Humorale Immunität III. B-Zellreifung und Antikörper-Repertoire Hans-Martin Jäck Division of Molecular Immunology Department of Internal Medicine III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum

Humorale ImmunitätIII. B-Zellreifung und Antikörper-Repertoire

Hans-Martin JäckDivision of Molecular Immunology

Department of Internal Medicine IIINikolaus-Fiebiger-Zentrum

University of Erlangen-Nürnberg

UniversitätsklinikumErlangen

Immunologie für Studierende der Biologie & Molekularmedizin

Konzepte der ImmunologieErlangen WS 2007/2008

Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 2

B-ZELLREIFUNG & AK-REPERTOIRE

Plasma-Plasma-zellezelle

IgM, IgA,IgM, IgA,IgG, IgEIgG, IgE

Gedächtnis-Gedächtnis-B-ZelleB-Zelle

Naive,Naive,reife B-Zellereife B-Zelle

+Ag

+TH

Knochenmark

Periphäres lymphatisches Organ

StammzelleStammzelle Pro-B-ZellePro-B-Zelle Prä-B-ZellePrä-B-Zelle Unreife B-ZelleUnreife B-Zelle

IgMIgM IgDIgDIgGIgG

IgMIgMPrä-BZRPrä-BZR


Pro-B-Zelle

SpätePrä-B

UnreifeB-Zelle

FrühePrä-B

Stamm-zelle

Vettermann et al.Sem. Immunol, 2006

B-Zellreifung - Übersicht

VL → JL

Primäres B-Zell-Repertoire

~109-1012 Antikörper

ReifeB-Zelle

Plasma-zelle

Gedächtnis-B-Zelle

Ag

VH →D→JH

Knochenmark z.B. Milz


IgH-Lokus in Stammzelle

IgH-Lokus in B-Zelle

Memban-IgH

CH-Exons

VH CH

VH-Exon

Eine zusammenhängende Sequenz des V-Exons (codiert für V-Region einer Ig-Kette) und smit ein funktionelles Immunglobulingen wird durch somatische VDJ-Umlagerung von DNA-Segmenten (liegen in multiplen Kopien vor) während der Reifung B-lymphoider Zellen aus Blutstammzellen gebildet (Susumo Tonegawa, 1976)

VDJ-Rekombination

Nobel Price1987

VH D JH


~ 85 Vκ Vκ-Regionen(340) 4 Jκ

1 Cκ

VH-Regionen(ca. 6760) 4 JH

5 CH

~ 134 VH

13 DH

Antikörper-REPERTOIRE

RekombinatorischeDiversität

~ 2.3 x 106 Ab

Ko

mb

ina

tori

sch

e

Div

ers

ität

C H1

V H

C L

V

L

CH3

CH2

Antigenbindungsstelle= Paratop

“Magic Part”

(reperire, lat. wiederfinden)

V(D)J-Rekombination generiert

Antikörperdiversität



Genetics and biochemistry Ig recombination

V J

VL 7 9 79 JL

RSS = recombination signal sequences

Coding Joints

Ku70/80

Signal Joint

Ligation

•XRCC4•Ligase IV

1. Processing•DNA-PK•Artemis

2. Ligation•XRCC4 •Ligase IV

Paired complex

RAG1/2

CleavedSignal complex


V(D)J-Rekombination - Genetischer Mechanismus

DNA instem cell

Jκ CκVκ1 Vκ n

(Coding Joint)

(Signal Joint)

Rekombinations-Signal-Sequenz(Heptamer-spacer-Nonamer)

Deletion (RAG1/2)

Looping-out (RAG1/2)

Ligation(Nonhomologou

sEnd

joining=NHEJ)


Rekombinationssignalsequenzen (RSS)

RSS: 7-23-9 bzw. 9-12-7-Motife

Hepatmer (7) und Nonamer (9) sowie Länge (aber nicht Sequenz) der Spacer evolutionär hochkonser-viert

Nötig für V(D)J-Umlagerung

Dirigieren intrachromosomale Umlagerung

Umlagerung zwischen Segmenten auf demselben Chromosom

12/23-Regel:

Umlagerung normalerweise immer nur zwischen Segment mit 12bp-Spacer und Segment mit 23bp-Spacer

DNA instem cell

RSSRSS

RSS – Rekombinationssignalsequenzen


Nach: Bassing et al. (2002), Cell

DH to JH

23-RSS

JHDVH

12-RSS

DJH

VH to DJH

No VH to JH

X

No VH to JH

X

12/23-Regel: VH-nach JH-Umlagerungen


Allelausschluss - Grundlage für die Monospezifiät einer B-Zelle

Allel A

Allel B

Allelausschluß: Das Produkt nur eines Allels wird von einer Zelle synthetisiert

A B AB

B-Zellen exponieren

entweder Igh vom Allel a oder

Allel bauf der

ZelloberflächeAu

s Ja

ne

wa

y, I

mm

un

ob

iolo

gy

Igh a/a Igh b/b

Igh a/b


Allelausschluss – Fred Alts Feedback-Modell als ein möglicher Mechanismus

CH-ExonsVH-Exon

VH CH

IgH-Kette oder mRNA

DNA

DNA

DNA

Negatives Feedbackdurch Signale der

IgH-Kette oder IgH-mRNA


Sequenzen, die für die 3. hypervariable Domäne (CDR3) einer L- und H-Kette codieren, werden erst durch die Umlagerung von Ig-Segmenten gebildet

VH-Region einer IgH-Kette

VHDJH-Exon eines umgelagerten

IgH-Gens

V D J

Keimbahn-konfiguration V D J

VH-RegionCDR1 CDR2 CDR3

V(D)J-Rekombination etabliert die CDR3-Region


Schritt 1: Erkennung und Paarung von RSS (DNA-bindende Proteine)

Schritt 2: Schneiden → DoppelstrangbrücheDoppelstrangbrüche(Endonukleasen)

Schritt 3: Prozessieren der Enden (Polymerasen, Endo- und Exonukleasen)

Schritt 4: Ligieren der Enden (Ligasen)

Nur in Lymphozyten

(RAG1/2-Proteine)

Alle Zellen„Doppelstrangbruch-

reparaturproteine“(NHEJ = Non-homologues

end joining)

V(D)J-Rekombination - Biochemie


Produkte der Rekombinations-aktivierenden Gene 1 & 2 (RAG = recombination activating genes 1 & 2)

RAG-Gene sind nur ca. 8kb voneinander entfernt

Offene Leseraster enthalten keine Introns (→prokrayontischen Ursprungs ???)

Nur in B- und T-Lymphozyten

Aktivitäten: Erkennung der RSS Endonukleolytischer

Einzelstrangschnitt Bildung von Haarnadel-strukturen

(hairpins)

Offene Leseraster

RAG1

RAG2

RAG1/2 - Recombination-Activating Genes


Durch RAG1 und RAG2

Offene Leseraster ohne Introns – Prokaryonten?

Endonukleolytischer Einzelstrangschnitt und Bildung von Haarnadelstrukturen (hairpins)

Spaltung

Gespaltener Signalkomplex

Bildung der Synapse(12/23 Regel)

Gepaarter Komplex

A-C-P-G-GT-G-P-C-C

A-C T-G

8kbRAG1 RAG2

A-C G-GT-G-P-C-C

OH P

-P-G-G OH-C-C

V J

Schritte 1 & 2: Erkennung und Spaltung der RSS

Bindung von RAG1/2


Gespaltener Signalkomplex

Ku70/80

XRCC4Ligase IV

Ligierung

Signalverknüpfnung(Signal Joint)

Ligierung

Kodierende Verknüpfung(Coding Joint)

DNA-PKcsArtemis

Öffnen der Haarnadelstruktur

Prozessierung der freien Enden

Ku70/80

XRCC4Ligase IV

Mo

difi

zie

rt n

ach

Ba

ssin

g e

t a

l. (2

00

2),

Ce

ll 1

09

:45

-55

Schritt 3&4: Prozessierung der Haarnadelstruktur & Ligierung


G-T-A-C C-A-T-G

A-T-G-G T-A-C-C

G-T-A-C C-A-T-G

A-T-G-G T-A-C-C

G-T-A-C C-A-T-G

A-T-G-G T-A-C-C

ArtemisDNA-PKcs

G-T-A-C-G-T-N-N- C-A-T-G-C-A-N-N-

G-G C-C

P N

+ TdT

G-T C-A-T-G-C-A

G-G T-A-T-A-C-C

G-T-A-C-G-T C-A-T-G-C-A

G-G C-C

Fill-in 5‘ Exo (Artemis)

+

T-G-G A-C-C

G-T-A-C-G- C-A-T-G-C-

P

Ungenaues Prozessierung der Haarnadelschleife führt zu ver-schiedenen Verknüpfungsse-quenzen und erhöht dadurch das AK-Repertoire !!!

Verknüpfungsdiversität durch ungenaues Prozessieren

V J


IgH-Lokus in Stammzelle

IgH-Lokus in B-Zelle

Memban-IgH

CH-Exons

VH CH

VH-Exon

Eine zusammenhängende Sequenz des V-Exons (codiert für V-Region einer Ig-Kette) und smit ein funktionelles Immunglobulingen wird durch somatische VDJ-Umlagerung von DNA-Segmenten (liegen in multiplen Kopien vor) während der Reifung B-lymphoider Zellen aus Blutstammzellen gebildet (Susumo Tonegawa, 1976)

Antikörper-Repertoire

Nobel Price1987

VH D JH



1 Cκ


5 CH

~ 134 VH

13 DH

Rekombinatorische & kombinatorische Diversität


~ 2.3 x 106 Ab

Ko

mb

ina

tori

sch

e

Div

ers

ität

C H1

V H

C L

V

L

CH3

CH2


“Magic Part”






Die Welt der Antigene

Abhängig vom Paratop erkennt eine B-Zelle jede Struktur

• Protein• Lipide• Nukleinsäuren• Kohlenhydrate• Moleküle oder Haptene (Halbantigene)• Sogar Plastik und Metalle (z.B. Nickel)

Wieviele Paratope (Antikörperspezifiäten) ?

Antigen-Repertoire


206 = 6 x 107 lineare Peptid-Epitope

6 x 107 Antikörper

Anzahl der Aminosäuren

Minimale Größe eines Peptidepitopes

Wieviele Antikörper werden zum Schutz gegen Pathogene benötigt?

Größe des Antigen-Repertoires



1 Cκ


5 CH

~ 134 VH

13 DH

Rekombinatorische & kombinatorische Diversität


~ 2.3 x 106 Ab

Ko

mb

ina

tori

sch

e

Div

ers

ität

C H1

V H

C L

V

L

CH3

CH2


“Magic Part”






Germline-DNA Rekombinierte DNA AA amVerknüpfungs-

punkt

C C C C T GCC G

V J

C C C C T GCC G

C C C C T GCC G

C C C C T GCC G Frame-shiftC C C GTC G

Pro-ProC C C GCC

Pro-ArgC C C GGC

Pro-TrpC C C GGT

durch ungenaue Rekombination von Ig-Gensegmenten

Verknüpfungsdiversität 1 (Junctional Diversity)


JDV

.... GGG AAA TTA GTC TTC CCG ACG ....

Enzym: terminale Desoxytransferase (TdT)

In B- und T-lymphoiden Vorläuferzellen

Maus: nur in H-Ketten

Mensch: in H- und L-Ketten

Kaum N-Insertionen während der Embryonalentwicklung

N-Sequenzen

CCT ACA

durch Insertion von Nukleotiden vor der Ligierung



J

D

V.... GGG AAA CCT TTAGTCACATTCCCG ACG AAA TTT ....

AGTCACATTCCC

TAGTCACATTCCNonsense

Codon

D-Segmente können in allen 3 Leseraster benützt werden durch



Punktmutationen (Schaf)

VH-Replacement

Genkonversion (Huhn und Hase)

o nicht-reziproke homologe Rekombination

o VH-Repertoire beim Kaninchen und Huhn

Aus Martin & Scharf, Nature Immunol Rev. 2002

Genkonversion

Diversität durch Rekombination/Mutation

Veränderung bereits etablierter V-Exons



1 Cκ


5 CH

~ 134 VH

13 DH



~ 2.3 x 106 Ab

Ko

mb

ina

tori

sch

e

Div

ers

ität

C H1

V H

C L

V

L

CH3

CH2


“Magic Part”



109 - 1012 Ab

Verknüpfungs-diversität


Aus den nächsten vier Dias kann das Passende ausgesucht werden


C H1

V H

C L

V

L

CH3

C

H2

AK

V-Repertoire (Spezifität) Millionen von Paratopen durch

Bildung von V-Exons durch Umlagerungen von Gensegmenten

Selektion von Vorläuferzellen mit funktioneller Ig-Ketten

Aktivierung vonEffektorreaktionen

CH-Repertoire 5 CH-Regionen

Ermöglich effiziente humorale Abwehr gegen Pathogene

V-Repertoire (Affinität) Mutationen von fertigen V-

Exonsequenzen

Selektion von reifen B-Zellen mit affineren BZRen

• In sekundären lymphatischen Organen

• Induziert durch fremdes Ag und TH-Zellen in reifen IgM-B-Zellen

• Während der B-Zellreifung im Knochenmark bzw. der fötalen Leber

• Umlagerung unabhängig von Antigen

Antigen-erkennung

lat. reperiredt. finden



pro-BStem cell immature B

V-Repertoire (Diversity)

V-Repertoire (Affinity)

CH-Repertoire (Effector)

• V(D)J rearrangement (RAG) • Selection of functional IgR

IgM

Adult BONE MARROW(independent of foreign Ag)

• Affinity maturation Somatic hypermutation of V exons Selection of high-affine BCRs

• IgH class-switch

mature B

IgG

IgG

IgM

IgD

PERIPHERAL LYMPHATIC ORGAN(Induced by foreign Ag and TH cells)

memory B

plasma cellAg + TH

pre-B

lat. reperiredt. finden

Primäres und sekundäres Repertoire


Background – Antibody repertoire

C H1

V H

C L

V

L

CH3

C

H2

V-Repertoire (Diversity) V(D)J rearrangement (RAG)

Selection and duplication of precurors with functional Ig receptors Effector

reactionsCH-Repertoire

5 CH Regions

Class-switch recombination (AID)

Humoral immunitiy against pathogens

V-Repertoire (Affinity) Somatic Hypermutationen of

V exons (AID)

Selection of mature B cells with high-affine BCRs

Antigenrecognition PERIPHERY

(Induced by Ag and TH cells) Adult BONE MARROW(independent of foreign Ag)


Antikörper-Repertoire - Zusammenfassung

1. Rekombinatorische Diversität

2. Kombinatorische Diversität

3. Verknüpfungsdiversität Unpräzises Verknüpfen von V, D und J-Segmenten Insertionen von Nukleotiden zwischen V, D und J-Segmenten Benützen verschiedener Leseraster des D-Segments

4. Somatische Mutation von V(D)J-Exons

Repertoire für Antigenerkennung

Repertoire für Effektorfunktionen

Austausch der C-Region (insgesamt 5) durch Schwerketten-Isotyp- oder -Klassenwechsel (class switch recombination = CSR)


Pro-B-Zelle

SpätePrä-B

UnreifeB-Zelle

FrühePrä-B

Stamm-zelle


Qualitätskontrolle der B-Zellreifung

VL → JL

Auto-reaktivität?

Anwesenheit und Paarung von Ig-Ketten?

Kontroll-punkte

ReifeB-Zelle

Plasma-zelle

Gedächtnis-B-Zelle

Ag

VH →D→JH

BCRPre-BCR


Igα/Igβ

Cµ1

Cµ2

Cµ3

Cµ4

VH

L-Kette

µH-Kette

Cµ1

Cµ2

Cµ3

Cµ4

VH

VpreB

5

µH-Kette

β8

Igα/Igβ

unique

tails

Prä-B-Zell-Rezeptor B-Zell-Rezeptor

Der Prä-B-Zellrezeptor-Kontrollpunkt

Surrogate L-Kette

Unreifer und reife Ig-Rezeptoren


Ankurbeln des Zellzyklus Vervielfältigung von Prä-B-Zellen mit

paarungsfähigen µH-Ketten durch selektive klonale Expansion

Überlebenssignale

Umleitung der V(D)J-Rekombinase vom IgH- zum IgL-Lokus ???

Allelausschluss am IgH-Lokus

Öffnen des IgL-LokusPrä-BZR

µH-Kette

Igαβ

Funktionen des Prä-B-Zellrezeptors

SL-Kette


Prä-BZR

VH1 VH1VL1

BZR

VH1 VH1VL2

VH1 VH1VL3

VH1 VH1VL4

Prä-B-Zellexpansion erhöht kombinatorische Diversität


Signals induced by receptor assembly

Signals induced by receptor self-ligation

Signals induced by external ligand

Ligand-independent Ligand-dependent

pre-B cell

B

pre-B cell

C

Signals induced by self-ligand

pre-B cell

D

BM stroma cell

pre-B cell

E

Pre-B cell autonomous Stroma cell-dependent

Aus

Vet

term

ann

et a

l, S

em I

mm

unol

, 20

06

The5 unique region distinguisges a pre-BCR from a BCR, and thus allows pre-BCR-specific signal enhancement via binding to SELF (autoreactivity)

Signalinitiierung des ‚Autoreaktiven‘ Prä-BZR


„Eliminierung“ autoreaktiver B-Zellen

Zentrale Mechanismen• Deletion • Anergie• Editieren des Rezeptors

Periphäre Mechanismen• Ignoranz• Anergie• Kompetition

VL VJ JL CL

AutoreaktiverRezeptor

Editieren des Rezeptors

EditierterRezeptor


Pro-B-Zelle

SpätePrä-B

UnreifeB-Zelle

FrühePrä-B

Stamm-zelle


Reife naive B-Zell-Populationen

VL → JL

Primäres B-Zell-Repertoire

~109-1012 Antikörper

ReifeB-Zelle

Plasma-zelle

Gedächtnis-B-Zelle

Ag

VH →D→JH

Knochenmark z.B. Milz


Ko-expression von IgM und IgD

Aus Janeway

Unreife B-Zelle

ReifeB-Zelle

KM Peripheres LO

IgM

IgDIgM


• B1-Zellen

• B2-Zellen– Follikuläre B-Zellen– Marginal-Zonen B-Zellen

Reife B-Zellpopulationen


• B1-Zellen • In Peritoneal- und Pleuralhöhle

• Entstehen schon während der Embryonalentwicklung

• Selbsterneuernd

• T-Zell-unabhängige schnelle Antikörperproduktion

• Dienen der Abwehr auf mukösen Oberflächen

• Markers: CD5+ und IgM↑

• Follikuläre B2-Zellen• In allen lymphatischen Organen

• „Normale“ rezirkulierende B-Zellen

• Markers: IgM↓, IgD↑, CD21/35↑, CD23↑

B1 und Follikuläre B2-Zellen


• Residente, langlebige Zellen in der Marginal-Zone der Milz

• Sehr gute Immunantwort gegen Polysaccharide (Kapselbakterien)

• Vermitteln „frühe“ Immunabwehr gegen Erregern, die aus dem Blut in die Milz gelangen

• Nach Kontakt mit Antigen inner-halb von 4 Stunden Differenzier-ung in Plasmazellen

• Markers: IgM↑, IgD↓, CR1/2↑, CD23↓, CD1d↑ (non-klassisches MHC)

Cyster, Nat. Immunol. 2000

Marginalzonen(MZ)-B2-Zellen

Milz mit Ausschnit zeigen

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