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Text of Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex ... · PDF fileon the oxidation of...

Daniela Mesquita Moutinho

Degree in Molecular and Cellular Biology

Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex stabilization and crystallization

Dissertation to obtain a Master Degree in Molecular Genetics and Biomedicine

at Faculty of Sciences and Technology, Universidade Nova de Lisboa

Supervisor: Isabel Bento, Ph.D., ITQB-UNL Co-supervisor: Jos Paulo Sampaio, Ph.D., FCT-UNL

Jri Presidente: Doutora Margarida Casal Ribeiro Castro Caldas Braga Arguente: Doutor Colin Edward McVey Vogal: Doutora Isabel Maria Travassos de Almeida de Jesus Bento

November 2013

Daniela Mesquita Moutinho

Degree in Molecular and Cellular Biology

Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex stabilization and crystallization

Dissertation to obtain a Master Degree in Molecular Genetics and Biomedicine

at Faculty of Sciences and Technology, Universidade Nova de Lisboa

Supervisor Isabel Bento, Ph.D., ITQB-UNL Co-supervisor: Jos Paulo Sampaio, Ph.D., FCT-UNL

Jri Presidente: Doutora Margarida Casal Ribeiro Castro Caldas Braga Arguente: Doutor Colin Edward McVey Vogal: Doutora Isabel Maria Travassos de Almeida de Jesus Bento

November 2013

III

Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex stabilization and crystallization Daniela Mesquita Moutinho, FCT/UNL, FCT A Faculdade de Cincias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa tm o direito, perptuo e

sem limites geogrficos, de arquivar e publicar esta dissertao atravs de exemplares impressos

reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a

ser inventado, e de a divulgar atravs de repositrios cientficos e de admitir a sua cpia e distri-

buio com objetivos educacionais ou de investigao, no comerciais, desde que seja dado cr-

dito ao autor e editor.

IV

V

Just because something doesn't do what you planned it to do doesn't mean it's useless.

Thomas Edison

VI

VII

Agradecimentos Acknowledgments

A realizao deste trabalho marca o final de mais uma etapa na minha vida e s pode ocor-rer devido confiana, apoio, incentivo, dedicao e conhecimento de vrias pessoas a quem no poderia deixar de expressar a minha gratido e apreo.

A todos aqueles que me acompanharam ao longo deste ano na Unidade de Cristalografia

Macromolecular do Instituto de Tecnologia Qumica e Biolgica da Universidade Nova de Lisboa e que de alguma forma contriburam para a realizao deste trabalho e que me levam a querer prosseguir e alargar os meus horizontes nesta rea.

Agradeo em especial, A Professora Doutora Maria Armnia Carrondo por me ter recebido na Unidade de Cristalo-

grafia Macromolecular e pela sua disponibilidade. Doutora Isabel Bento por me ter possibilitado trabalhar num projecto que me causou

grande interesse e me pode ensinar tanto e por poder fazer parte do Laboratrio de Genmica Estrutural. Pela sua orientao e entusiasmo. Por todo o seu apoio e crtica.

Ao Doutor Pedro Matias e ao Doutor Tiago Bandeiras por me terem dado a possibilidade de

realizar este trabalho ao mesmo tempo que trabalhei com eles e fiz parte da Unidade de Protemi-ca do Instituto de Biologia Experimental e Tecnolgica. Por todo o seu apoio, entusiasmo, com-preenso, preocupao, interesse e ajuda.

Aos meus colegas da Unidade de Protemica do iBET e do Laboratrio de Cristalografia

Aplicada Medicina e Industria do ITQB pelo seu apoio e compreenso. Cristiana Sousa pela cumplicidade, partilha de momentos e boa disposio! Ao Micael Freitas, Margarida Silva e Sara Silva pela sua ajuda, apoio e partilha de conhecimentos.

Aos meus colegas do Laboratrio de Genmica Estrutural Ana Teresa Gonalves, Bruno

Correia, Sara Brando e Doutora Ana Maria Gonalves por toda a ajuda e apoio partilhado. s minhas colegas e amigas do Laboratrio de Biologia Estrutural Ana Rita Silva e Patrcia

Borges por todos os momentos de afecto e apoio sempre que necessitei. Pelo incentivo e partilha de ideias.

A todos os meus amigos que estiveram presentes durante esta etapa e que de uma forma

ou de outra me ajudaram a conseguir ultrapass-la com sucesso. Aos meus pais e irm por sempre me apoiarem em todas as decises da minha vida. Pela

sua orientao, compreenso, amor e sacrifcio constantes para me ajudarem no meu sucesso.

A todos, com todo o meu carinho, Obrigada.

VIII

Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex stabilization and crystallization IX IX

Abstract

Human ceruloplasmin (hCp) is the molecular linker between the copper and iron metabolism

and its importance in the homeostasis of human body has been implied in some neurological dis-

eases. This plasma cuproenzyme has ferroxidase activity, oxidizing Fe2+ to Fe3+ and incorporating

it into apotransferrin. hCp also has aminoxidase activity regulating the levels of amine stress hor-

mones in the bloodstream and brain. Thus, it is thought to have an important role in neurodegener-

ative diseases such as Alzheimers or Parkinsons. To know more about the role of cerulopalsmin

on the oxidation of neurotransmitters and on brain homeostasis it is essential to know which protein

residues are implied in the binding and stabilization of these neurotransmitters. The primary source

of structural information for protein-ligand complexes is X-ray crystallography. This is the most suc-

cessful method to determine macromolecular 3D structures but has some limitations as obtaining

good diffracting protein crystals.

In this study several attempts were made to achieve better hCp diffracting crystals and crys-

tals of hcp in complex with dopamine, L-dopa, epinephrine or serotonin in order to further deter-

mine its tridimensional structure.

To improve hCp stabilization and solubility, differential scanning fluorimetry and dynamic

light scattering were used in a search for a better buffer for crystallization. For hCp crystallization

the vapour-diffusion technique was used in combination with several other methods. Commercial

crystallization screens, crystal seeding, additives, crosslinking were the several methods used to

improve crystal diffraction.

Co-crystallization of hCp with neurotransmitters was performed with no success. Soaking of

hCp crystals with the neurotransmitters was performed in an attempt to get crystals of the hCp-

neurotransmitter complexes. All crystals were sent for analysis at European Synchrotron Radiation

Facility (ESRF) and structural data will be further processed.

Key words: ceruloplasmin, neurotransmitters, epinephrine, dopamine, L-dopa, serotonin, protein crystals, crystallization, X-ray crystallography

Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex stabilization and crystallization X X

Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex stabilization and crystallization XI XI

Resumo

A ceruloplasmina humana (hCp) a ligao molecular entre o metabolismo do cobre e do

ferro sendo de extrema importncia para a homeostase corporal. Esta cuproenzima plasmtica

tem actividade de ferroxidase, oxidando Fe2+ a Fe3+ e incorporando-o na apotransferina. A hCp

regula os nveis de hormonas na corrente sangunea e no crebro. Esta actividade de aminoxidase

muito importante podendo estar implicada em doenas neurodegenerativas como Alzheimer e

Parkinson. Para de saber mais sobre o papel da ceruloplasmina na oxidao de neurotrans-

missores e na homeostase cerebral necessrio conhecer a natureza desta interaco e quais os

resduos proteicos envolvidos na ligao e estabilizao destes complexos. A cristalografia de

raios-X a principal fonte de informao sobre complexos de protena-ligandos. Apesar deste ser

o mtodo mais bem sucedido na determinao de estruturas 3D, tem algumas limitaes, como a

obteno de cristais de protena com bom poder de difraco.

Neste estudo, foram feitas vrias tentativas de melhorar cristais de hCp, j previamente

descritos, e de obter cristais de hCp combinados com dopamina, L-dopa, epinefrina e serotonina

de forma a poder obter a sua estrutura tridimensional.

A soluo tamponante onde armazenada a protena muito importante para a sua estabi-

lizao e solubilidade. Para melhorar estes aspectos da hCp utilizaram-se tcnicas de fluorometria

de varrimento diferencial (DSF) e varrimento de luz dinmica (DLS). Para a cristalizao da hCp

usou-se o mtodo de difuso de vapor combinado com outros mtodos. Usaram-se screens de

cristalizao comerciais, semearam-se cristais, usaram-se aditivos e fez-se crosslinking para ten-

tar melhorar os cristais.

A co-cristalizao da ceruloplasmina com neurotransmissores no obteve sucesso e assim

usaram-se cristais de hCp e mergulharam-se em neurotransmissores para tentar obter os cristais

dos complexos. Todos os cristais foram enviados para anlise no European Synchrotron Radiation

Facility (ESRF) e os dados estruturais sero depois processados.

Palavras-Chave: ceruloplasmina, neurotransmissores, epinefrina, dopamina, L-dopa, serotonina, cristais de protena, cristalizao, cristalografia de raios-X

Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex stabilization and crystallization XII XII

Human ceruloplasmin and neurotransmitters: complex stabilizati