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U.Albrecht BC1
Hämoglobin: Proteinfunktion und Mikrokosmos (Voet Kapitel 9)
1. Funktion des Hämoglobins
2. Struktur und Mechanismus
3. Anormale Hämoglobine
4. Allosterische Regulation
U.Albrecht BC1
Strukturaufklärung des Pottwal-Myoglobinswurde 1959 von John Kendrew gemacht. Später wurde die Struktur verschiedener Spezies und auch von Hb Mutationen durchgeführt. Das Hämoglobin wurde zum besterforschten Proteinüberhaupt.
Myoglobin aus 8 Helices (A-H). ellipsoidHelices zwischen 7 und 26 AS langmeistens α-HelicesEnden der Helices A, C, E und G bilden 310-Helix
Bezeichnung von Resten:B5 = 5. AS in B-Helix (N-term nach C-term)FG3= 3. AS im Interhelicalen Segment zw. F u. GNA = nicht helicales aminoterminales SegmentHC= nicht helicales carboxyterminales Segment
A. Struktur von Myoglobin
Manchmal auch kombinierte Bezeichnung Glu EF6(83)= Glu 83 im interhelicalen Segment EF 6. AS.
U.Albrecht BC1Räumliche Darstellung des OxyMb
Häm in hydrophobe Tasche einge-bettet.
proximales His
distalesHis
H-Brücke
DesoxyMb -> sechste koord. Stellevon Fe(II) unbesetzt. Fe(II) rückt auch weiter aus Porphyrinebene
Distales His senkt Autooxidationsrateund erhöht Sauerstoffaffinität -> nicht ersetzbar durch andere ASFe durch O2 Bindung vor Oxidation ge-schützt -> paradoxOxidation von Häm-Fe in Desoxyformjedoch Säurekatalysiert. Protonen werdendurch Fe reduziert und diese reduzieren O2 zu Superoxid.Das distale His wirkt als Protonenfalle und schützt somit Fe vor oxitation.
Die Sauerstoffsättigung verändert dieKonformation von Mb nur geringfügig.Struktur von Oxy und Desoxy Mb gleich.
U.Albrecht BC1B. Struktur von Hämoglobin
Hämoglobin = sphäroides Tetramer, besteht aus αβ−Protomeren. 2 zählige Rotationsachse. Untereinheiten besetzen die Ecken eines Tetraeders -> verzerrte D2-Symmetrie.
α und β Untereinheiten (UE) sind strukturell sehr ähnlich (auch zu Mb)obwohl nur 18% AS identisch
α1
α2β1
β2
Nicht identische UE im Hb aus-geprägte Wechselwirkungen
α1−β1 Kontakt 35 AS
α1−β2 Kontakt nur 19 AS
αβ-Heterodimere -> hydrophobe WW
Homodimere -> keine WW da durch Flüssigkeit gefüllten Kanal getrennt
(see Model 1HBB Deoxy, 1BBB Oxyfilm)
U.Albrecht BC1Unterschiedliche Quartärstruktur von Desoxy- und Oxy- Hämoglobin
Desoxy-Form = T-Zustand Oxy-Form = R-Zustand
r-ZustandTertiärstrukturUE
t-ZustandTertiärstrukturUE
DesoxyHb Kristall zerplatzt an der Luft
α1−β2 Kontakt nur 19 AS dagegen α1−β1 Kontakt 35 AS -> stärkerer Kontakt unverändert d.h.Veränderung entlang α1−β2 Kontakt -> Verdrehung von α1−β1 Dimer um ca. 15° gegen α2−β2Dimer
β2β2α1
α1
β1β1
α2 α2
Oxygenierung verengt Kanal
U.Albrecht BC1
Blick von rechts auf vorherige Darstellung ->α1−β1 Dimer gefärbt dargestelltα2−β2 Dimer nur Umriss
Durch Oxygenierung verschieben sich die 2α−β Dimere gegeneinander
OxyHb ist kompakter als DesoxyHb
Beachte:
Lage von His FG4(97)β (schwarz) relativ zugelb markierten AS.
U.Albrecht BC1C. Mechanismus der Kooperativität bei der Sauerstoffbindung
Sauerstoffbindung an ein Häm beeinflusst Bindungsaffinität von Sauerstoff an anderen Häm Gruppenim Hämoglobin. Häm Gruppen zu weit voneinander entfernt -> keine direkte Beeinflussung -> WWwird über den Proteinteil vermittelt.Basierend auf Röntgenstrukturanalysen -> Perutz-Mechanismus
Häm-Gruppe und Umgebung inα−Untereinheit.
in β-Untereinheit versperrt ValE11 die O2-Bindungsstelleaber nicht in α−Untereinheiten.
t-ZustandproximalesHis
distales His
F-Helix
U.Albrecht BC1
Einwandern von Fe(II) in Porphyrin-Ebene löst T-> R Transformation aus
t-Zustand Fe(II) 60 pm aus Porph. Ebene.-> pyramidale durchgebogen
O2-Bindung ändert Elektr.konfig. vonFe -> Fe-N porph.-Bindung kontrahiert-> Fe in Phorphyrinebene und O2
Bindung
F-Helix muss Lage verändern, damit HisF8 dem Porphyrinring nicht zunahe kommt. Dadurch wird Fe- O2-Bindung stabilisiert.
U.Albrecht BC1
Desoxy-Form = T-Zustand Oxy-Form = R-Zustand
Die α1−β2 und α2−β1 Kontakte haben zwei stabile Positionen
α1α1β2β2
U.Albrecht BC1
Versetzen von 3 Seitenketten. Äquivalenter Satz von H-Brücken. Wie ein Schalter, nur2 Zustände.
Netzwerk von ionischen WW und H-Brücken am Carboxy-ende der α und β Untereinheiten.
Alle diese Bindungen werden beim T-> R Übergang geöffnet
deprotoniert beiBohr effekt
T-Zustand durch Ionenbindungen stabilisiert, brechen auf bei Übergang zu R-Zustand
U.Albrecht BC1
R-Zustand durch Bindung von Sauerstoff stabilisiert.Warum T-Zustand aber stabiler als R-Zustand?
C-terminale AS sind im R-Zustand flexibel im T-Zustandaber nicht, sie sind über Ionenbrücken stabilisiert.
U.Albrecht BC1
Die Kooperativität der Sauerstoffbindung an Hämoglobin ergibt sich aus dem T -> R Übergang
Bindung von Sauerstoff erfordert eng abgestimmte Molekülbewegungen:
1) Fe(II) gleitet nur in Porphyrinringebene wenn gleichzeitig sich die räumliche Orientierung vom proximalen His sich ändert.
2) Das proximale His ist fest mit Nachbarn verbunden -> Neuorientierung nur möglich wenn sich F-Helix über Porphyrinebene bewegt.
3) F-Helix kann sich nur dann bewegen wenn α1-β2 und α2-β1 Kontakte sich um eine Windung verschieben
4) Die Unbeweglichkeit der α1-β1 und α2-β2 Kontakte erzwingt die Konformationänderung in 3)
-> Untereinheiten oder Dimere können Konformation nicht unabhängig voneinander ändern. Da nur 2 stabile α1-β2 (bzw. α2-β1) Kontakte möglich -> Quartärstruktur von Hb nur in 2 ZustandsformenWas heisst Kooperativität? 1. UE bindet O2 muss aber in t-Zustand verharren da andere UE ohne O2 imt-Zustand. Je mehr O2 gebunden desto höher O2 Affinität da UE im r-Zustand.
U.Albrecht BC1Sigmoidale O2-Bindungskurve von Hbist Überlagerung der Kurven von R- und T-Zustand
Freie Enthalpie des Hb in R- und T- Zustand als Funktiondes Sättigungsgrades (YO2)
Sättigungsgrad in Abhängigkeit des SauerstoffPartialdruckes.
D. Untersuchung des Perutz Mechanismus
Umwandlung von T zu R-Zustand kann nicht „gefilmt“ werden. -> Perutz-Mechanismus nicht bewiesen. Es gibt jedoch gute experimentelle Hinweise das der Mechanismus stimmt.
1) Verändert man AS am Carboxyende der Untereinheiten die an Ionenbindungen beteiligt sind so wird der T-Zustand instabil. Kristallisiert man ein solch midifiziertes DesoxyHb hat es eine Konformation wie OxyHb.
2) Inositolhexakisphosphat (IHP) bindet stärker als BPG an DesoxyHb und stabilisiert T-Zustand -> es zieht also das proximale His von Porphyrinebene weg. Dagegen bindet NO stärker an OxyHb als O2 -> NO zieht Fe stark in Porphyrinringebene.
Werden nun gleichzeitig IHP und NO an Hämoglobin gebunden -> Entgegengesetzte Kräfte ziehen an His -Fe Bindung die grösser sind als normal -> Bindung bricht, was spektorskopisch Nachgewiesen werden kann.
U.Albrecht BC1
E. Ursprung des Bohr-EffektesU.Albrecht BC1
Bohr-Effekt= Abspaltung von H+ aus Hb bei Bindung von Sauerstoff.
Reaktion von Cyanat mit Aminogruppen:
Läuft nur ab bei terminalen Aminogruppen die pK von 8haben. Bei physiol. pH Lys pK von 10.8 reagiert nicht.Carbamyloirung destabilisiert T-Form
T-Form bindet mehr Protonen weil Chlorid Polarität derN-terminalen Aminogruppe erhöht -> pK steigt
F. Strukturvoraussetzungen für die BPG-BindungU.Albrecht BC1
BPG senkt Sauerstoffaffinität des Hb
verbindet b UE über Salzbrücken und stabilisiertsomit T-Form
Bei Übergang in R-Form wird BPG herausge-drückt da sich Kanal verengt.
Fötales Hb (HbF) hat anstelle von HisH143 einungeladenes Serin. BPG kann DesoxyHb nichtstabilisieren im Fötus -> höhere Sauerstoff-affinität.
Salz- und H-Brücken