Embed Size (px)
Citation preview
HPLC (High-performance liquid chromatography)
Introduccioacuten a HPLC
bullInicialmente se referiacutea a
High Pressure Liquid Chromatography
bullEn la actualidad hace referencia a
High Performance Liquid Chromatography
En generalhellip
bull En una cromatografiacutea participan
1 Fase estacionaria
2 Fase moacutevil
3 Muestra
iquestCoacutemo interaccionanEn general una cromatografiacutea se realiza permitiendo que la
mezcla de moleacuteculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria Un segundo medio (la fase moacutevil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a traveacutes de eacutesta para lavar (eluir) a las moleacuteculas en la muestra
HPLCbull La cromatografiacutea de liacutequidos de alta
resolucioacuten es un modo de cromatografiacutea en la cual el proceso de separacioacuten y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la fase moacutevil y una temperatura dada
HPLC
bull Es una teacutecnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basaacutendose en diferentes tipos de interacciones quiacutemicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatograacutefica
HPLC
bull La HPLC representa una de las herramientas maacutes empleadas en el laboratorio analiacutetico moderno
bull La cromatografiacutea es un meacutetodo usado primariamente para la separacioacuten de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases
bull Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anaacutelisis bull Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por
esta teacutecnica
HPLC
bull En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatograacutefica a traveacutes de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequentildeas partiacuteculas redondeadas con ciertas caracteriacutesticas quiacutemicas en su superficie)
bull Esto lo hace mediante el bombeo de liacutequido (fase moacutevil) a alta presioacuten a traveacutes de la columna
bull La muestra a analizar es introducida en pequentildeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones quiacutemicas o fiacutesicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna
bull El grado de retencioacuten de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto de la composicioacuten de la fase estacionaria y de la fase moacutevil
bull El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencioacuten y se considera una propiedad identificativa caracteriacutestica de un compuesto en una determinada fase moacutevil y estacionaria
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Introduccioacuten a HPLC
bullInicialmente se referiacutea a
High Pressure Liquid Chromatography
bullEn la actualidad hace referencia a
High Performance Liquid Chromatography
En generalhellip
bull En una cromatografiacutea participan
1 Fase estacionaria
2 Fase moacutevil
3 Muestra
iquestCoacutemo interaccionanEn general una cromatografiacutea se realiza permitiendo que la
mezcla de moleacuteculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria Un segundo medio (la fase moacutevil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a traveacutes de eacutesta para lavar (eluir) a las moleacuteculas en la muestra
HPLCbull La cromatografiacutea de liacutequidos de alta
resolucioacuten es un modo de cromatografiacutea en la cual el proceso de separacioacuten y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la fase moacutevil y una temperatura dada
HPLC
bull Es una teacutecnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basaacutendose en diferentes tipos de interacciones quiacutemicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatograacutefica
HPLC
bull La HPLC representa una de las herramientas maacutes empleadas en el laboratorio analiacutetico moderno
bull La cromatografiacutea es un meacutetodo usado primariamente para la separacioacuten de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases
bull Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anaacutelisis bull Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por
esta teacutecnica
HPLC
bull En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatograacutefica a traveacutes de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequentildeas partiacuteculas redondeadas con ciertas caracteriacutesticas quiacutemicas en su superficie)
bull Esto lo hace mediante el bombeo de liacutequido (fase moacutevil) a alta presioacuten a traveacutes de la columna
bull La muestra a analizar es introducida en pequentildeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones quiacutemicas o fiacutesicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna
bull El grado de retencioacuten de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto de la composicioacuten de la fase estacionaria y de la fase moacutevil
bull El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencioacuten y se considera una propiedad identificativa caracteriacutestica de un compuesto en una determinada fase moacutevil y estacionaria
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
En generalhellip
bull En una cromatografiacutea participan
1 Fase estacionaria
2 Fase moacutevil
3 Muestra
iquestCoacutemo interaccionanEn general una cromatografiacutea se realiza permitiendo que la
mezcla de moleacuteculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria Un segundo medio (la fase moacutevil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a traveacutes de eacutesta para lavar (eluir) a las moleacuteculas en la muestra
HPLCbull La cromatografiacutea de liacutequidos de alta
resolucioacuten es un modo de cromatografiacutea en la cual el proceso de separacioacuten y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la fase moacutevil y una temperatura dada
HPLC
bull Es una teacutecnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basaacutendose en diferentes tipos de interacciones quiacutemicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatograacutefica
HPLC
bull La HPLC representa una de las herramientas maacutes empleadas en el laboratorio analiacutetico moderno
bull La cromatografiacutea es un meacutetodo usado primariamente para la separacioacuten de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases
bull Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anaacutelisis bull Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por
esta teacutecnica
HPLC
bull En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatograacutefica a traveacutes de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequentildeas partiacuteculas redondeadas con ciertas caracteriacutesticas quiacutemicas en su superficie)
bull Esto lo hace mediante el bombeo de liacutequido (fase moacutevil) a alta presioacuten a traveacutes de la columna
bull La muestra a analizar es introducida en pequentildeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones quiacutemicas o fiacutesicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna
bull El grado de retencioacuten de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto de la composicioacuten de la fase estacionaria y de la fase moacutevil
bull El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencioacuten y se considera una propiedad identificativa caracteriacutestica de un compuesto en una determinada fase moacutevil y estacionaria
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
iquestCoacutemo interaccionanEn general una cromatografiacutea se realiza permitiendo que la
mezcla de moleacuteculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria Un segundo medio (la fase moacutevil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a traveacutes de eacutesta para lavar (eluir) a las moleacuteculas en la muestra
HPLCbull La cromatografiacutea de liacutequidos de alta
resolucioacuten es un modo de cromatografiacutea en la cual el proceso de separacioacuten y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la fase moacutevil y una temperatura dada
HPLC
bull Es una teacutecnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basaacutendose en diferentes tipos de interacciones quiacutemicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatograacutefica
HPLC
bull La HPLC representa una de las herramientas maacutes empleadas en el laboratorio analiacutetico moderno
bull La cromatografiacutea es un meacutetodo usado primariamente para la separacioacuten de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases
bull Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anaacutelisis bull Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por
esta teacutecnica
HPLC
bull En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatograacutefica a traveacutes de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequentildeas partiacuteculas redondeadas con ciertas caracteriacutesticas quiacutemicas en su superficie)
bull Esto lo hace mediante el bombeo de liacutequido (fase moacutevil) a alta presioacuten a traveacutes de la columna
bull La muestra a analizar es introducida en pequentildeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones quiacutemicas o fiacutesicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna
bull El grado de retencioacuten de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto de la composicioacuten de la fase estacionaria y de la fase moacutevil
bull El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencioacuten y se considera una propiedad identificativa caracteriacutestica de un compuesto en una determinada fase moacutevil y estacionaria
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
HPLCbull La cromatografiacutea de liacutequidos de alta
resolucioacuten es un modo de cromatografiacutea en la cual el proceso de separacioacuten y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la fase moacutevil y una temperatura dada
HPLC
bull Es una teacutecnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basaacutendose en diferentes tipos de interacciones quiacutemicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatograacutefica
HPLC
bull La HPLC representa una de las herramientas maacutes empleadas en el laboratorio analiacutetico moderno
bull La cromatografiacutea es un meacutetodo usado primariamente para la separacioacuten de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases
bull Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anaacutelisis bull Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por
esta teacutecnica
HPLC
bull En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatograacutefica a traveacutes de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequentildeas partiacuteculas redondeadas con ciertas caracteriacutesticas quiacutemicas en su superficie)
bull Esto lo hace mediante el bombeo de liacutequido (fase moacutevil) a alta presioacuten a traveacutes de la columna
bull La muestra a analizar es introducida en pequentildeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones quiacutemicas o fiacutesicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna
bull El grado de retencioacuten de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto de la composicioacuten de la fase estacionaria y de la fase moacutevil
bull El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencioacuten y se considera una propiedad identificativa caracteriacutestica de un compuesto en una determinada fase moacutevil y estacionaria
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
HPLC
bull Es una teacutecnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basaacutendose en diferentes tipos de interacciones quiacutemicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatograacutefica
HPLC
bull La HPLC representa una de las herramientas maacutes empleadas en el laboratorio analiacutetico moderno
bull La cromatografiacutea es un meacutetodo usado primariamente para la separacioacuten de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases
bull Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anaacutelisis bull Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por
esta teacutecnica
HPLC
bull En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatograacutefica a traveacutes de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequentildeas partiacuteculas redondeadas con ciertas caracteriacutesticas quiacutemicas en su superficie)
bull Esto lo hace mediante el bombeo de liacutequido (fase moacutevil) a alta presioacuten a traveacutes de la columna
bull La muestra a analizar es introducida en pequentildeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones quiacutemicas o fiacutesicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna
bull El grado de retencioacuten de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto de la composicioacuten de la fase estacionaria y de la fase moacutevil
bull El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencioacuten y se considera una propiedad identificativa caracteriacutestica de un compuesto en una determinada fase moacutevil y estacionaria
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
HPLC
bull La HPLC representa una de las herramientas maacutes empleadas en el laboratorio analiacutetico moderno
bull La cromatografiacutea es un meacutetodo usado primariamente para la separacioacuten de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases
bull Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anaacutelisis bull Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por
esta teacutecnica
HPLC
bull En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatograacutefica a traveacutes de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequentildeas partiacuteculas redondeadas con ciertas caracteriacutesticas quiacutemicas en su superficie)
bull Esto lo hace mediante el bombeo de liacutequido (fase moacutevil) a alta presioacuten a traveacutes de la columna
bull La muestra a analizar es introducida en pequentildeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones quiacutemicas o fiacutesicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna
bull El grado de retencioacuten de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto de la composicioacuten de la fase estacionaria y de la fase moacutevil
bull El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencioacuten y se considera una propiedad identificativa caracteriacutestica de un compuesto en una determinada fase moacutevil y estacionaria
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
HPLC
bull En la HPLC el compuesto pasa por la columna cromatograacutefica a traveacutes de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequentildeas partiacuteculas redondeadas con ciertas caracteriacutesticas quiacutemicas en su superficie)
bull Esto lo hace mediante el bombeo de liacutequido (fase moacutevil) a alta presioacuten a traveacutes de la columna
bull La muestra a analizar es introducida en pequentildeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones quiacutemicas o fiacutesicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna
bull El grado de retencioacuten de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto de la composicioacuten de la fase estacionaria y de la fase moacutevil
bull El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencioacuten y se considera una propiedad identificativa caracteriacutestica de un compuesto en una determinada fase moacutevil y estacionaria
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Disolventes HPLC
bull Los disolventes maacutes utilizados son- Agua- Metanol- Acetonitrilobull El agua puede contener tampones sales o
compuestos como el aacutecido trifluoroaceacutetico que ayudan a la separacioacuten de los compuestos
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Caracteriacutesticas HPLC
bull Selectividadbull Reproducibilidadbull Sensibilidadbull Rapidez
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Paraacutemetros HPLC
bull Naturaleza de la fase estacionariabull Tamantildeo de partiacuteculabull Eluyente (composicioacuten y flujo)bull Detectorbull Tamantildeo de porobull Presioacuten de la bomba
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
TIPOS DE HPLC
bull Fase Directa separa compuestos en base a su polaridad
- Fase estacionaria polar- Fase moacutevil de baja polaridad- El compuesto de intereacutes a analizar es muy polarbull Fase Reversa- Fase estacionaria de polaridad baja- Fase moacutevil de polaridad alta- El compuesto de intereacutes a analizar es apolar
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
TIPOS DE HPLCbull Exclusioacuten molecular ograve filtracioacuten en gel- Separa las partiacuteculas de la muestra en funcioacuten de su tamantildeo - Uacutetil para la determinacioacuten de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteiacutenas purificadasbull Intercambio ioacutenico- La retencioacuten se basa en la atraccioacuten electrostaacutetica entre los
iones en solucioacuten y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria
- Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Tipos de HPLCbull Bioafinidad- Se basa en la capacidad de las sustancias
bioloacutegicamente activas de formar complejos estables especiacuteficos y reversibles
- La formacioacuten de estos complejos implica la participacioacuten de fuerzas moleculares entre las partiacuteculas de la muestra y la fase estacionaria
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Mecanismos de interaccioacuten en HPLC
bull Adsorcioacuten superficialbull Particioacutenbull Intercambio ioacutenicobull Exclusioacuten molecular
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Adsorcioacuten superficial
bull La fase estacionaria es soacutelida La separacioacuten se logra por las diferencias en solubilidad (en fase moacutevil) y de retencioacuten por adsorcioacuten (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Adsorcioacuten superficial
bull Fases estacionarias maacutes comunes siacutelica y aluacuteminabull Tanto las moleacuteculas de solutos como de disolvente sonatraiacutedas hacia los lugares activos polares de la faseestacionariabull Unos solutos seraacuten maacutes atraiacutedos que otros por la faseestacionaria y asiacute se lograraacute su migracioacuten diferencialbull Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elucioacuten y la selectividad adecuadas Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro maacutes activo(acetona cloruro de metilo etc)
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Particioacuten
bull La separacioacuten se basa en el reparto o distribucioacuten de los solutos entre una fase moacutevil liacutequida y otra estacionaria inmiscible soportada sobre un soacutelido inerte
bull La discriminacioacuten se produce por diferencias de solubilidadbull Las especies maacutes retenidas seraacuten las que presenten mayor
afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase moacutevil (eluyente)
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacuten- Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polar- Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polar
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Fase moacutevil
bull Si es un gas Modalidad cromatograacutefica gaseosa
bull Si es un liacutequido Cromatografiacutea liacutequida bull Cromatografiacutea en capa delgadabull Cromatografiacutea liacutequida en columna abiertaHPLC
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Alta pureza (calidad HPLC)bull Inactividad frente a la fase estacionariabull Baja viscosidadbull Compatibles con la muestrabull Facilitar la recuperacioacuten de la muestrabull Compatibilidad con el sistema de deteccioacutenbull Seguacuten su composicioacuten variacutee o no con el tiempobull Elucioacuten isocraacuteticabull Elucioacuten en gradiente
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC
bull La desgasificacioacuten reduce el riesgo de formacioacuten de burbujas en la columna o en el detector
bull Posibilidadesbull Desplazamiento con un gas menos soluble (He)bull Aplicacioacuten de vaciacuteobull Sonicacioacutenbull Calentamiento
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Cromatografiacutea de particioacuten
bull Existen dos modos baacutesicos de operacioacutenbull Fase normal Cuando se trabaja con fase
estacionaria polar y fase moacutevil no polarbull Fase reversa Cuando se emplea una fase
estacionaria no polar y fase moacutevil polarbull Inicialmente tuvo maacutes auge la fase normal pero en
la actualidad son maacutes comunes los meacutetodos cromatograacuteficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofiacutelica delas muestras de mayor intereacutes (cliacutenico contaminacioacuten alimentos)
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Seguacuten empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucioacuten de bandas y el tiempo de anaacutelisis
bull Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografiacutea de adsorcioacuten y particioacuten
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Principales fases moviles en HPLC
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
bull Tanto fase estacionaria como fase moacutevil son de naturaleza ioacutenica
bull La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Se emplean rellenos en los cuales la partiacutecula estaacute constituida por un poliacutemero o por siacutelica gel
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Se emplea para el anaacutelisis de todo tipo de iones (inorgaacutenicos y orgaacutenicos)
bull Las moleacuteculas intercambiadoras se ligan a soportes especiacuteficos
bull El material intercambiador de la fase estacionaria es de diaacutemetro de partiacutecula pequentildeo (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 ndash 10-3 meqg)
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Cromatografiacutea de exclusioacuten molecular
bull Emplea materiales de porosidad controlada que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moleacuteculas de la muestra seguacuten un orden decreciente de tamantildeo molecular Si se dispone de estaacutendares apropiados de peso molecular adecuado puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminacioacuten entre los solutos seguacuten su tamantildeo
bull 1048707 Los analitos de mayor tamantildeo no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos viajando con la fase moacutevil en el frente de la misma
bull Se muestra especialmente uacutetil para determinar el rango molecular de poliacutemeros proteiacutenas etc
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Equipos
bull Integrados Cada una de sus partes estaacuten reunidas en un gabinete y su intercambio o conexioacuten con otros componentes es difiacutecil
bull Modulares Los moacutedulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo seguacuten las necesidades sino aumentar su complejidad seguacuten esa necesidad variacutee
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Estaacuten formados porbull Solventebull Bomba de alta presioacuten bull Inyectorbull Columnabull Detector bull Graficador
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Solventes
bull Alto poder solubilizante de las muestrasbull Baja reactividadbull Adecuado punto de ebullicioacutenbull Baja viscosidadbull Seguridadbull Alto grado de Pureza
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Propiedades quiacutemicas estas propiedades de la fase moacutevil son las que establecen el tipo y fuerza de interaccioacuten entre el solvente y la muestra en consecuencia son determinantes de la separacioacuten
bull Iacutendice de polaridad Resultante de todas las propiedades quiacutemicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interaccioacuten de los solventes frente a solutos polares
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Fuerzas dispersivas Indican la polarizabilidad de una moleacutecula y aumentan con el nuacutemero de electrones de la misma y con la distancia de eacutestos al nuacutecleo
bull Capacidad aceptora o donadora de protones Medida de la capacidad de las moleacuteculas de intercambiar protones
bull Momento dipolar Se refiere a la capacidad de una moleacutecula para formar dipolos permanentes y estaacute estrechamente relacionado con la constante dieleacutectrica del solvente
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Las fases moacuteviles estaacuten constituiacutedas por mezclas de solventes polares en general agua y un modificador orgaacutenico con o sin el agregado de aditivos
bull Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa
bull El agua destilada y desionizada puede encontrar varias limitaciones en HPLC La razoacuten de esto reside en la presencia de sustancias orgaacutenicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Solventes comunesbull Metanol HPLCbull Acetonitrilo HPLCbull Tetrahidrofurano HPLCbull Dioxano HPLCbull Sales de sodio y potasio
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
BOMBASbull Presioacuten estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm = 14696 psibull Flujo libre de pulsacionesbull Amplio rango de flujos (01 a 10
mLmin)bull Control exactitud y
reproducibilidad del flujobull Componentes quiacutemicamente
inertes y resistentes a la corrosioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
SISTEMAS DE INYECCIOacuteNbull Se emplean vaacutelvulas inyectoras de volumen
(loop) constantebull Pueden ser manuales o automaacuteticasbull Para variar el volumen de inyeccioacuten se debe
cambiar el ldquolooprdquo correspondientebull Se debe evitar la entrada de burbujas en el
sistema de inyeccioacuten
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
COLUMNAS
bull Gran avance en la uacuteltima deacutecada por el progreso en la tecnologiacutea de rellenos y columnas
bull Rellenos maacutes uniformes y de menor tamantildeo
bull Fases quiacutemicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolucioacuten
bull Mejora en los meacutetodos de empaquetado
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Las columnas constan de -Cuerpo ndash Normalmente de acero inoxidable 316 con diaacutemetro interno de 26 a 3 mm o 46 a 5 mm -Relleno ndash El material de relleno de una columna estaacute constituido por partiacuteculas definidas por una serie de caracteriacutesticas (morfologiacutea tamantildeo porosidad estructura quiacutemica)bull Al disminuir el tamantildeo del relleno aumenta la
eficiencia pero tambieacuten la presioacuten de trabajo
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Fase Normalbull Siacutelicabull Aluacuteminabull Amino (-NH2)bull Nitrilos (-CN)bull Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
bull C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3)bull C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3)bull C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3)
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Influencia de la longitud de la columna y del tamantildeo de
partiacutecula en la duracioacuten del cromatograma
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
DETECTORES
bull Cualquier propiedad fiacutesica o quiacutemica que se pueda medir en la disolucioacuten podriacutea usarse como meacutetodo de deteccioacuten
bull Los detectores en HPLC no son destructivos
Se pueden clasificar enDetectores que miden una propiedad de
la fase moacutevil (Detector de Indice de Refraccioacuten)
Detectores que miden una propiedad de los solutos (Detector de Fluorescencia Detector Ultravioleta )
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Principales detectores empleados en HPLC
bull UVVisbull Fotodiodosbull Iacutendice de refraccioacutenbull Fluorescenciabull Conductividadbull Dispersioacuten de luzbull Espectrometriacutea de masas
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Detector UVndash Detector de Longitud de Onda Fija ndash Detector de Longitud de Onda Variable ndash Detector de Arreglo de Diodos
bull Detector de Iacutendice de Refraccioacuten ndash Tipo Deflexioacuten ndash Tipo Fresnel
bull Detector de Fluorescencia ndash Este detector solamente puede detectar compuestos que
tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacioacuten bull Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
ndash Seguacuten la Fuente de Excitacioacuten ndash Seguacuten el sistema oacuteptico
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
DETECTOR UVVIS
bull Para sustancias que absorben radiacioacuten UVVIS
bull El maacutes usadobull Con laacutemparas de deuterio xenon o wolframiobull Desde 190 a 900 nm
Camino oacuteptico de la microcelda de un detector UVVISLas celdas ordinarias tienen 05 cm de camino oacuteptico y contienen 8 μL de liacutequido
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
DETECTOR FOTODIODOSbull Permite registrar la absorbancia simultaacutenea en
todo el rango UVVISbull La muestra es atravesada por luz blanca (todas
las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos En cada diodo incide una λ diferente que manda la informacioacuten al sistema de anaacutelisis de datos
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
DETECTOR DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbull Van a medir variaciones en el iacutendice de refraccioacuten del eluato con respecto al del disolvente puro
bull Soacutelo se pueden usar si la elucioacuten es isocraacutetica
bullResponden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad
bull Son muy sensibles a las variaciones de temperatura
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE IacuteNDICE DE REFRACCIOacuteNbullEl disolvente pasa a traveacutes de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad
bullLos dos compartimentos estaacuten separados por una placa de vidrio montada a un aacutengulo tal que si las dos disoluciones difieren en iacutendice de refraccioacuten se produce una desviacioacuten del haz incidente
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
DETECTOR DE FLUORESCENCIAbull Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes
bullSon de alta sensibilidad
bullNo se ven interferidos por los disolventes al no tener eacutestos naturaleza fluorescente
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
bull Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta
bullEmpleados fundamentalmente en cromatografiacutea de intercambio ioacutenico
Inconvenientes
bull Baja sensibilidad
bullSensibles a impurezas de la fase moacutevil
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Cuando los iones se mueven en la celda del sensor la impedancia eleacutectrica entre los electrodos cambia fuera de la sentildeal de equilibrioldquo Desde el puente se alimenta a un circuito electroacutenico adecuado
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
bullVaacutelido para aquellos solutos que sean claramente menos volaacutetiles que la fase moacutevil
bullEl eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partiacuteculas soacutelidas que entran en la zona de deteccioacuten
Las partiacuteculas se detectan por la luz que procede de un diodo laacutesery llega al fotodetector por dispersioacuten
bullSoacutelo tampones volaacutetiles en la fase moacutevil
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIOacuteN DE LUZ
Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequentildeas gotas Estas gotas se deja evaporar dejando los solutos como las partiacuteculas finas suspendidas en el gas de atomizacioacuten
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
APLICACIONES DEL METODO HPLC
Cuantificacioacuten de aminoaacutecidos en plasma
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
Cromatograma
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
iquest QUE ES UN CROMATOGRAMA
Es un grafico de la sentildeal de concentracioacuten de un analiacuteto en funcioacuten del tiempo
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
CONSTANTES DE DISTIBUCION
Es la relacioacuten entre la concentracioacuten molar del soluto en la fase estacionaria y se concentracioacuten molar en la fase moacutevil
Kc=CsCm
En donde Cs es la concentracioacuten molar de soluto en la fase moacutevil y Cm es la concentracioacuten del mismo en la fase estacionaria
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
TIEMPO DE RETECION
El tiempo requerido para que el analiacuteto sea detectado despueacutes de ser inyectado se conoce como tiempo de retencioacuten y se representa mediante el siacutembolo Tr El analiacuteto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migracioacuten de la fas moacutevil y es importante para identificar picos
tiempo
sentildeal
Tr= Ts + Tm
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
FACTOR DE RETENCION
Es un paraacutemetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migracioacuten de solutos en columnas
Ka= TsTm
FACTOR DE SELCTIVIDAD
El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION
![HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY [HPLC]€¦ · Get All Pharmaceutical Guidelines on Email- info@pharmaguideline.com High Performance Liquid Chromatography (HPLC): Introduction:](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/5ea7ad7bb7d7fd4ff1263c8a/high-performance-liquid-chromatography-hplc-get-all-pharmaceutical-guidelines.jpg)
![[PPT]Liquid Chromatography Fundamentals - Theory · Web viewLiquid Chromatography Fundamentals - Theory Keywords HPLC, LC, HPLC theory, HPLC fundamentals, teaching HPLC, learning](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/5b1aa2c67f8b9a3c258de481/pptliquid-chromatography-fundamentals-theory-web-viewliquid-chromatography.jpg)
![What is HPLC? High Performance Liquid Chromatography High Pressure Liquid Chromatography (usually true] Hewlett Packard Liquid Chromatography (a joke)](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/56649c855503460f9493c784/what-is-hplc-high-performance-liquid-chromatography-high-pressure-liquid-chromatography.jpg)
