Upload
voxuyen
View
233
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Date: Mercredi le 2 février 2011Heure: 9h00 à 12h00Durée: 3 heuresLieu: salle de conférence du 3e étage (T3-61),bloc T du Centre de recherche du CHUL-CHUQ
PHS 7013 - Génomique humaineResponsable du cours: professeure Francine Durocher
Section: Séquençage de nouvelle générationResponsable de la section: professeur Jacques Corbeil
Séquençage de nouvelle génération
Étudiant au doctorat -- Directeur: professeur Jacques Corbeil -- Codirecteur: professeur François LavioletteS.B. n'est pas Auxiliaire d'enseignement à l'Université Laval
Faculté de médecine, Université Laval
Préparation et présentation du cours: Sébastien Boisvert
La structure de l'ADN
Watson JD, Crick FH.Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid.Nature. 1953 Apr 25;171(4356):737-8. http://www.nature.com/nature/dna50/archive.html
© 2011 Nature Publishing Group
Technologies parallèles des acides nucléiques
Détection
Quantification
Décodage
Plusieurs cibles sont détectées ou quantifiées ou décodées en parallèle
Jian-Bing Fan, Mark S. Chee & Kevin L. GundersonHighly parallel genomic assaysNature Reviews Genetics 7, 632-644 (August 2006) | doi:10.1038/nrg190http://www.nature.com/nrg/journal/v7/n8/full/nrg1901.html
Vidéo sur les puces Affymetrix
Durée: 1 minute, 16 secondesLangue: anglais
Source:
tpaparountas sur YouTubehttp://www.youtube.com/watch?v=MuN54ecfHPw
Vidéo éducatif
Pourquoi séquencer l'ADN?
Expliquer et guérir les maladies génétiques
Étudier l'évolution
Étudier la spéciation
Lier le protéome au génome
Étudier l'épissage
Étudier la variation des génomes
Quantifier l'expression des ARNs messagers en séquençant l'ADN complémentaire
Idées générales
• Pour séquencer un polymère, on doit détecter le monomère à chaque position
• L'ADN a 4 monomères
• La méthode intuitive: détecter le monomère à chaque position itérativement
exemple: ATTCGGGACTAGGGCAT
• La méthode par compression: détecter le “déroulement de la séquence”
exemple: 1A 2T 1C 3G 1A 1C 1T 1A 3G 1C 1A 1T
TerminateurQuatre réactions de séquençage – unepour chaque base
deoxynucléotides and dideoxynucléotides (terminateurs)
Fin aléatoire de la polymérisation
Pour chaque base (A,T, C et G), nous avons toutes les sous-chaînes finissant par celle-ci,triées par longueur (sur gel)
L'analyse pénible est faite manuellement
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463-7.http://www.pnas.org/content/74/12/5463.abstract
Copyright ©2011 by the National Academy of Sciences
Cette méthode était fastidieuse
AutomatisationBasée sur la méthode de Sanger
Les réactions sont combinées
électrophorèse capillaire & fluorescence
Réception automatique desdonnées & analyse automatique
Commercialisée par Applied Biosystems
Le séquençeur du CRCHUL est comme ça
Smith LM et al..Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.Nature. 1986 Jun 12-18;321(6071):674-9.http://dx.doi.org/10.1038/321674a0
Le problème principale de cette méthode est la présence de terminateurs
Une molécule d'ADN peut être vue comme une chaîne de caractères
Avec cette méthode, il faut générer dans un tube toutes les sous-chaînes de caractères
Vidéo sur la méthode de Sanger
Durée: 1 minute, 7 secondesLangue: anglais
Source:
PHG Foundationhttp://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8
Vidéo éducatif
Pyrosequençage
Pas de terminaison aléatoire, Séquençage par synthèse
Détection lors de l'incorporation des nucléotides
Problème majeur avec les homopolymères (AAAA versus AAAAA, 4A vs 5A)
Ronaghi M, Uhlén M, Nyrén P.A sequencing method based on real-time pyrophosphate.Science. 1998 Jul 17;281(5375):363, 365http://www.sciencemag.org/content/281/5375/363.long
© 2011 American Association for the Advancement of Science
Avec le pyroséquençage, il n'y a pas de terminateurs
La nouvelle génération
Jay Shendure & Hanlee JiNext-generation DNA sequencingNature Biotechnology 26, 1135 - 1145 (2008) http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n10/full/nbt1486.html
Lecture parallèle de l'ADN
© 2011 Nature Publishing Group
Tout comme la technologie d'Affymetrix, les nouvelles technologies de séquençage utilisent des matrices d'échantillons
En général, les nouvelles technologies de séquençage filment les réactions qui se déroulent en parallèle
Les images sont analysées par ordinateur et on obtient beaucoup de données génétiques
Version parallèle
Basée sur une technologie à flux sur cellule
Developpée by 454, acheté by Roche
Margulies M et al.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.Nature. 2005 Sep 15;437(7057):376-80.http://www.nature.com/nature/journal/v437/n7057/abs/nature03959.html
© 2011 Nature Publishing Group
Avantage de la technologie 454: longue lectures (430)
Désavantage: beaucoup d'erreurs dans les homopolymères
Vidéo sur la technologie 454
Durée: 4 minutes, 33 secondesLangue: anglais
Source:
DaftPunkCA sur YouTubehttp://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc
Vidéo éducatif
Par ligation
Pas de polymérase
Utilise une ligase
Belle technologie, compliquée
Applied Biosystems SOLiD
Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, Lin X, McCutcheon JP, Rosenbaum AM, Wang MD, Zhang K, Mitra RD, Church GM.Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome.Science. 2005 Sep 9;309(5741):1728-32.http://www.sciencemag.org/content/309/5741/1728.abstract
© 2011 American Association for the Advancement of Science
Stephen M. Rumble, Phil Lacroute, Adrian V. Dalca, Marc Fiume, Arend Sidow, Michael BrudnoSHRiMP: Accurate Mapping of Short Color-space ReadsPLoS Comput Biol 5(5): e1000386. doi:10.1371/journal.pcbi.1000386http://www.ploscompbiol.org/article/info:doi/10.1371/journal.pcbi.1000386
L'espace de couleursLa technologie SOLiD génère des lectures colorées
Exemple: vert veut dire A si le nucléotide précédent était un C
© 2009 Rumble et al., Creative Commons Attribution License
Vidéo sur la technologie SOLiD
Durée: 4 minutes, 45 secondesLangue: anglais
Source:
KingofBiotech sur YouTubehttp://www.youtube.com/watch?v=nlvyF8bFDwM
Vidéo éducatif
Le retour des terminateurs
Developpée par Solexa
Achetée par Illumina
Terminateurs réversibles
Pas de problème avec les homopolymères
Séquences en paires
Succès commercial
Bentley DR, et al.Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature. 2008 Nov 6;456(7218):53-9.http://www.nature.com/nature/journal/v456/n7218/abs/nature07517.html
© 2011 Nature Publishing Group
Illumina a environ 70% du marché de l'analyse génétique
Madalina IacobIllumina: Shining In Dreary Times Forbes, FastTech, 01.29.09, 06:00 PM ESThttp://www.forbes.com/2009/01/29/illumina-biotech-equities-technology-breakthroughs-0129_illumina.html
Bentley DR, et al.Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature. 2008 Nov 6;456(7218):53-9.http://www.nature.com/nature/journal/v456/n7218/abs/nature07517.html
Séquences en pairesFabrication des librairies en paires
a petites distances
d longues distances
© 2011 Nature Publishing Group
Permet d'obtenir des paires de séquences dont la distance qui les séparent est approximativement connue
Vidéo sur la technologie d'Illumina
Durée: 1 minute, 37 secondesLangue: anglais
Source:
Aidan Flynn sur YouTubehttp://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk
Vidéo éducatif
Une molecule
Une molécule à la fois
Developpée par Helicos
Harris TD et al.Single-molecule DNA sequencing of a viral genome.Science. 2008 Apr 4;320(5872):106-9.http://www.sciencemag.org/content/320/5872/106.short
© 2011 American Association for the Advancement of Science
Vidéo sur la technologie d'Hélicos
Durée: 4 minutes, 2 secondesLangue: anglais
Source:
WIRED sur YouTubehttp://www.youtube.com/watch?v=TboL7wODBj4
Vidéo éducatif
En temps réel
Le décodage est fait pendant que la polymérase fait son travail
Developpée par Pacific Biosciences
Eid J et al.Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules.Science. 2009 Jan 2;323(5910):133-8.http://www.sciencemag.org/content/323/5910/133.abstract
© 2011 American Association for the Advancement of Science
Vidéo sur la technologie de Pacific Biosciences
Durée: 4 minutes, 4 secondesLangue: anglais
Source:
Pacific Bioscienceshttp://www.pacificbiosciences.com/sites/default/files/video_gallery/Pacbio%20Lg.flv
Vidéo éducatif
Ion Torrent
La technologie de Ion Torrent
Utilise des semi-conducteurs, nanotechnologie
Achetée par Life Technologies (Life Technologies = Applied Biosystems + Invitrogen)
Vidéo sur la technologie d'Ion Torrent
Durée: 2 minutes, 36 secondesLangue: anglais
Source:
IonTorrent sur YouTubehttp://www.youtube.com/watch?v=yVf2295JqUg
Vidéo éducatif
Daniel Branton et al.The potential and challenges of nanopore sequencingNature Biotechnology 26, 1146 - 1153 (2008) doi:10.1038/nbt.1495http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n10/full/nbt.1495.html
Séquençagepar
nanopore
© 2011 Nature Publishing Group
Illumina et Oxford Nanopore
2008
Oxford Nanopore signe une attente exclusive avec Illumina pour la distribution des machines
Source: WIRED
12 janvier 2009
Illumina a pris une participation de 18,0 millions de dollars dans Oxford Nanopore
Source: http://investor.illumina.com/
1 février 2010
Illumina joint un investissement de 28,0 millions de dollars dans Oxford Nanopore
Source: Xconomy
Vidéo éducatif
Vidéo sur la technologie de Oxford Nanopore
Durée: 3 minutes, 20 secondesLangue: anglais
Source:
Oxford Nanopore sur YouTubehttp://www.youtube.com/watch?v=HbjAMJehSlg
Le déluge
Nicole RuskTorrents of sequenceNature Methods 8, 44 (2011) doi:10.1038/nmeth.f.330http://www.nature.com/nmeth/journal/v8/n1/full/nmeth.f.330.html
Il y a plusieurs technologies à surveiller en 2011
© 2011 Nature Publishing Group
Deux types d'analyse
Paul Flicek & Ewan BirneySense from sequence reads: methods for alignment and assembly.Nature Methods 6, S6 - S12 (2009) http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n11s/abs/nmeth.1376.html
•Assemblage avec référence•Assemblage sans référence
Enrichir des régions
Andreas Gnirk et al.Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencingNature Biotechnology 27, 182 - 189 (2009) | doi:10.1038/nbt.1523http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n2/abs/nbt.1523.html
© 2011 Nature Publishing Group
Lorsque l'on n'est pas intéressé par tout le génome
Sélectionner des régions d'intérêt
Les enrichir
Les séquencer
Analyses en génomique humaine
Surtout avec une référence: la séquence du génome humain
Avec ou sans enrichissement
La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est une méthode d'enrichissement !
Sarah B. Ng et al.Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomesNature 461, 272-276 (10 September 2009) | doi:10.1038/nature08250http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7261/full/nature08250.html
Capturer et
séquencer les exons
© 2011 Nature Publishing Group
Seulement les variations dans les exons sont étudiées
The 1000 Genomes Project ConsortiumA map of human genome variation from population-scale sequencingNature 467, 1061–1073 (28 October 2010) doi:10.1038/nature09534 http://www.nature.com/nature/journal/v467/n7319/full/nature09534.html
1000 genomes humains
© 2011 Nature Publishing Group
Cole Trapnell & Steven L SalzbergHow to map billions of short reads onto genomesNature Biotechnology 27, 455 - 457 (2009) doi:10.1038/nbt0509-455http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n5/abs/nbt0509-455.html
Assemblageavec une référence
Chaque lecture est placée à la bonne place sur le génome humain en utilisant une sorte de table des matières
Deux algorithmes principaux:
•Graines espacées•Burrows-Wheeler
© 2011 Nature Publishing Group
Assemblagesans uneréférence
Paul Flicek & Ewan BirneySense from sequence reads: methods for alignment and assembly.Nature Methods 6, S6 - S12 (2009) http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n11s/abs/nmeth.1376.html
On trouve des chevauchements petits entre les lectures d'ADN et on construit un consensus
© 2011 Nature Publishing Group
Vidéo sur le séquençage “shotgun”
Durée: 59 secondesLangue: anglais
Source:
HHMIhttp://www.youtube.com/watch?v=vg7Y5EeZsjk
Vidéo éducatif
Ewan BirneyAssemblies: the good, the bad, the uglyNature Methods 8, 59–60 (2011) doi:10.1038/nmeth0111-59http://www.nature.com/nmeth/journal/v8/n1/abs/nmeth0111-59.html
Erreurs d'assemblage
“The low cost of short-read sequencing has motivated the development of de novo assemblies from only short-read data; impressively, assemblies for large mammalian genomes are now available. However, this is still a developing field, and these de novo assemblies have many artifacts, as do all de novo assemblies.
” -- Ewan Birney
RNA-Seq
Zhong Wang, Mark Gerstein & Michael SnyderRNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomicsNature Reviews Genetics 10, 57-63 (January 2009) | doi:10.1038/nrg2484http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n1/abs/nrg2484.html
Quantifier l'expression des gènes en utilisant le séquençage à haut débit
© 2011 Nature Publishing Group
Séquençage direct de l'ARN
Pas de conversion de l'ARN en ADNc, compréhension sans biais des transcriptomes
Ozsolak F et al.Direct RNA sequencing.Nature. 2009 Oct 8;461(7265):814-8.http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7265/full/nature08390.html
© 2011 Nature Publishing Group
Microbiome humain
Peter J. Turnbaugh, Ruth E. Ley, Micah Hamady, Claire M. Fraser-Liggett, Rob Knight & Jeffrey I. GordonThe Human Microbiome ProjectNature 449, 804-810 (18 October 2007) | doi:10.1038/nature06244http://www.nature.com/nature/journal/v449/n7164/full/nature06244.html
© 2011 Nature Publishing Group
Le microbiome humain est un métagénome – un ensemble formé de plusieurs génomes
Il est variable
Microbiome humain
Junjie Qin et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencingNature 464, 59-65 (4 March 2010) | doi:10.1038/nature08821http://www.nature.com/nature/journal/v464/n7285/full/nature08821.html
Les malades ont un microbiome différent
© 2011 Nature Publishing Group
Liens utiles
Nature Newshttp://www.nature.com/news/index.html
The Human Genome at Ten – Naturehttp://www.nature.com/humangenome
GenomeWebhttp://www.genomeweb.com/
Strunk, William, Jr. 1918. The Elements of Stylehttp://www.bartleby.com/141/