võivad rakud olla kapseldatud, et vältida ümbritsevate kudede infiltratsiooni.
Kapseldatud materjalid on tavaliselt bioloogiliselt ühtivad, poolläbilaskvad 15
polümeersed kestad või membraanid, mis võimaldavad proteiinprodukti(de)
vabanemist, aga ennetavad rakkude hävinemist patsiendi immuunsüsteemi poolt
või muude ümbritsevatest kudedest tulenevate kahjulike faktorite poolt.
Polüteraapia
Leiutise spetsiifilisi sideaineid (nagu peptikehad) saab kasutada koos teiste 20
ravimitega Ang-2 ekspressiooniga seostatavate haiguste ravimisel. Nende teiste
ravimite seas on näiteks kiiritusravi, kemoteraapia ja sihtmärgistatud ravimid nagu
Herceptin™, Rituxan™, Gleevec™ ja muu sarnane. Siin eraldi loetlemata
täiendavad polüteraapiad kuuluvad samuti käesoleva leiutise ulatusse.
Järelikult hõlmab leiutis ühe või mitme leiutise spetsiifilise sideaine manustamist 25
samale patsiendile koos ühe või mitme täiendavalt sobiva ainega, millest igaühte
manustatakse vastavalt sellele ravimisele sobivale režiimile. Siia kuulub leiutise
spetsiifilise sideaine ning ühe või mitme sobiva aine samaaegne manustamine.
Siin kasutatud terminid „manustatakse üheaegselt“ ja „üheaegne manustamine“
hõlmab ühe või mitme spetsiifilise sideaine (nagu peptiid või peptikeha) vastavalt 30
EE - EP1615952 B1 68
leiutisele üsna üheaegset manustamist koos ühe või mitme täiendavalt sobiva
ainega.
Siin kasutatud termin „mitte-üheaegne“ manustamine hõlmab ühe või mitme
selektiivse sideaine (nagu peptiid või peptikeha) vastavalt leiutisele ning ühe või
mitme täiendavalt sobiva aine manustamist erinevatel aegadel või mis tahes 5
järjekorras kas kattuvalt või mitte. Siia kuulub muuhulgas järjestikune ravi (nagu
eelravi, järelravi või kattuv ravi) kombinatsioon komponentidega ning ka režiimid,
kus ravimeid vahetatakse välja või kus ühte komponenti manustatakse
pikaajaliselt ning teist(i) manustatakse perioodiliselt. Komponente võib manustada
samades või eraldi koostistes ning samal või erineval manustamisviisil. 10
Kemoteraapiaga ravimine võib rakendata anti-neoplastilisi aineid, sealhulgas
näiteks alküülivaid aineid, sealhulgas: lämmastik-sinepid nagu meklooretamiin,
tsüklofosfamiid, ifosfamiid, melfalaan ja klorambutsiil; nitrosouuread nagu
karmustiin (BCNU), lomustiin (CCNU) ja semustiin (metüül-CCNU);
etüleenimiinid/metüülmelamiin nagu trietüleenamiin (TEM), trietüleen, 15
tiofosforamiid (tiotepa), heksametüül-melamiin (HMM, altretamiin);
alküülsulfonaadid nagu busulfaan; triasiinid nagu dakarbasiin (DTIC);
antimetaboliidid, sealhulgas foolhappe analoogid nagu metotreksaat ja
trimetreksaat, pürimidiini analoogid nagu 5-fluorouratsiil, fluorodeoksüuridiin,
gemtsitabiin, tsütosiin-arabinosiid (AraC, tsütarabiin), 5-asatsütidiin, 2,2’-20
difluorodeoksütsütidiin, puriini analoogid nagu 6-merkaptopuriin, 6-tioguaniin,
asatiopuriin, 2’-deoksükoformütsiin (pentostatiin), erütrohüdroksünonüüladeniin
(EHNA), fludarabiinfosfaat ja 2-klorodeoksüadenosiin (kladribiin, 2-CdA);
looduslikud tooted, sealhulgas antimitootilised ravimid nagu paklitakseel, vinka-
alkaloidid, sealhulgas vinblastiin (VLB), vinkristiin ja vinorelbiin, taksoteer, 25
estramustiin ja estramustiinfosfaat; epipodofüllotoksiinid nagu etoposiid ja
teniposiid; antibiootikumid nagu aktinomütsiin D, daunomütsiin (rubidomütsiin),
doksorubitsiin, mitoksantroon, idarubitsiin, bleomütsiinid, plikamütsiin
(mitramütsiin), mitomütsiin C ja aktinomütsiin; ensüümid nagu L-asparaginaas;
bioloogilise reaktsiooni modifikaatorid nagu interferoon-alfa, IL-2, GCSF ja GM-30
CSF; mitmesugused ained, sealhulgas plaatina koordinatsioonikompleksid nagu
tsisplatiin ja karboplatiin, antratseendioonid nagu mitoksantroon, asendatud uurea
EE - EP1615952 B1 69
nagu hüdroksü-uurea, metüülhüdrasiini derivaadid, sealhulgas N-metüülhüdrasiin
(MIH) ja prokarbasiin, neerupealiste supressandid nagu mitotaan (o,p’-DDD) ja
aminogluteetimiid; hormoonid ja antagonistid, sealhulgas adrenokortikosteroidsed
antagonistid nagu prednisoon ja ekvivalendid deksametasoon ja
aminogluteetimiid; progestiin nagu hüdroksüprogesteroon-kaproaat, 5
medroksüprogesteroon-atsetaat ja megestroolatsetaat; östrogeen nagu
dietüülstilbestrool ja etinüül-estradiooli ekvivalendid; antiöstrogeen nagu
tamoksifeen; androgeenid, sealhulgas testosteroon-propionaat ja
fluoksümesteroon/ekvivalendid; antiandrogeenid nagu flutamiid, gonadotropiini
vabastava hormooni analoogid ja leuproliid; ning mittesteroidsed antiandrogeenid 10
nagu flutamiid.
Kasvufaktoritega kombineeritud ravi võib hõlmata tsütokiine, lümfokiine,
kasvufaktoreid või teisi hematopoeetilisi faktoreid nagu M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-
1, IL-2, IL-3, BL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15,
IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, 15
trombopoietiin, tüverakufaktor ja erütropoietiin. Teiste koostiste seas võivad olla
teadaolevad angiopoietiinid, näiteks Ang-1, -2, -4, -Y ja/või inimese Ang-sarnane
polüpeptiid ja/või vaskulaarse endoteeli kasvufaktor (VEGF). Kasvufaktorite seas
on angiogeniin, luu morfogeenne proteiin-1, luu morfogeenne proteiin-2, luu
morfogeenne proteiin-3, luu morfogeenne proteiin-4, luu morfogeenne proteiin-5, 20
luu morfogeenne proteiin-6, luu morfogeenne proteiin-7, luu morfogeenne proteiin-
8, luu morfogeenne proteiin-9, luu morfogeenne proteiin-10, luu morfogeenne
proteiin-11, luu morfogeenne proteiin-12, luu morfogeenne proteiin-13, luu
morfogeenne proteiin-14, luu morfogeenne proteiin-15, luu morfogeenne proteiini-
retseptor IA, luu morfogeenne proteiini-retseptor IB, aju närvikasvufaktor, tsiliaarne 25
neurotroofne faktor, tsütokiini põhjustatud neutrofiili kemotaktiline faktor 1,
tsütokiin-tekitatud neutrofiil, kemotaktiline faktor 2, tsütoküün-põhjustatud neutrofiili
kemotaktiline faktor 2, endoteelraku kasvufaktor, endoteliin-1, epidermaalne
kasvufaktor, epiteelist tuletatud neutrofiili atraktant, fibroblasti kasvufaktor 4,
fibroblasti kasvufaktor 5, fibroblasti kasvufaktor 6, fibroblasti kasvufaktor 7, 30
fibroblasti kasvufaktor 8, fibroblasti kasvufaktor 8b, fibroblasti kasvufaktor 8c,
fibroblasti kasvufaktor 9, fibroblasti kasvufaktor 10, happeline fibroblasti
kasvufaktor, aluseline fibroblasti kasvufaktor, gliia päritolu neurotroofne faktor-1,
EE - EP1615952 B1 70
gliia päritolu neurotroofne faktor-2, kasvuga seotud proteiin, kasvuga seotud
proteiin-1, kasvuga seotud proteiin-2, kasvuga seotud proteiin-3, hepariini siduv
epidermaalne kasvufaktor, hepatotsüüdi kasvufaktor, hepatotsüüdi kasvufaktori
retseptor, insuliinisarnane kasvufaktor I, insuliinisarnane kasvufaktori retseptor,
insuliinisarnane kasvufaktor II, insuliinisarnast kasvufaktorit siduv proteiin, 5
keratinotsüüdi kasvufaktor, leukeemiat inhibeeriv faktor, leukeemiat inhibeeriv
faktor-1, närvi kasvufaktor, närvi kasvufaktori retseptor, neurotrofiin-3, neurotrofiin-
4, platsenta kasvufaktor, platsenta kasvufaktor 2, vereliistakutest pärit
endoteelraku kasvufaktor, vereliistakutest pärit kasvufaktor, vereliistakutest pärit
kasvufaktori A ahel, vereliistakutest pärit kasvufaktor AA, vereliistakutest pärit 10
kasvufaktor AB, vereliistakutest pärit kasvufaktori B ahel, vereliistakutest pärit
kasvufaktor BB, vereliistakutest pärit kasvufaktori retseptor-1, vereliistakutest pärit
kasvufaktor retseptor-2, pre-B raku kasvu stimuleeriv faktor, tüveraku faktor,
tüveraku faktori, transformeeriv kasvufaktor-1, transformeeriv kasvufaktor-2,
transformeeriv kasvufaktor-1, transformeeriv kasvufaktor-1,2, transformeeriv 15
kasvufaktor-2, transformeeriv kasvufaktor-3, transformeeriv kasvufaktor-5, latentne
transformeeriv kasvufaktor-1, transformeeriva kasvufaktori-1 seostusvalk I,
transformeeriva kasvufaktori-1 seostusvalk II, transformeeriva kasvufaktori-1
seostusvalk III, kasvaja nekroosifaktori retseptori I tüüp (TNF-R1), kasvaja
nekroosifaktori retseptori II tüüp (TNF-R2), urokinaasi-tüüpi plasminogeeni 20
aktivaator-retseptor, vaskulaarne endoteeli kasvufaktor ning kimäärsed valgud ja
nende bioloogiliselt või immunoloogiliselt aktiivsed fragmendid.
On mõistetav, et leiutise spetsiifilisi sideaineid (nagu peptiidid või peptikehad) võib
manustada ühe või mitme põletikuvastase ainega. Siin kasutatud termin
„põletikuvastane“ tähendab üldiselt mis tahes ainet, mis alandab patsiendil 25
põletikku või tursumist. Siin on loetletud terve hulk põletikuvastaste ainete näiteid,
aga on mõistetav, et võib leiduda täiendavaid sobivaid põletikuvastaseid aineid,
mida ei ole siin loetletud, kuid mida antud leiutis hõlmab.
Põletikuvastane aine võib olla näiteks ühend, mis inhibeerib põletikuliste
tsütokiinide koostoimet nende retseptoritega. Leiutise spetsiifiliste sideainetega 30
kombineeritult kasulike tsütokiini inhibiitorite näidete seas on näiteks TGF-β
antagonistid (nagu antikehad) ning antagonistid (nagu antikehad), mis on
EE - EP1615952 B1 71
suunatud põletikus osalevate interleukiinide vastu. Taolisi interleukiine on siin
kirjeldatud ning eelistatult on nende seas muuhulgas IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-
6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17 ja IL-18. Vaata Feghali, et al, Frontiers in
Biosci., 2:12-26 (1997).
Leiutise spetsiifilisi sideaineid võib manustada ka koos I tüüpi proteiini kinaasi A 5
inhibiitoritega, et parandada T-raku proliferatsiooni HIV nakkusega patsientidel,
kes saavad anti-retroviirusravi.
Närvi kasvufaktoreid (NGF-d) saab kombineerida ka leiutise spetsiifiliste
sideainetega teatud seisundite ravimiseks. Taoliste seisundite seas on
neurodegeneratiivsed haigused, seljaaju vigastused ja hulgiskleroos. Antud 10
kombinatsiooniga ravitavad muud haigused on glaukoom ja diabeet.
Eelistatud kombinatsiooniravi käsitleb leiutise spetsiifilist sideainet, mida
manustatakse patsiendile koos ühe või mitme sobiva IL-1 inhibiitoriga. IL-1
inhibiitorite seas on muuhulgas IL-1 retseptorit siduvad peptiidi fragmendid, IL-1
või IL-1 beeta või IL-1 retseptori I tüübi vastu suunatud antikehad ning 15
rekombinantsed proteiinid, mis sisaldavad kõiki või osa retseptoreid IL-1 või selle
modifitseeritud variantidele, sealhulgas geneetiliselt modifitseeritud muteiinid,
multimeersed vormid ja pidevalt vabanevad formulatsioonid. Spetsiifiliste
antagonistide seas on IL-1ra polüpeptiidid, IL-1 beetat konverteeriva ensüümi
(ICE) inhibiitorid, antagonistlikud I tüüpi I IL-1 retseptori antikehad, I tüüpi IL-1 20
retseptori ja II tüüpi IL-1 retseptori IL-1 seostusvormid, IL-1 antikehad, sealhulgas
IL-1 alfa ja IL-1 beeta ning teised IL-1 perekonna liikmed ning ravim nimega IL-1
Trap (Regeneron). IL-1ra polüpeptiidide seas on IL-1ra vormid, mida on kirjeldatud
USA patendis nr 5,075,222, ning modifitseeritud vormid ja variandid, sealhulgas
need, mida on kirjeldatud patentides U.S. 5,922,573, WO 91/17184, WO 92 16221 25
ja WO 96 09323. IL-1 beetat konverteeriva ensüümi (ICE) inhibiitorite seas on
peptidüül ja väikse molekuli ICE inhibiitorid, sealhulgas need, mida on kirjeldatud
PCT patenditaotlustes WO 91/15577, WO 93/05071, WO 93/09135, WO 93/14777
ja WO 93/16710 ning Euroopa patenditaotluses 0 547 699. Mitte-peptidüüli
ühendite seas on need, mida on kirjeldatud PCT patenditaotluses WO 95/26958, 30
USA patendis nr 5,552,400, USA patendis nr 6,121,266, ja Dolle et al, J. Med
Chem., 39, lk 2438-2440 (1996). Täiendavaid ICE-sid on kirjeldatud USA
EE - EP1615952 B1 72
patentides nr 6,162,790, 6,204,261, 6,136,787, 6,103,711, 6,025,147, 6,008,217,
5,973,111, 5,874,424, 5,847,135, 5,843,904, 5,756,466, 5,656,627 ja 5,716,929.
Tüüp I IL-1 retseptori ja tüüp II IL-1 retseptori IL-1 seostusvorme on kirjeldatud
USA patentides nr 4,968,607, 4,968,607, 5,081,228, Re 35,450, 5,319,071 ja
5,350,683. Teiste sobivate IL-1 antagonistide seas on muuhulgas IL-1-st pärit 5
peptiidid, mis suudavad konkureerivalt seonduda IL-1 signaalivale retseptorile I
tüüpi IL-1R. Teatud IL-1 (ja teise tsütokiini) antagoniste puudutavaid täiendavaid
juhiseid võib leida USA patendis nr 6,472,179.
Lisaks on sobilikud TNF inhibiitorid ja nende seas on muuhulgas TNFα retseptorit
siduva peptiidi fragmendid, antisenssed oligonukleotiidid või ribosüümid, mis 10
inhibeerivad TNFα tootmist, TNFα vastu suunatud antikehad ning rekombinantsed
proteiinid, mis sisaldavad kõiki või osa retseptoreid TNFα või selle modifitseeritud
variantide jaoks, sealhulgas geneetiliselt muundatud muteiinid, multimeersed
vormid ja pidevalt vabanevad formulatsioonid. Samuti on sobivad TACE (kasvaja
nekroosifaktorit-α konverteeriv ensüüm) inhibiitorid, nagu TAPI (Immunex Corp.) ja 15
GW-3333X (Glaxo Wellcome Inc.). Samuti sobivad molekulid, mis inhibeerivad
IgA-α1AT kompleksi moodustumist, nagu patendis EP 0 614 464 B avaldatud
peptiidid, või selle kompleksi vastased antikehad. Lisaks on sobivate molekulide
seas muuhulgas TNFα-inhibeerivad disahhariidid, glükosamiini sulfaaditud
derivaadid või teised sarnased süsivesikud, mida on kirjeldatud USA patendis nr 20
6,020,323. Täiendavate sobivate molekulide seas on peptiidi TNFα inhibiitorid,
mida on kirjeldatud USA patentides nr 5,641,751 ja 5,519,000, ning D-aminohapet
sisaldavad peptiidid, mida on kirjeldatud USA patendis nr 5,753,628. Lisaks
sobivad ka TNFα konverteeriva ensüümi inhibiitorid. WO 01/03719 kirjeldab
täiendavaid aineid, mida saab vastavalt leiutisele koos kasutada. 25
Ent veel on sobivate ühendite seas muuhulgas väiksed molekulid nagu talidomiid
või talidomiidi analoogid, pentoksifülliin või maatriks metalloproteinaasi (MMP)
inhibiitorid või teised väiksed molekulid. Antud sihtotstarbeks sobivate MMP
inhibiitorite seas on näiteks need, mida on kirjeldatud USA patentides nr
5,883,131, 5,863,949 ja 5,861,510, ning merkapto-alküülpeptidüül ühendid, nagu 30
on kirjeldatud USA patendis nr 5,872,146. TNFα tootmist alandada suutvate teiste
väikeste molekulide seas on näiteks molekulid, mida on kirjeldatud USA
EE - EP1615952 B1 73
patentides nr 5,508,300, 5,596,013 ja 5,563,143. Täiendavate sobivate väikeste
molekulide seas on muuhulgas MMP inhibiitorid, nagu on kirjeldatud USA
patentides nr 5,747,514 ja 5,691,382, ning hüdroksaamhappe derivaadid, nagu on
kirjeldatud USA patendis nr 5,821,262. Sobivate lisa molekulide seas on näiteks
väiksed molekulid, mis inhibeerivad fosfodiesteraasi IV ja TNFα tootmist nagu 5
asendatud oksiimi derivaadid (WO 96/00215), kinoliin-sulfoonamiidid (USA patent
nr 5,834,485), arüülfuraani derivaadid (WO 99/18095) ja heterobitsüklilised
derivaadid (WO 96/01825; GB 2 291 422 A). Kasulikud on ka tiasoolid derivaadid,
mis pärsivad TNFα ja IFNα (WO99/15524), ning ksantiini derivaadid, mis pärsivad
TNFα ja teisi proinflammatoorseid tsütokiine (vaata näiteks USA patente 10
5,118,500, 5,096,906 ja 5,196,430). Siin kirjeldatud seisundite ravimiseks kasulike
täiendavate väikeste molekulide seas on need, mida on kirjeldatud USA patendis
nr 5,547,979.
Kombineeritud raviga manustatavate ravimite ja ravimitüüpide täiendavate näidete
seas on muuhulgas viirusevastased ained, antibiootikumid, analgeetikumid (nt 15
atseetaminofeen, kodeiin, propoksüfeen-napsülaat, oksükodoon vesinikkloriid,
hüdrokodoon bitartraat, tramadool), kortikosteroidid, põletikuliste tsütokiinide
antagonistid, haigust modifitseerivad antireumaatilised ravimid (DMARD-d),
mittesteroidsed põletikuvastased ravimid (NSAID-d) ja aeglase toimega
antireumaatilised ravimid (SAARD-d). 20
Haigust modifitseerivate antireumaatiliste ravimite (DMARD-d) näidete seas on
muuhulgas: Rheumatrex™ (metotreksaat), Enbrel® (etanertsept), Remicade®
(infliksimaab), Humira™ (adalimumaab), Segard® (afelimomaab), Arava™
(leflunomiid), Kinere™ (anakinra), Arava™ (leflunomiid), D-penitsillamiin,
Myochrysine, Plaquenil, Ridaura™ (auranofiin), Solganal, lenertsept (Hoffman-La 25
Roche), CDP870 (Celltech), CDP571 (Celltech), ning antikehad, mida on
kirjeldatud patendis EP0 516 785 B1, USA patendis nr 5,656,272, EP0 492 448
A1, onertsept (Serono; CAS reg-nr 199685-57-9), MRA (Chugai), Imuran™
(asatiopriin), NFKB inhibiitorid; Cytoxan™ (tsüklofosfamiid), tsüklosporiin,
hüdroksüklorokiin-sulfaat, minotsükliin, sulfasalasiin ning kullaühendid nagu 30
suukaudsed kullaravimid, kuld-naatriumtiomalaat ja aurotioglükoos.
EE - EP1615952 B1 74
Järgmiste sobivate molekulide seas on näiteks lahustuvad TNFR-d, mis
pärinevad p55 ja p75 TNFR-dest erineva TNFα retseptori molekulide rakuvälistest
piirkondadest nagu näiteks TNFR, mida on kirjeldatud patendis WO 99/04001,
sealhulgas sellest TNFR-st pärinevad TNFR-Ig-d. Järgmised asjakohased TNFα
inhibiitorid sobivad siin kirjeldatud kasutuseks. Nende seas on lisaks siin 5
kirjeldatud TNFα või TNFR vastase antikeha kasutamisele ka TNFα-st pärit
peptiid, mis võivad toimida TNFα konkureeriva inhibiitorina (nagu need, mida on
kirjeldatud USA patendis nr 5,795,859 või USA patendis nr 6,107,273), TNFR-IgG
sulandvalgud, nagu see, mis sisaldab, lahustuva TNFR ja IgG sulandvalgust
erineva p55 TNFα retseptori rakuvälist osa, või teised molekulid, mis alandavad 10
endogeense TNFα tasemeid nagu TNFα konverteeriva ensüümi inhibiitorid (vaata
nt U.S. 5,594,106), või väikesed molekulid või TNFα inhibiitorid, millest osa on siin
kirjeldatud.
Kuigi TNF antikehadega seoses määrab optimaalse annuse kogenud
tervisetöötaja vastavalt kõnealuse patsiendi konkreetsetele vajadustele, on üks 15
eelistatud annuse vahemiku näidis TNFα vastasele antikehale 0,1 kuni 20mg/kg ja
veel soovitatavamalt 1-10mg/kg. Teine eelistatud annuse vahemik anti-TNFα
antikeha jaoks on 0,75 kuni 7,5mg/kg kehamassist.
Käesolev leiutis võib ka rakendada spetsiifilist sideainet ja mis tahes ühte või mitut
mitte-steroidset põletikuvastast ravimit (NSAID-d). NSAID-de põletikuvastane 20
toime tuleneb vähemalt osaliselt prostaglandiini sünteesi inhibeerimisest.
Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan 7.
väljaanne (1985). NSAID-d saab jaotada üheksaks rühmaks: (1) salitsüülhappe
derivaadid, (2) propioonhappe derivaadid, (3) äädikhappe derivaadid, (4)
fenaamhappe derivaadid, (5) karboksüülhappe derivaadid, (6) butüürhappe 25
derivaadid, (7) oksikaamid, (8) pürasoolid ja (9) pürasoloonid. NSAID-de näidete
seas on muuhulgas: Anaprox™, Anaprox DS™ (naprokseen-naatrium); Ansaid™
(flurbiprofeen), Arthrotec™ (diklofenaknaatrium + misoprostiil),
Cataflam™/Voltaren™ (diklofenak-kaalium); Clinoril™ (sulindak), Daypro™
(oksaprosiin), Disalcid™ (salsalaat), Dolobid™ (diflunisaal), EC Naprosyn™ 30
(naprokseen-naatrium), Feldene™ (piroksikaam), Indocin™, Indocin SR™
(indometatsiin), Lodine™, Lodine XL™ (etodolak), Motrin™ (ibuprofeen),
EE - EP1615952 B1 75
Naprelan™ (naprokseen), Naprosyn™ (naprokseen); Orudis™, (ketoprofeen),
Oruvail™ (ketoprofeen), Relafen™ (nabumetoon), Tolectin™, (tolmetiin-naatrium),
Trilisate™ (koliin-magneesium-trisalitsülaat), Cox-1 inhibiitorid, Cox-2 inhibiitorid
nagu Vioxx™ (rofekoksiib), Arcoxia™ (etorikoksiib), Celebrex™ (tselekoksiib),
Mobic™ (meloksikaam), Bextra™ (valdekoksiib), Dynastat™ (parakoksiib-5
naatrium), Prexige™ (lumirakoksiib) ja nambumetoon. Täiendavate sobivate
NSAID-de seas on muuhulgas järgnevad: ε-atseetamido-kaproonhape, S-
adenosüülmetioniin, 3-amino-4-hüdroksübutüürhape, amiksetriin, anitrasafeen,
antrafeniin, bendasak, bendasak-lüsinaat, bensüdamiin, beprosiin, broperamool,
bukoloom, bufesolak, kiprokvasoon (ciproquazone), kloksimaat (cloximate), 10
dasidamiin (dazidamine), deboksameet (deboxamet), detomidiin, difeenpiramiid
(difenpiramide), difeenpüramiid (difenpyramide), difisalamiin (difisalamine),
ditasool, emorfasoon, fanetisool mesülaat, fenflumisool, floktafeniin, flumisool,
fluniksiin, fluprokvasoon (fluproquazone), fopirtoliin (fopirtoline), fosfosaal,
guaimesaal (guaimesal), guaiasuleen, isoniksirn (isonixirn), lefetamiin HCl, 15
leflunomiid, lofemisool, lotifasool, lüsiin-kloniksinaat (lysin clonixinate),
meseklasoon, nabumetoon, niktindool, nimesuliid, orgoteiin, orpanoksiin,
oksakeprolm (oxaceprolm), oksapadool, paranüliin (paranyline), perisoksaal,
perisoksaaltsitraat, pifoksiim, piprokseen (piproxen), pirasolak, pirfenidoon,
prokvasoon (proquazone), proksasool, tielaviin B (thielavin B), tiflamisool, 20
timegadiin, tolektiin (tolectin), tolpadool, trüptamiid ja need, mis on märgitud firma
koodnumbriga nagu 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504,
AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506,
GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309,
ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, 25
SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-bensoüül-1-
indaankarboksüülhape), TVX2706, U60257, UR2301 ja WY41770. NSAID-dega
sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seonduvad
NSAID-d kuuluvad samuti antud rühma.
Sobivate SAARD-ide või DMARD-ide seas on muuhulgas: allocupreide naatrium, 30
auranofiin, aurotioglükoos, aurotioglükaniid, asatiopriin, brekvinaar (brequinar)
naatrium, butsillamiin, kaltsium 3-aurotio-2-propanool-1-sulfonaat, klorambutsiil,
klorokiin, klobusariit, kuproksoliin, tsüklofosfamiid, tsüklosporiin, dapsoon, 15-
EE - EP1615952 B1 76
deoksüspergualiin, diatsereiin, glükoosamiin, kulla soolad (nt tsükloniini
(cycloquine) kulla sool, kuld naatrium-tiomalaat, kuld-naatrium-tiosulfaat),
hüdroksüklorokiin, hüdroksü-uurea, kebusoon, levamisool, lobensariit, melitiin, 6-
merkaptopuriin, metotreksaat, misoribiin, mükofenolaat mofetiil, myoral,
lämmastik-sinep, D-penitsillamiin, püridinool imidasoolid nagu SKNF86002 ja 5
SB203580, rapamütsiin, tioolid, tümopoietiin (thymopoietin) ja vinkristiin. Sarnaste
analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud SAARD-d või
DMARD-d kuuluvad samuti antud rühma.
Signaalkaskaadides olevate kinaaside inhibiitorid on samuti sobivad ained leiutise
spetsiifiliste sideainetega kombineerimiseks. Nende seas on muuhulgas ained, 10
mis suudavad inhibeerida P-38 (alias „RK“ või „SAPK-2“, Lee et al, Nature,
372:739 (1994). P-38 iseloomustatakse kui seriin/treoniini kinaasi (vaata Han et al,
Biochimica Biophysica Acta, 1265:224-227 (1995). On tõestatud, et P-38
inhibiitorid sekkuvad rakuvälisesse stiimulisse ja IL-1 eritumisse ning rakust pärit
TNFα hõlmab signaalitransduktsiooni blokeerimist signaali rajal oleva kinaasi 15
inhibeerimise kaudu.
Lisaks on sobivad MK2 inhibiitorid ja tpl-2 inhibiitorid. Täiendavalt on sobilikud T-
raku inhibiitorid, sealhulgas näiteks ctla-4, CsA, Fk-506, OX40, OX40R-Fc, OX40
antikeha, OX40 ligand, OX40 ligandi antikeha, lck ja ZAP70. Lisaks sobivad ka
retinoidid, sealhulgas suukaudsed retinoidid ning TGF-β antagonistid. 20
Leiutise spetsiifiliste sideainetega kombineerimiseks sobivate järgmiste ainete
seas on näiteks mis tahes üks või mitu salitsüülhappe derivaati, eelravimi estrit või
selle farmatseutiliselt sobivat soola. Taoliste salitsüülhappe derivaatide, eelravimi
estrite või selle farmatseutiliselt sobivate soolade seas on: atseetaminosalool,
aloksipriin (aloxiprin), aspiriin, benorülaat, bromosaligeniin, kaltsium-25
atsetüülsalitsülaat, koliin-magneesium trisalitsülaadi diflusinaal, etersalaat,
fendosaal, gentishape, glükool-salitsülaat, imidasool-salitsülaat, lüsiin
atsetüülsalitsülaat, mesalamiin, morfoliin-salitsülaat, 1-naftüül-salitsülaat,
olsalasiin, parsalmiid, fenüül atsetüülsalitsülaat, fenüülsalitsülaat, salatseetamiid,
salitsüülamiid O-äädikhape, salsalaat ja sulfasalasiin. Sarnaste analgeetiliste ja 30
põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud salitsüülhappe derivaadid on
samuti siia rühma kaasatud. Täiendavate sobivate ainete seas on näiteks
EE - EP1615952 B1 77
propioonhappe derivaadid, eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad
soolad. Propioonhappe derivaatide, eelravimi estrite või nende farmatseutiliselt
sobivate soolade seas on: alminoprofeen, benoksaprofeen, buklokshape,
karprofeen, deksindoprofeen, fenoprofeen, flunoksaprofeen, fluprofeen,
flurbiprofeen, furkloprofeen, ibuprofeen, ibuprofeen-alumiinium, ibuproksaam, 5
indoprofeen, isoprofeen, ketoprofeen, loksoprofeen, miroprofeen, naprokseen,
oksaprosiin, piketoprofeen, pimeprofeen (pimeprofen), pirprofeen, pranoprofeen,
protisiinhape (protizinic acid), püridoksiprofeen (pyridoxiprofen), suprofeen,
tiaprofeenhape ja tioksaprofeen. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste
omadustega strukturaalselt seotud propioonhappe derivaadid on samuti siia 10
rühma kaasatud. Kasutuseks sobivad ka äädikhappe derivaadid, eelravimi estrid
või nende farmatseutiliselt sobivad soolad. Äädikhappe derivaatide, eelravimi
estrite või nende farmatseutiliselt sobivate soolade seas on: atsemetatsiin,
alklofenak, amfenak, bufeksamak, tsinmetatsiin, klopirak (clopirac), delmetatsiin,
diklofenak-naatrium, etodolak, felbinak, fenklofenak, fenklorak, fenklosiinhape 15
(fenclozic acid), fentiasak, furofenak, glükametatsiin (glucametacin), ibufenak,
indometatsiin, isofesolak, isoksepak (isoxepac), lonasolak, metiasiinhape,
oksametatsiin, okspinak, pimetatsiin, proglumetatsiin, sulindak, talmetatsiin,
tiaramiid, tiopinak, tolmetiin, sidometatsiin ja somepirak. Sarnaste analgeetiliste ja
põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud äädikhappe derivaadid on 20
samuti siia rühma kaasatud. Järgmised siin kirjeldatud kasutamiseks sobivad on
fenaamhape derivaadid, eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad
soolad. Fenaamhape derivaatide, eelravimi estrite või nende farmatseutiliselt
sobivate soolade seas on: enfenaamhape, etofenamaat, flufenaamhape,
isoniksiin, meklofenaamhape, meklofenamaat-naatrium, medofenaamhape, 25
mefanaamhape, nifluumhape, talniflumaat, terofenamaat, tolfenaamhape ja
ufenamaat. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega strukturaalselt
seotud fenaamhape derivaadid on samuti siia rühma kaasatud.
Lisaks on sobivad kasutatavad karboksüülhappe derivaadid, eelravimi estrid või
nende farmatseutiliselt sobivad soolad: klidanak, diflunisaal, flufenisaal, inoridiin 30
(inoridine), ketorolak ja tinoridiin. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste
omadustega strukturaalselt seotud karboksüülhappe derivaadid on samuti siia
rühma kaasatud. Lisaks on sobilikud butüürhappe derivaadid, eelravimi estrid või
EE - EP1615952 B1 78
nende farmatseutiliselt sobivad soolad. Kasutatavad butüürhappe derivaadid,
eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad on: bumadisoon,
butibufeen, fenbufeen ja ksenbutsiin. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste
omadustega strukturaalselt seotud butüürhappe derivaadid on samuti siia rühma
kaasatud. Oksikaamid, eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad 5
on samuti sobilikud. Oksikaamide, eelravimi estrite või nende farmatseutiliselt
sobivate soolade seas on: droksikaam, enolikaam, isoksikaam, piroksikaam,
sudoksikaam, tenoksikaam ja 4-hüdroksüül-1,2-bensotiasiin 1,1-dioksiid 4-(N-
fenüül)-karboksamiid. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega
strukturaalselt seotud oksikaamid on samuti siia rühma kaasatud. Pürasoolid, 10
eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad on samuti sobilikud.
Kasutatavate pürasoolide, eelravimi estrite või nende farmatseutiliselt sobivate
soolade seas on: difenamisool ja epirisool. Sarnaste analgeetiliste ja
põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud pürasoolid on samuti siia
rühma kaasatud. Lisaks on sobilikud ka pürasoloonid, eelravimi estrid või nende 15
farmatseutiliselt sobivad soolad. Kasutatavad pürasaloonid, eelravimi estrid või
nende farmatseutiliselt sobivad soolad on: apasoon, asapropasoon,
benspiperüloon, feprasoon, mofebutasoon, morasoon, oksüfeenbutasoon,
fenüülbutasoon, pipebusoon, propüülfenasoon, ramifenasoon, suksibusoon ja
tiasolinobutasoon. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega 20
strukturaalselt seotud pürasaloonid on samuti siia rühma kaasatud.
Lisaks sobivad eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad ka TNF-
põhjustatud haiguste ravimiseks. Kortikosteroidide, eelravimi estrite või nende
farmatseutiliselt sobivate soolade seas on hüdrokortisoon ja ühendid, mis on
tuletatud hüdrokortisoonist nagu 21-atsetoksü-pregnenoloon, alklomerasoon, 25
algestoon, amtsinoniid, beklometasoon, beetametasoon, beetametasoon-valeraat,
budesoniid, kloroprednisoon, klobetasool, klobetasool-propionaat, klobetasoon,
klobetasoon-butüraat, klokortoloon, kloprednool, kortikosteroon, kortivasool,
deflasakon (deflazacon), desoniid, desoksimerasoon (desoximerasone),
deksametasoon, diflorasoon (diflorasone), diflukortoloon, difluprednaat, 30
enoksoloon, fluasakort, flukloroniid, flumetasoon, flumetasoon-pivalaat, flunisoliid,
fluotsinoloonatsetoniid, fluotsinoniid, fluorotsinoloon-atsetoniid (fluorocinolone
acetonide), fluokortiin-butüül, fluokortoloon, fluokortoloon-heksanoaat,
EE - EP1615952 B1 79
diflukortoloon-valeraat, fluorometoloon, fluperoloon-atsetaat, fluprednideen-
atsetaat, fluprednisoloon, flurandenoliid, formokortaal, haltsinoniid, halometasoon,
halopredoon-atsetaat, hüdrokortamaat, hüdrokortisoon, hüdrokortisoon-atsetaat,
hüdrokortisoon-butüraat, hüdrokortisoon-fosfaat, hüdrokortisoon 21-
naatriumsuktsinaat, hüdrokortisoon-tebutaat, masipredoon, medrüsoon, 5
meprednisoon, metüülprednikoloon, mometasoon furoaat, parametasoon,
prednikarbaat, prednisoloon, prednisoloon 21-diedrüaminoatsetaat (prednisolone
21-diedryaminoacetate), prednisoloon naatriumfosfaat, prednisoloon
naatriumsuktsinaat, prednisoloon naatrium 21-m-sulfobensoaat, prednisoloon
naatrium 21-stearoglükolaat, prednisoloon-tebutaat, prednisoloon 21-10
trimetüülatsetaat, prednisoon, prednival, prednülideen, prednülideen 21-
dietüülaminoatsetaat, tiksokortool, triamtsinoloon, triamtsinoloon atsetoniid,
triamtsinoloon benetoniid ja triamtsinoloon heksatsetoniid. Sarnaste analgeetiliste
ja põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud kortikosteroidid on samuti
siia rühma kaasatud. 15
Antimikroobikumid (ja eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad)
sobivad samuti kombineeritud kasutamiseks, nagu on siin kirjeldatud. Sobivate
antimikroobikumid seas on näiteks ampitsilliin, amoksütsilliin, aureomütsiin,
batsitratsiin, tseftasidiim, tseftriaksoon, tsefotaksiim, tsefakloor, tsefaleksiin,
tsefradiin, tsiprofloksatsiin, klavulaanhape, kloksatsilliin, dikloksatsillaan 20
(dicloxacillan), erütromütsiin, flukloksatsillaan, gentamitsiin, gramitsidiin,
metitsillaan (methicillan), neomütsiin, oksatsillaan (oxacillan), penitsilliin ja
vankomütsiin. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega
strukturaalselt seotud antimikroobikumid on samuti siia rühma kaasatud.
Täiendavate sobivate ühendite seas on muuhulgas: BN 50730, tenidap, E 5531, 25
tiapafant PCA 4248, nimesuliid, panavir, rolipraam, RP 73401, peptiid T, MDL
201,449A, (1R,3S)-tsis-1-[9-(2,6-diaminopurinüül)]-3-hüdroksü-4-tsüklopenteen
vesinikkloriid, (1R,3R)-trans-1-[9-(2,6-diamino)puriin]-3-atsetoksütsüklopentaan,
(1R,3R)-trans-1-[9-adenüül)-3-asidotüklopentaan vesinikkloriid ja (1R,3R)-trans-1-
[6-hüdroksü-pusin-9-üül)-3-asidotsüklopentaan. 30
On avastatud, et IL-4 võib mõnel juhul nagu astmas esile kutsuda põletikulise
toime, kus IL-4 üle-ekspressioon kopsudes põhjustab epiteelraku hüpertoofiat ning
EE - EP1615952 B1 80
lümfotsüütide, eosinofiilide ja neutrofiilide kuhjumist. See reaktsioon on iseloomulik
teiste Th2 tsütokiinide tekitatud proinflammatoorse reaktsiooni põhiomadustele.
Nagu eespool märgiti, on IL-4 inhibiitorid järelikult kasulikud vastavalt leiutisele.
Lisaks on mõistetav, et teatud immunosupressiivseid ravimeid saab samuti
kasutada artriidi ravimisel, sealhulgas muuhulgas iNOS inhibiitorid ja 5-5
lipoksügenaasi inhibiitorid.
Ingveri puhul on tõestatud, et sellel on teatud põletikuvastased omadused ning
järelikult sobib see põletikuvastase ainena kasutamiseks vastavalt leiutisele, nagu
seda on kondroitiin.
Eespool toodud loetelud on esitatud ainult näidetena ning ei välista teiste ühendite 10
või ravi kasutamist, mida saab siin kirjeldatud ühenditega üheaegselt rakendada ja
antud valdkonnas pädevad isikud tunnevad või mis võivad jõuda antud valdkonnas
pädevate isikuteni, kasutades antud spetsifikatsioonis esitatud juhiseid.
Immuunravimid
Immuunravimid tuginevad üldiselt immuunsete efektorrakkude ja molekulide 15
kasutamisel, et vähirakke sihtida ja hävitada. Immuunefektoriks võib olla
käesoleva leiutise peptikeha, mis tunneb ära teatud markeri sihtraku pinnal.
Peptikeha võib üksinda toimida raviefektorina või kaasata teisi rakke, et rakkude
tapmist algatada. Peptikeha võib olla ka konjugeeritud ravimile või mürgile
(kemoterapeutiline ravim, radionukliid, ritsiini A-ahel, koolera mürk, läkaköha mürk 20
jne) ning seeläbi võib see toimida ainult märklaud-ravimina.
Vastavalt käesolevale leiutisele võivad Ang-2 mutantvormid olla immuunravi
sihtmärgiks kas leiutise peptikehade või peptikeha konjugaatidega. Eriti
võimalikuks peetakse, et peptikeha kompositsioone võib kasutada kombineeritud
teraapia võttes koos Ang-2 sihtmärgistatud raviga. 25
Tõestatult on passiivne immuunravi eriti tõhus mitmesuguste vähkide vastu. Vaata
näiteks patenti WO 98/39027.
Järgnevad näited on mõeldud ainult illustreerimiseks ning neid ei tohiks
tõlgendada leiutise ulatust mingil moel piiravana.
EE - EP1615952 B1 81
Näide 1
Ang-2 ekspressioon patoloogilises ja normaalses koes
Ang-2 ekspressiooni vaadeldi normaalses ja patoloogilises koes in situ
hübridisatsiooni kasutades. Inimese (GenBanki registreerimisnumber: AF004327,
nukleotiidid 1274-1726) ja hiirte (GenBanki registreerimisnumber: AF004326, 5
nukleotiidid 1135-1588) Ang-2 järjestuste fragmente võimendati
pöördtranskriptaas-PCR-ga inimese või hiire loote kopsu cDNA-st, klooniti pGEM-
T plasmiidi ja kinnitati sekventeerimisel. 33P-märgistusega antisense-RNA proove
transkribeeriti lineaarsetest plasmiidi mudelitest, kasutades 33P-UTP ja RNA
polümeraasi. Formaldehüüdiga fikseeritud parafiinis olevad kudede plokid jaotati 10
5µM kaupa lõikudesse ning koguti laetud slaididele. Enne in situ hübridisatsiooni
tehti koed läbilaskvaks 0,2MHCL-ga, millele järgnes proteinaasi K-ga lagundamine
ning atsetüülimine trietanoolamiini ja äädikhappe anhüdriidiga. Lõigud ristati
radiomärgistusega prooviga öö jooksul temperatuuril 55 ˚C ning edastati siis
RNaasi lagundamisse ning kõrgpiiratud pessu umbes 0,1xSSC temperatuuril 55 15
˚C. Slaidid pisteti Kodak NTB2 emulsiooni, hoiti 2-3 nädalat temperatuuril 4 ˚C,
neid arendati ning märgistati vastupidise värviga. Lõike uuriti pimevälja ja
standardvalgustamisega, et võimaldada koe morfoloogia ja hübridisatsiooni
signaali üheaegset hindamist.
Tulemused näitasid, et normaalses sünnijärgses inimeses on Ang-2 ekspressioon 20
piiratud väheste kudedeni, mis sisaldavad angiogeenilist vaskulatuuri nagu
munasarjad, platsenta ja emakas. Ang-2 ekspressiooni ei tuvastatud normaalses
inimese südames, ajus, neerus, maksas, kopsus, pankreases, põrnas, lihastes,
mandlites, tüümuses, pimesooles, lümfisõlmes, sapipõies, eesnäärmes ega
mundandites. Viie nädala vanusel hiirel (aga mitte täiskasvanud ahvil või inimesel) 25
ilmnes neerudes märkimisväärset Ang-2 ekspressiooni soolestikus. Et tuvastada,
kas see ekspressioon oli embrüonaalse arengu jäänus, korrati katset kuni ühe
aasta vanustelt hiirtelt pärit neerudel, kasutades hiirte Ang-2 proovi ning eespool
kirjeldatud tingimusi. Ang-2 ekspressiooni puhul täheldati alanemist vastsündinute
arengus, aga oli endiselt ilmne ühe aasta vanuste hiirte neerudes. 30
EE - EP1615952 B1 82
Ang-2 ekspressioon tuvastati praktiliselt kõikides testitud kasvajaliikides,
sealhulgas inimese primaarsetes kasvajates nagu käärsoole kartsinoom (5
juhtumit), rinnakartsinoom (10 juhtumit), kopsukartsinoom (8 juhtumit),
glioblastoom (1 juhtum), inimese metastaatilistes kasvajates nagu rinnakartsinoom
(2 juhtumit), kopsukartsinoom (2 juhtumit) ning munasarja kartsinoom (2 juhtumit), 5
mis olid läinud üle ajju, ning näriliste kasvajamudelites nagu C6 (roti glioom), HT29
(inimese käärsoole kartsinoom), Colo-205 (inimese käärsoole kartsinoom),
HCT116 (inimese käärsoole kartsinoom), A431 (inimese epidermoidne
kartsinoom), A673 (inimese rhabdomüosarkoom), HT1080 (inimese fibrosarkoom),
PC-3 (inimese eesnäärme kartsinoom), B16F10 (hiire melanoom), MethA (hiire 10
sarkoom) ning metastaasis Lewise kopsukartsinoom. Lisaks tuvastati Ang-2
ekspressiooni uutes veresoontes, mis kasvasid Matrigeli korgis pärast VEGF-ile
reageerimist ning enneaegse retionpaatia hiire hüpoksia mudelis.
Näide 2
Molekulaaranalüüsid Ang-2 peptikehade hindamiseks 15
Molekulaaranalüüsid (afiinsuse ELISA, neutralisatsiooni ELISA ja BIAcore meetod)
töötati välja peptikeha otsese sidumise Ang-2 ja asjakohase perekonnaliikmetele
seondumise ning peptikehade mõju Ang-2:Tie-2 koostoimele hindamiseks. Neid in
vitro analüüse on kirjeldatud järgnevalt.
Afiinsuse ELISA 20
Kandidaat anti-Ang-2 peptikehade esialgseks skriinimiseks kasutati inimese
puhastatud Ang-2 (R&D Systems, Inc; kataloogi number 623-AN; Ang-2 antakse 2
kärbitud versiooni seguna) või hiire Ang-2 polüpeptiidi (valmistati vastavalt eespool
kirjeldatule). Kinnitavate seostumistestideks saadi inimese Ang-2 inimese 293T
rakkude, mis olid transfekteeritud inimese täispika Ang-2 DNA-ga ja kasvatatud 25
ühe ml kohta 50 mikrogrammi veise seerumi albumiini (BSA) sisaldavas
seerumivabas DMEM-is (Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM),
konditsioneeritud söötmest.
Mikrotiitri plaate kasutades lisati igale süvendile ligikaudu 100 mikroliitrit Ang-2
ning seejärel inkubeeriti plaate umbes 2 tundi, mille järel pesti plaate neli korda 30
EE - EP1615952 B1 83
fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS), mis sisaldas umbes 0,1 protsenti
Tween-20. Seejärel süvendid blokeeriti, kasutades iga süvendi kohta umbes 250
mikroliitrit umbes 5 protsenti BSA-d PBS-s ning plaate inkubeeriti umbes 2 tundi
toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist üleliigne blokeerimislahus eemaldati ning
100 mikroliitrit iga kandidaat anti-Ang-2 peptikeha lisati süvendile lahjendatud 5
seeriates, alustades kontsentratsiooniga umbes 40 nanomooli ja seejärel
lahjendati seeria kaupa 4-kordselt PBS-s, mis sisaldas umbes 1 protsenti BSA-d.
Neid plaate inkubeeriti seejärel öö jooksul toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist
pesti plaate PBS-ga, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Pesemist korrati
täiendavalt neli korda ning seejärel lisati igasse süvendisse umbes 100 mikroliitrit 10
kitse inimesevastast IgG(Fc)-HRP (Pierce Chemical Co., kataloogi nr 31416),
mida oli eelnevalt lahjendatud 1:5000 PBS-sis, kus oli 1 protsent BSA-d. Plaate
inkubeeriti ligikaudu 1 tund toatemperatuuril. Plaate pesti seejärel viis korda PBS-
sis, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20, mille järel lisati igasse süvendisse
umbes 100 mikroliitrit TMB (3,3’,5,5’-tetrametüülbensidiini vedela substraadi 15
süsteem Liquid Substrate System; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO,
kataloogi number T8665) substraati ning plaate inkubeeriti umbes 5-15 minutit
sinise värvuse tekkimiseni. Absorptsiooni loeti spektrofotomeetriga umbes 370nm
juures.
Neutralisatsiooni ELISA 20
Mikrotiitri plaadid, millele inimese Ang-2 polüpeptiid olid seotud, valmistati
afiinsuse ELISA analüüsis. Kandidaat anti-Ang-2 peptikehasid tiitriti 1000nM-st
0,2pM-ni 4-kordsetes lahjendustes PBS lahuses, mis sisaldas umbes 1% BSA-d ja
umbes 1nM Tie-2 (mis anti Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa sisaldab ainult
molekuli lahustuvat rakuvälist osa; R&D Systems, kataloogi number 313-TI). 25
Pärast igale süvendile umbes 100 mikroliitri antikeha/Tie-2 lahuse lisamist
inkubeeriti plaate öö jooksul toatemperatuuril ning seejärel pesti viis korda PBS-is,
mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Pärast pesemist lisati igasse
süvendisse umbes 100 mikroliitrit anti-Tie-2 antikeha (Pharmingen Inc., kataloogi
nr 557039) lõppkontsentratsioonil umbes 1 mikrogrammi ml kohta ning plaate 30
inkubeeriti umbes 1 tund toatemperatuuril. Järgmisena lisati igasse süvendisse
100 mikroliitrit kitse hiirevastast-IgG-HRP (Pierce Chemical CO., kataloogi nr
EE - EP1615952 B1 84
31432) lahjendusega 1:10,000 PBS-is, mis sisaldas umbes 1 protsent BSA-d.
Plaate inkubeeriti umbes 1 tund toatemperatuuril, mille järel neid pesti viis korda
PBS-ga, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Seejärel lisati süvendi kohta
100 mikroliitrit TMB substraati (kirjeldati eespool) ning värvil lasti tekkida.
Absorptsiooni loeti seejärel spektrofotomeetriga 370nM juures. 5
Afiinsuse BIAcore
Iga kandidaat Ang-2 peptikeha afiinsuse analüüs tehti seadmel BIAcore® 2000
(Biacore, Inc., Piscataway, NJ), kus PBS ja 0,005 protsendine P20 surfaktant
(Biacore, Inc.) oli töötlemispuhver. Rekombinantne proteiin G (Repligen,
Needham, MA) immobiliseeriti teadusliku astmega CM5 sensoriga kiibile (research 10
grade CM5 sensor chip) (Biacore, Inc.) primaarsete amiinirühmade kaudu,
kasutades komplekti Amine Coupling Kit (Biacore, Inc.) vastavalt tootja soovitatud
eeskirjadele.
Seostumistestid tehti esmalt umbes 100RÜ iga kandidaat anti-Ang-2 peptikeha
kinnitamisel immobiliseeritud proteiinile G, mille järel erinevates 15
kontsentratsioonides (0-100nM) huAng-2 või mAng-2 süstiti 3 minuti jooksul
antikeha pinnale voolukiirusel 50µl/min. Peptikeha seostumise kineetilised
parameetrid, sealhulgas ka (assotsiatsioonikonstant), kd (dissotsiatsioonikonstant)
ja KD (dissotsiatsiooni tasakaalukonstant) tuvastati BIA hindamise 3.1
arvutiprogrammi (Biacore, Inc.) abil. Madalamad dissotsiatsiooni 20
tasakaalukonstandid näitasid Ang-2 peptikeha kõrgemat afiinsust.
Näide 3
Ang-2 seostumispeptiidide tuvastamine
1. Ang-2-kattega magnetilise graanuli valmistamine
A. Ang-2 kinnistamine magnetilistele graanulitele 25
Mittespetsiifiliseks elueerimiseks kinnistati biotinüülitud Ang-2 proteiin (Biotinylated
Recombinant Human Angiopoietin-2, R&D Systems, Inc.; kataloogi number BT
623) graanulitele Streptavidin Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY)
kontsentratsioonil umbes 4µg biotinüülitud Ang-2 proteiini 100µl graanuli varu
EE - EP1615952 B1 85
kohta tootjalt kõigiks kolmeks selektsiooniks. Antigeeni (Ang-2) ja retseptori (Tie-2)
elueerimiseks kinnistati 2µl biotinüülitud Ang-2 proteiini 50µl-le graanulitele
Streptavidin Dynabeads teiseks selektsiooniks. Katteaine kontsentratsioon
alandati umbes 1mg biotinüülitud Ang-2 proteiinile 50µl graanulite varu kohta
kolmandaks selektsiooniks. Tõmmates magneti abil graanulid tuubi ühele küljele ja 5
eemaldades vedeliku pipetiga, pesti graanuleid viis korda fosfaatpuhvri
soolalahusega (PBS) ja resuspendeeriti PBS-s. Biotinüülitud Ang-2 proteiini lisati
pestud graanulitele eespool toodud kontsentratsioonil ning inkubeeriti 1 tund
pöörlemisel toatemperatuuril, millele järgnes mõni tund öö jooksul pöörlemisel
inkubeerimist temperatuuril 4 ˚C. Seejärel Ang-2-kattega graanulid blokeeriti BSA 10
lisamisel umbes 1%-lise lõppkontsentratsioonini ning inkubeeriti pöörlemisel öö
jooksul temperatuuril 4 ˚C. Saadud Ang-2 kattega graanuleid pesti seejärel viis
korda PBS-ga enne selektsiooniprotseduuri edastamist.
B. Negatiivse selekteerimisega graanuli valmistamine
Valmistati ka lisagraanuleid negatiivseks selektsiooniks. Igaks pesuseisundiks 15
edastati 500µl tootja graanulite varu eespool toodud protseduuri (lõik 1A), kuid
biotinüülitud Ang-2-ga etapp jäeti vahele. Viimases pesemisetapis jaotati graanulid
viieks 100µl-ks alikvoodiks.
2. Ang-2 seostumisfaagi selekteerimine
A. Üldine strateegia 20
Kolme kiulist faagi kogumit, mis olid märkega „TN8-IX“ (5x109 sõltumatud
transformandid), „TN12-I“ (1,4x109 sõltumatud transformandid) ja „lineaarne“
(2,3x109 sõltumatud transformandid) (kõik firmalt Dyax Corp.), kasutati Ang-2
seostumisfaagile selekteerimiseks. Iga kogum edastati seejärel kas
mittespetsiifilisse elueerimisse, Ang-2 elueerimisse või retseptori elueerimisse 25
(Tie-2). Üheksa erinevat pesuseisundit teostati Ang-2 (TN8-IX, kasutades
mittespetsiifilise elueerimise meetodit, TN8-IX, kasutades Ang-2 elueerimise
meetodit, TN8-IX, kasutades Tie-2 elueerimise meetodit, TN12-I, kasutades
mittespetsiifilist elueerimise meetodit, TN12-I, kasutades Ang-2 elueerimise
meetodit, ning TN12-I, kasutades Tie-2 elueerimise meetodit, lineaarne, kasutades 30
EE - EP1615952 B1 86
mittespetsfiilist elueerimise meetodit, lineaarne, kasutades Ang-2 elueerimise
meetodit, ning lineaarne, kasutades Tie-2 elueerimise meetodit). Kõigi kolme kogu
jaoks elueeriti esimesest selektsioonist saadud faage järgmiste
selektsioonikordade jaoks ainult mittespetsiifilisel moel. Ang-2 ja Tie-2 elueerimisi
kasutati teises ja kolmandas selektsioonikorras. Lineaarse kogu jaoks teostati 5
selektsioon ainult teisele ringile Ang-2 ja Tie-2 elueerimise jaoks.
B. Negatiivne selekteerimine
Iga pesemisseisundi jaoks tehti umbes 100 suvalise kogumi ekvivalenti TN8-IX ja
TN12-I kogu jaoks (umbes 5x1011pfu TN8-IX jaoks ning umbes 1,4x1011pfu TN12-I
jaoks) ning umbes 10 suvalise kogu ekvivalenti lineaarsele kogule (umbes 10
1x1011pfu) alikvootideks kogu varust ja lahjendati umbes 400µl-ni PBST-GA-ga
(PBS 0,05%-lise Tween-20-ga). Pärast viimast pesu eemaldati vedelik esimesest
graanulite 100µl alikvoodist, mis valmistati negatiivseks selekteerimiseks (lõik 1B),
ligikaudu 400µl-line lahjendatud kogu varu lisati graanulitele. Saadud segu
inkubeeriti umbes 10 minutit toatemperatuuril pöörlemisel. Faagi supernatant võeti 15
välja magneti abil ning lisati teisele 100µl-lisele alikvoodile järgmiseks negatiivse
selektsiooni etapiks. Sedasi sooritati viis negatiivse selekteerimise etappi.
C. Selekteerimine Ang-2 proteiiniga kaetud graanulite abil
Pärast viimast negatiivse selekteerimise etappi (lõik 1B) saadud faagi supernatant
lisati Ang-2 kattega graanulitele (lõik 1A). Seda mikstuuri inkubeeriti pöörlemisel 20
üks kuni kaks tundi toatemperatuuril, lastes faagil sihtmärk-proteiinile seonduda.
Pärast supernatandi eemaldamist pesti graanuleid umbes kümme korda PBST-
GA-ga, millele järgnes kaks pesu PBS-ga.
D. Mittespetsiifiline elueerimine
Pärast viimast pesu eemaldati vedelik (lõik 2C) ning graanulitele lisati umbes 1ml 25
Min A soolade lahust (60mM K2HPO4, 33mM KH2PO4, 7,6mM (NH4)SO4 ja 1,7mM
naatriumtsitraati). Antud graanulite segu lisati otse kontsentreeritud bakterite
proovile infektsiooniks (vaata allpool lõik 3A ja 3B).
E. Seostusfaagi antigeeni (Ang-2) elueerimine
EE - EP1615952 B1 87
Teiseks ringiks elueeriti seostusfaag pärast viimast pesemisetappi (lõik 2C)
magnetilistest graanulitest, lisades 100µl 1pM, 0,1nM ja 10nM rekombinantset
Ang-2 proteiini (Recombinant Human Angiopoietin-2, R&D Systems, Inc.,
Minneapolis, Minnesota) järgemööda 30-minutilise inkubeerimisega igaks
seisundiks. Allesjäänud faag elueeriti mittespetsiifiliselt (lõik 2D). Elueeritud faag 5
10nM-st ja mittespetsiifilised elueerimised kombineeriti ning need edastati
kolmandasse selekteerimisringi (vaata lõiku 4, allpool).
Kolmandaks ringiks elueeriti seostusfaag pärast viimast pesemisetappi (lõik 2C)
magnetilistest graanulitest, lisades umbes 1nM rekombinantset Ang-2 proteiini
ning 10nM rekombinantset Ang-2 proteiini järgemööda 30-minutilise 10
inkubeerimisega igaks seisundiks. Lisaks elueeriti faagi umbes 10 minutit rotaatoril
100mM trietüülamiini lahusega (Sigma, St. Louis, Missouri). Trietüülamini lahust
sisaldava faagi pH neutraliseeriti 0,5ml 1M Tris-HCl-ga (pH 7,5). Pärast viimast
elueerimist 100mM trietüülamiini lahusega elueeriti allesjäänud faagi graanulite
lisamisel bakteritele (lõik 2D). 15
F. Seostusfaagi retseptori (Tie-2) elueerimine
Teiseks ringiks elueeriti seostusfaag pärast viimast pesemisetappi (lõik 2C)
magnetilistest graanulitest, lisades 100µl 1pM, 0,1nM ja 10nM rekombinantset Tie-
2 proteiini (Recombinant Human Tie-2-Fc Chimera, R&D Systems, Inc.,
Minneapolis, Minnesota) järgemööda 30-minutilise inkubeerimisega igaks 20
seisundiks. Allesjäänud faag elueeriti mittespetsiifiliselt (lõik 2D). Elueeritud faag
10nM-st ja mittespetsiifilised elueerimised kombineeriti ning need edastati
kolmandasse selekteerimisringi (vaata lõiku 4, allpool).
Kolmandaks ringiks elueeriti seostusfaag pärast viimast pesemisetappi (lõik 2C)
magnetilistest graanulitest, lisades umbes 1nM rekombinantset Ang-2 proteiini 25
ning 10nM rekombinantset Ang-2 proteiini järgemööda 30-minutilise
inkubeerimisega igaks seisundiks. Lisaks elueeriti faagi umbes 10 minutit rotaatoril
100mM trietüülamiini lahusega (Sigma, St. Louis, Missouri). Trietüülamiini lahust
sisaldava faagi pH neutraliseeriti 0,5ml 1M Tris-HCl-ga (pH 7,5). Pärast viimast
elueerimist 100mM trietüülamiini lahusega elueeriti allesjäänud faagi graanulite 30
lisamisel bakteritele (lõik 2D).
EE - EP1615952 B1 88
3. Amplifikatsioon
A. Rakkude valmistamine plaadil
Värske E. Coli. (XL-1 Blue MRF’) kultuur kasvatati algtihedusel OD600 umbes 0,5
LB söötmes, mis sisaldas umbes 12,5µg/ml tetratsükliini. Igaks
pesemistingimuseks jahutati umbes 20ml seda kultuuri jääl ning tsentrifuugiti. 5
Bakterite graanul resuspendeeriti umbes 1ml-s Min A soolade lahuses.
B. Transduktsioon
Eespool esitatud (lõigud 2D, 2E ja 2F) igast erinevast elueerimismeetodist saadud
iga segu lisati kontsentreeritud bakteriproovile (lõik 3A) ja inkubeeriti umbes 15
minutit temperatuuril umbes 37 ˚C. Igale mikstuurile lisati ligikaudu 2ml NZCYM 10
söödet (2XNZCYM, 50µg/ml ampitsiliin) ning 15 minutit inkubeeriti temperatuuril
umbes 37 ˚C. Saadud 4ml lahus asetati suurele NZCYM agar-plaadile, mis
sisaldas umbes 50µg/ml ampitsiliini, ja seda inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 37
˚C.
C. Faagi kogumine 15
Iga bakteri/faagi segu kasvatati öö jooksul suurel NZCYM agar-plaadil (lõik 3B),
mille järel need kraabiti umbes 35ml-lisse LB söötmesse. Agar-plaati puhastati
veel täiendava 35ml LB söötmega. Saadud bakteri/faagi mikstuuri LB söötmes
tsentrifuugiti, et baktereid välja granuleerida. Ligikaudu 50ml faagi supernatanti
edastati seejärel värskesse tuubi ja lisati umbes 12,5ml PEG lahust (20% 20
PEG8000, 3,5M ammooniumatsetaat) ning seda inkubeeriti 2 tundi jääl, et faagi
sadestada. Sadestunud faag tsentrifuugiti ja resuspendeeriti 6ml-s faagi
resuspensioonipuhvris (250mM NaCl, 100mM Tris pH8, 1mM EDTA). Seda faagi
lahust puhastati veel allesjäänud bakterite välja tsentrifuugimisel ning faagi
sadestamisel teist korda, lisades umbes 1,5ml PEG lahust. Pärast tsentrifuugimist 25
resuspendeeriti faagi graanulit umbes 400µl-s PBS-s. See lahus edastati lõplikku
tsentrifuugimisse, et mis tahes allesjäänud bakterite jääkide lahust eemaldada.
Saadud faagi preparaat tiitriti standardsete naastu moodustavate analüüsidega.
EE - EP1615952 B1 89
4. Täiendav selektsioon ja amplifikatsioon
Teises ringis kasutati esimesest ringist pärit (lõik 3C) amplifitseeritud faagi
preparaati (umbes 1010pfu) sisendfaagina, et selekteerimist ja
amplifikatsioonietappe teha (lõigud 2 ja 3). Ang-2 ja Tie-2 elueerimisteks
kombineeriti faagid 10nM-st ja mittespetsiifilised elueerimised ning amplifitseeriti 5
kolmanda selekteerimise jaoks. Amplifitseeritud faagi preparaati (umbes 109pfu)
teisest ringist kasutati omakorda sisendfaagina kolmanda selekteerimise ja
amplifikatsiooni teostamiseks (lõigud 2 ja 3). Pärast kolmanda ringi
elueerimisetappe (lõigud 2D, 2E ja 2F) seati plaadile elueeritud faagi väike
fraktsioon nagu naastu moodustumise analüüsis (lõik 3C). Valiti individuaalsed 10
naastud ning need asetati 96-süvendilistele mikrotiitri plaatidele, mis sisaldasid
100µl TE puhvrit igas süvendis. Neid põhiplaate inkubeeriti öö jooksul
temperatuuril 4 ˚C, et võimaldada faagil TE puhvrisse elueerida.
5. Kloonianalüüs
Faagi kloone analüüsiti faagi ELISA ja DNA sekventeerimise abil. Järjestusi 15
reastati nendest kahest analüüsist saadud tulemuste kombineerimise põhjal.
A. Faagi ELISA
XL-1 Blue MRF’ kultuuri kasvatati algtiheduse OD600 umbes 0,5 saavutamiseni.
Umbes kolmkümmend µl seda kultuuri tehti alikvootideks igasse 96-süvendilise
miktrotiitri plaadi süvendi vahel. Igasse süvendisse lisati umbes 10µl elueeritud 20
faagi (lõik 4) ja bakteritel lasti umbes 15 minuti jooksul toatemperatuuril nakatuda.
Igasse süvendisse lisati 100µl LB söödet, mis sisaldas ligikaudu 12,5µg/ml
tetratsükliini ja ligikaudu 50µg/ml ampitsilliini. Seejärel inkubeeriti miktrotiitri plaati
öö jooksul raputamisel temperatuuril umbes 37 ˚C. Rekombinantsel Ang-2
proteiinil (umbes 1µg/ml PBS-s) lasti öö jooksul temperatuuril umbes 4 ˚C 96-25
süvendilistele Maxisorp plaatidele seonduda (NUNC). Kontrolliks kaeti streptavidiin
eraldi Maxisorp plaadile umbes 2µg/ml juures PBS-s.
Järgmisel päeval eemaldati vedelik proteiiniga kaetud Maxisorpi plaatides ning iga
süvend blokeeriti öö jooksul umbes 300µl 5%-lise piimalahusega temperatuuril
umbes 4 ˚C (teisel juhul 1 tund toatemperatuuril). Seejärel eemaldati piimalahus 30
EE - EP1615952 B1 90
ning süvendeid pesti kolm korda PBST lahusega. Pärast viimast pesuetappi lisati
igasse proteiiniga kaetud Maxisorpi plaatide süvendisse umbes 50µl PBST 4%-list
piimalahust. Umbes 50µl öö jooksul saadud kultuure igast süvendist 96-
süvendilisel mikrotiitri plaadil edastati vastavatesse Ang-2-kaetud plaatide ning
kontrollina mõeldud streptavidiiniga kaetud plaatide süvenditesse. 100µl mikstuuri 5
igas plaadi tüübis inkubeeriti umbes 1 tund toatemperatuuril. Vedelik eemaldati
Maxisorpi plaatidelt ning süvendeid pesti umbes kolm korda PBST-ga. HRP-
konjugeeritud anti-M13 antikeha (Amersham Pharmacia Biotech) lahjendati umbes
1:7,500-le ning umbes 100ml lahjendatud lahust lisati Maxisorpi plaatide igale
süvendile ligikaudu 1 tunni inkubeerimisega toatemperatuuril. Vedelik eemaldati 10
uuesti ning süvendeid pesti umbes viis korda PBST-ga. Seejärel lisati igasse
süvendisse 100µl TMB substraati (Sigma) ning reaktsioon peatati umbes 50µl 5N
H2SO4 lahusega. Optiline tihendus OD450 loeti spektrofotomeetriga (Molecular
Devices).
B. Faagi kloonide järjestamine 15
Iga faagi klooni jaoks valmistati järjestusmaatriks PCR abil. Järgnevat
oligonukletiidi paari kasutati ligikaudu 500 nukleotiidi fragmendi
amplifitseerimiseks:
praimer 1: 5’-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3’ (JÄRJESTUSE ID-
NR: 54) 20
praimer 2: 5’-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3’ (JÄRJESTUSE ID-
NR:55)
Iga klooni jaoks valmistati järgnev mikstuur:
Reagendid Kogus (µL)/tuub
dH2O 26,25
50% glütserool 10
10X PCR puhver (w/o MgCl2) 5
25nM MgCl2 4
10mM dNTP segu 1
100µM praimer 1 0,25
100µM praimer 2 0,25
EE - EP1615952 B1 91
Reagendid Kogus (µL)/tuub
Taq polümeraas 0,25
Faag TE-s (lõik 4) 3
Lõplik reaktsiooni kogus 50
PCR jaoks kasutati termotsüklerit (GeneAmp PCR System 9700, Applied
Biosystems) järgmise programmi teostamiseks: 94 ˚C 5 minutit; (94 ˚C 30 sek, 55
˚C 30 sek, 72 ˚C 45 sek) x 30 tsüklit; 72 ˚C 7 minutit; jahutamine temperatuurile 4
˚C. Igast reaktsioonist saadud PCR produkti puhastati komplektiga QIAquick
Multiwell PCR Purification (Qiagen), järgides tootja juhiseid. Puhastatud PCR 5
produkti analüüsiti seejärel umbes 10µl iga PCR reaktsioonimikstuuri töötlemisel
umbes 1µl värviga (10xBBXS agaroosi geeli laadimisvärv) 1%-lisel agaroosigeelil.
Allesjäänud produkt järjestati seejärel sekvenaatoriga ABI 377 Sequencer (Perkin
Elmer), järgides tootja soovituslikke eeskirju.
6. Järjestuse hindamine ja konsensusjärjestuse tuvastamine 10
A. Järjestuse hindamine ja analüüs
Erinevatest nukleotiidi järjestustest (lõik 5B) transleeritud peptiidi järjestused pandi
ELISA andmetega korreleeruma. Kloonidele, millel oli kõrge OD450 Ang-2-kaetud
süvendites ning madal OD450 streptavidiiniga kaetud süvendites, anti kõrgema
prioriteediga hinnang. Järjestustele, mis esinesid mitu korda, anti samuti kõrgema 15
prioriteediga hinnang. Kandidaatjärjestused valiti nende kriteeriumide põhjal
edasiseks analüüsiks peptiidide või peptikehadena.
B. Konsensusjärjestuse tuvastamine
Kolm erinevat liiki konsensusmotiivi loodi TN8-IX kogumist järgnevalt:
KRPCEEXWGGCXYX (JÄRJESTUSE ID-NR:56) 20
KRPCEEXFGGCXYX (JÄRJESTUSE ID-NR:57)
XXXCXDXYWYCXXX (JÄRJESTUSE ID-NR:61)
XXXCXDXYTYCXXX (JÄRJESTUSE ID-NR:62)
EE - EP1615952 B1 92
XXXCXDXFWYCXXX (JÄRJESTUSE ID-NR:63)
XXXCXDXFTYCXXX (JÄRJESTUSE ID-NR:64)
XXXCXWDPWTCEXM (JÄRJESTUSE ID-NR:58)
Üks konsensus motiiv loodi TN12-I kogumist:
WSXCAWFXGXXXXXCRRX (JÄRJESTUSE ID-NR:59) 5
Kõikide konsensuse motiivi järjestuste jaoks saadi allajoonitud „aminohappe
tuumjärjestused“ igast konsensusjärjestusest, tuvastades kõige sagedamini
esineva aminohappe igas positsioonis. „X“ tähistab mis tahes looduslikult esinevat
aminohapet. Tuumjärjestuse kõrval olevad tsüsteiinid olid fikseeritud aminohapped
TN8-IX ja TN12-I kogus. 10
Ang-2-le seostuvatena tuvastatud peptiidid on esitatud tabelis 3 allpool.
Tabel 3: Ang-2 seostuspeptiid
Näide 4
DNA-d kodeerivate peptikehade loomine 15
Ang-2:Tie-2 seostamisele potentsiaalselt inhibeerivateks selekteeritud
modifitseeritud peptiide (vaata tabelit 3) kasutati sulandvalkude loomiseks, kus iga
peptiidi kumbki monomeer või iga peptiidi tandeemne dimeer (kus monomeersete
ühikute vahel on linker) ühendati seadmel DNA-d kodeerivale linkerile, millele
järgnes inimese IgG1 Fc piirkond. Iga modifitseeritud peptiid loodi 20
EE - EP1615952 B1 93
oligonukleotiidide („oligod“) paaridega karastamisel, et anda polünukleotiidi
dupleks, kodeerides peptiidi linkeriga, mis sõltuvalt peptiidist sisaldab kas viit
glütsiini jääki, kaheksat glütsiini jääki või ühte lüsiini jääki; need struktuurid olid
loodud kui NdeI kuni XhoI fragmendid. Need dupleksse polünukleotiidi molekulid
ligeeriti vektorisse (pAMG21-Fc N-ots, mida on allpool täpsemalt kirjeldatud), mis 5
sisaldas inimese Fc geeni, mida olin eelnevalt lagundatud NdeI ja XhoI-ga.
Standardprotseduure kasutades transformeeriti saadud ligeeritud segud
elektroporatsiooniga E. coli tüve 2596 rakkudesse (GM221, mida on allpool
täpsemalt kirjeldatud). Kloone uuriti võime osas toota rekombinantset proteiini
toodet ja omada geenifusiooni, millel on korrektne nukleotiidi järjestus. Taoline 10
üksik kloon selekteeriti igale modifitseeritud peptiidile (st Fc-peptiidi
sulandproduktid).
pAMG21-Fc N-terminaalse vektori loomine
pAMG21
Ekspressiooni plasmiid pAMG21 (ATCC nr 98113) saadakse 15
ekspressioonivektorist pCFM1656 (ATCC nr 69576) ja ekspressioonivektori
süsteemist, mida on kirjeldatud USA patendis nr 4,710,473, järgides avaldatud
rahvusvahelises patenditaotluses WO 00/24782 kirjeldatud protseduure (vaata
näite 2 osa, lehekülgede vahemik 100-103, ning joonised Fig 17A ja 17B).
Fc N- terminaalne vektor 20
Fc N-terminaalne vektor loodi E. coli tüve 3788, pAMG21 Tpo_Gly5_Fc
monomeeri maatriksina kasutades. Antud tüve kloonimist puudutava
informatsiooni leiab patendist WO 00/24782 (vaata seal näidet 2 ja joonist Fig 10).
5’ PCR praimer (allpool täpsemalt kirjeldatud) määratleti Tpo peptiidi järjestuse
eemaldamiseks pAMG Tpo Gly5 sees ja selle asendamiseks polülinkeriga, mis 25
sisaldas ApaLI ja XhoI kohti. Võttes tüve 3788 mudeliks, teostati PCR Expand
Long polümeraasiga, kasutades JÄRJESTUSE ID-NR: 8 oligonukleotiidi, allpool,
praimerina 5’ ja universaalse 3’ praimerina JÄRJESTUSE ID-NR: 9, allpool.
Saadud PCR produkt puhastati geeliga ning lagundati restriktsiooniensüümidega
NdeI ja BsrGI. Nii plasmiid kui ka huvialust peptiidi kodeeriv polünukleotiid koos 30
EE - EP1615952 B1 94
linkeriga puhastati firma Qiagen (Chatsworth, CA) geelpuhastuse tsentrifuugivate
kolonnidega. Plasmiid ja lisand ligeeriti seejärel ligeerimise
standardprotseduuridega ning saadud ligeerimise segu transformeeriti E. coli
rakkudeks (tüvi 2596). Selekteeriti üksikud kloonid ja teostati DNA järjestamine.
Tuvastati korrektne kloon ning seda kasutati vektori allikana siin kirjeldatud 5
modifitseeritud peptiidide jaoks.
5’ praimer:
ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAA
CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA (JÄRJESTUSE ID-NR: 8)
3’ praimer: 10
GGTCATTACTGGACCGGATC (JÄRJESTUSE ID-NR: 9)
Lisaks nende modifitseeritud peptiidide valmistamisele N-terminaalsete
fusioonidena Fc-le (N-terminaalsed peptikehad), valmistati osa neis ka C-
terminaalsete sulandproduktidena (C-terminaalsed peptikehad). C-terminaalsete
fusioonidena valmistamiseks kasutatud vektorit on kirjeldatud allpool. 15
N-terminaalse vektori loomine
Fc C-terminaalne vektor loodi E. coli tüve 3728, pAMG21 Fc_Gly5_Tpo
monomeeri maatriksina kasutades. Antud tüve kloonimist puudutava
informatsiooni leiab patendist WO 00/24782 (vaata seal näidet 2 ja joonist Fig 7).
3’ PCR praimer (JÄRJESTUSE ID-NR: 10) määratleti Tpo peptiidi järjestuse 20
eemaldamiseks pAMG Tpo Gly5 sees ja selle asendamiseks polülinkeriga, mis
sisaldas ApaLI ja XhoI kohti. Võttes tüve 3728 mudeliks, teostati PCR Expand
Long polümeraasiga, kasutades universaalset 5’ praimerit (JÄRJESTUSE ID-NR:
11) ja eespool nimetatud 3’ praimerit. Saadud PCR produkt puhastati geeliga ning
lagundati restriktsiooniensüümidega BsrGI ja BamHI. Nii plasmiid kui ka huvialust 25
peptiidi kodeeriv polünukleotiid koos linkeriga puhastati firma Qiagen
geelpuhastuse tsentrifuugivate kolonnidega. Plasmiid ja lisand ligeeriti seejärel
ligeerimise standardprotseduuridega ning saadud ligeerimise segu transformeeriti
EE - EP1615952 B1 95
E. coli (tüve 2596) rakkudeks. Tuvastati korrektne kloon ning seda kasutati vektori
allikana siin kirjeldatud modifitseeritud peptiidide jaoks.
5’ praimer:
CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (JÄRJESTUSE ID-NR: 10)
3’ praimer: 5
TTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTG
CACCACCACCTCCACCTTTAC (JÄRJESTUSE ID-NR: 11)
GM221 (nr 2596). Peremeestüvi nr 2596, mida kasutati Fc-peptiidi sulandvalkude
ekspresseerimiseks, on E. coli K-12 tüvi, mis on modifitseeritud sisaldama lux
promotorit ning mõlemat temperatuuritundlikku lambda repressorit cI857s7 10
varajases ebg piirkonnas ja lacIQ repressorit hilises ebg piirkonnas. Nende kahe
repressori olemasolu võimaldab selle peremeestüve kasutamist hulga
ekspressioonisüsteemidega. ATCC märge sellele tüvele on 202174.
Näide 5
Peptikehade tootmine 15
Ekspressioon E. colis. Iga pAMG21-Fc sulandstruktuuri kultuurid E. colis GM221
kasvatati temperatuuril 37 ˚C söötmes Terrific Brothmedium (vaata Tartof and
Hobbs, „Improved media for growing plasmid and cosmid clones“, Bethesda
Research Labs Focus, 9. köide, lk 12, 1987, tsiteeritud eespool mainitud
Sambrooki et al viites). Geeni produkti ekspressiooni esilekutsumine luxPR 20
promootorist saavutati sünteetilise autoinduktori N-(3-oksoheksanoüül)-DL-
homoseriin-laktooni lisamisel kultuurisöötmele lõppkontsentratsioonini 20
nanogrammi milliliitri kohta (ng/ml). Kultuure inkubeeriti veel kuus tundi
temperatuuril 37 ˚C. Bakteri kultuure uuriti seejärel mikroskoopiaga
sisestuskehakeste olemasolu jaoks ning koguti tsentrifuugimisel. 25
Murdumisvõimelisi sisestuskehasid vaadeldi indutseeritud kultuurides, mis viitas,
et Fc-fusioonid olid kõige tõenäolisemalt toodetud lahustumatus fraktsioonis E. coli
sees. Raku graanuleid lüüsiti otse resuspensiooniga Laemmli puhvriga, mis
sisaldas 10% β-merkaptoetanooli, ja seejärel analüüsiti SDS-PAGE-ga. Enamus
EE - EP1615952 B1 96
juhtudel täheldati vastava molekulmassi intensiivse Coomassie värviga riba SDS-
PAGE geelil.
Puhastamine. Rakud avati vees (1/10) kõrgsurvel homogeniseerimisega (kaks
läbimist 14 000PSI juures) ning sisestuskehakesed koguti tsentrifuugimisel
(4000RPM J-6B tsentrifuugis ühe tunni jooksul). Sisestuskehakesed tehti 6M 5
guanidiinis, 50mM Tris-is, 10mM DTT-s, pH 8,5, lahustuvaks ühe tunni jooksul
suhtega 1/10. Fc-le ühendatud lineaarsete peptiidide jaoks lahjendati lahustuvaks
tehtud segu kakskümmend viis korda 2M uureas, 50mM Tris-is, 160mM arginiinis
ja 2mM tsüsteiinis, pH 8,5. Oksüdeerumisel lasti kaks päeva temperatuuril 4 ˚C
jätkuda, võimaldades disulfiidiga seotud ühendi (st Fc-peptiidi homodimeer) 10
moodustumist. Fc-le ühendatud tsükliliste peptiidide jaoks järgiti samu eeskirju,
millele lisandus kolm voltimistingimust: (1) 2M uurea, 50mM Tris, 160mM arginiin,
4mM tsüsteiin, 1mM tsüstamiin, pH 8,5; (2) 4M uurea, 20% glütserool, 50mM Tris,
160mM arginiin, 2mM tsüsteiin, pH 8,5; ja (3) 4M uurea, 20% glütserool, 50mM
Tris, 160mM arginiin, 4mM tsüsteiin, 1mM tsüstamiin, pH 8,5. Taasvolditud 15
proteiini dialüüsiti 1,5M uurea, 50mM NaCl, 50mM Tris, pH 9,0 suhtes. Antud
mikstuuri pH alandati äädikhappega 5-le. Sete eemaldati tsentrifuugimisel ning
supernatant viidi pH-lt 5 pH-le 6,5, sõltuvalt iga sulandprodukti isoelektrilisest
punktist. Proteiin filtreeriti ja asetati temperatuuril 4 ˚C SP-Sepharose HP
kolonnile, mida oli tasakaalustatud 20mM-s NaAc-s, 50mM-s NaCl-s igale 20
struktuurile määratud pH juures. Proteiini elueeriti 20 kolonniga lineaarse
gradiendiga samas puhvris vahemikus 50mM NaCl kuni 500mM NaCl. Piik puuliti
ja filtreeriti.
Eespool toodud protseduuridega loodud peptikehad on esitatud tabelis 4 allpool.
Tabel 4 25
EE - EP1615952 B1 97
EE - EP1615952 B1 98
Tabelis 4 „Fc“ tähistab inimese Fc IgG1 järjestust. Teine tulp esitab peptikeha
aminohappe järjestuse. Sealne Fc osa on märkega „Fc“ ning on esitatud
JÄRJESTUSE ID-NR-s: 60 allpool. On mõistetav, et kui kasutatakse märget,
näiteks „Con4“ või „Con-4“, tähistab see Con-4 peptiidi, kusjuures nende sufiks 5
„C“, „(C)“ või „-C“ või „N“, „(N)“ või „-N“ viitab, et molekul on peptikeha, nagu on
siin kirjeldatud. Sufiksid „N“, „(N)“ või „-N“ peptikeha nimes viitavad, et Ang-2-
seostuspeptiid (või peptiidid) on N-terminaalsed Fc domeenil ning sufiksid „C“,
„(C)“ või „-C“ tähistavad, et Ang-2-seostuspeptiid (või peptiidid) on C-terminaalne
Fc domeenil. Lisaks võib 2xCon4 (C) 1K, nagu on määratletud JÄRJESTUSE ID-10
NR-s: 25, siin käsitleda ka ilma „1K“ sufiksita.
Iga peptikeha Fc osa aminohappe järjestus on järgnev (amino-otsast karboksüül-
otsani):
DNA järjestus (JÄRJESTUSE ID-NR-d: 33-53, mis kodeerivad vastavalt peptikeha 15
JÄRJESTUSE ID-NR-tele: 12-32 vastavaid peptikehasid tabelis 4) on esitatud
allpool:
EE - EP1615952 B1 99
EE - EP1615952 B1 100
EE - EP1615952 B1 101
EE - EP1615952 B1 102
EE - EP1615952 B1 103
EE - EP1615952 B1 104
EE - EP1615952 B1 105
EE - EP1615952 B1 106
EE - EP1615952 B1 107
EE - EP1615952 B1 108
EE - EP1615952 B1 109
Näide 6
Peptikeha analüüsid
Peptikehadest neljateistkümmet testiti neutralisatsiooni ELISA analüüsi kasutades
ning peptikehadest kolme testiti afiinsuse ELISA analüüsiga. Tulemused on 5
esitatud tabelis 5.
Tabel 5
hAng-2 mAng-2 hAng-1
Peptikeha IC 50 (nM) EC 50 (nM)
IC 50 (nM)
EC 50 (nM)
IC 50 (nM)
EC 50 (nM)
2xCon4 (C) 1K 0,04 0,02
Con4-L1 (C) 0,05 0,04
Con4 (C) 0,20 0,30
2xL1 (N) 0,65 0,80
Con4 (N) 0,85 0,03 0,72 0,07 Inhibeeri-
mine
puudus
Sidumine
puudus
2xL1 (C) 0,90 1,0
Con4 (N) 1K-
WT
1,9
EE - EP1615952 B1 110
Peptikeha IC 50 (nM) EC 50 (nM)
IC 50 (nM)
EC 50 (nM)
IC 50 (nM)
EC 50 (nM)
L1 (N) 6 11 Inhibeeri-
mine
puudus
C17 (N) 9 13 Inhibeeri-
mine
puudus
12-9 (N) 21 7,7 Inhibeeri-
mine
puudus
Con1 (N) 26 ~ 200 Inhibeeri-
mine
puudus
8-14 (N) 45 33 Inhibeeri-
mine
puudus
L1 (C) 65 37
8-8 (N) 80 ~ 700 Inhibeeri-
mine
puudus
Negatiivne
kontrolli
peptikeha 4883
Inhibeeri-
mine
puudus
Sidumi-
ne
puudus
Inhibee
-rimine
puudus
Sidu-
mine
puudu
s
Inhibeeri-
mine
puudus
Sidumine
puudus
Negatiivse kontrolli peptikeha 4883 aminohappe järjestus on järgnev (Fc osa on
allajoonitud, linker on „GGGGG“ ning peptiidi osa on paksus kirjas):
EE - EP1615952 B1 111
On mõistetav, et siinne termin „inhibeerimine puudus“ ei tähenda, et ühenditel
puuduvad inhibeerivad omadused. Pigem tähistab siin kasutatud „inhibeerimine
puudus“ ühendeid, millel testimisel neutralisatsiooni ELISA analüüsiga siin
kirjeldatud tingimustes oli IC50 väärtus suurem kui 1000nM, mis oli ka kõrgeim
kontsentratsioon, millega neid ühendeid skriiniti. Kuigi olulisi inhibeerivaid omadusi 5
ei täheldatud molekulidel märkega „inhibeerimine puudus“, on mõistetav, et nendel
molekulidel võib tegelikult inhibeerivaid omadusi olla erinevates analüüsi
tingimustes või erinevates analüüsides. Teatud eelistatud variandis on mõistetav,
et leiutis käsitleb peptikehasid, millel on inhibeerivad omadused siin kirjeldatud
analüüse kasutades. 10
Kahte peptikeha testiti afiinsuse BIAcore analüüsi kasutades (nagu kirjeldati näites
2). Tulemused on esitatud tabelis 6 allpool.
Tabel 6
Peptikeha (Pk) afiinsused hAng-2 ja mAng-2 jaoks
hAng-2 mAng-2
Peptikeha KD
(nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s)
Pk L1 (N) 3,1 2,9x105 9,1x10-4 0,425 5,6x105 2,3x10-4
Con4 (N) 0,67 3,3x105 2,2x10-4 0,60 7,3x105 4,4x10-4
TN12-9 (N) 8,2 1,2x105 1,0x10-3 0,32 7,2x105 2,3x10-4
Näide 7
Terapeutilise tõhususe uuringud süsteemselt manustatud Ang-2 peptikehaga 15
Ang-2 peptikeha TN8-Con4-C manustati subkutaanselt A431 kasvajaga hiirtele
üks päevas režiimiga 72 tundi pärast kasvaja teket. Peptikeha kasutatud annused
olid 1000, 200, 40 ja 8ug/hiir/päevas. Kokku anti kõikidele loomadele 20 annust.
Kasvaja suurus ja kehamassi märgiti kolm korda nädalas. Uuringu lõpus loomad
surmati ning nende seerumid koguti kokku peptikeha tasemete mõõtmiseks ELISA 20
analüüsiga. Kasvajad ja normaalsete kudede hulk koguti kõikidest rühmadest.
Tulemused on esitatud joonisel Fig 1. Nagu näha, täheldati olulisi erinevusi
kasvaja arengus Ang-2 peptikehaga ravitud rühma ja kanduriga kontrolli vahel.
EE - EP1615952 B1 112
Kõik neli Ang-2 peptikeha annust inhibeerisid kasvaja arengut, võrreldes kanduri
kontrollidega (p <0,0001, võrreldes kanduri kontrolliga, kasutades
korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi). Seevastu kontrollrühma kasvajad arenesid
edasi tunduvalt suurema kiirusega. Antud peptikehaga ravimisel ei olnud eespool
toodud annustel märkimisväärset toimet ravitud looma lõplikule kehamassile, 5
organite kaalule ega hematoloogia parameetritele.
Näide 8
1. Ang-2 sekundaarsete peptiidi kogumite loomine
A. Elektrokompetentse E. coli rakud
Epicurian Coli® XL1-Blue MRF’ elektroporatsiooni kompetentsed rakud 10
(Stratagene nr 200158) osteti firmalt Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La
Jolla, CA).
B. pCES1 vektori modifitseerimine
PCR teostati süsteemiga Extend Long Template PCR Systems (Roche
Diagnostics Corp., Indianapolis, IN), kus 1µg pCES1 vektor (TargetQuest Inc.) oli 15
mudeliks. PCR mikstuuri kogus oli 100µl, mis sisaldas 1x PCR puhvrit, 200nM
kumbagi kahte praimerit: 5’-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3’
(JÄRJESTUSE ID-NR: 244) ja 5’-
GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA-3’
(JÄRJESTUSE ID-NR: 245), 200nM dNTP ja 3 ühikut (Ü) Tag DNA polümeraasi. 20
TRIO-Thermoblock (Biometra) PCR süsteemil lasti järgnevalt töötada: 94 ˚C 5
minutit; 30 tsüklit temperatuuriga 94 ˚C 30 sekundit, 50 ˚C 30 sekundit, 72 ˚C 45
sekundit ning 72 ˚C 10 minutit; jahtumine temperatuurile 4 ˚C.
PCR produkte töödeldi 1%-lisel agaroosi geelil ja puhastati QIAGEN tsentrifuugiva
kolonniga (QIAGEN Inc., Valencia, CA) vastavalt tootja ettekirjutustele. Teine PCR 25
reaktsioon sooritati 5µl PCR produktide ja 200nM kummagi mõlema praimeriga 5’-
CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3’ (JÄRJESTUSE ID-NR: 246) ja 5’-
AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT-3’
(JÄRJESTUSE ID-NR: 247) samades PCR tingimustes, nagu kirjeldati eespool.
EE - EP1615952 B1 113
PCR produktid ja algne pCES1 vektor lagundati seejärel 1 tunni jooksul eraldi
100µl-lises reaktsioonis, mis sisaldas 1x NEB2 puhvrit, 60Ü ApaLI (New England
Biolabs, Beverly, MA), 60Ü BamHI (New England Biolabs) temperatuuril 37 ˚C.
Lagundatud DNA puhastati seejärel QIAGEN tsentrifuugiva kolonniga ning ligeeriti
öö jooksul toatemperatuuril kokku 40µl-lises reaktsioonis, mis sisaldas 1x 5
ligeerimise puhvrit ja 40Ü T4 DNA ligaasi (New England Biolabs).
Vektorid transfekteeriti E. colisse ja inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 37 ˚C.
Selekteeriti isoleeritud üksikud kolooniad ja plasmiid puhastati seejärel QIAGEN
tsentrifuugiva kolonniga. Korrektne lisand kinnitati DNA sekventeerimisega.
C. Vektori DNA valmistamine 10
Üks mikrogramm modifitseeritud pCES1 vektori DNA-d (lõigust 1B eespool)
transformeeriti 40ml-ks elektrokompetentseks XL1-blue E.coliks (lõigust 1A
eespool), kasutades komplekti Gene Pulser II (BIO-RAD, Hercules, CA) pingel
2500V, 25µF ja 200 oomi. Transformeeritud bakteri proov edastati kohe tuubi,
milles oli 960µl SOC (2% trüptoon, 0,5% pärmi ekstrakt, 10mM NaCl, 2,5mM KCl, 15
20mM glükoos, 10mM MgSO4, 10mM MgCl2), ning kultuuril lasti 1 tund kasvada
temperatuuril 37 ˚C raputamisel.
Rakud jaotati 2xYTAGT (2xYT 100ug/ml ampitsilliiniga, 12,5ug/ml tetratsükliin ja
2% glükoos) agarplaadile ja inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 37 ˚C. Üksik
koloonia kinnitati sekventeerimisega ning kasutati 2 liitri 2xYTAGT söötme 20
inokuleerimiseks temperatuuril 37 ˚C raputamisel öö jooksul. Plasmiidi vektori
DNA puhastati komplektiga QIAGEN Plasmid Maxi Kit vastavalt tootja
ettekirjutustele.
D. Vektor DNA lagundamine
Kokku umbes 2000 mikrogrammi vektori DNA (lõigust 1C eespool) lagundati 25
5000µl-lises reaktsioonis, mis sisaldas 1xNEB puhvrit 2, 300Ü ApaLI ja 300Ü
XhoI, temperatuuril 37 ˚C öö jooksul. Restriktsiooni lagundamisreaktsiooni
inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 37 ˚C ja analüüsiti eelnevalt valmistatud 0,8%
agaroosi geelis (Embi Tec, San Diego, CA). Seejärel lineariseeritud vektori DNA
EE - EP1615952 B1 114
eemaldati geelist ja seda ekstraktiti komplektiga QIAquick Gel Extraction Kit
(QIAGEN Inc.) vastavalt tootja juhistele.
E. Kogumi oligonukleotiidide valmistamine
Kuus kogumi oligonukleotiidi (1 fikseeritud ja 5 töödeldud) loodi järjestuste põhjal,
mis tuletati eespool kirjeldatud tulemustest. Üks kogumi fikseeritud oligonukleotiid 5
oli: 5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKS
ARTGGGATCCGTGGASCNNKNNKNNKNNKNNKNNK-NNKCATT
CTCTCGAGATCA-3’ (kogumi number 20) (JÄRJESTUSE ID-NR: 248);
ning 70% kogumi töödeldud oligonukleotiidist kaks olid järgnevad:
5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKaaKcgKccKNNKga 10
KgaKatKttKggKggKNNKacKtaKcaKNNKNNKNNKCATTCTC
TCGAGATCA-3’ (kogumi number 27); (JÄRJESTUSE ID-NR: 249);
5’-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga
KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-
3’ (kogumi number 99); (JÄRJESTUSE ID-NR: 250). 15
Väiketähed tähistavad segu 70% näidatud baasist ja 10% igast teisest kolmest
nukleotiidist. Ülejäänud 91% kogumi oligonukleotiididest kolm olid järgnevad:
5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKgaKgaKTGCgaKtg
KgaKccKtgKacKTGCgaKcaKatKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGA
TC A-3’ (kogumi number 94); (JÄRJESTUSE ID-NR: 251); 20
5’-CACAGTGCACAGGGTNNKttKgaKtaKNNKgaKggKgtKgaKgaKcc
KttKacKttKggKNNKgaKaaKcaKNNKCATTCTCT-
CGAGATCA-3’ (kogumi number 25); (JÄRJESTUSE ID-NR: 252);
ning
EE - EP1615952 B1 115
5’-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga
KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-
3’ (kogumi number 26); (JÄRJESTUSE ID-NR: 253);
Eespool toodud oligode puhul antud valdkonnas pädevad isikud mõistavad, et „N“
tähendab, et neljast nukleotiidist (A, T, C ja G) igaüks on võrdselt esindatud oligo 5
sünteesi käigus, ning „K“ tähendab, et nukleotiidid G ja T olid võrdselt esindatud
oligo sünteesi käigus. Väiketähed tähistavad segu 91% näidatud baasist ja 3%
igast teisest kolmest nukleotiidist. Neist nukleotiididest igaühte kasutati mudelina
PCR-s.
PCR reaktsioonide jaoks kasutati süsteemi Expand High Fidelity PCR System kit 10
(Roche Diagnostics Corp.). Kogumi iga oligot amplifitseeriti 96-lises süvendis 50µl
PCR reaktsioonis, mis sisaldas 1nM kogumi oligonukleotiidi, 1X PCR puhvrit,
300nM kumbagi praimerit:
5’-CACAGTGCACAGGGT-3’ (JÄRJESTUSE ID-NR: 254);
ja 15
5’-TGATCTCGAGAGAATG-3’, (JÄRJESTUSE ID-NR: 255);
200µM dNTP, 1,5mM MgCl2 ja 350Ü Expand polümeraasi. Termotsüklerit
(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) kasutati järgneva programmi
teostamiseks: 94 ˚C 5 minutit; 25 tsüklit temperatuuril 94 ˚C 30 sekundit, 52,5 ˚C
60 sekundit, 72 ˚C 30 sekundit; 72 ˚C 10 minutit; jahutamine temperatuurile 4 ˚C. 20
Seejärel eemaldati vabad nukleotiidid komplektiga QIAquick PCR Purification Kit
(QIAGEN Inc. kat-nr 28104) vastavalt tootja juhistele.
F. Kogumi oligonukleotiidide lagundamine
Iga kogumi jaoks lagundati PCR produktid (lõik 1E) 1200µl-lises reaktsioonis, mis
sisaldas 1x NEB puhvrit 2, 750Ü ApaLI ja 750Ü XhoI, öö jooksul temperatuuril 37 25
˚C. Lagundatud DNA eraldati eelnevalt valmistatud 3% agaroosi geelil (Embi Tec).
Vaatlusalune DNA riba igast reaktsioonist lõigati geelist ning seda ekstraktiti
EE - EP1615952 B1 116
COSTAR Spin-X tsentrifuugi torufiltriga, 0,22mM tselluloosatsetaadiga (Corning
Inc., kat-nr 8160).
G. Vektori ligeerimine kogumi oligonukleotiididega
450µl ligeerimise reaktsioon sisaldas lineariseeritud vektorit (lõik 1D) ja kogumi iga
lagundatud PCR produkti (lõik IF) moolisuhtes 1:5, 1xNEB ligeerimispuhvrit ja 5
20 000Ü T4 DNA ligaasi temperatuuril 16 ˚C öö jooksul. Ligeeritud produkte
inkubeeriti 20 minutit temperatuuril 65 ˚C, et T4 DNA ligaasi inaktiveerida, ja
inkubeeriti veel 2 tundi 100Ü NotI-ga temperatuuril 37 ˚C, et vekotri iseeneslikku
ligeerimist miinimumini viia. Ligeeritud produktid puhastati seejärel
fenool/kloroformi standardse ekstraktimisega (Molecular Cloning: A Laboratory 10
Manual, Maniatis et al, 3. väljaanne, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)
ja resuspendeeriti 120µl-s H2O-s.
H. Elektroporatsiooni transformatsioon
Iga kogumi jaoks teostati kaksteist elektroporatsiooni reaktsiooni. Igaks
transformatsiooniks segati 10µl ligeeritud vektorit DNA (lõik 1G) ja 300µl XL1-15
BLUE MRF’ rakke (lõik 1A) 0,2cm-lises küvetis (BIO-RAD). Saadud segu
elektroporeeriti seadmega Gene Pulser II pingel 2500V, 25uF ja 200 oomi.
Transformeeritud bakterid kaheteistkümnest elektroporatsiooni reaktsioonist
kombineeriti ja edastati 1 tunniks temperatuuril 37 ˚C inkubeerimiseks kolvi, milles
oli 26ml SOC. Rakud lisati 450ml 2xYTAG-le ja kasvatati temperatuuril 37 ˚C 20
raputamisel 5 tundi. Rakke tsentrifuugiti 15 minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel
4000rpm. Seejärel rakugraanulid resuspendeeriti 12ml-s 15%-lises
glütseroolis/2xYT-s ja neid hoiti temperatuuril -80 ˚C. See oli kogumike primaarne
varu. Tiitrid näitasid kogumite suurusteks 5,0x109 (kogumi number 20), 3,3x1010
(kogumi number 94), 4,7x109 (kogumi number 25), 5,0x109 (kogumi number 26), 25
3,0x109 (kogumi number 27) ja 4,2x109 (kogumi number 99) sõltumatut
transformanti.
2. Kogumite amplifitseerimine
A. Kogumite teise varu valmistamine
EE - EP1615952 B1 117
Esmasest kogumi rakuvarust (lõigust 1H eespool) kasutati piisavalt rakke, et katta
10x liiasust igast kogumi suurusest ja inokuleerida 2xYTAGT (2YT 100ug/ml
ampitsilliini, 12,5ug/ml tetratsükliini ja 2% glükoosiga) söödet, nii et esialgne OD600
oli 0,1. Kultuuridel lasti kasvada mitu tundi temperatuuril 37 ˚C raputades, kuni
OD600 = 0,5. Igast kogumist võeti välja ühe kümnendiku suurune alikvoot ja 5
kasvatati üles eraldi kolbides veel kahe tunni jooksul temperatuuril 37 ˚C. Neid
alamkultuure tsentrifuugiti seejärel 10 minutit temperatuuril 4 ˚C rootoriga
Beckman JA-14 kiirusel 4000rpm ning bakterite graanuleid resuspendeeriti
säilitamiseks 7,0ml-s (iga kogumi jaoks) 15%-lises gltüseroolis/2xYT-s
temperatuuril -80 ˚C. 10
B. Faagi induktsioon
M13KO7 faagi abistaja alikvoote (Amersham Pharmacia Biotech) lisati allesjäänud
bakteri kultuuridele optilisel tihedusel OD600=0,5 (lõigust 2A eespool)
lõppkontsentratsioonile 3x109pfu/ml. Abistaja faagil lasti baktereid 30 minutit
raputamata nakatada temperatuuril 37 ˚C ning 30 minutit aeglase raputamisega. 15
Nakatatud rakke tsentrifuugiti 15 minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel 5000rpm. Raku
graanuleid resuspendeeriti samas koguses (lõigust 2A eespool) 2xYTAK
söötmega (2YT 100ug/ml ampitsiliini ja 40ug/ml kanamütsiiniga). Fagemiidi
tootmisel lasti öö jooksul loksutamisel toimuda temperatuuril 30 ˚C.
C. Faagi kogumine 20
Bakteri kultuure lõigust 2B eespool tsentrifuugiti 15 minutit temperatuuril 4 ˚C
kiirusel 5000rpm. Supernatandid edastati seejärel uutesse pudelitesse ning lisati
0,2-line kogus 20%-list PEG/2,5M NaCl ja seda inkubeeriti jääl 1 tund, et
fagemiide sadestada. Sadestatud fagemiide tsentrifuugiti 30 minutit temperatuuril
4 ˚C kiirusel 10 000rpm ja resuspendeeriti ettevaatlikult 100ml külma PBS-ga. 25
Fagemiidi lahust puhastati veel allesjäänud rakkude välja tsentrifuugimisel 10
minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel 4000rpm ning fagemiidide setitamisel, lisades
0,2-lise koguse 20%-list PEG/2,5M NaCl. Fagemiide tsentrifuugiti 30 minutit
temperatuuril 4 ˚C kiirusel 10 000rpm ning fagemiidi graanuleid resuspendeeriti
18ml külma PBS-ga. Fagemiidi lahusele lisati säilitamiseks kuus ml 60% 30
EE - EP1615952 B1 118
glütserooli lahust temperatuuril -80 ˚C. Fagemiidi tiitrid tuvastati
standardprotseduuriga (Molecular Cloning, Maniatis et al, 3. väljaanne).
3. Ang-2 seostusfaagi selekteerimine
A. Ang-2 kinnistamine magnetilistele graanulitele
Biotinüülitud Ang-2 (lõigust 3A eespool) kinnistati osakestele Dynabead M-280 5
Streptavidin (DYNAL, Lake Success, NY) kontsentratsioonil 2000ng Ang-2
proteiini 100µl graanulite varu kohta tootjalt. Pärast graanulite tõmbamist toru
ühele küljele magneti abil ja vedeliku pipetiga eemaldamist pesti graanuleid kaks
korda fosfaatpuhvri soolahusega (PBS) ja resuspendeeriti PBS-s. Biotinüülitud
Ang-2 proteiini lisati pestud graanulitele ülaltoodud kontsentratsioonil ning 10
inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril pöörlemisel. Ang-2 kattega graanulid blokeeriti
seejärel BSA lisamisel 2%-lise lõppkontsentratsioonile ning inkubeeriti öö jooksul
temperatuuril 4 ˚C pöörlemisel. Saadud Ang-2 kattega graanuleid pesti seejärel
kaks korda PBST-ga (PBS 0,05%-lise Tween-20-ga) enne selektsiooni
protseduuridesse edastamist. 15
B. Ang-2 kattega graanulitega selekteerimine
Umbes 1000-kordse kogumiga ekvivalentseid fagemiide (lõigust 2C eespool)
blokeeriti üks tund 2%-list BSA-d sisaldava 1ml PBS-ga. Blokeeritud fagemiidi
proov edastati kolme negatiivse selektsiooni etappi, lisades selle puhastele
graanulitele (samad graanulid nagu lõigus 3A, aga Ang-2 proteiini katteta) ning 20
seda mikstuuri inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril pöörlemisel. Fagemiidi
sisaldav supernatant tõmmati magneti abil välja ja edastati teise torusse, mis
sisaldas puhtaid graanuleid (samad graanulid nagu lõigus 3A, aga Ang-2 proteiini
katteta) ning seda mikstuuri inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril pöörlemisel.
Sama protseduuri korrati. Fagemiidi sisaldav supernatant tõmmati magneti abil 25
välja ja edastati teise torusse, mis sisaldas Ang-2 proteiini kattega graanuleid
(lõigust 3A) ning seda mikstuuri inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril pöörlemisel.
Pärast supernatandi eemaldamist pesti fagemiidiga seotud graanuleid 10 korda
2%-lise piima-PBS-ga, 10 korda 2%-lise BSA-PBS-ga, 10 korda PBST-ga ja kaks
korda PBS-ga. Seejärel lasti fagemiididel 10 minutit rotaatoril elueerida 1ml-s 30
EE - EP1615952 B1 119
100mM-s trietüülamiini lahuses (Sigma, St. Louis, MO). Fagemiidi sisaldava
lahuse pH neutraliseeriti 0,5ml 1MTris-HCl (pH 7,5) lisamisega. Saadud fagemiide
kasutati 10ml värskelt kasvatatud XL1-Blue MRF’ bakterite nakatamiseks (OD600
umbes 0,5) temperatuuril 37 ˚C 30 minutit loksutamisega ning 30 minutit aeglase
loksutamisega. Kõik nakatatud XL1-BLUE MRF’ rakud seati 15x15cm 2xYTAG 5
plaadile ja inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 30 ˚C.
C. Faagi induktsioon ja kogumine
10ml-line alikvoot 2xYTAGT söödet lisati plaadile (lõigust 3B) XL1-BLUE MRF’
rakkude resuspendeerimiseks. Kõik XL1-BLUE MRF’ rakud koguti torusse ning
250ml-line alikvoot neid rakke lisati 25ml-le 2xYTAGT-le ja kasvatati temperatuuril 10
37 ˚C, kuni OD600 = 0,5. M13KO7 abistaja faagi lisati lõppkontsentratsioonile
3x109cfu/ml ning inkubeeriti 30 minutit loksutamiseta temperatuuril 37 ˚C ja 30
minutit aeglasel loksutamisel. Rakke tsentrifuugiti 10 minutit kiirusel 5000rpm
temperatuuril 4 ˚C ja resuspendeeriti 25ml 2xYTAK-ga. Nendel bakteritel lasti öö
jooksul temperatuuril 30 ˚C loksutamisel kasvada. Indutseeritud fagemiidid koguti 15
kokku ning puhastati nagu lõigus 2C.
D. Teine selekteerimine
Teine selekteermine tehti nagu lõikudes 3B kuni 3C, välja arvatud järgnev. Umbes
1000-kordse kogumiga ekvivalentseid lõigust 3C saadud fagemiide kasutati
lähtefagemiidina. Biotinüülitud Ang-2 proteiini (lõik 3A) katte kogust osakestele 20
Dynabead M-280 Streptavidin vähendati 20ng-ni. Faagiga seotud graanuleid pesti
seejärel 10 korda 2%-lise piima-PBS-ga, 10 korda 2%-lise BSA-PBS-ga, 10 korda
PBST-ga, kus viimane pesu hõlmas 60-minutilist inkubeerimist toatemperatuuril
PBST-s. Graanuleid pesti kaks korda PBS-ga. Elueerimise tingimused olid samad
nagu esimeses selekteerimises (lõik 3B). 25
E. Kolmas selekteerimine
Kolmanda ringi selekteerimine sooritati nagu lõikudes 3B kuni 3C eespool, välja
arvatud järgnev. Umbes 10-kordse kogumi ekvivalendi fagemiide 3D kasutati
lähtefagemiididena. Umbes 2ng biotinüülitud Ang-2 proteiini (lõigust 3A) kasutati
osakeste Dynabead M-280 Streptavidin katmiseks. Faagiga seotud graanuleid 30
EE - EP1615952 B1 120
pesti 10 korda 2%-lise piima-PBS-ga, 10 korda 2%-lise BSA-PBS-ga, 10 korda
PBST-ga, kus viimane pesu hõlmas 60-minutilist inkubeerimist toatemperatuuril
PBST-s. Graanuleid pesti kaks korda PBS-ga. Elueerimise tingimused olid samad
nagu esimeses selekteerimises (lõik 3B).
F. Neljas selekteerimine 5
Neljanda ringi selekteerimine sooritati nagu lõikudes 3B kuni 3C eespool, välja
arvatud järgnev. Kogumi ekvivalendi fagemiide lõigust 3E kasutati
lähtefagemiididena. Biotinüülitud Ang-2 proteiini (lõik 3A) katte kogust osakestele
Dynabead M-280 Streptavidin vähendati kogumite 25, 26 ja 27 puhul 0,4ng-le.
Kogumitele 20 ja 94 hoiti katte kogust nagu kolmandas ringis 2ng juures. Kogumit 10
99 neljanda selektsiooni etapile ei tehtud. Elueerimise tingimused olid samad nagu
esimeses selekteerimises (lõik 3B).
4. KLOONI ANALÜÜS
A. Peaplaadi (Master Plate) valmistamine
Üksikud kolooniad teisest selekteerimisest valiti välja ja inokuleeriti 96-15
süvendilistele plaatidele, mis sisaldasid igas süvendis 120µl 2xYTAGT. 96-
süvendilisi plaate inkubeeriti öö jooksul loksutis temperatuuril 30 ˚C. Igale
süvendile lisati säilitamiseks nelikümmend mikroliitrit 60%-list glütserooli
temperatuuril -80 ˚C.
B. Fagemiidi ELISA 20
Umbes 2µl alikvoote rakke peaplaadist (lõigust 4A eespool) inokuleeriti värskele
Costar® 96-süvendilisele plaadile (Corning Incorporated, Coming, NY, kat-nr
9794), mis sisaldas igas süvendis 100µl 2xYTAGT, ning seda uut rakkude plaati
kasvatati temperatuuril 37 ˚C, kuni OD600 oli ligikaudu 0,5.
Igale süvendile lisati nelikümmend µl 2xYTAGT, mis sisaldas M13KO7 abistaja 25
faagi (1,5x1013cfu/ml), ning 96-süvendilist plaati inkubeeriti 30 minutit
loksutamiseta ning veel 30 minutit aeglase loksutamisega temperatuuril 37 ˚C.
Plaati tsentrifuugiti 10 minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel 2000rpm (Beckman CS-
6R lauatsentrifuug). Supernatandid eemaldati rakkudest ning iga rakugraanulit
EE - EP1615952 B1 121
resuspendeeriti igas süvendis 150µl 2xYTAK kasutamisel. Plaati inkubeeriti öö
jooksul temperatuuril 30 ˚C fagemiidi ekspressiooniks.
Inimese Ang-2 proteiin kaeti temperatuuril 4 ˚C öö jooksul 96-süvendilisele
Maxisorpi plaadile (NUNC) koguses 1µg/ml 1xPBS-s. Kontrolliks kaeti 2% BSA
(Sigma) eraldi Maxisorpi plaadile. Järgmisel päeval tsentrifuugiti öö jooksul saadud 5
rakke 10 minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel 2000rpm. Kümme µl supernatanti igast
süvendist edastati uuele 96-süvendilisele plaadile, mis sisaldas BSA/PBS lahust,
et lahjendada supernatanti suhtes 1:10. Saadud segusid inkubeeriti 1 tund
toatemperatuuril loksutamisel, et fagemiide blokeerida. Samal ajal blokeeriti Ang-2
proteiiniga kaetud plaat 400µl 2% BSA/PBS lahusega igas süvendis 1 tunni 10
jooksul toatemperatuuril loksutamisel. BSA lahus eemaldati ning iga süvendit pesti
kolm korda PBS lahusega. Pärast viimast pesuetappi lisati igale Ang-2 proteiiniga
kaetud plaadi süvendile ja kontrollplaadile 100µl blokeeritud fagemiidi lahuseid
ning neid inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril loksutamisel. Vedelik eemaldati ja iga
süvendit pesti kolm korda PBST lahusega. Igale Ang-2 proteiiniga kaetud ja 15
kontrollplaadi süvendile lisati sada µl HRP-konjugeeritud anti-M13 mAb
(Amersham Pharmacia Biotech) 15 000-lisel lahjendusel ning neid plaate
inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril loksutamisel. Vedelik eemaldati uuesti ja iga
süvendit pesti kolm korda PBST lahusega. Süvenditele lisati sada µl LumiGLO
kemoluminestsents-substraate (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, 20
MD) ja iga süvendit loeti seadmega Luminoskan Ascent DLRearly (Labsystems,
Franklin, MA).
C. Faagi kloonide sekventeerimine
PCR reaktsioon sooritati 1µl bakteritega peaplaadi igast süvendist (lõik 4A), mis
olid mudeliks. Iga PCR segu kogus oli 50µl, mis sisaldas 1xPCR puhvrit, 300nM 25
kumbagi praimerit:
5’-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3’ (JÄRJESTUSE ID-NR: 256) ja
5’-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3’, (JÄRJESTUSE ID-NR: 257);
200mM dNTP, 2mM MgCl2 ja 2,5Ü taq DNA polümeraasi (Roche Molecular
Biochemicals). Järgneva programmi teostamiseks kasutati masinat GeneAmp 30
EE - EP1615952 B1 122
PCR System 9700 (Applied Biosystems): 94 ˚C 5 minutit; 40 tsüklit (94 ˚C 45
sekundit, 55 ˚C 45 sekundit, 72 ˚C 90 sekundit); 72 ˚C 10 minutit; jahutamine
temperatuurile 4 ˚C. PCR produkte puhastati seadmega QIAquick 96 PCR
Purification Kit (QIAGEN Inc.) vastavalt tootja juhistele. Kõik PCR produktid
järjestati praimeriga 5’-TTACACTTTATGCITCCG-3’ (JÄRJESTUSE ID-NR: 258), 5
kasutades sekventserit ABI 3770 (Perkin Elmer) vastavalt tootja juhistele.
5. Järjestuse hindamine
Nukleotiidi järjestustest (lõigust 4C eespool) transleeritud peptiidi järjestused pandi
ELISA andmetega korreleeruma. Kloonid näitasid, et kõrget OD näitu Ang-2
kaetud süvendites ja madalat OD näitu BSA kaetud süvendites peeti palju 10
olulisemaks. Mitu korda esinenud järjestusi peeti samuti oluliseks. Kakskümmend
neli peptiidi järjestust kogumist 20, 26 peptiidi järjestust kogumist 94, 7 peptiidi
järjestust kogumist 25, 18 peptiidi järjestust kogumist 26, 6 peptiidi järjestust
kogumist 27 ning 4 peptiidi järjestust kogumist 99 valiti edasiseks analüüsiks ja
peptikeha loomiseks. Lisaks tuletati üksteist konsensusjärjestust kogumitest 20 ja 15
94, kolm konsensusjärjestust kogumitest 26 ja 99 ning kaks konsensusjärjestust
kogumitest 25 ning neid kasutati peptikehade loomiseks. Peptikehasid tabelis 7
hinnati neutralisatsiooni ELISA analüüsi eeskirjadega, mida on kirjeldatud siin
näites 10. Tulemused on esitatud tabelis 7.
Tabel 7 20
EE - EP1615952 B1 123
EE - EP1615952 B1 124
EE - EP1615952 B1 125
EE - EP1615952 B1 126
EE - EP1615952 B1 127
EE - EP1615952 B1 128
EE - EP1615952 B1 129
EE - EP1615952 B1 130
EE - EP1615952 B1 131
Näide 9
Anti-Ang2 peptikehade 6 proovi testiti nende seostumistoime osas huAng2-le
(R&D Systems, BNO12103A firmalt BIAcore). Proteiin G kinnistati CM5 kiibile
vastavalt amiini sidumise standardeeskirjadele (BIAcore Inc.) ning peptikehad 5
sisestati proteiini G pinnale haaramiseks (RL ~100RÜ). Seostumise testimiseks
hAng2 ja haaratud peptikeha vahel süstiti 0,3nM kuni 40nM huAng2 haaratud
peptikeha pinnale ja seostuvaid sensorgramme analüüsiti seadmega
EE - EP1615952 B1 132
BIAevaluation 3,0 (BIAcore Inc.). Tabelis 8 on antud katse tulemused kokku
võetud.
Tabel 8
Peptikeha Partii nr KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s)
Con4-44 (C) 011702 2,1E-10 2,9E+05 5,9E-05
L1-7 (N) 022102 2,4E-10 3,7E+05 8,7E-05
L1-10 (N) 021302 7,7E-10 1,5E+05 1,1E-04
L1-21 (N) 021802 2,4E-10 5,6E+05 1,4E-04
Con4 (C) 33456-77 3,8E-10 5,3E+05 2,0E-04
2xCon4 (C) 1K 092501 3,4E-10 4,8E+05 1,6E-04
Näide 10
Neutralisatsiooni ELISA 5
Inimese, hiire, koera ja roti Ang-2 ning inimese ja hiire Ang-1 töödeldud söödet
lahjendati DMEM/50mg/ml-s BSA-s järgnevalt: hAng-2 - 1:64 lahjendus; mAng-2 -
1:64 lahjendus; roti Ang-2 - lahjendamata; koera Ang-2 - 1:32 lahjendus; hAng-1 -
1:4 lahjendus; ning mAng-1 - 1:4 lahjendus.
Ulatus, milleni iga konditsioneeritud söödet lahjendati, määrati nende võime põhjal 10
siduda 1nM hTie2-Fc (võimaldati Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa sisaldab
ainult molekuli lahustuvat rakuvälist osa; R&D Systems, kataloogi number 313-TI)
50% maksimaalselt saavutatava sidumisega (st platoo). Mikrotiitri plaadid kaeti
100µl lahjendatud konditsioneeritud söötmega. Ang-2 neutralisatsiooni ELISA
analüüside jaoks tiitriti kandidaat anti-Ang-2 peptikehasid 62,5nM-st 0,015pM-ni 4-15
kordsetes lahjendustes PBS lahuses, mis sisaldas umbes 1% BSA-d ja umbes
1nM Tie-2 (võimaldati Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa sisaldab ainult molekuli
lahustuvat rakuvälist osa; R&D Systems, kataloogi number 313-TI). Ang-1
neutralisatsiooni ELISA analüüside jaoks tiitriti kandidaat anti-Ang-2 peptikehasid
1000nM-st 0,2pM-ni 4-kordsetes lahjendustes PBS lahuses, mis sisaldas umbes 20
1% BSA-d ja umbes 1nM Tie-2 (võimaldati Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa
sisaldab ainult molekuli lahustuvat rakuvälist; R&D Systems, kataloogi number
313-TI).
EE - EP1615952 B1 133
Pärast umbes 100 mikroliitri peptikeha/Tie-2 lahuse lisamist igasse süvendisse
inkubeeriti plaate öö jooksul toatemperatuuril ning seejärel pesti viis korda PBS-s,
mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Pärast pesu lisati süvendi kohta 100
mikroliitrit anti-Tie-2 antikeha (Pharmingen Inc., kataloogi nr557039)
lõppkontsentratsioonil umbes 1 mikrogrammi ml kohta ning plaate inkubeeriti 5
umbes 1 tund toatemperatuuril. Järgmisena lisati süvendi kohta 100 mikroliitrit
kitse anti-hiire-IgG-HRP (Pierce Chemical Co., kataloogi nr 31432) lahjendusel
umbes 1:10 000 PBS-s, mis sisaldas umbes 1% BSA-d.
Plaate inkubeeriti toatemperatuuril umbes 1 tund, mille järel neid pesti viis korda
PBS-ga, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Seejärel lisati umbes 100 10
mikroliitrit TMB substraati süvendi kohta (SIGMA, kataloogi nr T8665) ning sinisel
värvil lasti tekkida. Seejärel loeti spektrofotomeetriga absorptsioon 370nM juures.
Tulemused on esitatud tabelis 9 allpool.
Tabel 9
Angiopoietiin:Tie2 koostoime peptikeha vahendatud neutralisatsioon
hAng-2 mAng-2 rAng-2 cAng-2 hAng-1 mAng-1
Peptikeha IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM)
2xCon4 (C) 0,026 0,035 0,024 0,047 3,0 3,2
Con4 (C) 0,197 0,289 0,236 0,540 200 300
Con4-44 (C) 0,08 0,16 0,22 ---- 43 ----
Con4-40 (C) 0,20 0,27 0,35 ---- > 1000 ----
L1-7 (N) 0,046 0,063 0,035 0,108 > 1000 > 1000
L1-21 (N) 0,179 0,249 0,204 0,608 > 1000 > 1000
L1-10 (N) 0,06 0,06 0,06 ---- > 1000 ----
Näide 11 15
FK uuring
Uuringu struktuur
Isased CD-1 hiired kehamassiga 20-30g jaotati suvaliselt iga peptikeha ravirühma
(2xCon4-C, L1-7-N ja L1-21-N). Loomad said üksiku IV booluse (n=38/rühm) või
EE - EP1615952 B1 134
üksiku subkutaanse (SK) manustamisena 50µg peptikeha (n=34/rühm). Süste tehti
sabaveeni kaudu ja õlgadel oleva naha alla vastavalt N ja SK manustamiseks.
Vereproovid ja analüütilised meetodid
Vereproovid võeti iga anti-Ang2 peptikeha kontsentratsiooni mõõtmise esialgse
annuse jaoks ning 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 216, 264, 312 ja 5
336 tundi pärast doosi manustamist SK ja N rühmadele. Lisaproovid võeti 5 ja 30
minutit doosijärgselt IV rühmade jaoks. Kahel loomal võeti verd teatud ajapunktil
ning loomad surmati pärast proovi võtmist. Veri (ligikaudu 0,50ml) koguti südamest
vere võtmisega Microtainer® polüproüleeni seerumi eraldustorudesse. Proove
hoiti jääl ligikaudu 20 minutit või klompide moodustumiseni. Seerum eemaldati 10
vereproovist ligikaudu 10 minuti jooksul temperatuuril 2-8 ˚C tsentrifuugimisel ning
seda hoiti analüüsimiseni ligikaudu temperatuuril -70 ˚C. Proove mõõdeti
kontrollitud TRF analüüsiga alumise määramispiiriga (LLOQ) 100ng/mL. NUNC
Maxisorpi fluoriga miktrotiitri plaadid kaeti rekombinantse hiire Ang-2 proteiiniga.
Seejärel blokeeriti plaadid proteiini lahusega, et alandada mittespetsiifilist sidumist. 15
Standardid, kvaliteedikontroll ja tundmatud proovid valmistati 10%-lises hiire
seerumi analüüsi puhvris ning lasti pipetiga mikrotiitri plaatide süvenditesse.
Peptikehad seoti spetsiifiliselt kinnistatud Ang-2-le. Pärast kõikide seondumata
ainete välja pesemist (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) lisati süvenditesse
biotinüülitud kitse anti-inimese IgG (H+L) monoklonaalne antikeha (Jackson 20
ImmunoResearch Laboratories Inc.). Pärast mis tahes seondumata biotinüülitud
monoklonaalsete antikehade eemaldamise etappi lisati süvenditesse
euroopiumiga märgistatud streptavidiini. Pärast seondumata streptavidiin-
euroopiumi välja pesemist eemaldati seotud euroopium streptavidiinist igasse
süvendisse pipeteeritud happelise lahusega. Loodi fluorestsentssignaal ja seda 25
loeti Wallaci fluorimeetriga. Testi vahemik anti-Ang-2 peptikeha analüüsiks hiire
seerumis on 0,078-5µg/mL.
Farmakokineetiline analüüs
Komposiidi keskmine kontsentratsiooni-aja andmed iga rühma jaoks sisestati
jaotusega analüüsi, kasutades tarkvara WinNonlin Professional (versioon 3.3, 30
Pharsight Corp., Mountain View, CA). Nominaalseid proovi aegu kasutati
EE - EP1615952 B1 135
farmakokineetiliseks analüüsiks, kui proovid koguti nominaalsest ajast 10%
jooksul. Kõik alla LLOQ kontsentratsiooni väärtused seati enne FK analüüsi nullile.
Mõõdeti järgnevad FK parameetrid:
• terminaalne poolestusaeg (t½ arvutati valemiga , kus kel oli
esimest järku terminaalne kiiruskonstant, mis määrati kindlaks terminaalse 5
log-lineaarse lagunemisfaasi lineaarse regressiooniga;
• seerumi kontsentratsiooni-aja kõvera all olev ala (AUC(0-viimane)) määrati
kindlaks lineaarse/log trapetsiaalse meetodiga ajast 0 kuni viimane, viimase
mõõdetava kontsentratsiooni aeg (Cviimane).
• ala kõvera all ajast 0 kuni lõpmatuseni (AUC(0-∞)) määrati kindlaks vastava 10
AUC(0-viimane) ja prognoositud Cviimane/kel väärtuste summana:
AUC(0-∞)=AUC(0-viimane)+prognoositud Cviimane/kel
• absoluutne biokättesaadavus (F) pärast SK manustamist arvutati
valemiga:
F=(AUC(0-∞)SK/AUC(0-∞)IV)x100 15
Tulemused on esitatud joonisel Fig 2.
Näide 12
Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 1x107 A431
rakke. 3. päeval manustati Ang-2 peptikeha 2xCon4-C subkutaanselt annuses
200µg/hiir/päevas. Kasvaja suurust ja kehamassi märgiti üles regulaarsete 20
intervallidega, nagu on joonisel näidatud. Olulisi erinevusi kasvaja arengus
täheldati Ang-2 peptikehaga ravitud rühma ning kandur-kontrolli ja kontroll-
peptikeha (p <0,0001 iga kontrolli suhtes, kasutades korduvmõõtmisega ANOVA
analüüsi, Scheffe’i post hoc testiga) vahel. Selle peptikehaga ravimisel ei olnud
olulist toimet kehamassile. Tulemused on esitatud joonisel Fig 3. 25
EE - EP1615952 B1 136
Näide 13
A431 in vitro kasvukõver
A431 rakud külvati 96-süvendilistele koekultuuri plaatidele tihedusel 2000 rakku
süvendisse 200µl-s DMEM-s, millele oli lisatud 10%-list veise looteseerumit (FBS).
Sööde imeti välja 16 tundi pärast külvamist. Seejärel lisati süvenditesse järgnev 5
ning seati sisse triplikaadina: 100µl DMEM-i igasse süvendisse, 10% FBS, 1mg/ml
negatiivne kontroll-peptikeha 4883 või peptikeha TN8-Con4. Sama seadistust
korrati 5 plaadil. Ühelt plaadilt saadud sööde imeti välja 24, 48, 72, 96 ja 120 tundi
pärast ravi. Seejärel lisati igasse süvendisse sada µl 10% trikloroäädikhapet (TCA)
ning plaate hoiti temperatuuril 4 ˚C. Kõik plaadid koguti, kui viimane plaat oli 10
minimaalselt 4 tundi 10%-lises TCA-s. 10%-line TCA loksutati välja ning süvendeid
loputati 5 korda kraaniveega. Rakud märgistati seejärel 10 minuti jooksul
toatemperatuuril 100µl 0,4% sulforodamiiniga B (Sigma S-9012) 1%-lises
äädikhappes (Sigma A-6283) ning neid pesti siis 5 korda 1%-lise äädikhappega.
Hiljem kuivatati plaadid õhkkuivaks. Värvi tehti 2 tundi pöördloksutil lahustuvaks 15
300µl 20mM puhverdamata Tris-ga (pH>10). Seejärel mõõdeti optiline tihedus
(OD) 540nm juures mikrotiitri plaadi loenduriga. Tulemused on esitatud joonisel
Fig 4.
Näide 14
Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-20
205 rakke ja Matrigeli (2:1). 3. päeval manustati Ang-2 peptikehasid L1-7-N, L1-
21-N, Con4-C ja 2xCon4-C subkutaanselt annusel 14µg/hiir kaks korda nädalas.
Positiivse kontrollina manustati Anti-Ang-2 antikeha Ab536 annuses 47µg/hiir kolm
korda nädalas. Kasvaja suurus ja kehamassid märgiti üles regulaarsetel
intervallidel. 25
Olulisi erinevusi kasvaja arengus täheldati iga Ang-2 peptikehaga ravitud rühma ja
kandur-kontrolli ning kontroll-peptikeha vahel (p <0,0001 iga kontrolli suhtes,
kasutades korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi Scheffe’i post hoc testiga). Nende
peptikehadega ravimisel ei olnud märkimisväärset toimet kehamassile (tulemusi ei
ole näidatud). Tulemused on esitatud joonisel Fig 5. 30
EE - EP1615952 B1 137
Näide 15
Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-
205 rakke ja Matrigeli (2:1). 3. päeval manustati Ang-2 peptikeha 2xCon4-C
subkutaanselt annustes 14, 2,8 ja 0,56µg/hiir kaks korda nädalas. Kasvaja suurust
ja kehamassi märgiti üles regulaarsetel intervallidel, nagu on näidatud. Olulisi 5
erinevusi kasvaja arengus täheldati kahe kõrgemas annuses Ang-2 peptikehaga
ravitud rühma ning kandur-kontrolli ja kontroll-peptikeha suhtes (p=0,003
vaheannuse puhul ja p<0,0001 kõrgema annuse puhul, kasutades
korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi Scheffe’i post hoc testiga). Nende
peptikehadega ravimisel ei olnud olulist toimet kehamassile. Katkendlik joon 10
tähistab rühma kogu n vähenemist 10-st 9 hiireni ühe hiire surma tõttu teadmata
põhjustel. Tulemused on esitatud joonisel Fig 6.
Näide 16
Anti-Ang-2 peptikehad Colo-205 ksenografti kasvajatega võrreldes
Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-15
205 rakke ja Matrigeli (2:1). 3. päeval manustati Ang-2 peptikeha 2xCon4-C või
kontroll-peptikeha subkutaanselt annuses 350µg/päevas. Kontroll-peptikehaga
ravitud rühmadest (nagu on kirjeldatud tabelis 5) saadud kasvajad koguti kas 14.
päeval (suurusega ühitatud kontroll) või 18. päeval (ajaga ühitatud kontroll).
Kasvajad 2xCon4(C) ravitud rühmadest koguti seejärel 18. päeval. Kasvaja 20
suurust märgiti üles regulaarsetel intervallidel, nagu on näidatud. Olulisi erinevusi
kasvaja arengus täheldati ajaga ühitatud kontrollrühma ja 2xCon4-C ravitud rühma
(p=0,0154 korduvmõõtmisega ANOVA analüüsil Scheffe’i post hoc testiga) vahel.
Nende peptikehadega ravimisel ei olnud olulist toimet kehamassile.
Kujutise analüüsiks valmistatud kasvajad lõigati pooleks ning üks pool kiirkülmutati 25
OCT-s (Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA). Külmutatud lõigud märgistati
immunohistokeemiliselt anti-hiire CD31-ga (kataloogi nr 553370, BD PharMingen,
San Diego, CA) 2µg/ml juures, kus DAB oli kromogeen. Kasvaja lõike fotografeeriti
digitaalselt 20-kordse objektiiviga suurendamisel. Tabati neli „kompass-punkti“
välja kasvaja kohta, kus ravirühma kohta oli kümme kasvajat. Kujundi analüüsi 30
EE - EP1615952 B1 138
süsteemiga MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Downington, PA) seati
lävi kujundites olevate CD31 märgistusega veresoonte jaoks. CD31 positiivse
märgistusega alasid ekspresseeriti kasvaja kogu koe suhtena igas väljas.
Tulemused on esitatud joonisel Fig 7.
Näide 17 5
Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-
205 rakke ja Matrigeli (2:1). Ravimine annuses 350µg/hiirele kaks korda nädalas
Ang-2 peptikeha 2xCon4-C või ekvivalentse kontroll-peptikehaga algas 3., 10. või
15. uuringu päeval. Kasvaja suurust ja kehamassi märgiti üles regulaarsetel
intervallidel. Olulisi erinevusi kasvaja arengus täheldati kõikide Ang-2 peptikehaga 10
ravitud rühmade vahel ning kandur-kontrolli suhtes (p=0,089 15. päeva rühma ning
p<0,0001 3. ja 10. päeva rühmade jaoks, kasutades korduvmõõtmisega ANOVA
analüüsi Scheffei post hoc testiga). Nende peptikehadega ravimisel ei olnud olulist
toimet kehamassile. Tulemused on esitatud joonisel Fig 8 (kehamasse ei ole
näidatud). 15
Näide 18
Kokkuvõte täieliku vastuse (CR) määradest saadi antikehaga Ab536 annusel
47µg/emasele karvutule hiirele, kellele seda manustati intraperitoneaalselt kolm
korda nädalas, või peptikehaga 2xCon4(C), mida anti subkutaanselt mitmekordse
annustamise režiimidega erinevates pikaajalistes uuringutes (≥10 nädalat 20
doseerimist) mõlemas A431 ja Colo-205 ksenografti mudelis. Siin kasutatud CR
tähistab tulemust, millesse mõõdetavat kasvajat pärast ravi ei jäänud. Tulemused
on esitatud joonisel Fig 9.
Näide 19
a) Pk kombinatsioon taksoteeriga Colo-205 kasvaja mudelis 25
Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-
205 rakke ja Matrigeli (2:1). 14. uuringupäeval algatati ravimist a) annuses
350µg/hiir kaks korda nädalas Ang-2 peptikeha 2xCon4-C, b) 20mg/kg qwx3
intraperitoneaalselt taksoteeriga või c) kombinatsiooniga mõlemast. Kasvaja
EE - EP1615952 B1 139
suurust ja kehamassi märgiti üles regulaarsetel intervallidel. Olulisi erinevusi
kasvaja arengus täheldati kõikides ravirühmades kandur-kontrolliga võrreldes
(p<0,0001, kasutades korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi Scheffe’i post hoc
testiga). Lisaks oli kombineeritud ravi tunduvalt erinevam kui kumbki monoteraapia
aine (p<0,0001 2xCon-4-C ja p=0,0122 taksoteeriga võrreldes). Katkendlik joon 5
tähistab rühma kogu n vähenemist 10-st 9 hiirele ühe hiire surma tõttu teadmata
põhjustel. Nende peptikehadega ravimisel ei olnud olulist toimet kehamassile.
Tulemused on esitatud joonisel Fig 10a.
b) Pk kombinatsioon 5-FU-ga Colo-205 kasvaja mudelis
Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-10
205 rakke ja Matrigeli (2:1). 14. uuringupäeval algatati ravimist a) annuses
350µg/hiirele kaks korda nädalas Ang-2 peptikehaga 2xCon4-C, b) 50mg/kg qdx5
intraperitoneaalselt 5-FU-ga või c) a kombinatsiooniga mõlemast. Kasvaja suurust
ja kehamassi märgiti üles regulaarsetel intervallidel, nagu on näidatud.
Olulisi erinevusi kasvaja arengus täheldati kõikides ravirühmades kandur-15
kontrolliga võrreldes (p<0,0001, kasutades korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi
Scheffe’i post hoc testiga). Lisaks oli kombineeritud ravi tunduvalt erinevam kui
kumbki monoteraapia aine (p=0,0375 2xCon-4-C-ga võrreldes ja p=0,0453 5-FU-
ga võrreldes). Mööduvat alanemist kehamassis täheldati 5-FU ravirühmas (18%
20. uuringu päeval) ning kombineeritud ravi rühmas (16% 20. uuringu päeval), 20
millele järgnes kehamassi täielik taastumine. Tulemused on esitatud joonisel Fig
10b.
Näide 20
Adjuvandi artriidi mudel
Isased Lewise rotid (120-130g, Charles River, Wilmington MA) paigutati 25
kahekaupa filtriga kaetud puuri kontrollitud keskkonnaga ruumis (temperatuur
23±2 ˚C, suhteline niiskus 50±20%) 12-tunnise valge/pime tsükliga. Loomadele
söödeti kommertsiaalset näriliste toitu (formulatsioon 8640; Tek Lab, Madison, WI)
ning nad said filtriga puhastatud kraanivett ad libitum. Normipõhine kaltsiumi ja
fosfori sisaldus oli vastavalt 1,2% ja 1,0%. 30
EE - EP1615952 B1 140
Adjuvandi artriit kutsuti esile 0,05mL-s petrooleumis (Crescent Chemical Co.,
Hauppauge, NY) suspendeeritud kuumusega surmatud Mycobacterium
tuberculosise H37Ra üksiku 0,5mg-lise süstiga (Difco Laboratories, Detroit, MI)
intradermaaselt saba alaotsa. Artriidi kliiniline algus oli 9. päeval, nagu näitasid
tagakäpa tursumine ja ambulatoorsed raskused. Välja arvatud 2xCon4(c) 5
ravirühmas (mida raviti 1. päevast pärast immuniseerimist), tehti ravi igapäevaste
subkutaansete süstidena alates 9. päevast pärast immunisatsiooni (enne artriidi
algust) ning jätkati 18. päevani.
Adjuvandi artriidi kliiniline jälgimine
Põletiku progressiooni hinnati kliiniliselt tagakäpa suuruse perioodilise 10
mõõtmisega, kasutades vee pletüsmograafi vastavalt meetoditele, mida on
kirjeldanud Feige et al, Cellular Molec. Life Sci., 57:1457-1470 (2000). Käpa
põletiku inhibeerimine arvutati kõvera all oleva ala põhjal (AUC), kasutades
trapetsiaalset reeglit vastavalt valemile:
[1-{(ravitud AdA)-normaalne)/(ravimata AdA-normaalne)}x100 15
Lisaks tuvastati kogu kehamass igapäevaselt 9-päevase ravirežiimi jooksul
täiendava lõpp-punktina, kuna kehamass on olnud paralleelne liigese põletiku
progressiooniga antud artriidi mudelis. Loomad surmati CO2 keskkonnas 18.
päeval.
Luutihedust (BMD) vaadeldi lahangul (18. päev pärast immuniseerimist). 20
Tagakäpad eemaldati karvajoonelt (täpselt pahkluu juures (hüppeliiges)), kasteti
70%-lisse etanooli ning seejärel skaneeriti horisontaalsuunas, kasutades
röntgenkiirte (fan-beam x-ray) densitomeetrit (Model QDR-4500A; Hologic,
Waltham, MA). Vaata Feige et al, supra. Pärast skaneerimist paigutati kontsluu
keskele nelinurkne karp (29x25mm), et analüüsitavat kohta piiritleda, ning 25
patenditud algoritmidega (Hologic software) arvutati luu piirkond, luu mineraali
sisaldus ja luutihedus.
Kõik tulemused väljendati keskmise ± standardhälbega. p väärtusega 0,05
kasutati oluliste erinevuste piiritlemiseks rühmade vahel. Kliinilistel andmetel
EE - EP1615952 B1 141
(pidevad muutujad) tehti Kruskal-Wallis ANOVA ja Mann-Whitney U. test
kommertsiaalse statistika tarkvaraga (Statsoft v 3.0; Statsoft, Tulsa, OK).
Tulemused on esitatud vastavalt joonistel Fig 11a, 11b ja 11c.
Näide 21
Sarvkesta angiogeneesi mudel 5
CON4(C) toime VEGF tekitatud angiogeneesile rottidel
Ang-2 peptikeha CON4(C) hinnati sarvkesta angiogeneesi mudelil rottidel.
Angiogenees kutsuti esile VEGF-ga (või BSA kontrolli) immutatud nailondiski
siirdamisel sarvkesta põhikoesse (n=8/rühmas). Peptikeha TN8CON4-C manustati
subkutaanse süstiga annuses 1,0 või 0,1mg/rott/päevas mitme päeva jooksul. 10
Loomade teist kahte rühma töödeldi samas annuses negatiivse kontroll-
peptikehaga 4883. Kõiki rühmi eeltöödeldi üksiku esialgse suurema annusega
(loading dose) kas 3,0 või 0,3mg, mis oli kolmekordne pidev annus (maintenance
dose) 1,0 või 0,1mg (vaata joonist). Seitse päeva pärast ravi määratleti kaks
vaskulaarset lõpp-punkti roti igast sarvkesta digitaalkujutisest: diski ja ääre ning 15
veresoone pinna vahelises keskpunktis lõikuvate veresoonte arv. TN8CON4-C-ga
ravimine inhibeeris tunduvalt VEGF indutseeritud angiogeneesi annusest sõltuval
moel (p<0,04), samas kui kontroll-peptikehaga ravimisel ei olnud olulist toimet
kummalegi lõpp-punktile. Puudusid tõendid ilmsest mürgisusest ravitud loomade
kehamassi põhjal. Tulemused on esitatud joonisel Fig 12. 20
Näide 22
Epitoopide kaardistamine
Täispikad (aminohapped 1-495), N-terminaalsed (aminohapped 1-254) ja C-
terminaalsed (aminohapped 255-495) inimese Ang-2 (hAng-2) proteiinid klooniti
CMV-tekitatud imetaja ekspressiooni vektorisse C-terminaalsete 6xHis 25
märgistega. Kolm saadud struktuuri ja vektori-kontroll ekspresseeriti kiirelt 293T
rakkudesse. Seejärel koguti transfekteeritud rakkudest konditsioneeritud sööde
ning Ang-2ekspressiooni tase söötmes määrati anti-6xhis ELISA ja western blot-
analüüsiga.
EE - EP1615952 B1 142
Anti-Ang-2 antikehade ja peptikehade siduv epitoop tuvastati ELISA analüüsiga
nende võime põhjal seonduda kolmele inimese hAng-2 versioonile vastavalt
järgnevatele eeskirjadele: kõrge seondumisega 96-süvendiline analüüsi plaat kaeti
100µl konditsioneeritud söötmega süvendis ning seda inkubeeriti 1 tund
temperatuuril 37 ˚C. Konditsioneeritud sööde imeti välja ning plaati blokeeriti 1 5
tund 200µl süvendis 5%-lise BSA-ga PBS-s toatemperatuuril. Seejärel imeti
blokeerimise lahus välja. Igasse süvendisse lisati 100µl antikeha, peptikeha või
Tie2-Fc 1µg/ml juures 1%-lises BSA-s PBS-s ning neid inkubeeriti 1 tund
toatemperatuuril. Süvendeid pesti 4 korda 200µl 0,1% Tween-ga PBS-is. Igasse
süvendisse lisati 100µl HRP-konjugeeritud kitse anti-inimese IgG või kitse anti-10
hiire IgG ning seda inkubeeriti 45 minutit toatemperatuuril. Seejärel pesti
süvendeid 4 korda 200µl 0,1%-lise Tween-ga PBS-is. Seejärel lisati igasse
süvendisse 100µl TMB substraati. O.D. määrati 370nm juures.
Tulemused on esitatud joonistel Fig 13a, Fig 13b ja Fig 13c.
Näide 23 15
BiaCore analüüsile omaste teatud tundlikkuspiirangute tõttu hinnati sidumise
afiinsust ka Sepidyne KinExA analüüsiga.
2xCON4-C (Pb5714) seondumist huAng-2-le testiti KinExA analüüsiga (Sapidyne,
Boise, ID). Reacti-Gel 6x graanulid (Pierce, Rockford, IL) kaeti eelnevalt huAng-2-
ga ja blokeeriti BSA-ga. 10pM ja 30pM 2xCON4-C proove inkubeeriti 8 tundi 20
erinevatel kontsentratsioonidel (0,3pM-3nM) huAng-2-ga toatemperatuuril enne
huAng-2-kattega graanulite läbitöötamist. Graanulitega kaetud peptikeha kogus
määrati fluorestsentsmärkega (Cy5) kitse anti-inimse-Fc antikehaga (Jackson
ImmunoResearch, West Grove, PA). Sidumise signaal oli proportsionaalne
tasakaalus vaba peptikeha kontsentratsiooniga. 25
Dissotsiatsiooni tasakaalu konstant (KD) saadi konkureerivate kõverate
mittelineaarsest regressioonist, kasutades topelt kõvera ühe kohaga homogeenset
sidumismudelit (KinEx™ tarkvara). Seejärel tuvastati, et KD oli huAng-2-ga
seonduva 2xCON4-C jaoks ligikaudu 2pM.
EE - EP1615952 B1 143
Nagu on joonisel Fig 14 näidatud, analüüsi KinExA kasutades oli peptikehal
2xCon4 afiinsus -2pM hAng-2-le.
Näide 24
Pegüülitud peptiidid
L1-7 peptiidi sünteesiti 431 ABI sünteesijaga, kasutades sidumise 5
standardeeskirja ning topelt sidumist jäägist 14 (met) kuni N-terminaalse jäägini 1
(Cys) N-otsast C-otsani nummerdades.
L1-7 peptiidi konjugeerimine metoksü-polü(etüleenglükool)-maleimiidiga; MW: 5
KDa: nimega „mPEG5K-(L1-7 peptiid)“
0,8mg L1-7 peptiidi lahust 400mL-s puhvris 1 (20mM fosfaat, 5mM EDTA, pH 6,5) 10
töödeldi 13,5mg metoksü-polü(etüleenglükool)-maleimiidiga (MW=5KDa;
Shearwater Corp.), 0,27ml 50,0mg/mL lahusega puhvris 1. Reaktsioonimikstuuri
inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 4 ˚C, lahjendati seejärel 1,6ml puhvriga A
(20mM Tris vesinikkloriid, pH 7,2) ning dialüüsiti Slide-A-Lyzer kassetis (3500
MWCO, Pierce) sama puhvri suhtes. Dialüüsitud reaktsioonimikstuuri puhastati 15
ioonvahetus kromatograafiaga 1,0ml HiTrap Q Sepharose HP kolonnil (Amersham
Biosciences Corp.). Saaduse piiki elueeriti kahes 1,0ml-lises fraktsioonis
gradiendiga 100%-lisest puhvrist A 100%-lisele puhvrile B (puhver A + 0,5M NaCl)
40 kolonni kogusel. Kombineeritud saaduse fraktsioonid kontsentreeriti
tsentrifugaalseadmega Microsep 1K Centrifugal Device (Pall Life Sciences) 20
koguseni 250µl, mis sisaldas 0,23mg proteiini/mL.
L1-7 peptiidi konjugeerimine 1,11-bis-maleimidotetraetüleenglükooliga; nimega
„PEO4(L1-7 peptiid)2“
1,0mg L1-7 peptiidi lahust 500µl puhvris 1 (20mM fosfaat, 5mM EDTA, pH 6,5)
töödeldi 0,0375mg 1,11-bis-maleimidotetraetüleenglükooliga (Pierce) (0,375ml 25
0,1mg/mL lahust puhvris 1). Reaktsioonimikstuuri inkubeeriti 3,33 tundi
temperatuuril 4 ˚C, seejärel dialüüsiti Slide-A-Lyzer kassetis (3500 MWCO, Pierce)
puhvri A suhtes (20mM Tris vesinikkloriid, pH 7,2). Dialüüsitud
reaktsioonimikstuuri puhastati ioonvahetus kromatograafiaga 1,0ml HiTrap Q
EE - EP1615952 B1 144
Sepharose HP kolonnil (Amersham Biosciences Corp.). Dimeerse produkti piiki
elueeriti kolmes 1,0ml-lises fraktsioonis gradiendiga 100%-lisest puhvrist A 100%-
lisele puhvrile B (puhver A + 0,5M NaCl) 40 kolonni kogusel. Saaduse
kombineeritud fraktsioonid kontsentreeriti tsentrifugaalseadmega Microsep 1K
Centrifugal Device (Pall Life Sciences) koguseni 550µl, mis sisaldas 0,12mg 5
proteiini/mL.
L1-7 peptiidi konjugeerimine polü(etüleenglükool)-bis-maleimiidiga: MW3,4 KDa:
nimega „PEG3,4K(L1-7 peptiid)2“
3,0mg L1-7 peptiidi lahust 1,5ml puhvris 1 (20mM fosfaat, 5mM EDTA, pH 6,5)
töödeldi 1,125mg polü(etüleenglükool)-bis-maleimiidiga (MW=3,4 KDa, 10
Shearwater Corp.); 0,563ml 2,0mg/mL lahust puhvris 1. Reaktsioonimikstuuri
inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 4 ˚C, seejärel dialüüsiti Slide-A-Lyzer kassetis
(3500 MWCO, Pierce) puhvri A suhtes (20mM Tris vesinikkloriid, pH 7,2).
Dialüüsitud reaktsioonimikstuuri puhastati ioonvahetus kromatograafiaga 5,0ml
HiTrap Q Sepharose HP kolonnil (Amersham Biosciences Corp.). Produkti piiki 15
elueeriti kolmes 3,0ml-lises fraktsioonis gradiendiga 100%-lisest puhvrist A 100%-
lisele puhvrile B (puhver A + 0,5M NaCl) 40 kolonni kogusel. Kombineeritud
fraktsioonid kontsentreeriti tsentrifugaalseadmega Microsep 1K Centrifugal Device
(Pall Life Sciences) koguseni 850µl, mis sisaldas 0,24mg proteiini/mL.
MALDI-TOF massisepktromeetria tulemused olid järgnevad: 20
Proovi nr Identiteet Eksp. MS Vaatluse MS
1 L1-7 (PEGüülimata
peptiid)
3,545 3,538,7
2 mPEG5K-(L1-7 peptiid) 8,500 8,851
3 PE04(L1-7 peptiid)2 7,443 7,446,29
4 PEG3,4K(L1-7 peptiid)2 10,550 10,552
6,882,61
3,550,13
On mõistetav, et alaindeks „2“ PEG3,4K(L1-7 peptiid) ja PE04(L1-7 peptiid) jaoks
tähendab, et polümeeri ahela kohta on kaks peptiidi, kus üks asub iga polümeeri
kummaski otsas.
EE - EP1615952 B1 145
IC50 määramine
IC50 hAng2:hTie2-Fc koostoime inhibeerimise jaoks L1-7 vabale ja PEGüülitud
peptiididele tuvastati neutralisatsiooni ELISA analüüsiga, nagu kirjeldati näites 2.
Neutralisatsiooni ELISA analüüsi jaoks valmistati mikrotiitri plaadid, millele inimese
Ang-2 polüpeptiid seoti, nagu kirjeldati näites 2 afiinsuse ELISA analüüsiks. 5
Kandidaadi anti-Ang-2 L1-7 PEGüülitud ja vabasid peptiidid tiitriti 1000nM-st
0,2pM-le 4-kordsetes lahjendustes PBS-s, mis sisaldas umbes 1% BSA ja umbes
1nM Tie-2 (olemas Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa sisaldab ainult molekuli
lahustuvat rakuvälist osa; R&D Systems, kataloogi number 313-TI). Pärast umbes
100 mikroliitri antikeha/Tie-2 lisamist igale süvendile inkubeeriti plaate öö jooksul 10
toatemperatuuril ning pesti viis korda PBS-s, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti
Tween-20. Pärast pesemist lisati igasse süvendisse 100 mikroliitrit anti-Tie-2
antikeha (Pharmingen Inc., kataloogi nr 557039) lõppkontsentratsioonile umbes 1
mikrogrammi ml kohta ja plaate inkubeeriti umbes 1 tund toatemperatuuril.
Järgmisena lisati igasse süvendisse umbes 100 mikroliitrit kitse anti-hiire-IgGHRP 15
(Pierce Chemical CO., kataloogi nr 31432) lahjendusel 1:10,000 PBS-s, mis
sisaldas umbes 1 protsenti BSA-d. Plaate inkubeeriti umbes 1 tund
toatemperatuuril, mille järel neid pesti viis korda PBS-ga, mis sisaldas umbes 0,1
protsenti Tween-20. Seejärel lisati igasse süvendisse umbes 100 mikroliitrit TMB
substraati (kirjeldati eespool) ning seejärel lasti värvil tekkida. Absorptsioon loeti 20
hiljem spektrofotomeetriga 370nM juures.
L1-7 peptiidid (C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-LE)
(JÄRJESTUSE ID-NR: 359) hõlmasid: N-terminaalset tsüsteiini PEG-le
seondumiseks ning 5Gly linkerit. AQ ja LE flankeeriv järjestus olid olemas nii
esialgses faagi kloonis kui ka peptikehas. hAng-2:Tie2 inhibeerimise IC50 25
tulemused olid järgnevad:
Peptiid IC50 (nM)
L1-7 peptiid 0,49
mPEG5K-(L1-7 peptiid) 11,7
PE04(L1-7 peptiid)2 0,064
PEG3,4K(L1-7 peptiid)2 0,058
EE - EP1615952 B1 146
Näide 25
Ang-2 peptikeha 2xCon4(C) toime roti adjuvandi artriidile oli uurimise all,
manustamine algas kas immunisatsiooni päeval (päev 0) või kohe enne artriidi
kliiniliste sümptomite algust (8. päev). Ang-2 peptikeha 2xCon4(C) uuriti samuti
koos PEGüülitud TNF inhibiitoriga pegsunertsept (PEG sTNF-R1). 5
Isased Lewise rotid (200-250g) saadi firmalt Charles River (Wilmington, MA). Artriit
kutsuti esile 0 päeval saba alaossa tehtud üksiku intradermaalse 0,5mg süstiga
kuumusega surmatud Mycobacterium tuberculosise H37Ra ehk „MTb“-ga (Difco
Laboratories, Detroit, MI), mida oli suspendeeritud 0,05ml-s petrooleumis
(Crescent Chemical Co., Hauppauge, NY). PEG sTNF-R1 (30mg/ml, anti annuses 10
1mg/kg), peptikeha 2xCon4(C) (30,8mg/ml, anti annuses 1mg/rott) või kanduri
(PBS) ravi manustati subkutaanselt, nagu on allpool tabelis välja toodud.
Rühma nr MTb Rühm PEG s TNF-R1 või PBS
2xCon4(C) või PBS
N
1 - Normaalne kontroll - - 6
2 + Artriidi kontroll - - 6
3 + PBS kontroll PBS päevadel 0-17
PBS päevadel 0-17
6
4 + PEG sTNF-R1 PEGsTNF-R1 päevadel 0-17
PBS päevadel 0-17
6
5 + 2xCon4(C) PBS päevadel 0-17
2xCon4(C) päevadel 0-17
6
6 + PEG sTNF-R1 + 2xCon4(C)
PEGsTNF-R1 päevadel 0-17
6
7 + PBS kontroll PBS päevadel 8-17
PBS päevadel 8-17
6
8 + PEG sTNF-R1 PEGsTNF-R1 päevadel 8-17
PBS päevadel 8-17
6
9 + 2xCon4(C) PBS päevadel 8-17
2xCon4(C) päevadel 8-17
6
10 + PEG sTNF-R1 + 2xCon4(C)
PEG sTNF-R1 päevadel 8-17
2xCon4(C) päevadel 8-17
6
11 + PEG sTNF-R1 + 2xCon4(C)
PEG sTNF-R1 päevadel 8-17
2xCon4(C) päevadel 0-17
6
Väiksem kui maksimaalselt tõhus annus 1mg/kg PEG sTNF-R1 valiti selleks, et
võimaldada peptikehaga 2xCon4(C) ravimise potentsiaalsete lisatoimete
hindamist. Tagakäpa suurust hinnati kliiniliselt iga päevase tagakäpa suuruse 15
mõõtmisega, kasutades vee pletüsmograafiat (Feige et al, Cell Mol Life Sci,
EE - EP1615952 B1 147
57:1457-1470 (2000)). Käpa põletiku inhibeerimine arvutati kõvera aluse piirkonna
(AUC) põhjal vastavalt valemile:
[(AUC artriidi AdA-AUC ravitud Ada)/ AUC artriidi AdA]x100
Kogu kehamass määratleti alates 9. päevast kuni 18. päevani täiendava lõpp-
punktina, kuna kehamassi langemine oli paralleelne liigese põletiku 5
progressiooniga antud artriidi mudelis.
Joonisel Fig 16 on tulemused esitatud keskmise ± standardhälbena. p väärtust
0,05 kasutati rühmade vahel märkimisväärsete erinevuste piiritlemiseks. Kruskal-
Wallise ANOVA analüüs ja Mann-Whitney U test ilma kohandustega
mitmekordseks testimiseks tehti kliiniliste andmete põhjal (pidevad muutujad). 10
Kehamass: rühmad, kellele anti kas peptikeha 2xCon4(C) või PEG sTNF-R1
üksinda mis tahes perioodi jooksul, kas kaotasid kaalu või ei võtnud katse käigus
kaalus juurde. Loomadele, kellele anti kombineeritud ravi peptikehaga 2xCon4(C)
ja PEG sTNF-R1 päevadel 8-17, säilitasid kaalu, aga ei võtnud juurde. Ent
artriidiga loomad, kes said peptikeha 2xCon4 (C) päevadel 0-17 koos PEG sTNF-15
R1-ga kummagi perioodi jooksul (päevadel 0-17 või päevadel 8-17), võtsid katse
jooksul kaalus juurde.
Tulemused on esitatud joonisel Fig 15, 16 ja 17.
EE - EP1615952 B1 148
Patendinõudlus
1. Peptikeha, mis suudab siduda Ang-2, kusjuures peptikeha hõlmab
JÄRJESTUSE ID-NR:25-s esitatud järjestust, koos põletikuvastase ainega
kasutamiseks põletikulise haiguse ravimeetodis.
2. Peptikeha kasutamiseks vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et 5
põletikuvastane aine hõlmab vähemalt ühte DMARD-i (haigust modifitseerivad
antireumaatilised ravimid), SAARD-i (aeglase toimega antireumaatilised ravimid)
ja NSAID-i (mittesteroidsed põletikuvastased ravimid).
3. Peptikeha kasutamiseks vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et
põletikuvastane aine hõlmab vähemalt ühte TNF inhibiitorit, IL-1 inhibiitorit, TACE 10
inhibiitorit, COX-2 inhibiitorit ja P-38 inhibiitorit.
4. Peptikeha kasutamiseks vastavalt punktile 2, mis erineb selle poolest, et TNF
inhibiitor hõlmab vähemalt ühte etanertsepti, adalimumaabi, pegsunertsepti
(PEGsTNF-R1), onertsepti ja infliksimaabi.
5. Peptikeha kasutamiseks vastavalt punktile 2, mis erineb selle poolest, et 15
nimetatud IL-1 inhibiitor on vähemalt üks anakinra, IL-1, TRAP, IL-1 antikeha ja
lahustuva IL-1 retseptori seast.
EP 1 615 952 B1
210
EP 1 615 952 B1
211
EP 1 615 952 B1
212
EP 1 615 952 B1
213
EP 1 615 952 B1
214
EP 1 615 952 B1
215
EP 1 615 952 B1
216
EP 1 615 952 B1
217
EP 1 615 952 B1
218
EP 1 615 952 B1
219
EP 1 615 952 B1
220
EP 1 615 952 B1
221
EP 1 615 952 B1
222
EP 1 615 952 B1
223
EP 1 615 952 B1
224
EP 1 615 952 B1
225
EP 1 615 952 B1
226
EP 1 615 952 B1
227
EP 1 615 952 B1
228
EP 1 615 952 B1
229
EP 1 615 952 B1
230
EP 1 615 952 B1
231
EP 1 615 952 B1
78
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0382] The results are set forth in Figures 15, 16, and 17.
SEQUENCE LISTING
[0383]
<110> AMGEN INC.
<120> SPECIFIC BINDING AGENTS OF HUMAN ANGIOPOIETIN-2
<130> A-801C
<140> NOT YET ASSIGNED<141> 2004-04-08
<150> US 10/410,998<151> 2003-04-09
<160> 359
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Ang-2 Binding Peptides
<400> 1
<210> 2<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Ang-2 Binding Peptides
<400> 2
<210> 3<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Ang-2 binding Polypeptide
EP 1 615 952 B1
79
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 3
<210> 4<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Ang-2 binding Polypeptide
<400> 4
<210> 5<211> 18<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Ang-2 binding Polypeptide
<400> 5
Asn His
<210> 6<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Ang-2 binding Polypeptide
<400> 6
<210> 7<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> Ang-2 Binding Peptides
<400> 7
<210> 8<211> 67<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> Oligonucleotide
<400> 8
<210> 9<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 9ggtcattact ggaccggatc 20
<210> 10<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 10cgtacaggtt tacgcaagaa aatgg 25
<210> 11<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 11
EP 1 615 952 B1
81
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 12<211> 32<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (32)..(32)<223> Xaa = Fc
<400> 12
<210> 13<211> 29<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (29)..(29)<223> Xaa = Fc
<400> 13
<210> 14<211> 51<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
82
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (51)..(51)<223> Xaa = Fc
<400> 14
<210> 15<211> 60<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (60)..(60)<223> xaa = Fc
<400> 15
<210> 16<211> 56<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
83
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (56)..(56)<223> xaa = Fc
<400> 16
<210> 17<211> 26<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> xaa = Fc
<400> 17
<210> 18<211> 45<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (45)..(45)<223> xaa = Fc
<400> 18
EP 1 615 952 B1
84
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 19<211> 62<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (62)..(62)<223> Xaa = Fc
<400> 19
<210> 20<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_features<222> (2)..(2)<223> xaa = Fc
<400> 20
EP 1 615 952 B1
85
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 21<211> 53<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 21
<210> 22<211> 59<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 22
EP 1 615 952 B1
86
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 23<211> 25<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 23
<210> 24<211> 47<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 24
EP 1 615 952 B1
87
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 25<211> 61<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 25
<210> 26<211> 75<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (75)..(75)<223> Xaa = Fc
<400> 26
EP 1 615 952 B1
88
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 27<211> 72<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 27
<210> 28<211> 30<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220>
EP 1 615 952 B1
89
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<221> misc_feature<222> (30)..(30)<223> Xaa = Fc
<400> 28
<210> 29<211> 26<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> Xaa = Fc
<400> 29
<210> 30<211> 26<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> Xaa = Fc
<400> 30
<210> 31
EP 1 615 952 B1
90
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 26<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> Xaa = Fc
<400> 31
<210> 32<211> 26<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> Xaa = Fc
<400> 32
<210> 33<211> 784<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 33
EP 1 615 952 B1
91
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 34<211> 768<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 34
EP 1 615 952 B1
92
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 35<211> 834<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 35
<210> 36
EP 1 615 952 B1
93
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 861<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 36
<210> 37<211> 849<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 37
EP 1 615 952 B1
94
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 38<211> 759<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 38
EP 1 615 952 B1
95
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 39<211> 816<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 39
EP 1 615 952 B1
96
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 40<211> 867<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 40
<210> 41<211> 774<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 41
EP 1 615 952 B1
97
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 42<211> 840<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 42
EP 1 615 952 B1
98
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 43<211> 858<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 43
EP 1 615 952 B1
99
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 44<211> 756<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 44
EP 1 615 952 B1
100
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 45<211> 822<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 45
EP 1 615 952 B1
101
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 46<211> 864<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 46
<210> 47<211> 906<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 47
EP 1 615 952 B1
102
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 48<211> 897<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 48
EP 1 615 952 B1
103
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 49<211> 771<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 49
<210> 50<211> 759<212> DNA<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
104
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 50
<210> 51<211> 759<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 51
EP 1 615 952 B1
105
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 52<211> 759<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 52
<210> 53<211> 759
EP 1 615 952 B1
106
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2
<400> 53
<210> 54<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 54cggcgcaact atcggtatca agctg 25
<210> 55<211> 26<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 55catgtaccgt aacactgagt ttcgtc 26
<210> 56 <211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence
EP 1 615 952 B1
107
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> consensus motifs generated from TN8-IX library
<220><221> misc_feature<222> (7, 12 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.
<400> 56
<210> 57<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> consensus motifs generated from TN8-Ix library
<220><221> misc_feature<222> (7, 12 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.
<400> 57
<210> 58<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Consensus motifs generated from TN8-IX library
<220><221> misc_feature<222> (1, 2, 3, 5 and)..(13)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.
<400> 58
<210> 59<211> 18<212> PRT<213> Artificial sequence
<220>
EP 1 615 952 B1
108
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> consensus motif generated from TN12-I library
<220><221> misc_feature<222> (3, 8, 10-14 and)..(18)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.
<400> 59
<210> 60<211> 227<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Human Fc IgG1
<400> 60
EP 1 615 952 B1
109
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 61<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Consensus motifs generated from TN8-IX library
<220><221> misc_feature<222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.
<400> 61
<210> 62<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence
EP 1 615 952 B1
110
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> Consensus motifs generated from TN8-IX library
<220><221> misc_feature<222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.
<400> 62
<210> 63<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> consensus motifs generated from TN8-IX library
<220><221> misc_feature<222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.
<400> 63
<210> 64<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Consensus motifs generated from TN8-IX library
<220><221> misc_feature<222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.
<400> 64
<210> 65<211> 5<212> PRT<213> Artificial sequence
<220>
EP 1 615 952 B1
111
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 65
<210> 66<211> 6<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 66
<210> 67<211> 7<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa is an acidic or neutral polar amino acid residue
<400> 67
<210> 68<211> 8<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa is an acidic or neutral polar amino acid residue
<400> 68
EP 1 615 952 B1
112
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 69<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (1, 2 and)..(3)<223> Xaa are each independent amino acid residues.
<220><221> misc_feature<222> (5)..(5)<223> Xaa is an amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (12)..(12)<223> Xaa is absent or an amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (13)..(13)<223> Xaa is absent or a neutral hydrophobic, neutral polar, or a basic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (14)..(14)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.
<400> 69
<210> 70<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (1 and)..(15)<223> Xaa is absent or an amino acid residue.
<220>
EP 1 615 952 B1
113
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<221> misc_feature<222> (2 and)..(16)<223> Xaa is absent or a neutral hydrophobic, neutral polar, or a basic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (3-6, 18, 19 and)..(20)<223> Xaa are each independently absent or amino acid residues.
<220><221> misc_feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is an amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (17)..(17)<223> Xaa is absent or a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.
<400> 70
<210> 71<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (4)..(4)<223> Xaa is a A, D, or E.
<220><221> misc_feature<222> (6)..(6)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (7)..(7)<223> Xaa is an amino acid residue.
<220>
EP 1 615 952 B1
114
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<221> misc_feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is a neutral hydrophobic, neutral polar, or basic amino acid residue.
<400> 71
<210> 72<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (1, 4 and )..(20)<223> Xaa is absent, or an amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (2, 15, 16 and)..(21)<223> Xaa is absent, or a neutral polar, acidic, or a basic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (3, 17 and)..(18)<223> xaa is absent, or a neutral hydrophobic, or neutral polar amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (6)..(6)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.
<220><221> mist-feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is a A, D, or E.
<220><221> misc_feature<222> (10)..(10)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (11)..(11)<223> Xaa is an amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (12)..(12)<223> Xaa is a neutral hydrophobic, neutral polar, or basic amino acid residue.
EP 1 615 952 B1
115
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (19 and)..(22)<223> Xaa is absent, or a neutral hydrophobic, neutral polar, or basic amino acid residue.
<400> 72
<210> 73<211> 8<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (3)..(3)<223> Xaa is a neutral polar amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (4)..(4)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (5)..(5)<223> Xaa is a neutral polar or an acidic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (6 and)..(7)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.
<400> 73
<210> 74<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature
EP 1 615 952 B1
116
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<222> (1, 2, 4, 13, 14, 19 and)..(20)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (3, 9 and)..(17)<223> Xaa is a neutral polar or acidic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (7, 15 and)..(16)<223> Xaa is a neutral polar amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (10 and)..(11)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (18)..(18)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or basic amino acid residue.
<400> 74
<210> 75<211> 13<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa is an acidic amino acid residue;
<220><221> misc_feature<222> (4)..(4)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (5)..(5)
EP 1 615 952 B1
117
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> Xaa is E, D, or Q.
<220><221> misc_feature<222> (10)..(10)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (13)..(13)<223> Xaa is an acidic residue.
<400> 75
<210> 76<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 76
<210> 77<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 77
<210> 78<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220>
EP 1 615 952 B1
118
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 78
<210> 79<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 79
<210> 80<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 80
<210> 81<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 81
EP 1 615 952 B1
119
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 82<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 82
<210> 83<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 83
<210> 84<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 84
<210> 85<211> 20<212> PRT
EP 1 615 952 B1
120
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 85
<210> 86<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 86
<210> 87<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 87
<210> 88<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 88
EP 1 615 952 B1
121
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 89<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 89
<210> 90<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 90
<210> 91<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 91
EP 1 615 952 B1
122
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 92<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 92
<210> 93<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 93
<210> 94<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 94
<210> 95<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
123
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 95
<210> 96<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 96
<210> 97<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 97
<210> 98<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 98
EP 1 615 952 B1
124
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 99<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 99
<210> 100<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 100
<210> 101<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 101
EP 1 615 952 B1
125
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 102<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 102
<210> 103<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 103
<210> 104<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 104
<210> 105<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
126
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 105
<210> 106<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 106
<210> 107<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 107
<210> 108<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 108
EP 1 615 952 B1
127
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 109<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 109
<210> 110<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 110
<210> 111<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 111
EP 1 615 952 B1
128
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 112<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 112
<210> 113<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 113
<210> 114<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 114
<210> 115<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
129
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 115
<210> 116<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 116
<210> 117<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 117
<210> 118<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 118
EP 1 615 952 B1
130
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 119<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 119
<210> 120<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 120
<210> 121<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 121
EP 1 615 952 B1
131
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 122<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 122
<210> 123<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 123
<210> 124<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 124
<210> 125<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
132
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 125
<210> 126<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 126
<210> 127<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 127
<210> 128<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 128
EP 1 615 952 B1
133
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 129<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 129
<210> 130<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 130
<210> 131<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 131
EP 1 615 952 B1
134
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 132<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 132
<210> 133<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 133
<210> 134<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 134
EP 1 615 952 B1
135
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 135<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 135
<210> 136<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 136
<210> 137<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 137
<210> 138<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
136
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 138
<210> 139<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 139
<210> 140<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 140
<210> 141<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 141
EP 1 615 952 B1
137
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 142<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 142
<210> 143<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 143
<210> 144<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 144
EP 1 615 952 B1
138
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 145<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 145
<210> 146<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 146
<210> 147<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 147
<210> 148<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
139
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 148
<210> 149<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 149
<210> 150<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 150
<210> 151<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 151
EP 1 615 952 B1
140
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 152<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 152
<210> 153<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 153
<210> 154<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 154
EP 1 615 952 B1
141
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 155<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 155
<210> 156<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 156
<210> 157<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 157
<210> 158<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
142
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (1) .. (1)<223> Xaa is absent or a neutral hydrophobic, neutral polar, or a basic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (2, 4, 14)..(19)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (3, 6)..(17)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (9)..(9)<223> Xaa is E, D, or Q.
<220><221> misc_feature<222> (18)..(18)<223> Xaa is a neutral hydrophobic, neutral polar, or a basic amino acid residue.
<220><221> misc_feature<222> (20)..(20)<223> Xaa is absent or an amino acid residue.
<400> 158
<210> 159<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 159ccgatccgtc aggaagaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gtgggaagtt 60
<210> 160<211> 60<212> DNA
EP 1 615 952 B1
143
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 160accaacatcc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgggtaaa 60
<210> 161<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 161tggtacgaac aggacgcttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggctgaagtt 60
<210> 162<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 162aaccgtctgc aggaagtttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaaaacgtt 60
<210> 163<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 163gctgctaccc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60
<210> 164<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 164ctgcgtcacc aggaaggttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttcgactgg 60
<210> 165<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220>
EP 1 615 952 B1
144
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 165gttccgcgtc agaaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gtacgttggt 60
<210> 166<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 166tgggctgctc aggaagaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggtcgtatg 60
<210> 167<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 167acttggccgc aggacaaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctact 60
<210> 168<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 168ggtcactccc aggaagaatg cggttgggac ccgtggacct gcgaacacat gggtacgtcc 60
<210> 169<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 169cagcactggc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgtccaaa 60
<210> 170<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 170
EP 1 615 952 B1
145
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
aacgttcgtc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccggttcgt 60
<210> 171<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 171aaatccggtc aggttgaatg caactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgtaac 60
<210> 172<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 172gttaaaaccc aggaacactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gcgtgaatgg 60
<210> 173<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 173gcttggggtc aggaaggttg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gctgccgatg 60
<210> 174<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 174ccggttaacc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgccgatg 60
<210> 175<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 175cgtgctccgc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat ggacatcaaa 60
<210> 176
EP 1 615 952 B1
146
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 176cacggtcaga acatggaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttccgttac 60
<210> 177<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 177ccgcgtctgc aggaagaatg cgtttgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgctgcgt 60
<210> 178<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 178cgtaccaccc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaatcccag 60
<210> 179<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 179cagacctccc aggaagactg cgtttgggac ccgtggacct gcgaccacat ggtttcctcc 60
<210> 180<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 180caggttatcg gtcgtccgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacct ggaaggtctg 60
<210> 181<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
147
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 181tgggctcagc aggaagaatg cgcttgggac ccgtggacct gcgaccacat ggttggtctg 60<210> 182<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 182ctgccgggtc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttcgttcc 60
<210> 183<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 183ccgatgaacc aggttgaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60
<210> 184<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 184ttcggttggt ctcacggttg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctacc 60
<210> 185<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 185aaatccaccc aggacgactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttggtccg 60
<210> 186<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 186
EP 1 615 952 B1
148
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ggtccgcgta tctccacctg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaccagctg 60
<210> 187<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 187tccaccatcg gtgacatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcaggttgac 60
<210> 188<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 188gttctgggtg gtcagggttg cgaatgggac ccgtggacct gccgtctgct gcagggttgg 60
<210> 189<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 189gttctgggtg gtcagggttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacct ggaagacggt 60
<210> 190<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 190accaccatcg gttccatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt 60
<210> 191<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 191accaaaggta aatccgtttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat gcagtccggt 60
<210> 192
EP 1 615 952 B1
149
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 192accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt 60
<210> 193<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 193tgggttaacg aagttgtttg cgaatgggac ccgtggacct gcaaccactg ggacaccccg 60
<210> 194<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 194gttgttcagg ttggtatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcaaacacat gcgtctgcag 60
<210> 195<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 195gctgttggtt cccagacctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacct ggttgaagtt 60
<210> 196<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 196cagggtatga aaatgttctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat cgtttaccgt 60
<210> 197<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
150
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 197accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat gcagggtggt 60
<210> 198<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 198acctcccagc gtgttggttg cgaatgggac ccgtggacct gccagcacct gacctacacc 60
<210> 199<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 199cagtggtcct ggccgccgtg cgaatgggac ccgtggacct gccagaccgt ttggccgtcc 60
<210> 200<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 200ggtacctccc cgtccttctg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat ggttcagggt 60
<210> 201<211> 42<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 201caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca tg 42
<210> 202<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
151
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 202
<210> 203<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 203
<210> 204<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 204
<210> 205<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 205
<210> 206<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
152
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 206
<210> 207<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 207
<210> 208<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 208
<210> 209<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 209
<210> 210<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence
<220>
EP 1 615 952 B1
153
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> RNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 210
<210> 211<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 211
<210> 212<211> 65<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 212
<210> 213<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 213
<210> 214<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
154
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 214
<210> 215<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 215
<210> 216<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 216
<210> 217<211> 67<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 217
<210> 218
EP 1 615 952 B1
155
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 218
<210> 219<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 219
<210> 220<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 220
<210> 221<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 221
EP 1 615 952 B1
156
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 222<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 222
<210> 223<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 223
<210> 224<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 224
<210> 225<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 225
EP 1 615 952 B1
157
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 226<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 226aaattcaacc cgctggacga gctggaagag actctgtacg aacagtttac ttttcaacag 60
<210> 227<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 227gctggtggta tgcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgaactacga cgttcaggct 60
<210> 228<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 228cagacttggg acgatccgtg catgcacatt ctgggtccgg ttacttggcg tcgttgcatc 60
<210> 229<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 229gctccgggtc agcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgacctacca gcgtatcgtt 60
<210> 230<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 230
EP 1 615 952 B1
158
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
tccggtcagc tgcgtccgtg cgaagaaatc ttcggttgcg gtacccagaa cctggctctg 60
<210> 231<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 231ttcggtgaca aacgtccgct ggaatgcatg ttcggtggtc cgatccagct gtgcccgcgt 60
<210> 232<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 232ggtcaggacc tgcgtccgtg cgaagacatg ttcggttgcg gtaccaaaga ctggtacggt 60
<210> 233<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 233ggtttcgaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga caaacagacc 60
<210> 234<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 234aaactggaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcaccc agggttgcga caaccagtcc 60
<210> 235<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 235ctgcaggaat ggtgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60
<210> 236
EP 1 615 952 B1
159
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 236gctcaggact actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga aatgcagaaa 60
<210> 237<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 237ctgctggact actgcgaagg tgttcaggac ccgttcacct tcggttgcga aaacctggac 60
<210> 238<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 238caccaggaat actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga ataccagggt 60
<210> 239<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 239atgctggact actgcgaagg tatggacgac ccgttcacct tcggttgcga caaacagatg 60
<210> 240<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 240ctgcaggact actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaccagcgt 60
<210> 241<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
160
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 241ctgcaggact actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60
<210> 242<211> 54<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 242ttcgactact gcgaaggtgt tgaagacccg ttcactttcg gctgtgataa ccac 54
<210> 243<211> 250<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2
<400> 243
EP 1 615 952 B1
161
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 244
EP 1 615 952 B1
162
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 29<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 244caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga 29
<210> 245<211> 42<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 245ggtggtgcgg ccgcactcga gactgttgaa agttgtttag ca 42
<210> 246<211> 29<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 246caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga 29
<210> 247<211> 43<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 247aacacaaaag tgcacagggt ggaggtggtg gtgcggccgc act 43
<210> 248<211> 91<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 248
EP 1 615 952 B1
163
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 249<211> 91<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 249
<210> 250<211> 95<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220>
EP 1 615 952 B1
164
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> oligonucleotide
<400> 250
<210> 251<211> 91<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 251
<210> 252 <211> 89
EP 1 615 952 B1
165
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 252
<210> 253<211> 95<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 253
EP 1 615 952 B1
166
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 254<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 254cacagtgcac agggt 15
<210> 255<211> 16<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 255tgatctcgag agaatg 16
<210> 256<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 256gttagctcac tcattaggca c 21
<210> 257<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
167
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> oligonucleotide
<400> 257gtaccgtaac actgagtttc g 21
<210> 258<211> 18<212> DNA<213> Artificial Sequence
<220><223> oligonucleotide
<400> 258ttacacttta tgcttccg 18
<210> 259<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 259
<210> 260<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 260
EP 1 615 952 B1
168
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 261<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2) .. (2)<223> Xaa = Fc
<400> 261
<210> 262<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 262
<210> 263<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
169
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 263
<210> 264<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 264
<210> 265<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 265
EP 1 615 952 B1
170
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 266<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 266
<210> 267<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 267
<210> 268<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 268
EP 1 615 952 B1
171
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 269<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 269
<210> 270<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 270
<210> 271<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
172
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 271
<210> 272<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 272
<210> 273<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 273
EP 1 615 952 B1
173
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 274<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 274
<210> 275<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 275
<210> 276<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
174
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 276
<210> 277<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 277
<210> 278<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 278
EP 1 615 952 B1
175
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 279<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 279
<210> 280<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 280
<210> 281<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
176
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 281
<210> 282<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 282
<210> 283<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 283
EP 1 615 952 B1
177
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 284<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 284
<210> 285<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 285
<210> 286<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 286
EP 1 615 952 B1
178
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 287<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 287
<210> 288<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 288
<210> 289<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
179
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 289
<210> 290<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 290
<210> 291<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 291
EP 1 615 952 B1
180
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 292<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 292
<210> 293<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 293
<210> 294<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 294
EP 1 615 952 B1
181
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 295<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 295
<210> 296<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 296
<210> 297<211> 31
EP 1 615 952 B1
182
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 297
<210> 298<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 298
<210> 299<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 299
EP 1 615 952 B1
183
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 300<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 300
<210> 301<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 301
<210> 302<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220>
EP 1 615 952 B1
184
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 302
<210> 303<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 303
<210> 304<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 304
EP 1 615 952 B1
185
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 305<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 305
<210> 306<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 306
<210> 307<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
186
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 307
<210> 308<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 308
<210> 309<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 309
EP 1 615 952 B1
187
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 310<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 310
<210> 311<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 311
<210> 312<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 312
EP 1 615 952 B1
188
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 313<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 313
<210> 314<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 314
<210> 315<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
189
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 315
<210> 316<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 316
<210> 317<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 317
EP 1 615 952 B1
190
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 318<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 318
<210> 319<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 319
<210> 320<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
191
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 320
<210> 321<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 321
<210> 322<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
EP 1 615 952 B1
192
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 322
<210> 323<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 323
<210> 324<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 324
EP 1 615 952 B1
193
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 325<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 325
<210> 326<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 326
EP 1 615 952 B1
194
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 327<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<220><221> ’misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 327
<210> 328<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc-feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 328
EP 1 615 952 B1
195
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 329<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 329
<210> 330<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 330
EP 1 615 952 B1
196
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 331<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 331
<210> 332<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 332
EP 1 615 952 B1
197
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 333<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 333
<210> 334<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 334
EP 1 615 952 B1
198
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 335<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 335
<210> 336<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 336
EP 1 615 952 B1
199
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 337<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 337
<210> 338<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 338
<210> 339
EP 1 615 952 B1
200
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34) .. (34)<223> Xaa = Fc
<400> 339
<210> 340<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 340
<210> 341<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220>
EP 1 615 952 B1
201
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc
<400> 341
<210> 342<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 342
<210> 343<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 343
EP 1 615 952 B1
202
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 344<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 344
<210> 345<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 345
<210> 346<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
EP 1 615 952 B1
203
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 346
<210> 347<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 347
<210> 348<211> 25<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 348
EP 1 615 952 B1
204
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 349<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 349
<210> 350<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 350
<210> 351<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 351
EP 1 615 952 B1
205
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 352<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 352
<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 353
<210> 354<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
EP 1 615 952 B1
206
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 354
<210> 355<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 355
<210> 356<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc
<400> 356
EP 1 615 952 B1
207
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 357<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2) .. (2)<223> Xaa = Fc
<400> 357
<210> 358<211> 29<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2
<220><221> misc_feature<222> (2) .. (2)<223> Xaa = Fc
<400> 358
<210> 359
<211> 32
<212> PRT<213> Artificial Sequence
EP 1 615 952 B1
208
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2
<400> 359
Claims
1. A peptibody capable of binding Ang-2 wherein the peptibody comprises the sequence set forth in SEQ ID NO:25,in combination with an anti-inflammatory agent, for use in a method for treating an inflammatory disease.
2. The peptibody for use according to claim 1 wherein the anti-inflammatory agent comprises at least one of a DMARD(Disease-Modifying Anti-Rheumatic Drug), SAARD (Slow-Acting Anti-Rheumatic Drug), and NSAID (Non-SteroidalAnti-Inflammatory Drug).
3. The peptibody for use according to claim 1 wherein the anti-inflammatory agent comprises at least one of a TNFinhibitor, a IL-1 inhibitor, a TACE inhibitor, a COX-2 inhibitor, and a P-38 inhibitor.
4. The peptibody for use according to claim 2 wherein the TNF inhibitor comprises at least one of etanercept, adali-mumab, pegsunercept (PEGsTNF-R1), onercept, and infliximab.
5. The peptibody for use according to claim 2 wherein said IL-1 inhibitor is at least one of anakinra, IL-1, TRAP, IL-1antibody, and soluble IL-1 receptor.
Patentansprüche
1. Peptikörper ("Peptibody"), der zur Bindung von Ang-2 in der Lage ist, wobei der Peptikörper die in SEQ ID NR: 25dargestellte Sequenz umfasst, in Kombination mit einem entzündungshemmenden Wirkstoff, zur Verwendung ineinem Verfahren zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung.
2. Peptikörper zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei der entzündungshemmende Wirkstoff mindestens ein Elementder Gruppe bestehend aus einem krankheitsmodifizierenden Antirheumatikum (DMARD), einem langsam wirkendenAntirheumatikum (SAARD) und einem nicht-steroiden entzündungshemmenden Wirkstoff (NSAID) umfasst.
3. Peptikörper zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei der entzündungshemmende Wirkstoff mindestens ein Elementder Gruppe bestehend aus einem TNF-Inhibitor, einem IL-1-Inhibitor, einem TA-CE-Inhibitor, einem COX-2-Inhibitorund einem P-38-Inhibitor umfasst.
4. Peptikörper zur Verwendung nach Anspruch 2, wobei der TN-F-Inhibitor mindestens ein Element der Gruppe be-stehend aus Etanercept, Adalimumab, Pegsunercept (PEGs TNF-R1), Onercept und Infliximab umfasst.
5. Peptikörper zur Verwendung nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem IL-1-Inhibitor um mindestens ein Elementder Gruppe bestehend aus Anakinra, IL-1, TRAP, IL-1-Antikörper und löslichem IL-1-Rezeptor handelt.
Revendications
1. Peptibody capable de se lier à Ang-2, ledit peptibody comprenant la séquence définie dans SEQ ID N˚ : 25, encombinaison avec un agent anti-inflammatoire, à utiliser dans un procédé de traitement d’une maladie inflammatoire.