Higiena živil - bf.uni-lj.si · Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo HIGIENA ŽIVIL Barbara Jeršek Ljubljana, 2009 LABORATORIJSKE VAJE ZA ŠTUDENTE

Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo

HIGIENA ŽIVIL

Barbara Jeršek

Ljubljana, 2009

LABORATORIJSKE VAJE ZA ŠTUDENTE ŽIVILSTVA IN PREHRANE

2. dopolnjena izdaja

Recenzenta: prof. dr. Janez Marinšek prof. dr. Sonja Smole Možina Izdajatelj: Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 614.31(075.8)(076.5) JERŠEK, Barbara Higiena živil [Elektronski vir] : laboratorijske vaje za študente živilstva in prehrane / Barbara Jeršek. - 2. dopolnjena izd. - El. knjiga. - Ljubljana : Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2009 Način dostopa (URL): http://www.bf.uni-lj.si/zivilstvo ISBN 978-961-6333-77-1 246514688 Po sklepu dekana Biotehniške fakultete dne 21.1.2009 je delo Higiena živil učbenik za laboratorijske vaje pri predmetu Higiena živil. Vse pravice pridržane. Ponatis (grafični, elektronski ali mehanski, vključno s fotokopiranjem, snemanjem ali prenosom v baze podatkov) celote ali posameznih delov je dovoljen le s pisnim soglasjem nosilca avtorskih pravic.

Jeršek B . H ig iena ž iv i l : Laborator i jske va je za š tudente ž iv i ls tva in prehrane. Un iverza v L jub l jan i , B iotehn iška faku l teta , Oddelek za ž iv i ls tvo , 2009

2

KAZALO VSEBINE 1. VAJA: ZAKONODAJA NA PODROČJU HIGIENE ŽIVIL ............................................. 4

UVOD....................................................................................................................................... 4 NACIONALNA ZAKONODAJA - GLAVNI ZAKONI..................................................... 4 EU ZAKONODAJA ............................................................................................................. 7

PRAKTIČNO DELO................................................................................................................ 9 2. VAJA: KROMOGENA IN FLUOROGENA GOJIŠČA.................................................... 11

UVOD..................................................................................................................................... 11 PRINCIPI DOLOČANJA MIKROORGANIZMOV S KROMOGENIMI IN FLUOROGENIMI GOJIŠČI .............................................................................................. 11

PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 19 3. VAJA: PETRIFILMI ............................................................................................................ 21

UVOD..................................................................................................................................... 21 PRINCIP DOLOČANJA MIKROORGANIZMOV S PETRIFILMI ................................. 21

PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 23 4. VAJA: VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO .............................................................. 25

UVOD..................................................................................................................................... 25 PRINCIP IN UPORABA PCR ............................................................................................ 26

PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 30 5. VAJA: PCR V REALNEM ČASU........................................................................................ 35

UVOD..................................................................................................................................... 35 PRINCIP IN LASTNOSTI PCR V REALNEM ČASU....................................................... 35

PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 39 6. VAJA: KONTAMINANTI: UGOTAVLJANJE OSTANKOV ANTIBIOTIKOV V ŽIVILIH.................................................................................................................................... 43

UVOD..................................................................................................................................... 43 METODA DIFUZIJE V AGARJU ZA UGOTAVLJANJE ANTIBIOTIKOV V ŽIVILIH............................................................................................................................................. 45

PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 48 7. VAJA: ČIŠČENJE: DOLOČANJE SNAŽNOSTI DELOVNE POVRŠINE.................. 50

UVOD..................................................................................................................................... 50 ČIŠČENJE ........................................................................................................................... 50 KONTROLA UČINKOVITOSTI ČIŠČENJA ................................................................... 52

PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 56 8.VAJA: RAZKUŽEVANJE ..................................................................................................... 58

UVOD..................................................................................................................................... 58 RAZREDČEVALNO-NEVTRALIZACIJSKA METODA................................................. 59

PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 61


3

9. VAJA: PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST RAZKUŽILA ........................................ 64 UVOD..................................................................................................................................... 64

DOLOČANJE UČINKOVITOSTI RAZKUŽILA ............................................................. 64 PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 67

10. VAJA: OSEBNA HIGIENA............................................................................................... 70 UVOD..................................................................................................................................... 70 NORMALNA MIKROBNA POPULACIJA ........................................................................... 70 PRAKTIČNO DELO.............................................................................................................. 73

ZAPISKI .................................................................................................................................... 76

LITERATURA ......................................................................................................................... 77


4

1. VAJA: ZAKONODAJA NA PODROČJU HIGIENE ŽIVIL

UVOD

o zakonu o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (ZZUZIS, 2000, 2002, 2004) higiena živil vključuje vse zahteve in ukrepe, ki so potrebni za zagotavljanje zdravstvene ustreznosti oz. varnosti živil v vseh fazah njihove proizvodnje in prometa.

Proizvodnjo in promet z živili, nadzor živil, kakovost in zdravstveno ustreznost živil ter ukrepe v primeru, da je prišlo do ogrožanja zdravja, urejajo in določajo številni zakonski predpisi (zakoni, pravilniki, odredbe, …). Glavni zakonski predpisi so zakoni in z njimi morajo biti usklajeni pravilniki, odredbe, seznami in drugi podzakonski predpisi. Predpise lahko razvrstimo v glavne skupine, ki vsebujejo: • predpise, ki določajo kakovostne zahteve za živila, • predpise, ki določajo mikrobiološke zahteve za živila, • predpise, ki opredeljujejo aditive, pesticide, veterinarska zdravila ter druge

onesnaževalce in njihove ostanke v živilih, • predpise, ki določajo higienske in sanitarno tehnične pogoje za proizvodne, prodajne,

skladiščne in druge živilske obrate, • predpise, ki določajo kdo in kako nadzoruje ravnanje z živili, • predpise, ki določajo posebne ukrepe za varstvo pred nalezljivimi boleznimi. Povzetek glavnih zakonskih predpisov: NACIONALNA ZAKONODAJA - GLAVNI ZAKONI • Zakon o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili

(ZZUIZS) (Uradni list RS 52/2000; 42/2002, 47/2004) • Zakon o veterinarstvu (Zvet-1) (Ur. list RS 33/2001; 62/2004) • Zakon o veterinarskih merilih skladnosti (ZVMS) (Uradni list RS 93/2005) • Zakon o zdravstveni inšpekciji (ZZdrl) (Uradni list 36/2004, 39/2006, 59/2006) • Zakon o kmetijstvu (ZKme) (Uradni list RS 45/2008) • Zakon o nalezljivih boleznih (ZNB) (Ur. list RS 65/1995, 119/2005, 33/2006) • Zakon o fitofarmacevtskih sredstvih (ZFfS) (Uradni list RS 11/2001, 37/2004, 98/2004,

14/2007, 35/2007)

P

1


5

• Zakon o ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi (ZRGSO) (Uradni list RS 67/2002, 73/2004, 23/2005)

• Zakon o inšpekcijskem nadzoru (ZIN) (Uradni list RS 56/2002), 26/2007, 43/2007) Z Zakonom o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (ZZUIZS, 2000, 2002, 2004) in Zakonom o veterinarstvu (Zvet-1, 2001, 2004) ter pripadajočimi podzakonskimi predpisi, so opredeljena živila, živila živalskega izvora, proizvodnja živil ter promet z živili. Za zagotovitev zdravstvene ustreznosti živil so načini nadzora določeni tako v proizvodnji kot v prometu z živili. Zakon o kmetijstvu (ZKme, 2008) s pripadajočimi podzakonskimi predpisi določa minimalno kakovost kmetijskih pridelkov oziroma živil, način pridelave oziroma proizvodnje, sestavine in njihovo vsebnost, zahteve za doseganje in ohranjanje kakovosti, razvrščanje ter označevanje. Poleg minimalne kakovosti pridelkov oziroma živil so določeni tudi ekološki kmetijski pridelki oziroma živila, integrirani kmetijski pridelki oziroma živila ter kmetijski pridelki oziroma živila tradicionalnega ugleda. Živilo je zdravstveno ustrezno oz. varno (ZZUZIS, 2000, 2002), če: 1. ne vsebuje mikroorganizmov ali parazitov oz. njihovih razvojnih oblik ali izločkov,

ki lahko škodljivo vplivajo na zdravje ljudi; 2. ostanki pesticidov in zdravil za veterinarsko uporabo ne presegajo najvišje dovoljene

koncentracije; 3. ne vsebuje strupenih kovin, nekovin, drugih kemijskih onesnaževalcev iz okolja ter

strupenih in drugih snovi v koncentracijah, ki lahko škodljivo vplivajo na zdravje ljudi;

4. ne vsebuje aditivov, ki niso dovoljeni za proizvodnjo živil, ali ne izpolnjujejo pogojev

čistosti oziroma če količina aktivov ne presega dovoljene količine; 5. če ostanki pomožnih tehnoloških sredstev ali drugih snovi, ki se uporabljajo v

proizvodnji živil, ne presegajo najvišje dovoljene koncentracije, oziroma ne vplivajo škodljivo na zdravje ljudi;

6. ne vsebuje radionuklidov nad dopustno mejo ali živilo ni obsevano nad mejo

določeno s predpisi; 7. ni mehanično onesnaženo s primesmi ali tujki, ki so lahko škodljivi za zdravje ljudi,

povzročajo odpor ali neposredno ogrožajo zdravje ljudi; 8. je njegova sestava, ki lahko vpliva na biološko in energijsko vrednost živila, v skladu

s predpisanimi pogoji;


6

9. ni njegova sestava ali organoleptične lastnosti (okus, vonj, videz) zaradi fizikalnih, kemijskih, mikrobioloških ali drugih procesov tako spremenjena, da je živilo namensko neuporabno;

10. je rok uporabnosti čitljiv in ni pretečen; 11. je živilo živalskega izvora označeno z oznako zdravstvene ustreznosti. Za zagotovitev zdravstvene ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili, se izvajajo naslednje vrste nadzora (ZZUZIS, 2000, 2002): • notranji nadzor izvajajo pravne ali fizične osebe, ki proizvajajo in dajejo v promet

živila, nadzor mora biti vzpostavljen na osnovah sistema HACCP, • uradni zdravstveni nadzor nad živili, pitno vodo, aditivi, sestavo živil, ki vpliva na

biološko in energijsko vrednost, in izdelki, nad higienskimi in zdravstveno tehničnimi pogoji objektov za njihovo proizvodnjo in promet, nad zdravjem, osebno higieno in strokovno usposobljenostjo oseb, ki delajo z živili ter nad izvajanjem notranjega nadzora nad živili, izvajajo zdravstveni inšpektorji,

• uradni zdravstveni nadzor nad proizvodnjo in prometom z živili živalskega izvora, surovinami živalskega izvora, živalskimi proizvodi, njihovem prometom pri uvozu, izvozu, tranzitom, skladiščenjem na debelo, krmo, odpadki, obrati, kjer se predelujejo oziroma obdelujejo surovine živalskega izvora, živalski proizvodi, živila živalskega izvora in odpadki izvajajo veterinarski inšpektorji.

Inšpektor za kontrolo kakovosti kmetijskih pridelkov in živil (ZKme, 2008): • opravlja pregled listin o skladnosti kmetijskih pridelkov oziroma živil, ki so v

prometu, • nadzira predpisano kakovost kmetijskih pridelkov oziroma živil, • jemlje vzorce blaga za analize in izda potrdilo, • nadzira izpolnjevanje pogojev za označevanje skladnosti označb kmetijskih pridelkov

oziroma živil s predpisanimi zahtevami, • ima dostop do zbirk podatkov, ki so potrebna za izvajanje nadzora. Dokler niso imenovani inšpektorji za kontrolo kakovosti kmetijskih pridelkov in živil, opravljajo njihove naloge tržni inšpektorji – nadzor kakovosti živil v proizvodnji in nadzor surovin. Uradni zdravstveni nadzor nad živili torej izvajajo zdravstveni inšpektorji, veterinarski inšpektorji, inšpektorji za kontrolo kakovosti kmetijskih pridelkov in živil oziroma tržni inšpektorji. Ti nadzorujejo vse faze proizvodnje in prometa z živili in tudi notranji nadzor za zagotavljanje zdravstvene ustreznosti in kakovosti živil.


7

Z Zakonom o ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi (ZRGSO, 2002, 2004, 2005) je določeno ravnanje z gensko spremenjenimi organizmi, določeni so ukrepi za preprečevanje in zmanjšanje škodljivih vplivov na okolje in na zdravje ljudi. Z zakonom je določen tudi uvoz in izvoz gensko spremenjenih organizmov. EU ZAKONODAJA

Uredba Uredba je splošen in v celoti zavezujoč akt. V nasprotju z direktivami, ki so namenjene državam članicam, in odločbami, ki imajo točno določene prejemnike, so uredbe namenjene vsem. Uredba se uporabi nemudoma v vseh državah članicah enako kot nacionalni zakon brez vsakršnega posredovanja nacionalnih oblasti.

Direktiva Direktiva je namenjena državam članicam. Njen glavni cilj je približevanje zakonodaj. Direktiva zavezuje države članice glede rezultata, ki ga je treba doseči, vendar jim pušča izbiro pri sprejemanju oblike in sredstev za uresničitev ciljev v okviru njihovega notranjega pravnega reda.

Odločba Odločba je akt, s katerim institucije Skupnosti odločajo o posebnih primerih. Institucije lahko z odločbo zahtevajo od države članice ali državljana Unije, da deluje ali se temu odpove, ji/mu podelijo pravice ali naložijo obveznosti. Odločba je individualna in njeni prejemniki morajo biti individualno določeni, zaradi česar se razlikuje od uredbe, ki je v celoti zavezujoča. Nekateri pomembnejši EU predpisi s področja higiene živil

UREDBE • Uredba Evropskega parlamenta in Sveta (ES) št. 852/2004 o higieni živil. Popravek:

Corrigendum to Regulation (EC) No 852/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 on the hygiene of foodstuffs

• Uredba Komisije (ES) št. 322/2006 o spremembi Uredbe (ES) št. 1043/2005 zaradi določb o higieni živil in o živilih živalskega izvora, določenih z uredbama Evropskega parlamenta in Sveta (ES) št. 852/2004 in (ES) št. 853/2004

• Uredba Komisije (ES) št. 37/2005 o spremljanju temperature v prevoznih sredstvih, skladiščih in pri shranjevanju hitro zamrznjenih živil, namenjenih za prehrano ljudi


8

• Uredba (ES) št. 853/2004 o posebnih higienskih pravilih za živila živalskega izvora Spremenjena z: Uredba (ES) št. 1791/2006, Uredba (ES) št. 1662/2006 , Uredba (ES) št. 2076/2005 , Uredba (ES) št. 2074/2005

DIREKTIVE Napotki za izvajanje nekaterih določb Uredbe (ES) št. 853/2004 o higieni za živila živalskega izvora Napotki za izvajanje nekaterih določb Uredbe (ES) št. 852/2004 o higieni živil Napotki o izvajanju postopkov, ki temeljijo na načelih HACCP, in olajšanju izvajanja načel HACCP v nekaterih živilskih dejavnostih (osnutek) Guidance document - Key questions related to import requirements and the new rules on food hygiene and official food controls. Napotki o izvajanju postopkov, ki temeljijo na načelih HACCP, in olajšanju izvajanja načel HACCP v nekaterih živilskih dejavnostih (osnutek) Food hygiene

Vsi veljavni pravni predpisi in tudi predpisi, ki so šele v postopku sprejemanja, so na voljo na spletni strani Registra pravnih predpisov RS; spletna stran: http://zakonodaja.gov.si, http://www.mz.gov.si/si/zakonodaja_in_dokumenti/veljavni_predpisi/ . Dostop do Uradnega lista RS: http://www.uradni-list.si/index.jsp . Dostop do zakonodaje EU: http://eur-lex.europa.eu/sl/index.htm .


9

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. Preglejte zakonske predpise in odgovorite na vprašanja! 1.

2.

3.

4.

Materiali: 1. Vipišite vire


10

Rezultati:


11

2. VAJA: KROMOGENA IN FLUOROGENA GOJIŠČA

UVOD ivila so ugodno okolje za rast mnogih bakterij in gliv. Če je ravnanje z živili v toku proizvodnje ali prometa neustrezno, so živila lahko kontaminirana z mikroorganizmi ali / in njihovimi toksini. Uživanje kontaminiranih živil lahko v določenih okoliščinah vodi do okužb ali zastrupitev posameznikov ali večjih

skupin (epidemije). Zastrupitve s hrano, ki je kontaminirana z mikroorganizmi in /ali njihovimi strupi, se skrajšano imenujejo alimentarne toksikoinfekcije. Glede na dejstvo, da so okužbe in zastrupitve z živili, kontaminiranimi z mikrobi oziroma njihovimi strupi, med najbolj pogostimi vzroki za zastrupitve s hrano, je pomembno, da so metode, s katerimi se mikrobi odkrivajo v živilih, občutljive, specifične in hitre. Klasična mikrobiološka preiskava za ugotavljanje mikroorganizmov v živilih vključuje gojitev mikroorganizmov v laboratoriju. Za gojitev se, odvisno od namena preiskave, uporabljajo različna gojišča, na primer osnovna, obogatitvena, diferencialna, selektivna gojišča in gojišča za ugotavljanje biokemijskih lastnosti. Pri klasični identifikaciji bakterij je potrebno izolirati čisto kulturo na primarnem izolacijskem gojišču, nato pa izvesti serijo biokemijskih in seroloških testov. Postopek je največkrat zelo dolgotrajen. Med različnimi modifikacijami klasičnih mikrobioloških gojitvenih metod so pogosto navedena kromogena in fluorogena gojišča. PRINCIPI DOLOČANJA MIKROORGANIZMOV S KROMOGENIMI IN FLUOROGENIMI GOJIŠČI

zadnjih 10 – 15 letih so raziskave mikrobnega metabolizma pripeljale do razvoja novih mikrobioloških gojišč. Tako so ena od novejših skupin gojišč kromogena in fluorogena gojišča, ki vsebujejo umetne kromogene oziroma fluorogene encimske substrate. Kromogena in fluorogena gojišča so glede na sestavine lahko

osnovna, diferencialna ali selektivna. Fluorogeni in kromogeni encimski substrati so sestavine mikrobioloških gojišč in različnih sistemov za hitro, direktno identifikacijo mikroorganizmov. Če so fluorogeni in kromogeni substrati sestavine selektivnih gojišč, se le-ta lahko uporabljajo kot primarna izolacijska gojišča. Tako za identifikacijo izolatov ni potrebna nova kultivacija in serije biokemijskih testov, kar pomeni, da se z uporabo kromogenih in fluorogenih gojišč skrajša čas preiskave ter prihrani material in delo. Interakcije med mikroorganizmi in

Ž

V

2


12

kemijskimi sestavinami gojišč so različne in večinoma odvisne od strukture kromoforov ali fluoroforov. Snov, ki nastane po encimski reakciji, se:

• direktno veže na mikrobne celice in tako se kolonije na gojišču specifično obarvajo ali

• difundira v gojišče in mu daje značilno barvo ali fluorescenco. Kromogeni encimski substrati so snovi za specifične encime z dodano kromogeno sestavino, ki ob encimski reakciji spremeni barvo. Večina kromogenih encimskih substratov vsebuje derivate fenola, na primer:

• o- in p-nitrofenoli (ONP, PNP) • p-nitroanilin (PNA) • indoksil (Y) • 5-bromo-4-kloro-3-indolil (X)

Kromogeni encimski substrati so v vodi topni, neobčutljivi na temperaturo in ne difundirajo v trdna gojišča. Princip ugotavljanja bakterij vrste Escherichia coli s kromogenimi encimskimi substrati: Večina bakterij vrste E. coli ima encim β-D-glukuronidazo (GUD). Kot kromogen substrat je v gojišču X-β-D-glukuronid (X-GLUC ali BCIG). Če so na gojišču bakterije E. coli, bodo z encimom GUD razgradile substrat X-GLUC. Sproščeni kromofor X obarva kolonije E. coli izrazito modro zeleno. Slika 1: Princip določanja bakterij vrste E. coli s kromogenim encimskim substratom

X-GLUC = X-β-D-glukuronid

β-D-glukuronidaza iz E. coli

Glukuronska kislina (brezbarvna)

X (modro obrvane

kolonije E. coli)

+


13

Fluorogeni encimski substrati so sestavljeni iz za encim specifične snovi (sladkor ali amino kislina) in fluorogena. Večina fluorogenih substratov so derivati kumarina, na primer:

• 2H-1 benzopiran-2-1-, 4-metil (4-MU), • 7-amino-4-metilkumarin (7-AMC), • β-naftilamin (β-NAP).

Po encimski reakciji se sprosti fluorogen, ki pri osvetlitvi z UV fluorescira. Fluorogeni substrati so topni v vodi, zelo občutljivi in specifični. Uporabo fluorogenih substratov omejujejo nekatere lastnosti kot so na primer: močna difuzija v trdna gojišča, odvisnost od pH in osvetlitev z UV. Princip ugotavljanja bakterij E. coli s fluorogenimi encimskimi substrati: Večina bakterij vrste E. coli ima encim β-D-glukuronidazo (GUD). Kot fluorogen substrat je v gojišču 4-MU-β-D-glukuronid (MUG). Če so na gojišču bakterije E. coli, bodo z encimom GUD razgradile substrat MUG. Sproščeni 4-MU bo ob UV osvetlitvi (366 nm) modro fluoresciral. Slika 2: Princip določanja bakterij vrste E. coli s fluorogenim encimskim substratom

PRIMERI: DOLOČANJE BAKTERIJ RODU Salmonella Določanje salmonel na klasičnih mikrobioloških gojiščih je zelo težavno, ker so si kolonije bakterij iz rodov Salmonella, Proteus in Citrobacter zelo podobne. Slaba specifičnost oziroma selektivnost gojišč pomeni veliko lažno pozitivnih rezultatov (Proteus in Citrobacter) med redkimi resnično pozitivnimi kolonijami salmonel.

MUG = 4-MUX-β-D-glukuronid

β-D-glukuronidaza iz E. coli

Glukuronska kislina (brezbarvna)

4-MU (modra fluorescenca

kolonije E. coli) +


14

Značilna rast kolonij bakterij rodu Salmonella na klasičnih mikrobioloških gojiščih: -Gojišče Salmonella-Shigela: • Salmonella: prosojne, sluzaste kolonije z temnim črnim centrom ali brez njega, • Proteus: prosojne, sluzaste kolonije z temnim črnim centrom ali brez njega, • Shigella: prozorne ali rahlo rožnate, lahko nepravilnih oblik; • enterobakterije, ki fermentirajo laktozo: rožnate. -Gojišče Bismut sulfid: • Salmonella: črne kolonije, s kovinskim sijajem, pojavlja se cona črno obarvanega

gojišča; • Proteus: rjave do rjavočrne; • E. coli: inhibirana. -Gojišče Briliantno zeleni agar: • Salmonella in nekatere druge vrste, ki ne fermentirajo laktoze: rdeče vijolične kolonije,

podobno se obarva tudi gojišče okoli kolonij (S. Typhi in S. Paratyphi ne rastejo); • Proteus: rožnate, sluzaste kolonije, 2 - 3 mm v premeru, gojišče okoli kolonij se

obarva rdeče zaradi bazične reakcije; sproščanje amonijevih spojin, ki nastanejo pri razgradnji beljakovin;

• E. coli: rumene do rumeno zelene kolonije, podobno se obarva tudi gojišče okoli kolonij zaradi fermentacije laktoze pade pH vrednost; briljantno zeleno prehaja v rumeno barvo.

Uporaba kromogenih in fluorogenih gojišč zato omogoča lažje in hitrejše določanje za salmonele značilnih kolonij. Značilna rast bakterij rodu Salmonella na kromogenih gojiščih: -Gojišče SM-ID (bio-Merieux, Francija) V gojišču sta dva kromogena substrata X-GAL za β-galaktozidazo in X-GLU za β-glukozidazo (druge sestavine: glukuronat, indikator nevtralno rdeče ter selektivne sestavine briljantno zelenilo in žolčne soli).

• Salmonele ne izkoriščajo kromogenih substratov (X-GAL in X-GLU), iz glukuronata pa tvorijo kislino. Zato se indikator spremeni v rdečo barvo in kolonije salmonel so rdeče barve.

• Druge enterobakterije izkoriščajo X-GLU in X--GAL in tvorijo modro do vijolično obarvane kolonije ali brezbarvne kolonije. (Enterobakterije so bakterije iz rodov Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Klebsiella, Erwinia, Serratia, Hafnia, Edwardsiella, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia).


15

-Gojišče Rambach (CHROMagar, Francija; Merck, Nemčija) Gojišče Rambach vsebuje kromogen substrat X-GAL za β-galaktozidazo (druge sestavine: propilen glikol, pepton, kvasni ekstrakt, natrijev deoksiholat in indikator nevtralno rdeče).

• Salmonele tvorijo kislino iz propilen glikola in zato indikator nevtralno rdeče spremeni barvo in kolonije salmonel so svetlo rdeče barve.

• Koliformne bakterije, ki imajo β-galaktozidazo, tvorijo modre kolonije, ker razgradijo X-gal (modre barve).

• Nekatere koliformne bakterije tvorijo kolonije vijolične barve zaradi tvorbe kisline iz propilen glikola in β-galaktozidazne aktivnosti.

• Bakterije rodu Proteus tvorijo brezbarvne kolonije. Test MUCAP (Biolife, Italija) Test MUCAP se uporablja za ugotavljanje salmonel na klasičnih selektivnih gojiščih. Osnova testa je reagent, ki vsebuje fluorogen encimski substrat 4-MU-kaprilat. Kolonijam na selektivnem gojišču dodamo reagent. Salmonele imajo encim esteraza C8, ki cepi 4-MU-kaprilat, in sprosti se 4-MU. 4-MU se po 1 - 5 minutah pri osvetlitvi z UV (366 nm) vidi kot močna modra fluorescenca. DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Escherichia coli Značilna rast kolonij bakterij vrste E. coli na klasičnih mikrobioloških gojiščih: -Gojišče Violično rdeči žolčni agar z laktozo (VRBL) je selektivno gojišče za izolacijo koliformnih bakterij.

• Bakterije vrste E. coli tvorijo temno rdeče kolonije s škrlatno rdečim centrom. • Rastejo tudi druge koliformne bakterije, na primer bakterije vrst Enterobacter

aerogenes tvorijo temno rdeče kolonije, Proteus mirabilis tvorijo brezbarvne kolonije.

-Gojišče Eozin metilen modro (EMB):

• Bakterije vrste E. coli tvorijo vijoličaste kolonije s temnejšim centrom in zelenkastim kovinskim sijajem.

• Bakterije vrste Enterobacter aerogenes: rdeče kolonije s temnim centrom, okoli prozorna cona.

• Bakterije rodov Salmonella in Shigella tvorijo brezbarvne ali roza kolonije.


16

Značilna rast kolonij bakterij vrste E. coli na kromogenih gojiščih: Okrog 94 – 96 % bakterij vrste E. coli ima encim β-D-glukuronidazo (GUD). Encima GUD nimajo druge vrste iz rodu Escherichia in tudi ne sev E. coli O157:H7. Z aktivnostjo encima GUD se določa bakterije E. coli na selektivnih gojiščih, v katerih so kot kromogeni in fluorogeni encimski substrati p-nitrofenol β-D-glukuronid (PNPG), X-β-D-glukuronid (X-GLUC ali BCIG) in 4-MU-β-D-glukuronid (MUG). Eno od kromogenih gojišč je Tergitol – BCIG Agar (Biokar Diagnostics), ki ima kromogen substrat BCIG (X-GLUC). Encim GUD cepi BCIG in sprosti se kromofor modre barve, ki kolonije E. coli intenzivno modro zeleno obarva (Slika 1). Ob hidrolizi fluorogenega substrata MUG se sprosti 4-MU, ki modro fluorescira ob UV osvetlitvi pri 366 nm (Slika 2). MUG je sestavina mnogih komercialno dostopnih tekočih (lauril sulfatno gojišče: Fluorocult Lauryl Sulphate Broth, Merck) in trdnih gojišč (Fluorocult ECD Agar, Merck; Fluorocult VRB Agar, Merck; Fluorocult MacConkey Agar, Merck). Znano je, da je fluorescenca 4-MU odvisna od vrednosti pH. Optimalno je nevtralno do rahlo alkalno okolje, sicer pa po inkubaciji na gojišče dodamo bazično raztopino. Slaba stran substrata MUG je, da 4-MU relativno hitro difundira v gojišče okoli kolonij in je odčitavanje reakcij najboljše na gojiščih po 18-urni ali krajši inkubaciji. Sočasno ugotavljanje koliformnih bakterij in bakterij vrste Escherichia coli Ker so tako bakterije vrste E. coli kot tudi druge koliformne bakterije pomembne kot indikatorji fekalne kontaminacije živil in vode, obstaja mnogo gojišč, ki omogočajo njihovo sočasno določanje. Koliformne bakterije so definirane kot bakterije, ki imajo encim β-D-galaktozidazo, ki cepi laktozo v glukozo in galaktozo. Po klasični definiciji so koliformne bakterije definirane kot gramnegativne paličaste, nesporogene, aerobne ali fakultativno anaerobne bakterije, ki v 48 urah pri 35 oC iz laktoze tvorijo kislino in plin. Določimo jih z metodo MPN ali metodo membranske filtracije ter potrdilnimi testi. Celotna preiskava lahko traja dva do štiri dni. Če jih določamo kot bakterije, ki imajo encim β-D-galaktozidazo, lahko dobimo pozitiven rezultat za nekatere enterobakterije, ki ne izkoriščajo laktoze. Komercialna gojišča za sočasno določanje koliformnih bakterij in bakterij vrste E. coli vsebujejo različne encimske substrate za ugotavljanje β-D-galaktozidaze (za vse koliformne bakterije) in β-D-glukuronidaze (GUD) za E. coli). -Gojišči Chromcult Coliform Agar (Merck) in ROSE-GAL BCIG (Biokar Diagnostics) vsebujta dva kromogena encimska substrata, Salmon-gal in X-GLUC, in značilen izgled kolonij je: • 6-kloro-3-indolil β-D-galaktopiranozid (Salmon-gal): koliformne bakterije tvorijo

temne modro vijolične in rdeče kolonije,


17

• X-β-D-glukuronska kislina (X-GLUC ali BCIG): E. coli tvorijo temno modro vijolične kolonije,

• druge enterobakterije tvorijo brezbarvne kolonije. DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Clostridium perfringens Značilna rast kolonij bakterij vrste Clostridium perfringens na klasičnih mikrobioloških gojiščih: -Gojišče SICA (egg yolk free tryptose sulphite iron citrate cycloserine agar): • za bakterije vrste Cl. perfringens značilne so črne kolonije, • drugi sulfitreducirajoči klostridiji kot so Cl. bifermentans, Cl. botulinum, Cl.

paraperfringens, Cl. sardinese in Cl. sporogens tvorijo tudi črne kolonije -Gojišče SPS (sulfit polimiksin sulfadiazin agar): • Cl. perfringens: črne kolonije, • Cl. sporogens: črne kolonije, • dobro rastejo tudi bakterije vrst Streptococcus faecalis in Staphylococcus aureus. Značilna rast kolonij bakterij vrste Clostridium perfringens na fluorogenih gojiščih: Za identifikacijo bakterij Cl. perfringens je v gojišču Fluorocult TSC (Merck) dodan fluorogeni encimski substrat 4-MU-fosfat (4-MUP). Bakterije Cl. perfringens z encimom kisla fosfataza hidrolizirajo 4-MUP. Po osvetlitvi z UV kolonije Cl. perfringens svetlo modro fluorescirajo zaradi modre fluorescence 4-MU. DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Listeria monocytogenes Značilna rast kolonij bakterij rodu Listeria na klasičnih mikrobioloških gojiščih: Klasična izolacija in identifikacija bakterij vrste L. monocytogenes je težavna, ker so kolonije vseh sedmih vrst iz rodu Listeria na klasičnih selektivnih gojiščih Oxford in Palcam enake. -Gojišče Oxford: Po 24 urah so kolonije listerij majhne s premerom 1 mm, sive barve s črno cono, po 48 urah postanejo temnejše, lahko imajo zelen sijaj, večji premer do 2 mm, imajo črno cono in so na sredini vdrte.


18

-Gojišče PALCAM: Po 24 urni inkubaciji so kolonije listerij majhne (premer 1,5 do 2 mm) sivo zelene ali olivno zelene barve s črno cono, včasih imajo črn center. Po 48 urah so zelene kolonije s črno cono. Za identifikacijo bakterij vrste L. monocytogenes je potrebna potrditev rodu Listeria in nadaljnja identifikacija posamezne vrste. Značilna rast kolonij bakterij rodu Listeria na kromogenih gojiščih: Zato novejša gojišča za identifikacijo vključujejo encimske substrate, ki vsebujejo za encim fosfatidil inositol fosfolipaza C (PI-PLC), ki je značilen za bakterije L. monocytogenes in L. ivanovii specifične substrate vezane s kromogenom. V kromogenem gojišču BCM-LMDS (Biosynth, Švica) je kot encimski kromogeni substrat dodan X-mio-inozitol-1-fosfat. Bakterije vrst L. monocytogenes in L. ivanovii tvorijo tirkizne kolonije. Podobno so kolonije L. monocytogenes in L. ivanovii na gojiščih CHROMagar Listeria (CHROMagar, Francija) in ALOA (Oxoid, Italija) modre z motno prosojno cono, medtem ko so kolonije drugih listerij modre brez cone ali bele. Gojišče Rapid L. mono (Sanofi, Francija) vsebuje sestavine, ki so potrebne za določanje aktivnosti encima PI-PLC in ksilozo. Kolonije bakterij L. ivanovii so tako modre barve na rumenem gojišču (izkoriščajo ksilozo), kolonije L. monocytogenes pa so modre barve na nespremenjenem gojišču rdeče barve (ne izkoriščajo ksiloze).


19

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. V vzorcu mešanih bakterijskih kultur z oznako A ugotovite, ali so prisotne bakterije

rodu Salmonella tako, da uporabite eno selektivno in eno kromogeno gojišče! Po inkubaciji naredite test MUCAP na klasičnem selektivnem gojišču.

2. V vzorcu mešanih bakterijskih kultur z oznako B ugotovite, ali so prisotne bakterije vrste Escherichia coli tako, da uporabite eno selektivno gojišče in eno kromogeno gojišče!

3. V vzorcu mešanih bakterijskih kultur z oznako C ugotovite, ali so prisotne bakterije vrste L. monocytogenes tako, da uporabite eno selektivno in eno kromogeno gojišče!

Materiali in delo: 1. Za posamezno preiskavo določite ustrezno vrsto klasičnega mikrobiološkega gojišča

in ustrezno vrsto kromogenega gojišča Vzorec Preiskava Klasično gojišče Kromogeno gojišče

A

B

C

2. Shema praktične izvedbe:


20

Rezultati 1. Za vzorce A, B in C opišite kolonije na klasičnem selektivnem in na kromogenem

gojišču! Glede na morfološke lastnosti kolonij določite, ali so bile v vzorcu A bakterije rodu Salmonella, v vzorcu B bakterije vrste Escherichia coli in v vzorcu C bakterije vrste Listeria monocytogenes! Napišite na katerem gojišču ste določili posamezne bakterije in specifične encimske reakcije, značilne za bakterije na posameznem kromogenem gojišču! Za vzorec A naredite test MUCAP. 2. Vzorec A

Test MUCAP:

3. Vzorec B

4. Vzorec C


21

3. VAJA: PETRIFILMI

UVOD nostavnost, hitra izvedba, natančnost, specifičnost in občutljivost so zahteve za mikrobiološko preiskavo, ki pa so v praksi težko dosegljive. Hiter razvoj v zadnjih 20. letih je pripomogel k temu, da so nekateri od naštetih parametrov uresničljivi tudi pri praktičnem delu. Tako je ena od alternativ klasičnih

mikrobioloških gojišč lahko uporaba vnaprej pripravljenih gojišč ali uporaba Petrifilmov. V laboratoriju zato ni potrebno pripravljati gojišč in s tem se prihrani pri času potrebnem za izvedbo preiskave. PRINCIP DOLOČANJA MIKROORGANIZMOV S PETRIFILMI

etrifilmi (3MTM, Microbiology Products, Sante) so ena od alternativ k klasičnim metodam mikrobiološke preiskave živil. To so komercialno pripravljena sterilna suha gojišča, ki se jih pred preiskavo rehidriramo. Gojišča vsebujejo podobne sestavine kot klasična mikrobiološka gojišča in kromogene encimske substrate. Z uporabo

Petrifilmov prihranimo čas, ki je potreben za pripravo klasičnih mikrobioloških gojišč, in znižamo se stroške preiskav. V laboratoriju ne potrebujemo dodatne opreme za delo, prav tako pa ni potrebno dodatno izobraževanje zaposlenih.

Petrifilm sestavljajo podložna in krovna folija ter dvoplastni sistem filmov, ki sta prekrita s hranili in v vodi topljivim želirnim sredstvom. Dodani so lahko različni indikatorji, ki obarvajo zrasle kolonije. Odvisno od vrste Petrifilma vsebujejo gojišča tudi različne selektivne dodatke in kromogene ali fluorogene encimske substrate. Na spodnji foliji je vrisana mreža, ki olajša štetje kolonij. Petrifilme se lahko uporabljamo za direktno nanašanje vzorca na površino, za vzorčenje zraka, za jemanje brisov ali odtisov površin. Delo s Petrifilmi je enostavno, na primer preiskava vzorca živila: Vzorec se aseptično pripravimo za mikrobiološko preiskavo. Petrifilm položimo na ravno vodoravno površino, aseptično dvignemo zgornjo folijo in na sredino površine z gojiščem odpipetiramo 1 ml vzorca živila ali ustrezne razredčitve. Zgornjo folijo Petrifilma previdno položimo na površino tako, da se ne tvorijo mehurčki zraka. Inokulum razporedimo po celotni površini gojišča s plastičnim pokrovčkom – razporejevalcem (pri Petrifilmih za določanje kvasovk in plesni ter skupnega števila mikroorganizmov z narobljeno stranjo, pri drugih Petrifilmih z gladko stranjo). Po 1

E

P

3


22

minuti Petrifilme inkubiramo v specifičnih razmerah, ki omogočajo rast preiskovanim mikroorganizmom. Rezultati mikrobioloških preiskav, dobljeni s Petrifilmi, so primerljivi z rezultati, dobljenimi s klasičnimi mikrobiološkimi gojišči. Glavne prednosti uporabe Petrifilmov v primerjavi s klasičnimi mikrobiološkimi gojišči so:

• Natančni rezultati po treh enostavnih stopnjah mikrobiološke preiskave: inokulacija vzorca, inkubacija ter odčitavanje rezultatov

• Standardizirana metodologija • Majhna, ploska gojišča • Petrifilmi so že vnaprej prekriti s hranilnimi snovmi in želirnim sredstvom • Lahko se uporabljajo za testiranje surovin, vmesnih produktov, končnih živilskih

izdelkov in za okoljske vzorce • Primerni so za sistem HACCP • Rezultati so primerljivi med posameznimi preiskavami, med izvajalci in med

laboratoriji Tabela 1: Vrste in lastnosti nekaterih Petrifilmov 3MTM

Vrsta Petrifilma 3MTM Gojišče

Kromo-gen

substrat Inkuba-

cija Izgled kolonij

Aerobic Count Plates PCA1 TTC2 30 oC / 48

ur rdeče kolonije

Enterobacteriaceae Count Plates VRBG1 TTC, pH

indikator 35 oC / 37

oC, 24 ur

rdeče kolonije z rumeno cono in /ali mehurčki

plina Coliform Count

Plate VRBG1 TTC 30 oC / 37 oC, 24 ur

rdeče kolonije z mehurčki plina

Select E. coli Count Plates VRBL1 TTC,

BCIG3 42 oC / 44

oC, 24 ur modro zelene kolonije

Escherichia Coli and Coliform Count

Plates VRBL1 TTC,

BCIG 35 oC / 37

oC, 24 ur

E. coli: modre, druge koliformne bakterije:

rdeče z mehurčki plina

Yeast and Mold Count Plates

Saboraud z antibiotikom X-fosfat 25 oC,

3 – 5 dni

Kvasovke: majhne modro zelene, plesni:

velike

Staph Express Count Plate

Modificirano gojišče BP4 TTC 37 oC / 24

ur

Staphylococcus aureus rastejo kot rdeče vijolične kolonije

Legenda: 1 modificirana gojišča: PCA (Plate Count Agar), VRBG (Violet Red Bile Galactose), VRBL

(Violet Red Bile Lactose) 2 TTC: kromogena sestavina 2,3,5-trifenil tetrazolijev klorid, ki obarva kolonije rdeče 3 BCIG: kromogena sestavina5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-glukuronska kislina (X-

GLUC) , ki obarva kolonije modro 4 Gojišče Baird- Parker


23

PRAKTIČNO DELO

Namen: Z ustrezno vrsto Petrifilma ugotovite v vzorcu z oznako MK … … skupno število aerobnih mezofilnih mikroorganizmov … število koliformnih bakterij … število bakterij vrste Escherichia coli … število bakterij vrste Staphylococcus aureus Materiali in delo: 1. Za posamezno preiskavo določite ustrezno vrsto Petrifilma Preiskava: Vrsta Petrifilma: Aerobni mezofilni mikroorganizmi Koliformne bakterije Bakterije vrste Escherichia coli Bakterije vrste Staphylococcus aureus

2. Shema praktične izvedbe:


24

Rezultati 1. Opišite izgled značilnih kolonij na izbranem Petrifilmu in rezultate kvantificirajte! Bakterije Petrifilm Opis kolonij N (cfu/ml)

Aerobni mezofilni mikroorganizmi

Koliformne bakterije

Bakterije vrste Escherichia coli

Bakterije vrste Staphylococcus aureus


25

4. VAJA: VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO

UVOD kužbe ali zastrupitve z živili največkrat povzročajo patogene bakterije, ki se prenesejo do človeka preko živalskih rezervoarjev (zoonoze) ali zaradi kontaminacije živil v tehnološkem procesu. Ugotavljanje patogenih bakterij v živilih je največkrat težavno, ker je njihovo število relativno nizko v primerjavi z

visokim številom drugih mikroorganizmov v živilu. Večina tradicionalnih mikrobioloških metod zato vključuje bolj ali manj selektivno obogatitev, včasih tudi predobogatitev, izolacijo in identifikacijo mikrobov. Celoten postopek mikrobiološke preiskave je zato velikokrat dolgotrajen in zamuden. V zadnjih 20 – 30 letih se je razvilo mnogo tehnologij in metod, s katerimi se ugotavljajo patogene bakterije v živilih (surovine, polproizvodi, proizvodi). Hitre, specifične in občutljive metode določanja bakterij so nujne tudi pri procesni kontroli, določanju čistosti in higiene v proizvodnji in prometu z živili. Nekateri primeri novejših metod so prikazani v tabeli 2. Tabela 2: Primeri novejših metod za ugotavljanje patogenih bakterij v živilih

PRINCIP METODA Spiralni PC (angl. Spiral plater) Kromogena in fluorogena gojišča Petrifilmi

Modifikacije in avtomatizacije metod, ki so vključene v klasične mikrobiološke gojitvene metode HGMF (angl. Hidrophobic grid-membrane filter

technique) Bioluminiscenca Meritve ATP

DEFT (direktna epifluorescentna tehnika s filtriranjem) Mikroskopiranje Pretočna citometrija Meritve električnih parametrov Impedančne metode

Avtomatizirane imunološke metode (Vidas) Imunomagnetno ločevanje Specifične reakcije antiteles z

antigeni ELISA Hibridizacijske tehnike PCR (verižna reakcija s polimerazo) Preiskave DNK Tehnologija DNK-čipov

O

4


26

PRINCIP IN UPORABA PCR Verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction, PCR) je poleg različnih hibridizacijskih tehnik in novejše tehnologije DNK-čipov ena od molekularnih metod, ki se uporablja tudi za določanje in ugotavljanje mikroorganizmov v živilih in različnih drugih vzorcih. Stopnje, ki so vključene v preiskavo vzorca s PCR:

• priprava DNK, • priprava in izvedba PCR, • ugotavljanje pomnožkov.

Priprava DNK: Priprava DNK vključuje različne fizikalno kemijske in /ali encimske metode, s katerimi dobimo bolj ali manj čisto suspenzijo DNK za PCR. Molekule DNK, ki so v notranjosti bakterijskih celic, iz celic sprostimo z lizo celične stene (s toplotnim, kemijskim, mehanskim ali encimskim delovanjem). Za PCR lahko uporabimo suspenzijo vseh celičnih sestavin po celični lizi ali pa DNK še osamimo in čistimo (na primer: ekstrakcija DNK s fenol-kloroformom). Princip PCR: Princip same reakcije PCR je in vitro pomnožitev dela tarčne DNK z DNK-polimerazo v cikličnem termostatu. Termostabilna DNK-polimeraza je encim, ki so ga izolirali iz termofilnih bakterij Thermus aquaticus. Encim ima optimalno temperaturo 72o C in ohranja svojo aktivnost tudi, če je krajši čas na višjih temperaturah, ki so potrebne za denaturacijo dvoverižne DNK. Poseben termostat zagotavlja zvezno spreminjanje temperature v ciklu, ki zajema tri faze (Slika 3):

• denaturacija / razdvajanje dvoverižne DNK (na primer: 95o C, 30 s), • prileganje oligonukleotidnih začetnikov (na primer: 55 - 72o C, 5 – 60 s), • podaljševanje (na primer: 72o C, 60 s).

V vsakem ciklu se število tarčnih kopij podvoji. S 25 do 35 ponovitvami cikla se koncentracija pomnoženega dela DNK eksponentno pomnoži tudi do 109 kopij. Za pomnoževanje dela DNK je torej potrebna reakcijska mešanica, ki poleg tarčnih molekul DNK, vsebuje termostabilno DNK-polimerazo, deoksinukleotid trifosfate (dNTP: dNTA, dNTT, dNTG, dNTC), ione Mg2+, reakcijski pufer in par oligonukleotidnih začetnikov. Vsak potek PCR moramo glede na izvedbo in namen


27

optimizirati (določiti temperature in čase v ciklusu, število ponovitev ciklusa in določiti sestavo reakcijske mešanice). Izbira oligonukleotidnih začetnikov je odvisna od vrste PCR in vrste preiskovanih mikroorganizmov. Zaporedja baz A, T, G, C v oligonukleotidnih začetnikih so komplementarna delu tarčne DNK in največkrat jih pri PCR, ki služijo identifikaciji izolatov, izberemo iz znanih podatkov o sekvencah virulentnih genov. Pomnožimo del tarčne DNK med izbranima oligonukleotidnima začetnikoma. Število pomnožkov, katerih velikost je določena z razdaljo med oligonukleotidnima začetnikoma, se podvoji v vsakem ciklu. Slika 3: Princip metode PCR

Pomnožke PCR najenostavneje ugotovimo z agarozno gelsko elektroforezo tako, da njihovo velikost primerjamo z molekularnim označevalcem z znanimi velikostmi fragmentov. Specifičnost pomnožitve moramo kontrolirati s hibridizacijo z interno DNK-sondo, z restrikcijo ali s sekveniranjem pomnožka.

3` 5`

C A T G A A G T G T A C T T C A

T A T C C A T C A T A G G T A G

3`

5`



1. Denaturacija DNK, 95o C, 30 s

3`

5`



2. Prileganje, 55 -72o C, 5-60 s

C A T G 5` 3` G T A G 5`

DNK-polimeraza

5` 3`

3` 5`



3. Podaljševanje, 72o C, 60 s

C A T G A A G T 5` A T A G G T A G 5` 3`

3`

3`

Dvoverižna DNK


28

Prednosti ugotavljanja in identifikacije mikroorganizmov s PCR v primerjavi s klasičnimi gojitvenimi metodami so boljša specifičnost in občutljivost ter predvsem krajši čas, ki je potreben za pridobitev rezultata, na kar kažejo številne objave v literaturi v zadnjih 15-ih letih. Glede na vrsto omejitev, ki se pojavijo pri preiskavah vzorcev s PCR, pa se v praksi največkrat še vedno uporablja različne kombinacije klasičnih gojitvenih metod in PCR. Glavne omejitve pri ugotavljanju mikroorganizmov s PCR direktno v vzorcu so:

• Občutljivost metode PCR:

Za samo encimsko reakcijo pomnožitve dela DNK je teoretično dovolj 1 bakterijska celica oziroma 1 molekula DNK. V reakcijsko mešanico za PCR običajno dodamo 1 - 10 µl pripravljene DNK iz vzorca, katerega volumen (ali masa) pa je v območju od 0,1 ml (g) pa vse do 50 ml (g). Pri vzorcih je običajno občutljivost PCR med 103 in 104 cfu/g. Ker so tarčni mikroorganizmi navadno prisotni v veliko manjši koncentraciji, je direktno ugotavljanje, brez posebne priprave vzorca, nemogoče. Zato uporabljamo različne obogatitve vzorca ali različne tehnike koncentriranja celic iz vzorcev. Ena najbolj obetavnih metod je imunomagnetna ločitev bakterijskih celic.

• Inhibicija PCR:

Zaradi inhibicije encimske reakcije lahko pride do lažno negativnih rezultatov. Lahko so neustrezne razmere pomnoževanja (na primer nepravilni temperaturni režim, neustrezna koncentracija ionov Mg2+), lahko pride do kontaminacije vzorca (na primer: sestavine živila ali sestavine gojišč inhibirajo PCR, encimi DNase in RNase degradirajo tarčno DNK in/ali oligonukleotidne začetnike; inhibicija zaradi prahu iz rokavic za enkratno uporabo ali snovi, ki vežejo Mg2+). Posebno pozornost moramo zato posvetiti kontaminaciji s tujo DNK, saj le-ta lahko tudi vodi do lažno pozitivnih rezultatov.

• Problem mrtvih in živih celic:

V PCR se pomnoži specifičen del DNK neodvisno od tega, ali je bila DNK pripravljena iz živih ali iz mrtvih bakterijskih celic – obstaja torej možnost lažno pozitivnih rezultatov. Temu se lahko izognemo z obogatitvijo vzorca pred pripravo DNK in tako povečamo tudi občutljivost PCR. Druga možnost je izolacija mRNK ali rRNK, ki pa je tehnično in izvedbeno bolj zahtevna.


29

Slika 4: Možnosti uporabe PCR za ugotavljanje mikroorganizmov v vzorcu

PCR

VZOREC

OBOGATITEV

IZOLACIJA NA SELEKTIVNIH GOJIŠČIH

IDENTIFIKACIJA IZOLATA (BIOKEMIJSKI IN/ALI SEROLOŠKI TESTI)

IZOLACIJA ZNAČILNIH KOLONIJ IZ SELEKTIVNIH GOJIŠČ NA NESELEKTIVNEM GOJIŠČU


30

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. V vzorcu mešane kulture ugotovite ali so prisotne bakterije vrste L. monocytogenes.

Uporabite PCR s specifičnima oligonukleotidnima začetnikoma LM1 in LM2! Zaporedji baz za LM4 in LM5 sta izbrani iz znanih sekvenčnih podatkov za gen hlyA (1,6 kb), ki določa za L. monocytogenes specifičen listeriolizin, in pomnožita 520 bp dolg del DNK L. monocytogenes.

Materiali in potek dela: 1. Priprava DNK: Alkalna liza bakterijskih celic z mešanico raztopin NaOH in

SDS • Za L. monocytogenes značilno kolonijo s cepilno zanko prenesete v 100 μl sterilne

deionizirane vode v 1,5-ml epruvetki, • centrifugirajte 5 min pri 13000 g, • odpipetirajte supernatant in peletu dodajte 100 μl sterilne deionizirane vode,

premešajte • centrifugirajte 5 min pri 13000 g, • odpipetirajte supernatant, • peletu dodajte 100 μl sveže pripravljene mešanice raztopin 0,05 M NaOH in

0,125 % SDS (razmerje1 :1), • vzorec 5 minut segrevajte v vodni kopeli pri 90 °C, lizat shranite v posodi z

ledom in za PCR uporabite 2,5 μl 2. Priprava reakcijske mešanice za PCR Reakcijsko mešanico za PCR naredite v posebnem prostoru, v katerem nikoli ne delamo z mikrobnimi kulturami in raztopinami ali suspenzijami DNK. Delajte v komori in vedno s svežimi rokavicami za enkratno uporabo. Vse kemikalije morajo biti ves čas na ledu. Glede na število vzorcev (N) izračunajte volumne posameznih sestavin. N pomeni število vzorcev, za katere je pripravljena DNK + 1 negativna kontrola + rezervni vzorec. Nato odpipetirajte v 1,5-ml epruveto najprej izračunani volumen vode, nato dodajte ustrezne volumne pufra PCR 10x in raztopin MgCl2, dNTP, LM4, LM5, Tween 20 ter na koncu DNK-polimerazo. Reakcijsko mešanico premešajte in razdelite v 0,2 ml-PCR-epruvetke po 47,5 µl. V drugem prostoru dodajte v PCR-epruvetke po 2,5 μl pripravljene DNK.


31

Primer izračuna reakcijske mešanice za PCR: Sestavina reakcijske mešanice Volumen za N vzorcev Pufer PCR 10x 5 μl x N MgCl2 (25 mM) 6 μl x N dNTP (2 mM) 5 μl x N LM4 (1 μM) 0,5 μl x N LM5 (1 μM) 0,5 μl x N Tween 20 (0,5 g/ml) 0,2 μl x N DNK-polimeraza (5 U/µl) 0,1 μl x N Suspenzija DNK 2,5 μl x N SKUPAJkemikalije in DNK 18,3 μl x N H2OPCR (50 μl x N) – SKUPAJkemikalije in DNK

3. PCR PCR-epruvetke postavite v ciklični termostat in izvedite program LM1/LM2: 1 cikel začetna denaturacija 95 oC 5 min 30 ciklov: denaturacija 94 oC 60s prileganje 57 oC 60 s podaljševanje 72 oC 120 s 1 cikel končno podaljševanje 72 oC 5 min ohladitev 4 oC ∞ 4. Agarozna elektroforeza Priprava 1,5 % agaroznega gela: Zatehtajte 0,96 g agaroze ME, dodajte 60 ml pufra TEA 0,5x (TEA 10x 0,4 M Tris, 0,2 M ocetna kislina, 0,02 M Na2EDTA, pH 8,1), segrejte v mikrovalovni pečici do vrenja oziroma toliko časa, da postane raztopina bistra, ohladite na 60 oC. V model za gel dodajte elektroforezni glavnik in gel vlijte v model. Počakajte 15 – 30 minut, da se gel strdi in polimerizira. Priprava pomnožkov: V 1,5 ml-epruvetke odpipetirate 2 μl barvila za nanos pomnožkov (loading buffer), nato dodajte po 8 μl vzorcev pomnožkov in previdno premešajte tako, da se ne tvorijo mehurčki. Pripravite še molekularni označevalec dolžin pomnožkov (Invitrogen,100 bp DNA Ladder) tako, da v 1,5 ml epruvetko odpipetirate 2 μl barvila za nanos pomnožkov in nato dodajte 2 µl molekularnega označevalca (slika 5).


32

Slika 5: Velikosti fragmentov molekularnega označevalca dolžin pomnožkov (100bp DNA Ladder ,15628-019 Invitrogen, ZDA)

Elektroforeza: Agarozni gel postavite v elektroforezo s pufrom TEA 0,5x, v prvi prostorček odpipetirajte 4 μl raztopine molekularnega označevalca, v naslednje luknjice odpipetirajte po 9,5 μl pripravljenih raztopin pomnožkov. Nanos vzorcev v gel naj bo čim hitrejši. Elektroforeza poteka pri14 V/cm. Barvanje agaroznega gela in dokumentiranje: Po končani elektroforezi gel barvate z raztopino etidijevega bromida. Etidijev bromid je strupena, mutagena in teratogena kemikalija, zato se barvanje izvaja v posebnem prostoru. Obvezna je uporaba zaščitne obleke. Po 10 minutah prenesete gel za nekaj minut v vodo in nato na transiluminator. Z UV svetlobo presvetlite gel in ga slikajte.

100 bp

200 bp

300 bp 400 bp 500 bp 600 bp


33

Rezultati 1. Opišite začetne vzorce, iz katerih ste pripravili suspenzije DNK!

2. Izračunajte volumne kemikalij za reakcijsko mešanico za PCR! Izračun reakcijske mešanice za PCR: N =

Sestavina reakcijske mešanice Volumen za 1 vzorec (µl) Volumen za N vzorcev (µl) Pufer PCR 10x MgCl2 (25 mM) dNTP (2 mM) LM4 (1 µM) LM5 (1 µM) Tween 20 (0,5 g/ml) DNK-polimeraza (5U / µl) Suspenzija DNK V (SKUPEN kemikalije in DNK) H2OPCR

3. Opišite pripravo agaroznega gela in pripravo pomnožkov ter potek elektroforeze!


34

4. Dodajte sliko agarozne elektroforeze in opišite rezultate PCR!


35

5. VAJA: PCR V REALNEM ČASU

UVOD etode, ki temeljijo na preiskavah DNK, kot so to različne tehnike oziroma izvedbe PCR, imajo v analitiki živil poseben pomen, ker so zelo občutljive in specifične. Ti dve lastnosti omogočajo, da določimo zelo majhne količine DNK (ali RNK) v preiskovanem vzorcu. Tako lahko poleg patogenih mikrobov

določamo tudi kvarljivce, gensko spremenjene organizme in alergene v živilih ter avtentičnost oziroma potvorbe živil. V zadnjih letih je tako PCR v realnem času postala ena od metod, ki lahko služi različnim preiskavam in s tem različnim namenom in jo je v veliki meri možno tudi standardizirati in avtomatizirati. PRINCIP IN LASTNOSTI PCR V REALNEM ČASU PCR v realnem času je v izboljšava klasičnega PCR. Reakcija poteka v cikličnem termostatu, kjer se temperatura zvezno spreminja v ponavljajočih se ciklih kot pri klasičnem PCR, le da je vsak cikel sestavljen iz dveh faz:

• denaturacija DNK pri temperaturi višji od 90 °C, • prileganje oligonukleotidnih začetnikov (in oligonukleotidne sonde) in

podaljševanje DNK pri temperaturi 50-60 °C z DNK-polimerazo. Nastale pomnožke določimo med samo encimsko reakcijo in tako prihranimo delo ter material za določanje pomnožka z gelsko elektroforezo. To je tudi glavna razlika med klasičnim PCR in PCR v realnem času, saj slednji omogoča sprotno spremljanje nastajanja pomnožka in/ali količine pomnožka s fluorogenim označevanjem oligonukleotidnih začetnikov, sond ali pomnožkov. Povečanje količine pomnožka zaznamo kot povečanje fluorescentnega signala, ki je posledica povezave med fluorogenim barvilom in pomnožkom oziroma njune hibridizacije. Zaradi fluorogenih barvil, ki so vezana na oligonukleotidne začetnike, specifične sonde ali pomnožke, je specifičnost PCR v realnem času večja kot pri klasičnem PCR. S PCR v realnem času lahko količino pomnožka tudi kvantificiramo. PCR v realnem času je zaprt sistem in zato so možnosti za kontaminacijo okolja in navzkrižno kontaminacijo vzorcev mnogo manjše kot pri klasičnem PCR Princip PCR v realnem času: Princip enega cikla PCR v realnem času je prikazan na sliki 6.

M

5


36

1. Prileganje oligonukleotidnih začetnikov in sonde na enoverižne DNK 2. FRET (Fluorescentni resonančni prenos energije) - prenos energije med

molekulami reporterskega in zaviralnega fluorogena 3. Eksonukleazna aktivnost DNK-polimeraze

4. Odcepitev reporterskega fluorogena in oddajanje fluorescence

3′ 5′

5′ 3′

5′

5′

Q R

5′

3′ 5′

5′ 3′

5′

Q R

5′

3′ 5′

5′ 3′

5′

Q R

5′

3′ 5′

5′ 3′

5′

Q

R


37

5. Razpad oligonukleotidne sonde Slika 6: Princip PCR v realnem času z dvojno označeno oligonukleotidno sondo ››TaqMan‹‹ (Real-Time PCR Systems, 2004)

Tako kot pri klasičnem PCR se tudi pri PCR v realnem času v vsakem ciklu število tračnih kopij podvoji. S 30 do 40 ponovitvami cikla se koncentracija pomnoženega dela DNK eksponentno pomnoži tudi do 109 kopij. Določitev pomnožkov: Pri PCR v realnem času pomnožke določamo z meritvami fluorescence in ločimo dve skupini metod določanja pomnožkov:

• Nespecifične metode: Princip je v vezanju fluorogenih barvil, kot je na primer SYBRGreen I, v dvovijačno DNK in fluorescenci vezanih barvil pri določeni valovni dolžini. Barvilo SYBRGreen I se veže na vsako dvoverižno DNK in fluorescira le, ko je vezano v DNK. Več ko je pomnožkov DNK, več barvila SYBRGreen I se veže in večja je intenziteta fluorescence. Pri tem PCR potrebujemo podobno kot pri klasičnem PCR le dva oligonukleotidna začetnika. Slabost nespecifičnih metod je v vezanju fluorogenih barvil na vse pomnožke, tako na specifične kot tudi na nespecifične pomnožke in različne dimere, zaradi česar lahko pride do netočne interpretacije rezultatov ali celo do lažno pozitivnih rezultatov.

• Specifične metode: Specifične metode določanja pomnožkov temeljijo na procesu FRET (fluorescentni resonančni prenos energije). Pri teh metodah sta v molekuli oligonukleotidne sonde, oligonukleotidnega začetnika ali pomnožka vezani dve fluorogeni barvili: reporterski (R) in zaviralni (Q) fluorogen. Rezultat podvojevanja specifičnega dela DNK ter eksonukleazne aktivnosti encima DNK-polimeraza je poleg pomnožka tudi ločitev

3′ 5′

5′ 3′ 5′

5′

Q R


38

reporterskega in zaviralnega fluorogena, kar vodi k povečevanju intenzitete fluorescence. Glede na vezavo reporterskega in zaviralnega fluorogena razlikujemo več metod in med njimi je najbolj poznana metoda dvojno označene oligonukleotidne sonde (››TaqMan‹‹). Oligonukleotidna sonda je na 5`-koncu označena z reporterskim fluorogenom, na 3`-koncu sonde pa je vezan zaviralni fluorogen (slika 5). Med različnimi fluorogenimi barvili je kot reporterski fluorogen največkrat 6-karboksi-fluorescein (6-FAM), kot zaviralni fluorogen pa 6-karboksi-tetrametil-rodamin (TAMRA). Zaviralni fluorogen zavira oddajanje fluorescence reporterskega fluorogena, dokler sta barvili vezani na sondo. Pri podaljševanju določene sekvence DNK pa eksonukleazna aktivnost encima DNK-polimeraze razgradi sondo in s tem se fluorogena ločita in reporterski fluorogen začne oddajati fluorescenco. Z uvedbo fluorescentno označene oligonukleotidne sonde, ki se veže na del sekvence DNK med obema oligonukleotidnima začetnikoma, se poveča specifičnost metode PCR v realnem času, saj se poleg specifičnih oligonukleotidnih začetnikov uporablja tudi specifično sondo. Glavne prednosti PCR v realnem času:

• podvojevanje in določitev pomnožkov v istem sistemu • fluorescentna barvila in sonde omogočajo sprotno spremljanje rezultatov reakcije • možna je kvantifikacija pomnožkov • povečana specifičnost zaradi uporabe specifičnih sond • območje določanja med 10 – 1010 kopij • sočasna analiza velikega števila vzorcev • pomnoževanje in določanje pomnožkov potekata v popolnoma zaprtem sistemu,

zato je zmanjšana verjetnost kontaminacije vzorcev in okolja

Slika 7: Primer rezultatov PCR v realnem času

1: 106 cfu/ml, Ct: 12,8 2: 104 cfu/ml, Ct:16,9 3: 102 cfu/ml: Ct: 21 4: 101 cfu/ml : Ct: 27 5: negativna kontrola


39

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. V vzorcih ugotovite, ali so prisotne bakterije vrste Staphylococcus aureus tako, da

določite gen za površinski protein B (femB). Uporabite par specifičnih oligonukleotidnih začetnikov z gen femB, ki kodira površinski protein: • femB-fw 5′-AATTAACGAAATGGGCAGAAACA • femB-rv 5′-TGCGCAACACCCTGAACTT

Specifičen pomnožek je velik 93 bp. Materiali in potek dela: 1. Priprava DNK: Toplotna liza bakterijskih celic

• 1 ml 24-urne kulture prenesete v 1,5 ml mikrocentrifugirko in vsebino centrifugirajte 5 min pri 13000 obratov/min

• odstranite supernatant • dodajte 100 µl H2OKEM in ponovno centrifugirajte 5 min s hitrostjo vrtenja 13000

obratov/min • odstranite supernatant • dodajte 100 µl H2OKEM ter suspenzijo 5 minut segrevajte pri temperaturi 94 °C • lizat shranite v posodi z ledom in za PCR uporabite 2,5 μl

2. Priprava reakcijske mešanice za PCR Reakcijsko mešanico za PCR v realnem času naredite v posebnem prostoru, v katerem se nikoli ne dela z mikrobnimi kulturami in raztopinami ali suspenzijami DNK. Delajte v komori in vedno s svežimi rokavicami za enkratno uporabo. Vse kemikalije morajo biti ves čas na ledu. Glede na število vzorcev (N) izračunajte volumne posameznih sestavin. N pomeni število vzorcev, za katere je pripravljena DNK (vsak vzorec delate v dveh paralelkah) + 2 negativni kontroli + rezervni vzorec. Nato odpipetirajte v 1,5-ml epruveto najprej izračunani volumen vode, nato dodajte ustrezne volumne SYBR® Green PCR Master Mix in raztopin oligonukleotidnih začetnikov femB-fw in femB-rv. Reakcijsko mešanico premešajte in razdelite v 0,2 ml-PCR-epruvetke po 22,5 µl. V drugem prostoru dodajte v PCR-epruvetke po 2,5 μl pripravljene DNK.


40

Primer izračuna reakcijske mešanice za PCR v realnem času: Sestavina reakcijske mešanice Volumen za 1 vzorec SYBR® Green PCR Master Mix 12,5 μl femB-fw (10 pmol/µl) 0,75 μl femB-rv (10 pmol/µl) 0,75 μl Suspenzija DNK 2,5 μl SKUPAJkemikalije in DNK 16,5 μl H2OPCR 25 μl – SKUPAJkemikalije in DNK

3. PCR PCR-epruvetke postavite v ciklični termostat in izvedite univerzalni program pomnoževanja: 1 cikel aktivacija polimeraze 95 oC 10 min 40 ciklov: denaturacija 95 oC 15s prileganje in pomnoževanje 57 oC 60 s 1 cikel disociacija pomnožka 95 oC 15 s, 60 oC 1 min, 95 oC 15 s 4. Odčitavanje / vrednotenje rezultatov Rezultat oz. pomnožek pri PCR v realnem času je fluorescentni signal, ki ga lahko spremljamo med samo reakcijo. Fluorescentni signal vrednotimo se po zaključku PCR kot število ciklov potrebnih, da pride do linearne faze podvojevanja. Izmerjeno intenziteto fluorescentnega signala izrazimo v kot vrednost Ct (primer na sliki 7). Vrednost Ct je število ciklov, pri katerem se intenziteta fluorescentnega signala poveča nad 10x standardno deviacijo fluorescence osnovne črte oz. ozadja. Čimveč je v vzorcu tarčne DNK, tem hitreje bo naraščala intenziteta fluorescence in manjša bo vrednost Ct. Natančnost vrednosti Ct je odvisna od fluorogena in njegove koncentracije, začetne količine DNK, občutljivosti sistema in sposobnosti meritev v sistemu, da razloči med specifičnim fluorescentnim signalom in fluorescentnim signalom ozadja


41

Rezultati 1. Opišite začetne vzorce, iz katerih ste pripravili suspenzije DNK!

2. Pripravite reakcijsko mešanico za PCR v realnem času za določitev bakterij vrste

Staphylococcus aureus (površinski protein femB). Izračunajte volumne kemikalij za reakcijsko mešanico za PCR v realnem času!

Izračun reakcijske mešanice za PCR v realnem času: N =

Reakcijska mešanica za femB: Sestavina reakcijske mešanice Volumen za 1 vzorec Volumen za N vzorcev

SYBR® Green PCR Master Mix femB-fw (10 pmol/µl) femB-rv (10 pmol/µl) Suspenzija DNK SKUPAJkemikalije in DNK H2OPCR


42

3. Dodajte sliko rezultatov PCR v realnem času (krivulje spremembe intenzitete fluorescence) in določite vrednosti Ct !


43

6. VAJA: KONTAMINANTI: UGOTAVLJANJE OSTANKOV ANTIBIOTIKOV V ŽIVILIH

UVOD

a splošno so tveganja oziroma nevarnosti, ki jih moramo glede na surovine, tehnološke postopke in vrsto živil kontrolirati in nadzirati, naslednja:

• mikrobiološka tveganja: v to skupino sodijo predvsem patogene bakterije (na primer Clostridium botulinum, Salmonella, …) in specifične vrste mikroorganizmov, ki povzročajo kvar živil (na primer Pseudomonas spp., Xanthomonas, plesni, …);

• kemijska tveganja: so v živilih naravno prisotne toksične snovi (na primer: mikotoksini, fitotoksini) in umetni onesnaževalci (na primer: poliklorirani bifenili, pesticidi, insekticidi, fungicidi, kovine in nekovine, veterinarsko medicinski preparati);

• fizikalna tveganja: v to skupino sodijo mehanska onesnaženja v živilih, na primer delci stekla, lasa, plastike ali kovin, pesek, insekti, dlake, ščetine, delci kosti, …

Po zakonu o zdravstveni ustreznosti živil (2000, 2002) je onesnaževalo (kontaminant) katerikoli biološki, kemijski, fizikalni ali radiološki agens, ki je nenamensko prisoten v živilu kot posledica postopkov pridelave kmetijskih pridelkov in surovin živalskega izvora, oziroma proizvodnje in prometa živil, ali kot posledica onesnaženja okolja. Kontaminant v živilu je torej lahko katerakoli snov, ki živilu ni bila namerno dodana in je posledica onesnaženja živila v procesu pridelave, predelave, proizvodnje, pakiranja, paketiranja, transporta ali skladiščenja ali pa posledica onesnaževalcev okolja. Ostanek (reziduum) določenega onesnaževalca, na primer pesticida, je ena ali več snovi, ki so prisotne v ali na živilih in so posledica uporabe pesticida, vključno z njegovimi metaboliti in proizvodi, ki so posledica njegovega razgrajevanja ali reakcije, kakor tudi nečistoče. Primarni vzrok za večino alimentarnih obolenj je mikrobiološka kontaminacija živil. Hude in resne zastrupitve z živili zaradi kemijskih onesnaževalcev niso pogoste in največkrat so to posamezni primeri, ki so omejeni na določeno področje. Potencialno veliko nevarnost človeku predstavljajo kemijski onesnaževalci zato, ker jih sprejemamo v majhnih

N

6


44

količinah praktično vse življenje. Primeri kemijskih onesnaževalcev so prikazani v Tabeli 3. Posledice se pojavijo postopoma ali šele čez daljši čas, lahko tudi z neznačilnimi znaki. Tabela 3: Kemijski onesnaževalci v živilih (O`Keeffe, 2000)

Kategorija Primeri Običajne sestavine živil fitoestrogeni, glikoalkaloidi a) Naravni

onesnaževalci Naravni onesnaževalci živil mikotoksini, fitotoksini, zastrupitve z gobami

Kmetijske kemikalije pesticidi, gnojila Veterinarska zdravila antibiotiki, biostimulatorji Živilski aditivi konzervansi, antioksidanti Kemikalije iz embalaže vinil monomeri, oligomeri Kemikalije iz tehnološkega procesa

nitrozamini, policiklični aromatski hidrokarboni (PAH)

b) Onesnaževalci iz okolja

Onesnaževalci okolja dioksini, poliklorirani bifenili (PCB), kovine in nekovine

Glede na problematiko kontaminantov v živilih imajo tako mednarodne organizacije (FAO; WHO) kot tudi posamezne države oblikovane zakonske predpise, s katerimi se ščiti zdravje potrošnikov. Za posamezne vrste živil so predpisane največje količine – mejne vrednosti za posamezne ostanke onesnaževalcev v posameznih živilih. Najvišja dovoljena količina ostankov (MRL – ang. maximum residue level) je najvišja s predpisi določena koncentracija ostanka sredstva, izražena v mg/kg v ali na živilu. Živila, ki presegajo te mejne vrednosti se ocenijo kot zdravstveno neustrezna. V sklopu sistematičnega nadzora – monitoringa izvajata zdravstvena in kmetijska inšpekcija nadzor nad ostanki v živilih rastlinskega izvora ter veterinarska inšpekcija nadzor nad ostanki v živilih živalskega izvora. Pri nadzoru vsebnosti ostankov v živilih se uporabljajo različne tehnike in metode, ki so na splošno razdeljene v:

• kvalitativne ali semi-kvantitativne "screening" metode, ki so relativno hitre, enostavne in omogočajo pregledovanje velikega števila vzorcev (na primer mikrobiološki preizkus, encimsko-imunski testi); z njimi se določi vzorce, ki ne ustrezajo obstoječim predpisom in jih je potrebno naprej analizirati s kvantitativnimi in specifičnimi metodami;

• različne kromatografske in spektroskopske metode, s katerimi se dokončno

določi določen reziduum, kvalitativno in kvantitativno (na primer plinska kromatografija (GC), masna spektroskopija (MS), visokotlačna plinska kromatografija, (HPLC), tenkoplastna kromatografija (TLC)).


45

Pesticidi so fitofarmacevtska sredstva, ki se uporabljajo: • za zatiranje povzročiteljev rastlinskih bolezni, plevela (herbicidi), gliv (fungicidi)

škodljivega mrčesa (insekticidi), glodalcev (rodenticidi), polžev (limacidi) in za uravnavanje rasti rastlin,

• za zatiranje škodljivcev in gliv, ki napadajo uskladiščene pridelke, • za zatiranje žuželk in drugih organizmov, ki prenašajo povzročitelje nalezljivih

bolezni na ljudi in živali. Pomembnejše skupine pesticidov:

• klorirani ogljikovodiki (DDT, lindan, alfa HCN), • organofosfati, • karbamati, • anorganski pesticidi na osnovi Cu, Pb, As, Hg, • rastlinski pesticidi (piretrin, nikotin).

Veterinarska zdravila: Veterinarska zdravila so snovi ali kombinacije snovi, ki so pripravljene in namenjene za zdravljenje ali preprečevanje bolezni pri živalih, za zdravilo se šteje tudi vsaka snov, ki je pripravljena z namenom, da bi se določila diagnoza ali ponovno vzpostavile, izboljšale ali spremenile fiziološke funkcije. Nadzor, spremljanje prometa in uporabe veterinarskih zdravil in tudi monitoring nad ostanki škodljivih snovi v živilih izvaja VURS (Veterinarska uprava RS). Glavne skupine veterinarskih zdravil:

• Antibiotiki: (aminoglikozidi (streptomicin, neomicin), penicilini, tetraciklini, polieni (nistantin), polipeptidi (bacitracin), makrolidi (eritromicin), novobiocin, kloramfenikol,

• Kemoterapevtiki: sulfonamidi, kabadoks, nitrofurani, dimetridazol, Antibiotiki in kemoterapevtiki v živilih živalskega izvora ne smejo biti prisotni (meso in mesni izdelki smejo v promet, če ne vsebujejo antibiotikov v količinah, ki jih je mogoče dokazati s predpisanimi metodami), kloramfenikol in dimetridazol sta prepovedana; za sulfonamide je mejna vrednost 0,1 mg/kg.

• Hormoni, tireostatiki, pomirjevalci, beta blokatorji in beta antagonisti - v živilih živalskega izvora ne smejo biti prisotni.

METODA DIFUZIJE V AGARJU ZA UGOTAVLJANJE ANTIBIOTIKOV V ŽIVILIH Kadar sumimo, da so v živilu (na primer sveže meso, mleko) ostanki antibiotikov, lahko kot relativno hitro in enostavno screening metodo uporabimo metodo difuzije v agarju, ki je sicer bolj poznana kot metoda za določanje antibiogramov.


46

Princip mikrobiološke metode ugotavljanja ostankov antibiotikov v živilu z metodo difuzije v agarju (angl. Four-plate agar diffusion test) je v določanju inhibicije rasti testnih bakterijskih kultur v prisotnosti preiskovanega vzorca. Kot testni bakterijski kulturi uporabljamo bakterije Bacillus subtilis in Micrococcus luteus. V sterilna, stopljena in na 48-50o C ohlajena trdna gojišča, ki so pripravljena s tremi različnimi končnimi vrednostmi pH (6,0; 7,2; 8,0), dodamo čiste bakterijske kulture tako, da je končna koncentracija bakterij 104 cfu/ml. Bakterije Bacillus subtilis dodamo v gojišča s pH 6,0; 7,2; 8,0 in bakterije Micrococcus luteus v gojišče s pH 8. Nato gojišča z bakterijami razlijemo v sterilne petrijevke. Če je preiskovan vzorec meso, iz sredine vzorca aseptično izrežemo valj s premerom 8 mm. Nato narežemo 8 kolutov/diskov debeline 2 mm in se jih prenesemo (po dva) na štiri že pripravljena gojišča (tri gojišča s tremi različnimi vrednostmi pH in kulturo Bacillus subtilis ter eno gojišče z bakterijami Micrococcus luteus). Če je preiskovan vzorec tekoč (mleko, serum) uporabimo sterilne filter papirčke / diske s premerom 6 mm, ki se jih prepojimo s preiskovanim vzorcem in nato po dva diska aseptično s pinceto prenesemo na štiri že pripravljena gojišča. Gojišča s preiskovanimi vzorci in z bakterijami Bacillus subtilis 18-24 ur inkubiramo pri 30o C, gojišča z bakterijami Micrococcus luteus pa 18-24 ur pri 37o C. Ob vsakem poskusu z metodo difuzije v agarju moramo narediti še kontrolo. Na pripravljena gojišča z vmešanimi bakterijskimi kulturami dodamo filter papirčke / diske, ki so prepojeni s standardnimi raztopinami antibiotikov (10 μl raztopine antibiotika z določeno koncentracijo, Tabela 4). Plošče s kontrolnimi diski inkubiramo v enakih razmerah kot plošče z preiskovanimi vzorci. Po inkubaciji izmerimo velikost krožne inhibicijske cone okrog vzorcev živil oziroma okrog diskov (Slika 8). Pozitivni rezultat pomeni, da preiskovana kultura ne raste okrog dveh filter papirčkov na enem ali več gojiščih in je inhibicijska cona velika 2 mm ali več. Slika 8: Krožna inhibicijska cona pri izvedbi metode difuzije v agarju

Testni disk / košček mesa

Krožna inhibicijska cona


47

Pravilnost izvajanja metode difuzije v agarju potrdimo z rezultati kontrolnih vzorcev – filter papirčki, ki so prepojeni s standardnimi raztopinami antibiotikov. Rezultati so prikazani v tabeli 4. Tabela 4: Rezultati kontrolnih vzorcev pri metodi difuzije v agarju za ugotavljanje antibiotikov v živilih

Testno gojišče s bakterijsko kulturo / pH

Koncentracija antibiotika na disku (μg / ml)

Minimalna velikost inhibicijske cone (mm)

Bacillus subtilis / pH 6 penicilin 0,625 μg / ml 6 mm Bacillus subtilis / pH 7,2 sulfamidin 0,5 μg / ml 6 mm Bacillus subtilis / pH 8 streptomicin 0,5 μg / ml 6 mm Micrococcus luteus / pH 8 streptomicin 0,5 μg / ml 6 mm

Če so v živilu ostanki antibiotika(ov), bo ta v času inkubacije difundiral iz diska v trdno gojišče in ustvaril koncentracijski gradient. Baktericiden učinek na bakterije vidimo kot inhibicijsko cono okrog diska, kjer ni bakterijske rasti. Ker je pri metodi difuzije v agarju pomembna stopnja difuzije antibiotika v gojišče z bakterijsko kulturo in pa sama sestava (na primer hlapne komponente) moramo v primeru pozitivnih rezultatov, nujno opraviti dodatne kemijske analize in tako potrditi prisotnost antibiotika(ov) v vzorcu. Živilski aditivi: Aditiv je vsaka snov, ki se običajno ne uporablja oziroma ne uživa kot živilo in ne predstavlja običajne, tipične sestavine živila, ne glede na to ali ima hranilno vrednost, se pa namensko dodaja živilu iz tehnoloških oziroma senzoričnih razlogov v proizvodnji, pri pakiranju, za transport, hrambo ter ima neposredne ali posredne učinke na živilo in postane sestavina živila. Pri proizvodnji živil se lahko uporabljajo le aditivi, ki so zakonsko dovoljeni. Aditivi se dodajajo živilom v najmanjši možni količini, ki še dosega željeni tehnološki učinek. Aditivi morajo imeti ustrezno čistost, saj se predvideva, da jih trajno uživamo. Poznani morajo biti tudi produkte njihove razgradnje v organizmu. Za posamezne aditive in živila so predpisane največje dovoljene količine. Primeri glavnih kategorij aditivov: sladila, barvila, konzervansi, antioksidanti, emulgatorji, stabilizatorji, plini za pakiranje. Kemikalije iz embalaže: vinil monomeri, oligomeri Kemikalije iz tehnološkega procesa: nitrozamini, policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH) Onesnaževala iz okolja: dioksini, poliklorirani bifenili (PCB), kovine in nekovine (svinec, kadmij, živo srebro, arzen, antimon, cink, baker kositer, fluor)


48

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. Z metodo difuzije v agarju ugotovite ali so v vzorcih živil prisotni ostanki

antibiotikov! Materiali in potek dela: 1. Opišite vzorce živil, navedite uporabljene materiale ter opišite potek preiskave! Vzorci:

Kontrolni vzorci:

Materiali in potek dela:


49

Rezultati 1. Za kontrolne vzorce in vzorce živil določite velikost inhibicijske cone in

ocenite prisotnost antibiotikov!

Kontrolni vzorec Bakterijska kultura, pH Velikost inhibicijske cone (mm)

Bakterije vrste Bacillus subtilis, pH 6,0

Oznaka vzorca živila Velikost inhibicijske cone (mm) Ocena





Bakterije vrste Micrococcus luteus, pH 8,0



50

7. VAJA: ČIŠČENJE: DOLOČANJE SNAŽNOSTI DELOVNE POVRŠINE

UVOD

živilski industriji je sanitacija postopek, s katerim dosežemo, da so površine, oprema in prostori v takšnih higienskih razmerah, da preprečujejo kontaminacijo, ki bi lahko privedla do higienske oporečnosti živil. Osnovni namen sanitacije je preprečevanje kontaminacije živil s patogenimi

mikroorganizmi in zmanjšanje možnosti za razmnoževanje mikroorganizmov-kvarljivcev. Sanitacija vključuje različne metode, s katerimi izvajamo čiščenje, razkuževanje (dezinfekcija), uničevanje določenih insektov (dezinsekcija), uničevanje glodalcev (deratizacija), uničevanje strupov (detoksikacija) in druge metode.

ČIŠČENJE Čiščenje, v ožjem pomenu besede, pomeni odstranjevanje nečistoč z določenih površin. Poleg tekočega sprotnega čiščenja in razkuževanja med delom ali zaključnega čiščenja po končanem delu moramo organizirati tudi generalno čiščenje in razkuževanje (dnevno, tedensko, trimesečno, letno). Čiščenje in razkuževanje je težko ločiti, saj je učinkovitost razkuževanja zelo vprašljiva brez predhodnega čiščenja. Samo čiščenje vsebuje naslednje faze:

• mehanično odstranjevanje nečistoče s površine (ribanje, strganje, vodni curek z visokim tlakom),

• disperzija nečistoče v čistilnem sredstvu, • preprečevanje ponovnega usedanja dispergirane nečistoče v čistilnem sredstvu na

že očiščene površine – spiranje, • sušenje.

Pri čiščenju uporabljamo sredstva za čiščenje ali kombinirana sredstva za čiščenje in razkuževanje. Pri izbiri sredstva in načina čiščenja je pomembno, da upoštevamo naslednje parametre: vrsta in lastnosti nečistoč, vrsta materiala, način čiščenja, lastnosti čistilnega sredstva, sestava vode ter razgradljivost čistilnega sredstva.

V

7


51

Vrsta in lastnosti nečistoč Nečistoče v živilski industriji so organskega in anorganskega izvora in po kemijski sestavi zelo heterogene. Za anorganske nečistoče so bolj primerna čistilna sredstva z nizkim pH, za organske pa z alkalnim pH. Nečistoče so po naravi zelo kompleksne in velikokrat so organske nečistoče "zaščitene" z anorganskimi usedlinami ter obratno (na primer mlečni film). Zato je zelo pomembna pravilna določitev vrste nečistoč in pravilna izbira čistilnega sredstva ali kombinacije različnih čistilnih sredstev (dvostopenjsko čiščenje), da se nečistoče učinkovito odstranijo. Glavna čistilna sredstva, ki se uporabljajo v živilski industriji, lahko razdelimo v tri glavne skupine: bazična čistilna sredstva (močne baze, šibke baze), kisla čistilna sredstva in površinsko aktivne snovi. Vrsta materiala V živilstvu se uporabljajo različne vrste materialov kot so na primer: nerjaveča pločevina, pocinkana pločevina, steklo, plastični materiali, keramika, beton, guma, les. Glede na strukturo in hrapavost površine, korozijsko odpornost materiala ter mehansko in toplotno odpornost materiala se izbere ustrezno tehnologijo čiščenja ter primerno čistilno sredstvo. Tako je na primer nerjaveča pločevina korozijsko najbolj odporen material z gladko površino, odporna na visoke temperature. Na drugi strani pa je les za čiščenje zelo problematičen material, ker je prepusten za vlago, maščobe in olja, ni primeren za visokotlačno čiščenje, ni odporen proti alkalnim čistilom. Vrsta in način čiščenja Način čiščenja je odvisen od površin, opreme, prostorov, ki se čistijo, ter od razpoložljivih sredstev in opreme za čiščenje. Osnovna načina čiščenja sta ročno in strojno čiščenje. Ročno čiščenje zajema več faz: grobo čiščenje, glavno čiščenje z detergentom in odplakovanje z vodo. Vse bolj pa se uveljavlja strojno čiščenje s stroji za čiščenje z vodo pod visokim pritiskom, tlačnimi aparati za penasti nanos čistilnih raztopin, CIP – čiščenje zaprtih sistemov (angl. Cleaning in place) ter drugimi napravami. Vso opremo za čiščenje in razkuževanje je potrebno redno čistiti in razkuževati. Lastnosti čistilnega sredstva Idealno čistilno sredstvo naj bi imelo dobro sposobnost mehčanja vode ter emulgiranja maščob in olj, dobro sposobnost pranja in raztapljanja, preprečevalo naj bi usedanje že dispergiranih delcev, dobro naj bi se spiralo s površin, imelo naj bi dobro topnost, naj ne bi bilo korozivno, enostavno za uporabo ter ekološko čisto ob primerni ceni. Učinkovitost čiščenja je odvisna od mnogih dejavnikov, med katerimi so najpomembnejši: čas delovanja, temperatura, mehanično učinkovanje ter vrsta in koncentracija čistilnega sredstva.


52

KONTROLA UČINKOVITOSTI ČIŠČENJA Kontrola čiščenja je lahko vizualna, treba pa tudi redno opravljati laboratorijsko kontrolo z mikrobiološko preiskavo brisov površin ali izpirkov. Poleg navedenih klasičnih mikrobioloških metod se vse več uporabljajo tudi tako imenovani »hitri testi«, ki s hitrimi rezultati pripomorejo k učinkovitem ukrepanju (na primer: meritve ATP-bioluminiscence, meritve NAD in NADP). V Z O RČE N J E Z B R I S I I N M I K R O B I O L O Š K E P R E I S K A V E

Vzorčenje z brisi uporabljamo za ugotavljanje higienskega stanja v proizvodnih obratih, gostinskih obratih, za ugotavljanje učinkovitosti čiščenja in razkuževanja. Z brisi vzorčimo delovne površine, opremo, jedilni in kuhinjski pribor, posodo, roke, nalivne pipe, cevovode, itd. Za vzorčenje z brisi uporabljamo sterilne epruvete z določenim volumnom sterilne fiziološke raztopine (5 ml ali 10 ml). Na notranji strani pokrovčka epruvete je pritrjena palčka, ki je na koncu ovita z vato. Pri vzorčenju površin z brisom pobrišemo površino določene velikosti (20 cm2) tako, da bris med vzorčenjem obračamo in da smer brisanja površine vsaj dvakrat zamenjamo. Nato damo bris v epruveto s fiziološko raztopino in vsebino dobro premešamo. V brisu po Pravilniku o posebnih ukrepih pri zastrupitvah in infekcijah oseb s hrano in o njihovem preprečevanju (Uradni list SRS, 24/1981) s klasičnimi mikrobiološkimi metodami določamo:

• število aerobnih mezofilnih bakterij • bakterije vrste Escherichia coli, koagulaza pozitivne stafilokoke, fekalne

streptokoke, Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa Število mikroorganizmov v brisu izračunamo po naslednji formuli:

VRkolonijštN ××= . (cfu / 20 cm2) R razredčitev vzorca V volumen fiziološke raztopine v brisu Po pravilniku je bris snažen:

• če je število aerobnih mezofilnih bakterij do 100 cfu / 20 cm2 (jedilni pribor, kozarci, skodelice, krožniki) oziroma do 200 cfu / 20 cm2 (delovna površina)

• če ne vsebuje bakterij vrste Escherichia coli, koagulaza pozitivnih stafilokokov, fekalnih streptokokov, Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa.


53

V Z O RČE N J E Z I Z P I R K I I N M I K R O B I O L O Š K E P R E I S K A V E

Vzorčenje z izpirki uporabljamo za ugotavljanje higienskega stanja težko dostopnih mest, embalaže (povratne in nepovratne). Na primer: izpirek steklenice: v steklenico nalijemo 10 ml sterilne fiziološke raztopine, jo pokrijemo z originalnim pokrovčkom in pretresemo tako, da se fiziološka raztopina razliva po celotni notranji površini steklenice in notranji strani pokrovčka (zamaška). Mikrobiološko preiskavo izvedemo enako kot pri vzorčenju z brisom. M E R J E N J E A T P - B I O L U M I N I S C E N C E

Adenozin trifosfat (ATP) je univerzalni nosilec energije v metaboličnih reakcijah v vseh živih celicah. Določanje snažnosti z meritvami ATP-bioluminiscence temelji na merjenju svetlobe, ki se kot stranski produkt sprosti med encimsko pretvorbo luciferina v oksiluciferin (Slika 9). Slika 9: Princip merjenja ATP-bioluminiscence

Emisija svetlobe se meri z luminometrom pri 562 nm v relativnih svetlobnih enotah RLU (angl. Relative Light Unit). Izmerjen delež svetlobe je pri standardiziranih reakcijskih pogojih sorazmeren količini ATP v vzorcu. Ker je količina ATP v metabolično aktivnih mikrobnih celicah relativno konstantna (v mrtvih celicah se ATP hitro razgradi), je delež izmerjene svetlobe lahko sorazmeren s številom živih celic v vzorcu. Zveza med količino ATP in številom mikroorganizmov na hranljivih podlogah je dobra v primerih, ko gre za laboratorijske vzorce kultur. V praksi je v vzorcih izmerjena količina ATP v korelaciji z vsemi celicami sposobnimi za življenje (mikrobne, rastlinske, animalne) in ne samo z ATP mikrobnega izvora. Na splošno sicer velja, da je na umazani površini veliko število mikroorganizmov in velika količina ATP, na čisti površini pa je malo mikroorganizmov in majhna količina ATP. Meritve ATP zaznajo tudi ostanke organskega

svetloba

ATP

O2

luciferin

luciferaza

AMP

oksiluciferin

CO2 + PPi

Mg2+


54

izvora (ostanki živil na delovnih površinah), ki so lahko idealno gojišče za mikroorganizme, in zato odločitev o čistosti oziroma umazanosti površine temelji na dejanski prisotnosti ostankov hrane in mikroorganizmov. Metoda merjenja ATP-bioluminiscence je zelo hitra (nekaj minut) in omogoča ustrezno hitro ukrepanje. Kot omejitve so pogosto v literaturi navedeni naslednji parametri: relativno nizka občutljivost (104 do 106 cfu/ml), mikrobne celice v stacionarni fazi rasti in pod stresom imajo manjše količine ATP, meritev je odvisna od encimske reakcije in ta od razmer v okolju (na primer sredstva za razkuževanje zmanjšajo aktivnost luciferaze). M E R J E N J E N A D I N N A D P

Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) in nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADP) sta koencima, ki sodelujeta v celičnem metabolizmu. NAD je predvsem vključen v katabolične reakcije, NADP pa v anabolične reakcije. Biološka oksidacija – dehidrogenacija pomeni, da se organska molekula oksidira, izgubi dva atoma vodika, medtem ko se molekula NAD reducira. Koencim NAD sprejme dva elektrona in en proton in nastane NADH, drug proton gre v okolje (Slika 7). Reduciran koencim NADH ima več energije kot NAD in energija se uporabi v kasnejših reakcijah tvorbe ATP. Določanje snažnosti z meritvami NAD in NADP temelji na oksidacijsko redukcijski encimski reakciji med organskimi molekulami (ostanki živil, mikroorganizmi) na preiskovani površini, dodanim substratom in encimom. Če so na površini ostanki živil in /ali mikroorganizmi se NAD reducira in posledica je sprememba barve. Metoda je hitra (5 minut) in enostavna. Za meritve ni potrebna posebna aparatura. V kompletu HY-RiSETM (Merck) je:

• sterilen trak za vzorčenje površine, • steklenička z raztopino za vlaženje površine (A), • steklenička z raztopino substrata (B), • steklenička z raztopino encima (C).

Pred vzorčenjem na balazinico na traku nanesemo kapljico raztopine A (če vzorčimo mokre ali vlažne površine, ta stopnja ni potrebna). Gladke površine vzorčimo z počasnim potegom traku po površini (3 cm x 10 cm), hrapave površine vzorčimo z 10x-nim odtisom površine. Nato na blazinico dodamo 1 kapljico raztopine B in 1 kapljico raztopine C. Trak spravimo nazaj v ovojno folijo tako, da je blazinica pokrita in je v temi. Po 4-5 minutah glede na barvno reakcijo odčitamo rezultat. Rumena barva pomeni čisto, rožnata, rdeča, modro vijolična barva pa pomenijo umazano površino.


55

Slika 10: Princip merjenja NAD+

Občutljivost metode HY-RiSETM je v območju pmol NAD. Ugotavljanje čistosti s pomočjo meritev NAD je enakovredno meritvam ATP-bioluminiscence. Metoda je boljša od vizualne kontrole, saj hkrati določi ostanke živil in mikroorganizme na preiskovani površini. Namenjena je ugotavljanju snažnosti različnih površin, rok in tekočin v manjših in srednje velikih živilskih obratih, menzah, restavracijah, trgovinah, mesnicah, pekarnah, hotelih, bolnicah, … Največkrat se vzorčijo površine, ki vsebujejo ostanke živil, na primer delovni pulti, stroji za rezanje, deske za rezanje, oprema, notranjost hladilnikov, mikrovalovnih pečic, različnih posod, kuhinjski pripomočki, kljuke, ročaji, odtoki, tehtnice, skladiščne police, tekoči trakovi…). Metoda je hitra in ima zelo dobro občutljivost. Zato je primerna za vključitev v sistem HACCP, z njeno uporabo izboljšamo splošen higienski nivo ter identificiramo nevarna področja, ki zahtevajo tudi druge mikrobiološke preiskave.

koencim NAD+ (nosilec elektronov)

NADH + H+ (reduciran nosilec elektronov

organska molekula z dvema atomoma vodika

oksidirana organska molekula

oksidacija

redukcija


56

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. Določite snažnost izbrane površine! Uporabite klasično mikrobiološko preiskavo

brisa površine in eno od hitrih metod za kontrolo čistosti! 2. Površino očistite! 3. Ugotovite uspešnost čiščenja s klasično mikrobiološko preiskavo brisa površine ter z

eno od hitrih metod za kontrolo čistosti! Materiali in potek dela: 1. Opišite izbrano površino in potek dela!

2. Vizualno ocenite čistost izbrane površine!


57

Rezultati: 1. Navedite rezultate klasičnih mikrobioloških preiskav brisov ter rezultate, dobljene z

eno od hitrih metod za kontrolo čistosti!

Rezultati klasične metode Rezultati hitre metode

Izbrana površina

N (cfu/bris)pred

čiščenjem

N (cfu/bris)po

čiščenju

Pred

čiščenjem

Po čiščenju

2. Komentirajte dobljene rezultate!


58

8.VAJA: RAZKUŽEVANJE

UVOD

azkuževanje v širšem pomenu besede pomeni uničenje mikroorganizmov, ki imajo lahko negativen učinek na živila. Razkuževanje je zahtevno področje v živilski industriji, kjer je pomembno, da zagotovimo najmanjšo možnost kontaminacije predvsem s patogenimi mikroorganizmi v predelavi, proizvodnji,

skladiščenju in prometu živil. POSTOPKI ZA RAZKUŽEVANJE 1. Fizikalni postopki Različni postopki razkuževanja imajo velik pomen, tako pri omejitvi prenosa patogenih mikroorganizmov kot tudi pri omejitvah prenosa v naravi ali organizmih splošno razširjenih (ubikvitarnih) mikroorganizmov. Zaradi enostavnosti, učinkovitosti in malo stranskih učinkov se fizikalni načini razkuževanja pogosto uporabljajo. Najbolj pogosti postopki poleg mehaničnega čiščenja in visokih temperatur so ventilacija, filtracija, različne vrste sevanja ter nizke temperature. 2. Kemijska sredstva Kemijska sredstva, ki zavirajo rast mikroorganizmov, se imenujejo bakteriostatiki (zavirajo rast bakterij) oziroma fungistatiki (zavirajo rast gliv), kemijska sredstva, ki uničijo mikroorganizme, pa se imenujejo baktericidi oziroma fungicidi. Razkužila imajo različne mehanizme delovanja na mikrobne celice: uničijo zunanjo membrano bakterijske celične stene, uničijo bakterijsko celično steno, uničijo citoplazmatsko membrano, porušijo energetski metabolizem mikrobov tako, da delujejo na ATP, uničijo citoplazmo ali jedro celice ali uničijo strukturo bakterijske spore. Dejavniki, ki vplivajo na učinkovitost razkužil:

• vrsta in število mikroorganizmov ter njihova občutljivost oziroma neobčutljivost na razkužilo,

R

8


59

• koncentracija razkužila, • čas delovanja razkužila, • temperatura raztopine razkužila, • vrsta materiala, • onesnaženost površin.

Lastnosti idealnega razkužila:

• deloval naj bi na čim širši spekter mikroorganizmov, • učinkovit naj bi bil pri čim nižji koncentraciji, • deloval naj bi čim hitreje v čim širšem območju pH in neodvisno od trdote vode, • deloval naj bi tudi v prisotnosti organskih ostankov, čistilnih sredstev, • naj ne bi bil strupen, ne koroziven, • imel naj bi neomejen rok trajanja in bil poceni, • naj bi bil enostaven za uporabo in naj se ne bi penil (razen izjemoma), • naj ne bi imel neprijetnega vonja in naj ne bi spreminjal vonja in okusa živil, • naj bi bil čim hitreje razgradljiv in okolju prijazen.

Ker idealnega čistila in idealnega razkužila ni, moramo pri izbiri sredstev upoštevati vse parametre tako, da izberemo tisto sredstvo ali kombinacijo, ki ima kar najmanj negativnih lastnosti.

RAZREDČEVALNO-NEVTRALIZACIJSKA METODA

Z razredčevalno-nevtralizacijsko metodo (SIST EN 1040, 2001) ugotavljamo učinek različnih koncentracij razkužila v različnih kontaktnih časih na preiskovane kulture. Po standardu SIST EN 1040 (2001) ima dezinfekcijsko sredstvo baktericidno aktivnost takrat, ko zniža število testnih bakterij (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) v določenem kontaktnem času najmanj za 105 cfu/ml. Metoda je standardizirana in kot preiskovane bakterije predpisuje vrsti Pseudomonas aeruginosa in Staphylococcus aureus. Poenostavljena metoda vsebuje naslednje stopnje:

• Pripravimo tri različne koncentracije razkužila, pri tem naj bodo dve koncentraciji v območju, ki ga predpisuje proizvajalec. Za raztopine uporabimo sveže destilirano in sterilizirano voda (ne deionizirano) in sterilno steklovino. Raztopine razkužil razlijemo (po 9 ml) v sterilne epruvete.

• V epruvete nato dodamo 1 ml čiste kulture (18-urna kultura z 108 cfu/ml),

premešamo in merimo kontaktni čas (na primer: 1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min).


60

• Po preteku določenega kontaktnega časa, vsebino epruvete premešamo in 1 ml suspenzije prenesemo v 9 ml nevtralizatorja. Epruveto z razkužilom in kulturo naprej inkubiramo na 20o C.

• Epruveto s kulturo in nevtralizatorjem spet premešamo in iz nje se 2-krat po 1

ml suspenzije prenesemo v prazni sterilni petrijevki.

• V petrijevki nato razlijemo stopljeno in na 45o C ohlajeno gojišče (tripton soja agar s kvasnim ekstraktom) in suspenzijo umešamo.

• Po 24-urni inkubaciji preštejemo kolonije in določimo število kot cfu/ml.

• Baktericidno aktivnost razkužila določimo kot koncentracijo razkužila, ki v

določenem kontaktnem času, zniža število testnih bakterij najmanj za 105 cfu/ml. Celotna metoda vsebuje validacijo nevtralizatorja in validacijo metode.


61

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. Z razredčevalno-nevtralizacijsko metodo določite učinek razkužila na osnovi

kvarternih amonijevih spojin na testne bakterije vrst Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa !

Materiali in potek dela: 1. Komercialni podatki o razkužilu: Ime: Nevtralno razkužilo na osnovi kvarternih amonijevih spojin. Uporaba: Razkužilo z aktivnimi kationskimi učinkovinami je primerno za

razkuževanje s pršenjem, oblivanjem in potapljanjem po temeljitem predčiščenju.

Izgled: Brezbarvna prozorna tekočina. Vonj: Skoraj brez vonja. Gostota: 1g cm-3 (1 kg = 1 l) Vrednost pH (1 %): Nevtralno. Uporaba: Uporablja se 1 – 3 % raztopina, čas učinkovanja 15 min. Agresivnost: Ob predpisani koncentraciji sredstvo ne bo poškodovalo običajnih

materialov. Posebni napotki: Površine, ki pridejo v stik s hrano, po uporabi temeljito sperite z

veliko količino vode. Varnostni napotki: Dražljivo. Draži oči in kožo. Ob stiku s kožo takoj izprati z obilo vode.

Če pride do zaužitja, poiskati zdravniško pomoč in pokazati embalažo ter etiketo.

Embaliranje: Ročke 20 kg Rok uporabe: 18 mesecev 2. V tabelo vpišite podatke ! Pripravljene koncentracije razkužila: Čista kultura: Kontaktni časi: Nevtralizator: Trdno gojišče: Inkubacija:


62

3. Narišite shemo razredčevalno-nevtralizacijske metode za vaš primer!


63

Rezultati: 1. Koncentracija čiste kulture Bakterije vrste N (cfu/ml)

2. Vpišite števila bakterij N (cfu/ml) v razkužilu glede na preizkušene kontaktne čase in

koncentracije razkužila!

Število preživelih bakterij N (cfu/ml) pri različnih koncentracijah razkužila (%) Kontaktni čas

(min)

3. Določite učinek nevtralnega razkužila na osnovi kvarternih amonijevih spojin na

preiskovano kulturo, glede na preiskovane koncentracije in kontaktne čase!


64

9. VAJA: PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST RAZKUŽILA

UVOD činek razkužil je v praksi manjši kot v idealnih razmerah. Na delovanje razkužila vpliva čistost površin, prisotnost nesnage in organskih ostankov, čas in temperatura delovanja ter vrsta in koncentracija mikroorganizmov. Seveda pa na delovanje razkužila vpliva tudi koncentracija, način priprave, pakiranja, uporabe

in shranjevanja. Za razkužila v uporabi moramo izvajati nadzor načina uporabe in občasno preverjanje kontaminiranosti z mikroorganizmi, zlasti manj učinkovitih oziroma določiti njihovo učinkovitost. DOLOČANJE UČINKOVITOSTI RAZKUŽILA Za določanje učinkovitosti razkužila uporabljamo mikroorganizme glede na posamezne povzročitelje bolezni ali pa ugotavljamo učinek razkužila na ubikvitarne mikrobe (splošno razširjene mikroorganizme), koliformne bakterije in stafilokoke. Učinek razkužila določamo s preživelimi mikroorganizmi na enoto površine. Nekatere definicije, ki navajajo, kaj pomeni dobro razkužilo: Za dobro razkužilo velja, da je na površini 100 cm2 po razkuževanju manj kot 100 mikroorganizmov (Pintarič, Dobeic, 2001). Dobro razkužilo uniči od 75 x 106 do 125 x 106 bakterij Escherichia coli in Staphylococcus aureus po 30 s delovanja pri 20o C (Marriott, 1995). Po standardu SIST EN 1040 (2001) ima dezinfekcijsko sredstvo baktericidno aktivnost takrat, ko zniža število testnih bakterij (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) v določenem kontaktnem času najmanj za 105 cfu/ml. Področje določanja učinkovitosti razkužil je zelo obsežno in vključuje mnoge metode, ki jih lahko razdelimo med difuzijske (metoda difuzije v trdnem gojišču) in razredčevalne (metoda razredčevanja v tekočem gojišču in metoda razredčevanja v trdnem gojišču). Na osnovi dobljenih rezultatov določimo minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) in mikrobicidne koncentracije (MBK). V nekaterih primerih lahko za določitev učinkovitosti razkužila uporabimo tudi direktno testiranje z brisi površin in nadaljnje mikrobiološke ali kemijske preiskave.

U

9


65

M E T O D A D I F U Z I J E V A GA R J U

Učinek razkužila lahko enostavno, približno določimo z metodo difuzije v agarju tako, da razkužilo nanesemo na sterilne diske, ki so položeni na gojišče z preiskovano mikrobno kulturo. Po končani inkubaciji izmerimo inhibicijske cone. Podroben opis postopka je opisan pri 6. vaji. M E T O D A R A Z R E DČE V A N J A V T E K OČE M G O J I ŠČU

Z metodo razredčevanja ugotavljamo, kako različne koncentracije razkužila delujejo na preiskovano kulturo. V serijo epruvet z ustreznim tekočim gojiščem (Mueller Hinton bujon, triptični soja bujon, bujon BHI) dodamo vnaprej pripravljene padajoče koncentracije razkužila in preiskovano 24-urno mikrobno kulturo. V eksperiment moramo vključiti tudi t.i. kontrolni vzorec, ki je pripravljen enako kot drugi vzorci, le da namesto razkužila dodamo enak volumen sterilne destilirane vode. Vse suspenzije nato določen čas pri določeni temperaturi inkubiramo. Po inkubaciji v epruvetah ugotovimo število preživelih mikroorganizmov. Metodo razredčevanja v tekočem gojišču lahko izvajamo tudi v mikrotiterskih ploščicah pri katerih je princip priprave enak, le da je volumen testne suspenzije manjši. Razlika je tudi v vrednotenju rezultatov, saj po inkubaciji določimo optično gostoto ali spremembo barve suspenzije. Če določamo spremembo barve suspenzije moramo v postopek priprave testne suspenzije vključiti dodatek barvila (na primer TTC – 2,3,5- trifenil tetrazolijev klorid). Aktivno rastoče bakterije brezbarvno barvilo TTC reducirajo in rezultat je precipitacija formazana, ki ga vizuelno zaznamo kot rdečo barvo. Najbolj pogosto merilo učinkovitosti razkužila je določitev minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) in mikrobicidne koncentracije (MBK). Najnižja koncentracija razkužila, ki zavira rast kulture, se imenuje minimalna inhibitorna koncentracija (MIK), najnižja koncentracija razkužila, pri kateri mikroorganizmi ne preživijo pa se imenuje mikrobicidna koncentracija (MBK). Definicije MIK se med avtorji nekoliko razlikujejo in zato je rezultate različnih raziskav včasih težko primerjati med seboj. MIK najmanjša koncentracija snovi, ki popolnoma prepreči razmnoževanje izbranega mikroorganizma za vsaj 48 ur (Cannilac in Mourey, 2001), MIK je najmanjša koncentracija snovi, ki prepreči vidno rast izbranega mikroorganizma (Delaquis in sod., 2002; Hammer in sod., 1999) ali MIK je najmanjša koncentracija snovi, ki povzroči več kot 90 % zmanjšanje živosti izbranega mikroorganizma (Cosentino in sod., 1999). Podobno je MBK tista koncentracija izbrane snovi, ki ubije 99,9 % ali več % mikroorganizmov (Cosentino in sod., 1999), oziroma MMK je koncentracija snovi, pri kateri ni rasti mikroorganizmov in ti ne rastejo niti po preceplanju na sveže gojišče.


66

D I R E K T N O T E S T I R A N J E Z B R I S I P O V R Š I N

Učinek razkužila lahko določimo s številom preživelih mikroorganizmov na določeni površini po določenem času delovanja razkužila. Opis postopka vzorčenja z brisom in nadaljnje preiskave brisa so opisani pri 7. vaji. Na podobne načine lahko določamo tudi protimikrobne učinke konzervansov in naravnih protimikrobnih snovi.


67

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. Z metodo razredčevanja v tekočem gojišču v mikrotiterski ploščici določite MIK

izbranega razkužila (Klorheksidin diacetat) na grampozitivne bakterije vrste Staphylococcus aureus in gramnegativne bakterije vrste Escherichia coli.

Materiali in potek dela: 1. Komercialni podatki o razkužilu Ime: Klorheksidin diacetat monohidrat Molekulska formula: C22H30Cl2N10 . 2CH3COOH . H2O Uporaba: Razkužilo z aktivnimi kationskimi učinkovinami iz skupine

bisguanidov Topnost: V vodi; 15 mg/ml 2. Priprava bakterijskih kultur, gojišča in testne suspenzije • Čisti kulturi bakterij Staphylococcus aureus in Escherichia coli v tekočem gojišču TSB

(triptični soja bujon) bodo 22 ur pred vajo precepljeni v TSB in tako pripravljeni kulturi uporabite za delo. Predvidevamo, da bodo bakterije zrasle do koncentracije 108

cfu/ml. • Vnaprej pripravljeno tekoče gojišče TSB, kateremu je dodano 0,1 % TTC razdelite v

mikrotitersko ploščico v vsak predviden prostor po 180 µl. • Nato dodajte v vsak prostor 10 µl bakterijske kulture in vsebino premešajte. • Testna suspenzija: v predvidene prostore dodajte 10 µl vnaprej pripravljenih

koncentracij razkužila in testno suspenzijo premešajte. Predvidite testiranje desetih koncentracij razkužila in vsako koncentracijo naredite v paralelki. Predvidene koncentracije razkužila: 15,625 µg/ml; 7,813 µg/ml; 3,906 µg/ml; 1,953 µg/ml; 0,976 µg/ml; 0,488 µg/ml; 0,244 µg/ml; 0,122 µg/ml; 0,061 µg/ml; 0,031 µg/ml.

• Kontrolna vzorca: v prva dva prostora A1 in A2 oz. E1 in E2 dodajte po 180 µl tekočega gojišča TSB, 10 µl bakterijske kulture in 10 µl sterilne destilirane vode.

3. Spremljanje aktivnosti bakterijskih kultur Po določenem času delovanja razkužila – 24 urna inkubacija pri 37 oC - določite v testnih suspenzijah in kontrolnih vzorcih aktivno rast bakterij oz. odmiranje glede na spremembo barve gojišča in MIK za posamezno vrsto bakterij.


68

Rezultati 1. Dopolnite shemo metode razredčevanja v tekočem gojišču na mikrotiterski ploščici! Bakterijska kultura: Sestava testnih suspenzij: Sestava kontrolnega vzorca: Testne koncentracije razkužila:

2. V spodnjo shemo mikrotiterske ploščice vpišite koncentracije razkužila (µg/ml) ter

označite bakterijske kulture:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A B C D E F G H


69

3. Po inkubaciji določite aktivno rast bakterij ter MIK za bakterije vrst Staphylococcus aureus in Escherichia coli!

Rezultate rasti oz. odmiranje vpišite v spodnjo shemo mikrotiterske ploščice kot + oz. -.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A B C D E F G H

Staphylococcus aureus MIK: _________________________ Escherichia coli MIK : ___________________________ 4. Komentirajte rezultate in navedite kako bi določili MMK!


70

10. VAJA: OSEBNA HIGIENA UVOD

sebna higiena vključuje vse, kar mora in more delati posameznik, da ohranja in krepi svoje zdravje. Ljudje oziroma človek, ki sodeluje v proizvodnji in prometu z živili, je kljub sodobnim tehnologijam in vedno večji stopnji avtomatizacije v živilstvu, še vedno glavni vir ali vzrok kontaminacije živil z

bakterijami. Človekove roke, lasje, izdihan zrak, znojenje, kašljanje, kihanje, so le nekateri dejavniki, ki so pomembni kot prenašalci mikrobov. Ustrezna osebna higiena vseh zaposlenih v živilstvu je zato eden od zelo pomembnih dejavnikov, ki doprinesejo k proizvodnji varnih živil. Za boljše razumevanje pomena osebne higiene so v nadaljevanju navedeni posamezni deli človekovega organizma, ki so lahko potencialen vir kontaminacije. Mikroorganizme, ki naseljujejo kožo in sluznice zdravih ljudi, lahko razvrstimo v dve skupini. Stalna mikrobna flora so tisti mikroorganizmi, ki jih v nekem starostnem obdobju najdemo na enakem območju. Prehodna mikrobna flora so nepatogeni al pogojno patogeni mikroorganizmi, ki začasno naseljujejo kožo ali sluznice. Če pride do motenj v sestavi normalne mikrobne flore, lahko mikrobi prehodne flore kolonizirajo neko območje, se namnožijo in povzročijo okužbo. NORMALNA MIKROBNA POPULACIJA KOŽA Koža ima pri človeku vsaj štiri pomembne funkcije: ščiti tkiva in organe pod njo, je čutilo ter sodeluje pri regulaciji telesne temperature in pri izločanju. Zunanji del povrhnjice (corneum) zunanje plasti kože (epidermis) vsebuje 20 –30 celic debelo plast, ki je nepropustna za mikroorganizme. To tkivo se obnavlja z novo rastočimi celicami vsakih 4 do 5 dni. Velikost odmrlih celic je približno 30 x 0,6 µm in gredo zlahka, na primer pri preoblačenju, v zrak. Notranje plasti kože (dermis) sestavljajo vezivno tkivo, elastična vlakna, krvne in limfne žile, živčno tkivo, mišično tkivo, različne žleze in vodi. Žleze znojnice izločajo znoj in žleze lojnice maščobo. Koža deluje kot organ, ki na površini stalno izloča znoj in maščobe ter odlaga odmrle celice. Ko se ti materiali zmešajo s snovmi iz okolja, na primer s prahom, z umazanijo, z maščobo, je to idealno gojišče za rast bakterij. Tako koža postane potencialen vir bakterijske kontaminacije. Neustrezno umivanje rok in vzdrževanje telesne higiene tako pomenita povečano število bakterij na koži, le te pa se lahko širijo tudi z odmrlimi kožnimi celicami v okolje.

O

10


71

Ob ustrezni osebni higieni pa seveda koža deluje kot naravna ovira za prehod mikroorganizmov. Večina mikroorganizmov se na koži inaktivira (razen komensalov – mikrobi normalne flore), saj so maščobne kisline in nekateri drugi izločki močna antimikrobna sredstva (zaradi maščobnih kislin je pH kože okrog 5,5). Komensali na koži: Na koži sta normalno dve dominantni vrsti bakterij Staphylococcus aureus in S. epidermis. Te bakterije so tudi v lasnih mešičkih in kanalih žlez znojnic. Globoko v kožnih porah so v obliki mikrokolonij pogosto bakterije vrst Micrococcus luteus in S. epidermis. ROKE, NOHTI Posebno pozornost je treba posvetiti higieni rok, saj so roke tiste s katerimi se človek dotika različnih predmetov (umazane opreme, drugih delov telesa, obleke) in lahko mikroorganizme direktno prenese na živila. Zelo pomembna je tudi higiena nohtov, saj je zanohtje lahko leglo mikrobov in jajčec parazitov. LASJE Tudi na laseh so mikroorganizmi, med katerimi prevladujejo stafilokoki. Zato je na primer nujno, da si zaposlen v živilstvu po česanju las, umije roke. Prav tako je za zaposlene v živilstvu nujno, da nosijo pokrivala. OČI V/na očesu normalno ni bakterij. Že manjša vnetja pa pomenijo tudi povečano število bakterij. Te so na trepalnicah in v očesnem kotu. Zato je tudi v takih primerih, da se z rokami bakterije prenesejo v okolje. DIHALA V nosu in žrelu je normalno manj bakterij kot v ustih. Obnosne votline, grlo, sapnik, bronhiji in alveoli pa so praviloma sterilni. V nosni votlini prevladujejo koagulazno negativni stafilokoki, korinebakterije in najserije, medtem ko je v žrelu več alfahemolitičnih streptokokov. Trideset odstotkov zdravih ljudi ima v nosni votlini bakterije vrste Staphylococcus aureus, 25 – 80 % ljudi ima v zgornjem delu dihalnega trakta tudi bakterije vrste Haemophilus influenzae. V zgornjem delu dihalnega trakta so pomembne tudi bakterije vrst Streptococcus pyogenes in Enterococcus faecalis. Občasno lahko mikroorganizmi preidejo mukozne membrane in se naselijo v grlo in dihalni trakt. Največkrat so to stafilokoki, streptokoki in enterokoki. Navaden prehlad je najpogostejša infekcijska bolezen. V začetni fazi je to virusna infekcija, navadno pa ji sledi sekundarna infekcija, ki pa je lahko tudi bakterijska. Zato je tudi pri prehladu potrebna posebna pozornost pri higieni nosu in rok. PREBAVILA V prebavilih so mikrobi naseljeni v ustih, požiralniku, želodcu, tankem in debelem črevesu, medtem ko jetra in žolčnik praviloma ne vsebujeta mikroorganizmov. V ustni votlini je mnogo bakterij (Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Actinomyces spp.,


72

Propionibacterium spp., Lactobacillus spp.). V ustih so lahko tudi patogene bakterije in virusi, še posebej, če je človek bolan. Izločki prebavnega trakta so primaren vir bakterijske kontaminacije. Približno 30 do 35 % suhe teže intestinalne vsebine so bakterijske celice. V zgornjem delu tankega črevesa prevladujejo bakterije vrste Enterococcus faecalis in stafilokoki, njihovo število se v toku tankega črevesa povečuje. V debelem črevesu je mikrobna flora zelo heterogena in številčna in poleg bakterij vsebuje tudi parazite in glive. V debelem črevesu je več kot 100 različnih vrst mikroorganizmov (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp., Lactobacillus spp., Bacteroides spp., Bifidobacterium spp., Clostridium perfringens, Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Escherichia coli in druge). Če je osebna higiena neustrezna se bakterije prenesejo v okolje. Kadar človek zboli se mikrobna populacija zelo poveča in s tem tudi se močno povečajo tudi možnosti za kontaminacijo okolja. Streptokoki so normalno okrog ognojkov, aken, turov, inficiranih vreznin, oči in ušes. Vnetje sinusov, vnetje grla, zbadajoče kašljanje in drugi simptomi prehlada prav tako pomenijo povečanje števila mikrobne populacije. Enako velja za različna gastrointestinalna obolenja kot je na primer driska in želodčne motnje. Bolezni oziroma bakterije, ki se prenašajo iz bolnega človeka na živila, so bolezni dihalnega trakta (na primer vneto grlo, različna vnetja v ustni in nosni votlini, pljučnica, tuberkuloza) in motnje v prebavnem traktu (na primer bolečine v trebuhu, bruhanje, krči, driska). Pri mnogih boleznih lahko mikroorganizmi, ki so bolezen povzročili, ostanejo v organizmu tudi po preboleli bolezni. Taki ljudje so poznani kot klicenosci. Ti mikroorganizmi so lahko vzrok rekontaminacijam. Na primer, salmonele lahko po preboleli bolezni ostanejo v človeku še več mesecev ali let. Prav tako ostanejo virusi v prebavnem traktu še več let po prebolelem hepatitisu. Umivanje/dezinfekcija rok:

• roke zmočimo in splakemo s tekočo toplo vodo, • roke namilimo z dezinfekcijskim milom (1 – 3 ml) ustrezne koncentracije in

umivamo roke določen čas (koncentracijo mila in čas umivanja predpiše proizvajalec),

• roke dobro splaknemo pod toplo tekočo vodo, • roke popolnoma osušimo s papirnato brisačo.


73

PRAKTIČNO DELO Namen: 1. Določite mikrobno populacijo na lasu! 2. Določite mikrobno populacijo na ustnici! 3. Določite mikrobno populacijo v zanohtju! 4. Določite mikrobno populacijo na dlani pred umivanjem, po umivanju z vodo, po

umivanju z tekočim milom in po umivanju s tekočim milom ter dezinfekciji! Ugotovite učinkovitost različnih načinov umivanja rok!

Materiali in potek dela:


74

Rezultati: 1. Mikrobna populacija na lasu

2. Mikrobna populacija na ustnici

3. Mikrobna populacija v zanohtju


75

4. Mikrobna populacija na roki pred umivanjem, po umivanju z vodo, po umivanju z navadnim milom in po umivanju z dezinfekcijskim milom

Število mikroorganizmov N (cfu / bris)

Voda Tekoče milo Tekoče milo in dezinfekcija

Pred 1-min umivanjem

Po 1-min umivanju


Po 3-min umivanju


Po 6-min umivanju

5. Učinkovitost umivanja rok

Učinkovitost (%)

Čas / način Voda Tekoče milo Tekoče milo in dezinfekcija

1-min umivanje

3-min umivanje

6-min umivanje


76

ZAPISKI


77

LITERATURA

Alexander S. K., Strete, D. 2001. Microbiology: A photographic atlas for the laboratory. San Francisco, Benjamin Cummings: 1-101

Barry M. 2002. Focus on personal hygiene through HACCP. International Food Hygiene, 12, 7: 17-19

Bogaerts R., Wolf F. 1980. A standardized method for the detection of residues of anti-bacterial substances in fresh meat. Fleischwirtschaft, 60, 40: 672-673

Bole-Hribovšek V., Hostnik P. 1996. Osnove dela v mikrobiološkem laboratoriju. Priročnik za vaje iz mikrobiologije za veterinarje. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta: 48-49

Cannilac N., Mourey A. 2001. Antibacterial activity of the essential oil of Picea excelsa on Listeria, Staphylococcus aureus and coliform bacteria. Food Microbiology, 18: 261-268

Cappuccino J. G., Sherman, N. 1996. Microbiology. A laboratory manual. 4th ed. Menolo Park, The Benjamin Cummings Publishing Company: 1-214

Cosentino S., Tuberoso C.I.G., Pisano B., Satta M., Mascia V., Arzedi E., Palmas F. 1999. In vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential oils. Letters in Applied Microbiology, 29: 130-135

de Boer E., Beumer R.R. 1999. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. International Journal of Food Microbiology, 50, 119-130

Delaquis P.J., Stanich K., Girard B., Mazza G. 2002. Antimicrobial activity of individual and mixed fractions of dill, cilantro, coriander and eucalyptus essential oils. International Journal of Food Microbiology, 74: 101-109

Evancho G. M., Sveum W. H., Moberg L. J., Frank F. J. 2001. Microbiological monitoring of the food processing environment. V: Compedium of methods for the microbiological examination of foods. 4th ed. Downes F. P., Ito K. (eds.). Washington, American Public Health Association: 25-36

Grare, M., FontanayS., Cornil, C., Finance, C., Duval, R. E. 2008. Tetrazolium salts for MIC determination in microplates: Why? Which salt to select? How? Journal of Microbiological Methods 75, 156–159

Hammer K.A., Carson C.F., Riley T.V. 1999. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extract. Journal of Applied Microbiology, 86: 985-990

Hayes, P. R. 1996. Food microbiology and hygiene. 2nd ed. London, Elsevier Applied Science Publisher: 516 str.

Jevšnik M. 2001. Ostanki nekaterih onesnažil okolja in veterinarskih zdravil v tkivih perutnine v Sloveniji. Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 102 str.


78

Jančigaj G. 2000. Merjenje ATP-bioluminiscence kot možne metode za hitro kontrolo uspešnosti čiščenja v mlekarskem obratu. Diplomska naloga. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 73 str.

Jay, J. 2000. Modern food microbiology. 6th ed. New York,Van Nostrand Reinhold: 177–277

Langsruda, S., Sidhua M. S., Heir, E., Holck A. L. 2003. Bacterial disinfectant resistance—a challenge for the food industry. International Biodeterioration & Biodegradation 51, 283 – 290

Logan J.M.J., Edwards K.J. 2004. An overview of Real-time PCR platforms. V: Real-time PCR an essential guide. Edwards K., Logan J., Saunders N. (eds.)., London, Health Protection Agency: 13-30

MacNeil J. D., Kay, J. F. 2000. Regulatory aspects of residue analysis. V: Residue analysis in food. principles and applications. O`Keeffe, M. (ed.). Amsterdam, Overseas Publishers Association: 277-299

Mackay I.M., 2004. Real-time PCR in the microbiological laboratory. Clinical Microbiology and Infection, 10, 3: 190-212

Manafi M. 2000. New developments in cromogenic anf fluorogenic culture media. International Journal of Food Microbiology, 60, 205-218

Merck HY-RiSETM colour hygiene strip test. 2001. Darmstadt, Merck: 3 str.

Merck hygiene monitoring. 2000. Darmstadt, Merck: 9 str.

Meyer, B. Does microbial resistance to biocides create a hazard to food hygiene? 2006. International Journal of Food Microbiology 112, 275–279

O`Keeffe M. 2000. Introduction. V: Residue analysis in food. Principles and applications. O`Keeffe M. (ed.). Amsterdam, Overseas Publishers Association: 277-299

PCR protocols. A guide to methods and applications. 1990. Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J., White T. J. (eds.), San Diego, Academic Press: 3-28

Pintarič Š., Dobeic M. 2001. Dezinfekcija, dezinsekcija in deratizacija v veterinarski medicini. Ljubljana, Veterinarska fakulteta: 14-50

Prescott L. M., Harley J. P., Klein, D. A. 1993. Microbiology. Dubukue,: Wm. C. Brown Publishers: 404-459

Real-Time PCR Systems. Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR SYstem and 7300/7500/7500 Fast. Chemistry guide. 2004. Foster city, USA, Applied Biosystems: 2-1 – 2-7

Reuter, G. 1998. Disinfection and hygiene in the field of food of animal origin. International Biodeterioration and Biodegradation, 41, 209-215

Saunders N.A. 2004. An introduction to real-time PCR. V: Real-time PCR an essential guide. Edwards K., Logan J., Saunders N. (eds.). London, Health Protection Agency: 1-12


79

Seme K. 2002. Normalna mikrobna flora. V: Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo. Gubina M., Ihan A. (ur.). Ljubljana, Medicinski razgledi: 59-64

Sequence detection systems. Chemistry guide. 2003. Foster City, USA, Applied Biosystems: 2-2 – 2-7

SIST EN 1040:2001. 2001. Kemična razkužila in antiseptiki – Osnovno baktericidno delovanje – Preskusna metoda in zahteve (faza 1). Chemical desinfectants and antiseptics – Basic bactericidal activity – Test method and requirements (phase 1). 32 str.

SIST EN ISO 16140:2003. 2003. Mikrobiologija živil in krme: protokol za validacijo alternativnih metod: 78 str.

Stead, D. A. 2000. Current methodologies for the analysis of aminoglycosides. Journal of Chromatography B, 747, 69-93

Thomas E. J. G., King E. J., Burchak J. and Gannon V. P. J. 1991. Sensitive and specific detection of Listeria monocytogenes in milk and ground beef with polymerase chain reaction. Applied and Environmental Microbiology, 57, 2576-2580

Tortora G. J., Funke B. R., Case C. L. 2001. Microbiology: an introduction. 7th ed. San Francisco, Benjamin Cummings: 184-209

Trkov M., Jeršek B., 2001. Vpliv različnih hitrih metod osamitve genomske DNK salmonel na občutljivost PCR = The effect of different rapid methods for isolation of Salmonella genomic DNA on PCR sensitivity. Zbornik Biotehniške fakakultete Univerze v Ljubljani, Kmetijstvo, 1: 27-37

Zakon o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (ZZUIZS). 2000. Uradni list Republike Slovenije, 12, 42: 6949-6977

Zakon o spremembah in dopolnitvah zakona o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (ZZUIZS-A). 2002. Uradni list Republike Slovenije, 10, 52: 4072-4075

Documents

Higiena živil - bf.uni-lj.si · Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo HIGIENA ŽIVIL Barbara Jeršek Ljubljana, 2009 LABORATORIJSKE VAJE ZA ŠTUDENTE