I muscoli, le vertebre, le coste, i tendini, i vasi originano da progenitori presenti nel mesoderma parassiale

Il mesoderma si forma per l’azione di fattori sia solubili (es. FGF) che trascrizionali (es Wnt e T-box) che sono spazio-specifici

FORMAZIONE DEL TESSUTO MUSCOLARE

Il mesoderma assume un’organizzazione segmentale: i somiti

Da ciascun somite originano specifici muscoli

La formazione delle “bozze” muscolari richiede migrazione delle cellule staminali

La migrazione è controllata da fattori trascrizionali (Pax 3) e segnali extracellulari

Ruolo fondamentale di SF-HGF (scatter factor-hepatocyte growth factor) la cui espressione è sotto controllo di FGF e Shh

Il recettore di HGF (c-met) è sotto controllo trascrizionale di Pax3

Le cellule mesodermiche sono pluripotenti destinate a “cell fate specification”

Concetto di “Cell Fate Specification”: formazione di linee cellulari da progenitori pluripotenti che progressivamente perdono la pluripotenzialità e acquisiscono proprietà di “lineage” definitive

Fattori induttivi locali, diversi in varie porzioni del corpo, determinano “cell fate specification”

Muscle Regulatory Factors

Gli MRF sono fattori trascrizionali

MyoD: Una volta attivo rimane autoregolato (permanente)

Myf5: precoce e transitorio (regolazione diversa in varie parti, vedi figura)

Myogenin: tardivo, importante durante il differenziamento

MRF4: tardivo, importante durante il differenziamento

Controllo della proliferazione dei mioblasti

I mioblasti sono progenitori proliferanti differenziati che esprimono Myf5 e MyoD

Fattori che controllano la proliferazione dei mioblasti: mitogeni, FGF, TGFb, IGF, integrine

I mioblasti vengono sottratti al ciclo cellulare per attivazione di myogenin, MRF4, MEF2

Controllo del differenziamento

Il differenziamento implica il controllo trascrizionale di geni per proteine muscolo-specificheFattori trascrizionali che regolano il differenziamento:

•Myogenin•MRF4•Mef2

I fattori trascrizionali di differenziamento si legano a promotori altamente conservati tra specie e geni.In una prima fase il differenziamento è reversibileIl differenziamento diventa irreversibile quando i mioblasti si fondono con i miotubi

Fusion-competentmyoblast

MyotubeMyoblast

nAChR

ec-coupling mechanism

I on channels and myogenesis

Fusion-competentmyoblast

MyotubeMyoblast Fusion-competentmyoblast

MyotubeMyoblast

nAChRnAChR

ec-coupling mechanismec-coupling mechanism

I on channels and myogenesis

Induzione di competenze e specificità muscolari

Cellule muscolari in coltura: la colorazione marrone indica l’espressione di una proteina presente solo nei miotubi differenziati

Notare la presenza di numerosi nuclei nei miotubi

Le cellule miogeniche non differenziate non sono colorate e si intravedono come ombre grigie

Progressione nella maturazione del tessuto muscolare

Mioblsti → miotubi → fibre muscolari

Cellule muscolari in coltura. Per avviare il filmato fare doppio click su ciascuna immagineA dx immagine in contrasto di fase; si vedono le contrazioniA sin: variazioni della concentrazione dello ione calcio all’interno di cellule in contrazione. La variazione è indicata dal passaggio dal colore blu a quello gialloLe due immagini sono delle stesse cellule ma le riprese sono in momenti diversi; alcune delle celule che si contraggono nell’immagine di sinistra, non lo fanno nell’immagine di destra e viceversa.

FATTORI DI CRESCITA E CELLULE SATELLITI

Fibra muscolare isolata in celeste si vedono i nuclei che appartengono alla fibra muscolare ad eccezione di uno che in B è colorato in rosso e che appartiene ad una cellula satellite

Nel muscolo adulto esiste una quota di cellule capaci di proliferare e di differenziarsi

DAPI M-caderina DesminaDAPI M-caderina Desmina

Controllo della proliferazione delle cellule satelliti

Il passaggio dalla fase quiescente alla proliferativa richiede fattori di competenza e di progressione

Riposo o Go → ingresso in G1 → progressione a mitosi Fattore di competenza Fattore di progressione

Fattori di competenza:FGF

•legato a proteoglicani della lamina basale, rilasciato dopo lesioni•L’espressione aumenta dopo lesione, in ipertrofia•Agisce su cellule satelliti, ma anche su innervazione, vascolarizzazione, fibroplasia

Fattori di progressioneIGF

•Due isoforme, dette IGF-I e IGF-II•IGF-I è il mediatore degli effetti di GH; IGF-II induce proliferazione cellule miogeniche durante lo sviluppo•E’ trasportato via sangue dove è legato a proteine di trasporto; •Desametazone (Cortisonico) potenzia le risposte da IGF•Da solo induce differenziamento•In combinazione con FGF induce proliferazione

Fattori di controllo negativo della proliferazione delle cellule satelliti

TGF-b (transforming growth factor): inibisce la fusione in miotubi

Miostatina: •membro di famiglia TGF; attiva sistema di proteolisi intracellulare•anticorpi inducono ipertorfia muscolare•la produzione di miostatina e/o suo recettore è controllata•è un dei fattori che contribuisce all’atrofia da disuso

Fattori da contatto (presente sulla membrana delle cellule muscolari)

TNF-a (tumor necrosis factor): •citochina coinvolta in atrofia da sepsi o tumore•non sembra essere coinvolta nell’atrofia da disuso

Atrofia da disuso Connessa ad attivazione di NF-kB (sistema di regolazione trascrizionale inizialmente scoperto nei linfociti B, ma poi identificato in diversi tessuti; consente la conversione di segnali extracellulari in eventi di regolazione dell’espressione genica)

L’ATROFIA E’ UNO SPECIFICO PROGRAMMA CELLULARE CHE RICHIEDE ENERGIA ED ESPRESSIONE GENICA CONTROLLATA

(per maggiori e interessanti informazioni sui vari meccanismi di regolazione dell’atrofia, vedere il file pdf allegato in rete: “05 Meccanismi atrofia muscolare review”)

Myostatin ResearchIntroduction Myostatin was first described by McPherron et al in 1997. It is a gene which is a member of the Transforming Growth Factor- (TGF-) Superfamily. These genes encode secreted factors that are important for regulating embryonic development and tissue homeostasis in adults. Myostatin-null mice show a dramatic and widespread increase in skeletal muscle mass due to an increase in number of muscle fibres ( hyperplasia) and thickness of fibres (hypertrophy).

Where and When is it expressed?During early embryogenesis myostatin is particularly important in the myotome compartment of developing somites. However myostatin also plays an important role in fully developed skeletal muscle. Myostatin controls not only fibre size but also fibre number. Muscle which is mechanically hypertrophied shows an increase in myostatin (Sakuma et al 2000). Conversely in regenerating muscle myostatin levels are reduced (Yamanouchi et al 2000).How does it work?

In many mammalian cells cell cycle progression is inhibited by members of the TGF- superfamily. This is done by arresting the cells in the G-1 phase of the cell cycle. This is mediated through the many elements of the complex cell cycle machinery.

Cyclin-dependent kinases (Cdks) regulate 'G1' transitions to 'S' through phosphorylation and inactivation of the retinoblastoma (Rb) protein. However p21 (which is a cyclin inhibitor) suppresses the kinase activities of the Cdk2. Myostatin works by increasing the p21 activity and thus decreasing the Cdk2 levels. This results in suppression of the Rb protein phosphorylation and concurrent cell cycle arrest of myoblasts in the G1 phase. As the diagram shows the fibre number is then regulated.

Myostatin Mutations:

Mutations in the myostatin gene has been shown to cause double muscling in cattle (Kambadur et al 1997). Mutations in Belgian blue and Piedmontese cattle occur in the 3rd exon of the myostatin gene. Ferrell et al 1999 showed that mutations can occur in exon 1 in the human genotype. Interestingly two of these mutations are polymorphic in the general population.

BibliografiaMcPherron, A.C, Lawler, A. M, Lee, S. J (1987). Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-b superfamily member. Nature. 387. 87-90.McPherron, A. C., and Lee, S. J. (1997). Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 94. 12457-61Thomas, M., Langley, B., Berry, C., Sharma, M., Kirk, S., Bass, J., and Kambadur, R. 2000). Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. J. Biol. Chem. 275(51):40235-43.

RIGENERAZIONE MUSCOLARE

La rigenerazione delle fibre muscolari è legata all’attività di cellule satelliti e delle porzioni sopravvissute della fibra muscolare

La risposta rigenerativa dipende dal tipo di lesione•Focale (ago o sovraccarico): muoiono poche fibre, la proliferazione è focale•Estesa: proliferazione e migrazione delle cellule satelliti anche nelle parti sane della fibra

Prime manifestazioni cellulari della necrosi muscolare•Ipercontrazione: strappo della membrana, ingresso Calcio, segmenti ipercontratti, densi•Attivazione proteolisi intracellulare: in 24h la parte lesionata scompare e lascia “tubo vuoto” di endomisio con aggregati proteici → invasione macrofagica•L’inizio della proliferazione e dell’invasione macrofagica dipendono da integrità vasale (non ci sono nel muscolo macrofagi residenti)•L’invasione macrofagica e la rimozione dei residui sono necessari per la rigenerazione delle fibre muscolari, per la rivascolarizzazione, per la proliferazione delle cellule satelliti

Le cellule satelliti invadono la cellula muscolare morta e si accumulano nel tubo endomisiale sia negli aggregati proteici che negli spazi vuoti

La rigenerazione delle fibre muscolari è legata all’attività di cellule satelliti e delle porzioni sopravvissute della fibra muscolare

La rimozione dei residui necrotici facilita la rigenerazione

La lamina basale forma intorno alla fibra muscolare un tubo (endomisio)

Ruolo in rigenerazione dell’endomisio• Intrappola le cellule satelliti• Consente l’orientamento spaziale dei miotubi rigeneranti• Promuove la crescita e il differenziamento delle cellule

satelliti• Guida la reinnervazione

Le cellule satelliti iniziano a proliferare 30h dopo il crushRuolo di proteoglicani in lamina: immobilizzano FGF, PDGF e altri

fattori che sono poi liberati dopo morte cellulare

Fattori neurogeniDurante lo sviluppo la crescita delle fibre mediata da fusione di cellule

satelliti richiede l’innervazioneDenervazione perinatale comporta la riduzione della popolazione di

cellule satellitiNell’adulto: la denervazione provoca proliferazione delle cellule satelliti

con picco a 4 giorni e che persiste per settimane

Attività muscolare e cellule satellitiNel muscolo non allenato

Sessione di corsa: raddoppio delle cellule satellitiSessione prolungata su treadmill: triplicano

Muscle overwork: necrosi e rigenerazione: proliferazione → fusione → iperplasia