Embed Size (px)
Citation preview
Ministerie van de Vlaamse Gemeenschap Departement leefmilieu en infrastructuur Administratie Milieu-, Natuur-, Land-, en Waterbeheer In samenwerking met de Vlaamse Milieumaatschappij November 2000 2
de herziene druk
Handboek voor de karakterisatie van de bodems van de Vlaamse
waterlopen, volgens
TRIADE
COLOFON
Redactie Eric de Deckere Ward De Cooman Marc Florus Marie Paule Devroede-Vander Linden Onder nazicht van VITO (expertisecentra TOX) Verantwoordelijke uitgever Marie Paule Devroede-Vander Linden Afdeling Water Emile Jacqmainlaan 20 1000 Brussel Tel. 02/550.21.11 Fax. 02/550.21.15 Kostprijs: 500 Bef
Handboek voor de karakterisatie van de bodems van de Vlaamse waterlopen, volgens de Triade
Deze handleiding is tot stand gekomen door de samenwerking tussen de volgende instanties: AMINAL - Afdeling Water Emile Jacqmainlaan 20 1000 Brussel Tel. 02/553.21.13 Fax. 02/553.21.15 email [email protected] met medewerking van: Vlaamse Milieumaatschappij Afdeling Meetnetten en Onderzoek A. Van Maelestraat, 96 9320 Erembodegem Tel. 053/72.62.11 Fax 053/77.71.68 email [email protected] of [email protected] Coördinatie en globale beoordeling Eric de Deckere, Ward De Cooman & Marc Florus o.l.v. Prof. Dr. P. Meire & Prof. Dr. Rudi Verheyen UIA/departement Biologie Universiteitsplein 1C 2610 Wilrijk Tel. 03/820.22.87 Fax. 03/820.22.71
email. [email protected]
Monsterneming en fysisch-chemische analysen Greet De Schutter, Eddy Rillaerts & Donald Vergauwe Provinciaal Instituut voor Hygiëne Kronenburgstraat 45 2000 Antwerpen tel. 03/259.12.00 fax. 03/259.12.01 email [email protected] Ecotoxicologisch Onderzoek Marnix Vangheluwe en Prof. Dr. Colin Janssen o.l.v. Prof. Dr. Guido Persoone Laboratorium voor Milieutoxicologie en Aquatische Ecologie Jozef Plateaustraat 22 9000 Gent tel. 09/264.37.66 fax. 09/264.41.99 email [email protected] Biologisch Onderzoek Steven Heylen, Philippe Carchon, Mattias Bossaer en Lieven Detemmerman o.l.v. Prof. Dr. Niels De Pauw Laboratorium voor Milieutoxicologie en Aquatische Ecologie Jozef Plateaustraat 22 9000 Gent tel. 09/264.37.68 fax. 09/264.41.99 email [email protected]
i
INHOUDSOPGAVE
INLEIDING 1
BEMONSTERING 3
1. Voorbereiding 4
1.1 Situering en doelstelling van het onderzoek 4
1.2 Verzamelen van gegevens die betrekking hebben op de te onderzoeken problematiek en de
specifieke waterloop 4
1.3 Prospectie ter plaatse 6
1.4 Opstellen van een bemonsteringsplan 7
2. Uitvoering 9
2.1 Materiaal 9
2.1.1 Bemonsteringsvoertuigen 9
2.1.2 Bemonsteringsmateriaal 9
2.1.3 Merken bemonsteringsplaats 10
2.1.4 Verpakkingen 10
2.1.5 In-situ metingen 10
2.1.6 Bescherming en veiligheidskledij 10
2.1.7 Reinigingsmogelijkheden voor het materiaal en de monsternemers 10
2.1.8 Bijkomende benodigdheden 10
2.2 Bemonsteringsstrategie 10
2.2.1 Bemonsteringspatroon en -methode 11
2.2.2 Mengmonsters 14
2.2.3 Bemonsteringsdiepte 15
2.2.4 Bemonsteringsfrequentie 16
2.3 Transport, opslag en bewaring 16
2.4 In situ metingen 16
2.5 Veldprotocol en bemonsteringsverslag 16
3. Evaluatie van de bemonstering 17
Referenties 18
Bijlage 1: Voorbeeld van een prospectiefiche 19
Bijlage 2: Van Veen grijper 20
Bijlage 3: Voorbeeld van een veldprotocol 21
FYSISCH-CHEMISCHE ANALYSEN 27
1. Voorbehandeling van waterbodemmonsters 27
1.1 Toepassingsgebied 27
1.2 Werkwijze 27
1.3 Analysetermijnen 27
Referenties 28
2. Bepaling van droge stofgehalte 29
2.1 Toepassingsgebied 29
2.2 Werkwijze 29
Referenties 29
3. Bepaling van totaal organische koolstof (TOC) in waterbodems 30
ii
3.1 Toepassingsgebied 30
3.2 Principe 30
3.3 Werkwijze 30
Referenties 31
4. Bepaling van extraheerbare organo-halogenen in waterbodems 32
4.1 Toepassingsgebied 32
4.2 Principe 32
4.3 Werkwijze 32
Referenties 33
5. Bepaling van apolaire koolwaterstoffen in waterbodems met behulp van infrarood
spectrofotometrie 34
5.1 Toepassingsgebied 34
5.2 Principe 34
5.3 Werkwijze 34
5.3.1 Controle reagentia 34
5.3.2 Extractie en zuivering 35
5.3.3 Meting van het monsterextract 36
Referenties 36
6. Bepaling van PAK’s in waterbodems 37
6.1 Toepassingsgebied 37
6.2 Principe 37
6.3 Werkwijze 37
6.3.1 Monstervoorbereiding 37
6.3.2 Extractieprocedure 38
6.3.3 Zuivering 38
6.3.4 Analysetechniek 38
Referenties 40
7. Bepaling van organochloorpesticiden en polychloorbifenylen in waterbodems 41
7.1 Toepassingsgebied 41
7.2 Principe 41
7.3 Werkwijze 41
7.3.1 Monstervoorbereiding 41
7.3.2 Extractieprocedure 42
7.3.3 Zuivering 42
7.3.4 Analysetechniek 43
Referenties 44
8. Bepaling van ammoniakale en organische stikstof in water-bodems (kjeldahl) 45
8.1 Toepassingsgebied 45
8.2 Principe 45
8.3 Werkwijze 45
8.3.1 Monsterdestructie 45
8.3.2 Destillatie 46
8.3.3 Analyse 46
Referenties 46
9. Mineralisatie met koningswater voor de bepaling van totale P en zware metalen in waterbodems
47
9.1 Toepassingsgebied 47
9.2 Principe 47
9.3 Werkwijze 47
9.3.1 Mineralisatie 47
9.3.2 Koude damp methode 48
9.3.3 Analyse 48
Referenties 48
iii
10. Kleigehalte 49
10.1 Toepassingsgebied 49
10.2 Principe 49
10.3 Werkwijze 49
10.3.1 Voorbehandeling 49
10.3.2 Bepaling van het kleigehalte 52
Referenties 54
ECOTOXICOLOGISCHE TESTEN 55
1. Staalbehandeling en bewaring 55
1.1 Behandeling 55
1.2 Bewaring 55
2. Bioassays op het poriënwater 56
2.1 Algengroei-inhibitietest met de alg Raphidocelis subcapitata 56
2.1.1 Inleiding 56
2.1.2 Definities 56
2.1.3 Principe van de testmethode 57
2.1.4 Standaard testprocedure 57
2.2 Acute mortaliteitstest met het kieuwpootkreeftje Thamnocephalus platyurus 62
2.2.1 Inleiding 62
2.2.2 Definities 63
2.2.3 Principe van de testmethode 63
2.2.4 Standaard testprocedure 63
3. Bioassay op het bulksediment 67
3.1 Acute sedimentcontacttest met de amfipode Hyalella azteca 67
3.1.1 Inleiding 67
3.1.2 Definities 67
3.1.3 Principe van de testmethode 68
3.1.4 Standaard testprocedure 68
Referenties 74
Bijlage 76
1. Inleiding 76
2. Methodebeschrijving 76
3. Voorbeeld 77
BIOLOGISCHE INDEXEN 79
1. Behandeling en verwerking monsters 79
2. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse 80
3. Chironomiden-onderzoek 81
3.1 Identificatie van de Chironomus-larven 81
3.2 Identificatie van het 4de larvale stadium 82
3.3 Prepareren van de kopkapsels 83
3.4 Evaluatie van de morfologische misvormingen 85
4. Gegevensverwerking 89
4.1 Biotische waterbodem index (BWI) 89
4.2 % Misvormingen Chironomus-larven 90
Referenties 94
iv
Bijlage 96
KWALITEITSBEOORDELING 99
1. Fysisch-chemische classificatie 99
1.1 Fysisch-chemische variabelen 99
1.2 Correctie voor bodemtype 100
1.3 Fysisch-chemische referentietoestand 101
1.4 Berekening van de verhouding t.o.v. de referentie (VTR) 101
1.5 Indeling in klassen 102
1.6 Weergave op kaart 103
2. Ecotoxicologische beoordeling 105
2.1 Ecotoxicologische variabelen 105
2.2 Omrekenen naar effecteenheden (E.E.) 105
2.3 Ecotoxicologische referentietoestand 105
2.4 Berekening verhouding t.o.v. de referentie 106
2.5 Indeling in klassen 106
2.6 weergave op kaart 107
3. Biologische beoordeling 108
3.1 Biologische variabelen 108
3.2 Biologische referentietoestand 108
3.3 Indeling in klassen 108
3.4 Weergave op kaart 110
4. Geïntegreerde verwerking 111
1
INLEIDING
Door verschillende onderzoeksgroepen werden methodieken geselecteerd en onderzocht
naar hun efficiëntie voor de monstername, analyse en karakterisatie van waterbodems in
Vlaanderen. In dit handboek worden de materialen en de methoden voorgesteld in de
eerste 4 hoofdstukken van het handboek. In het laatste hoofdstuk wordt de Triade-
beoordelingsmethodologie voorgesteld die leidt tot een ecologisch onderbouwde
karakterisatie van een waterbodem.
Het is van belang te beseffen dat deze methoden en beoordeling ontwikkeld zijn uit een
langdurig onderzoek waaruit verschillende ervaringen rond de waterbodemproblematiek zijn
opgedaan. Het was dan ook zinvol vanuit deze ervaringen de methoden te bundelen in een
handboek dat eventueel door andere laboratoria kan gebruikt worden. Er is gekozen voor
gemakkelijk toe te passen, kosteneffectieve technieken. Bovendien zijn de fysisch-
chemische technieken algemeen erkend. Ecotoxicologische en biologische testen zijn
voorgesteld en geëvalueerd na een grondige methodologische- en evaluatiestudie. En de
monstername is gegroeid uit een ervaring van 440 locaties.
In het eerste hoofdstuk wordt het bemonsteringsprotocol uitgewerkt. De initiële belangrijke
stap bij de inventarisatie van waterbodems. Een analyse mag correct zijn uitgevoerd, de
onjuiste keuze van de bemonsteringsplaats, het nemen van een onvoldoende aantal stalen
of op een onoordeelkundige wijze, kan een verkeerd beeld van de eigenschappen en de
samenstelling van het sediment weergeven.
De kennis van de aanwezigheid van organische en anorganische micropolluenten
(Hoofdstuk 2) in diverse milieucompartimenten is van aanzienlijk belang gezien het
mutageen en toxisch karakter van verschillende van deze componenten. Kennis van het
voorkomen en het gedrag van organisch en anorganische micropolluenten is derhalve
belangrijk bij de karakterisering van waterbodems. Bij het onderzoek naar de bodemkwaliteit
is het aantal mogelijke chemische parameters dat geanalyseerd kan worden nagenoeg
onbeperkt. Het aantal en de keuze van de parameters dat gemeten wordt hangt meestal af
van de beschikbare meetapparatuur, de financiële beperkingen of de voorkennis van het
type verontreiniging. Nochtans zal bij een inventarisatie de lijst van de gemeten parameters
nooit volledig zijn.
De graad van contaminatie van sedimenten wordt bepaald aan de hand van chemische
analyses. Dergelijke analyses geven echter geen uitsluitsel over mogelijke toxische effecten
van xenobiota. De mate waarin dergelijke effecten zich kunnen manifesteren is afhankelijk
van het al of niet beschikbaar zijn van de contaminanten. Deze biobeschikbaarheid kan
worden bepaald door organismen voor een bepaalde duur bloot te stellen aan de
2
verontreinigde waterbodem in ecotoxicologische testen (hoofdstuk 3). De testen die
besproken worden zijn onderverdeeld in testen uitgevoerd op het poriënwater en 1 test
uitgevoerd op het onbehandelde sediment (sediment contact testen). Het gebruik van
poriënwater als representatieve fractie voor de toxiciteit van waterbodems is gebaseerd op
de stelling dat het poriënwater de primaire blootstellingsroute vormt. Andere
blootstellingsroutes zoals ingestie van sedimentpartikels en blootstelling aan de vaste fractie
van het sediment via contact met de lichaamswand worden geëvalueerd in de sediment
contact testen.
De methodieken voor de biologische evaluatie van een waterbodem worden in hoofdstuk 4
voorgesteld. De toestand van de waterbodems wordt aan de hand van de biologische
indexen geëvalueerd. De biotische index met macro-invertebraten en de kaakafwijkingen bij
muggenlarven geven een idee over de graad van verontreiniging. Op die manier wordt een
idee gevormd over de actuele kwaliteit van de waterbodem.
3
BEMONSTERING
Bij het waterbodemonderzoek moet de nodige zorgvuldigheid in acht genomen worden, niet
alleen bij het uitvoeren van de analysen maar ook bij de uitvoering van de monsterneming.
Een onjuiste keuze van de bemonsteringsplaats, het nemen van een onvoldoende aantal
stalen en het onoordeelkundig uitvoeren van de monsterneming, zullen, ook als de verdere
analyse correct uitgevoerd wordt, onbetrouwbare resultaten en dus een verkeerd beeld van
de eigenschappen van het sediment tot gevolg hebben.
Het toepassingsgebied van dit TRIADE-bemonsteringsprotocol is zeer specifiek. Deze
TRIADE-methodologie wordt niet opgelegd in het kader van ruimings- of baggerwerken.
De specifieke eigenschappen van ruimings- en baggerwerken eisen dat er verschillende
afwijkingen zijn ten opzichte van de hieronder beschreven bemonsteringsmethode. De
bemonsteringsdiepte in functie van geplande baggerwerken zal afhankelijk zijn van de
wenselijke baggerdiepte zodat ook andere apparatuur noodzakelijk zal zijn. In het geval van
geplande ruimings- of baggerwerken dient de bemonsteringsmethode erop gericht te zijn de
kwaliteit van de specie te leren kennen, ten einde een (eventueel nuttige) secundaire
toepassing te kunnen bepalen.
Dit bemonsteringsprotocol heeft als doel een standaardbemonsteringsprotocol te vormen
ten einde een zo correct mogelijke beoordeling te geven van de in-situ waterbodemkwaliteit
in zijn functie als waterbodem.
De bemonstering bestaat uit de volgende stappen :
• Voorbereiding
• Uitvoering
• Evaluatie van de bemonstering
4
1. Voorbereiding
De voorbereiding van de bemonstering bestaat uit:
• Situering en doelstelling van het onderzoek
• Verzamelen van gegevens die betrekking hebben op de te onderzoeken problematiek
en de specifieke waterloop
• Prospectie ter plaatse
• Opstellen van een bemonsteringsplan
1.1 Situering en doelstelling van het onderzoek
In hoofdzaak zal dit TRIADE-bemonsteringsprotocol gehanteerd worden voor de volgende
doelstellingen:
• kwaliteitsmonitoring via periodieke karakterisaties
• een occasioneel onderzoek of screening (éénmalige karakterisatie)
• (fundamenteel) wetenschappelijk onderzoek
In overleg met de opdrachtgever en de deelnemers van het project wordt de exacte
doelstelling van het project geformuleerd en het verder gebruik van de analyses besproken.
In functie van de opgestelde hypothesen en de beoogde resultaten kan een voorstel tot
bemonstering worden opgesteld.
1.2 Verzamelen van gegevens die betrekking hebben op de te onderzoeken problematiek en de specifieke waterloop
Dit onderdeel van de voorbereiding heeft tot doel die gegevens te verzamelen die
betrekking hebben op het onderzoeksgebied en nodig zijn voor het opstellen van het
bemonsteringsplan. Het geeft een overzicht van de beschikbare informatie en duidt leemtes
in de informatie aan. De onderstaande aandachtspunten schetsen een richtinggevend
kader dat uiteraard niet-limitatief is en dat niet strikt gevolgd moet worden.
5
Volgende aspecten kunnen worden bekeken :
• beschrijving van de plaats van de lokale en bovenstroomse verontreinigingsbronnen
• emissieverslagen van de lozingen
• beschrijving van reeds waargenomen effecten
• waterkwaliteitsgegevens
• beschrijving van de omgeving
• gegevens over afvalwater(zuiverings)infrastructuur, zowel van industrieel als
huishoudelijk afvalwater
Volgende informatiebronnen kunnen worden geraadpleegd:
• kaartmateriaal
Geologische karteringsgegevens, topografische kaarten, geohydrologische kaarten,
gewestplannen, beleidsplannen en -kaarten (Structuurplannen, kaarten van VEN en
IVON,...)
• fysisch-chemische en biologische analyseresultaten
meetgegevens van het Meetnet Oppervlaktewater, AWP-II’s (VMM)
meetgegevens van de microverontreiniging in zwevend stof (VMM)
meetgegevens van het Emissiemeetnet Water (VMM)
meetgegevens van studies van waterbodems door of in opdracht van de beheerders
meetgegevens van reeds verwijderd bagger- en ruimingsspecie (Vlaams Gewest,
Provincies, gemeenten,...)
• gegevens over het sediment
verspreiding (erosie, sedimentatie) (geohydraulische gegevens)
pakkingsdichtheid (consolidatie) (AWZ)
dikte sedimentlaag en historische opbouw (AWZ, geologische karteringsgegevens)
6
• gegevens over de waterloop
debiet oppervlaktewater
breedte en diepte van de waterloop
nautische condities (densiteit scheepvaart, aanwezigheid van havens, e.a.)
baggeractiviteiten
zandwinning (heden en verleden)
stroomrichting oppervlaktewater en grondwater
interactie met landbodem
infiltratie of kwel ten opzichte van grondwater
afbraakprocessen (microbiële)
• omgevingsfactoren
aanwezigheid kunstwerken (heden en verleden) (AWZ, AMINAL, Polders en
Wateringen)
aanwezigheid van getijdewerking (saliniteit) (AWZ, VMM)
aanwezigheid van woonkernen, agrarische en industriële activiteiten
• bijkomende informatiebronnen
milieuvergunningen, milieudienst gemeenten en/of intercommunales, informatie van
omwonenden, plaatselijke natuurverenigingen, persknipsels, e.a.
Deze verzameling van informatie zal leiden tot een aantal potentiële bemonsteringspunten
welke zullen geprospecteerd worden.
1.3 Prospectie ter plaatse
Het ter plaatse gaan bekijken van de potentiële bemonsteringspunten laat toe om de
verzamelde informatie te verifiëren en aan te vullen.
7
Materiaal
• topografische kaarten, wegenkaarten, eventueel kleine bemonsteringsapparatuur (Van
Veengrijper, voor indien er getwijfeld wordt over de bodemsamenstelling en de
mogelijkheid tot het nemen van stalen), een aantal recipiënten, waadpak,
prospectiefiches
Volgende aspecten kunnen ter plaatse worden uitgevoerd
• exact lokaliseren van de bemonsteringspunten (eventueel in samenwerking met de
plaatselijke autoriteiten zoals milieudienst gemeente, de betrokken afdelingen van
AMINAL en AWZ, verantwoordelijke natuurgebieden)
• inschatten van de bereikbaarheid van de waterloop en het bemonsteringspunt
• het in te zetten bemonsterings- en analysemateriaal
• het aantal in te zetten personen
• beschikbare werkruimte
• inschatten toestand van de waterloop en de waterbodem (eventueel reeds een staal
nemen)
• invullen van de prospectiefiches (zie Bijlage 1)
1.4 Opstellen van een bemonsteringsplan
Aan de hand van de verzamelde gegevens, na prospectie van de potentiële
bemonsteringspunten en in overleg met de opdrachtgever en de deelnemers, kan een
definitief bemonsteringsplan worden opgesteld.
Volgende aspecten zijn belangrijk
• de juiste plaatsaanduiding (x/y-coördinaten, gemeente) van de definitieve
bemonsteringspunten, situatieschets, codering, routebeschrijving.
• opstellen bemonsteringsstrategie
• het bepalen van het in te zetten bemonsteringsmateriaal, beschermende kledij,
aantal in te zetten mensen, aantal en type recipiënt, keuze van in-situ metingen
8
• het bepalen van het tijdstip van de bemonstering, in functie van de doelstelling van
de opdracht, de deelnemers, de bestemming van de waterloop (vakanties in een
recreatiegebied, broedseizoen in een natuurgebied) en de te verwachten
weersomstandigheden (bij hoge wassen dient de bemonstering gestaakt te
worden).
• het bepalen van de volgorde van de bemonsteringen
• de betrokken autoriteiten en instanties verwittigen
• aanvragen van toestemmingen voor het betreden van privé-terreinen
9
2. Uitvoering
Na een grondige voorbereiding en het opstellen van een bemonsteringsplan, kan aan de
eigenlijke bemonstering worden begonnen. Van belang zijn hier:
• Materiaal
• Bemonsteringsstrategie
• Transport, opslag en bewaring
• In-situ metingen
• Veldprotocol en bemonsteringsverslag
2.1 Materiaal
2.1.1 Bemonsteringsvoertuigen
• Wagen met aanhangwagen en/of bagagedrager (eventueel 4 x 4)
• boot of ponton met een beperkte dieptegang, een minimum aan turbulentie
veroorzakend, voldoende werkruimte op het dek aanbiedend, hijsfaciliteiten en de
mogelijkheid om de stalen aan boord te bewaren.
2.1.2 Bemonsteringsmateriaal
• lier met hefcapaciteit van 100 tot 500 kg, afhankelijk van het gebruikte
bemonsteringstoestel
• Van Veen grijpers (2 l of 6 l) (zie Bijlage 2)
• mengton met inhoudsaanduiding in PE of roestvrij staal
• traagdraaiende, elektrische menger met inox roerstaven
• elektrische groep (generator)
• roestvrij stalen schopjes
10
2.1.3 Merken bemonsteringsplaats
• opvallende piketten
2.1.4 Verpakkingen
• donkergekleurde, glazen bokalen met brede opening en schroefdeksel
• geschikte transportbakken voor de glazen bokalen
• Polyethyleen-emmers (10 l) met deksels voor grote volumes staal
2.1.5 In-situ metingen
• pH
• O2
• conductiviteit
• temperatuur
2.1.6 Bescherming en veiligheidskledij
2.1.7 Reinigingsmogelijkheden voor het materiaal en de monsternemers
2.1.8 Bijkomende benodigdheden
• topografische kaarten
• veldprotocols: in-situ metingen, veldwaarnemingen en locatiespecifieke kenmerken
worden ter plaatse tijdens de bemonstering ingevuld (bijlage 3).
2.2 Bemonsteringsstrategie
Op grond van de doelstellingen van het onderzoek en de resultaten van het vooronderzoek
dient een aangepaste bemonsteringsstrategie te worden opgesteld. Waterbodemmonsters
voor het TRIADE-onderzoek zijn steeds mengmonsters. Daarbij staan volgende punten
centraal :
11
• Bemonsteringspatroon en -methode
• Mengmonsters
• Bemonsteringsdiepte
• Bemonsteringsfrequentie
2.2.1 Bemonsteringspatroon en -methode
De ruimtelijk variatie van de kwaliteit van de waterbodem kan per onderzoeksgebied
(beken, rivieren, stromen, zandvangen, spaarbekkens, enz) sterk verschillend zijn.
Algemeen geldt : hoe belangrijker en groter de ruimtelijke variatie, des te intensiever de
bemonstering.
De intensiteit van de bemonstering is dus afhankelijk van de grootte van de te bemonsteren
oppervlakte en de mate van homogeniteit. Gezien de waterbodem een moeilijk toegankelijk
medium is, wordt uitgegaan van heterogeniteit.
In de praktijk wordt onderscheid gemaakt tussen:
A. Grote oppervlakten (meren, spaarbekkens, dokken, zandvangen), kanalen en
bevaarbare rivieren
Om de invloed van de variatie in waterbodemsamenstelling op de samenstelling van het
monster zo klein mogelijk te houden wordt bij voorkeur gebruik gemaakt van een Van
Veengrijper van 2 liter. Op grote en diepe oppervlakken kan om praktische redenen (zoals
te veel stroming of te diep om met de relatief lichte 2 l grijper te werken) een Van
Veengrijper met een inhoud van 6 liter gebruikt worden
Per bemonsteringspunt wordt de waterbodem over een oppervlakte van 10000 m2
bemonsterd (1 ha). Bij systematische bemonstering van kanalen en bevaarbare rivieren
worden de bemonsteringspunten op een afstand van twee kilometer van elkaar gelegd.
Voor het TRIADE-onderzoek is ongeveer 40 l monster noodzakelijk. De monsters zijn dan
ook mengmonsters van verschillende happen verspreid over 10000 m2. Het aantal happen
(N) hangt af van de gebruikte grijper en is minstens gelijk aan 22 happen voor de grijper van
2 l en 7 happen voor de grijper van 6 l.
De te bemonsteren oppervlakte van 10.000 m² wordt ingedeeld in een aantal grids
waarbinnen telkens één hap genomen wordt. Het aantal grids hangt af van het aantal te
nemen happen. De afmetingen van de individuele grids worden berekend als volgt.
12
A.1. Wateroppervlakten met een breedte groter dan honderd meter.
De waterloop wordt verdeeld in drie stroken met lengte L (Figuur 1) :
L = 10000/3b
Met L: lengte van ieder grid (in m)
b: breedte van de waterloop (in m)
Vervolgens wordt iedere strook opgedeeld in een aantal grids met breedte B.
B = 3b/N
Met B: breedte van ieder grid (in m)
b : breedte van de waterloop (in m)
N: aantal happen (N = 7 voor een happer met 6 l inhoud, N = 20 voor een
happer met 2 l inhoud.
Figuur 1: Indeling van een waterloop, welke breder is dan 100 m.
A.2 Wateroppervlakten met een breedte kleiner dan honderd meter maar groter dan 30
meter.
De waterloop wordt in drie stroken met breedte B verdeeld (Figuur 2):
B = b/3
Met B: breedte van ieder grid (in m)
Waterloop Oever
B m
b m
x
x
x
x
x
x
x
x x
x
x
x x
x
x x
x
x
x
x x
L m
13
b: breedte van de waterloop (in m)
Vervolgens wordt iedere strook opgedeeld in een aantal grids met lengte L.
L = 10000/(B*N)
Met L: lengte van ieder grid (in m)
B: breedte van ieder grid (in m)
N: aantal happen (N = 7 voor een happer met 6 l inhoud, N = 20 voor een
happer met 2 l inhoud.
In elk grid wordt op een at random plaats één monsternamepunt vastgelegd.
Figuur 2: Indeling van een waterloop met een breedte tussen 30 en 100 m.
Indien om één of andere redenen geen waterbodemmonster kan genomen worden (bv
steenslag, betonplaat) binnen 1 grid, dan mag een ander waterbodemmonster at random
gekozen worden binnen zelfde grid.
A.3. Wateroppervlakten met een breedte kleiner dan 30 meter
Zie B.
B. Beken en onbevaarbare rivieren (Van Veen grijper 2 l)
Voor kleinere en onbevaarbare waterlopen wordt de waterbodem, per bemonsteringspunt,
over een lengte van 50 m zigzagsgewijs bemonsterd (figuur 3). Deze 50 m zone wordt op
de oever afgebakend met 6 opvallende piketten die elk op een onderlinge afstand van 10 m
Waterloop Oever
B m
b m
x
x
x
x x
x
x
x
x
x
x x x x
x x
x
x
x
x x
L m
14
geplaatst worden. Bij zigzagsgewijze bemonstering worden in elk van deze 10 m zones 4
happen genomen met de Van Veen-grijper. Normaal bekomt men ongeveer 20
waterbodemstalen die 1 mengmonster vormen.
Bij systematische bemonstering van beken en onbevaarbare rivieren worden de
bemonsteringspunten op een afstand van één kilometer van elkaar gelegd.
Figuur 3: Indeling van een waterlopen met een breedte <30 m.
Algemene opmerkingen
De bemonstering moet steeds in stroomopwaartse richting uitgevoerd worden om steeds
een niet-omgewoeld waterbodemstaal te verkrijgen.
De Van Veen grijper dient men gelijkmatig en in een niet te hoog tempo te laten zakken ten
einde omwoeling en turbulentie te vermijden
2.2.2 Mengmonsters
Aanmaak
Voor het TRIADE-onderzoek is ongeveer 40 l mengmonster noodzakelijk. Een
mengmonster bestaat uit een menging van een aantal deelmonsters. Deelmonsters die te
weinig slib bevatten (bv. Van Veen grijper sluit niet goed o.i.v. takken of bladeren die een
goede afsluiting beletten) mogen niet in de mengton toegevoegd worden gezien een
bepaalde fractie van de waterbodem weggevloeid is. Dit zijn niet representatieve
Waterloop Oever
10 m
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x x
x x
x
x
x
x x
x
15
waterbodemmonsters. De massa of het volume van elk deelmonster moet dus ongeveer
gelijk zijn.
Verdelen en coderen
Elk mengmonster wordt zorgvuldig gemengd door middel van een traagdraaiende,
elektrische menger met inox roerstaven, zodat een zeer homogeen mengmonster bekomen
wordt (homogene kleur). Vervolgens wordt het gehomogeniseerd mengmonster verdeeld.
De verdeling gebeurt als volgt:
• 3 l mengmonster voor de fysico-chemische analyses glazen bokalen
• 20 l voor de biologische evaluatie PE - emmers
• 20 l voor de ecotoxicologische evaluatie PE - emmers
Elk monster dient vervoerd te worden in het daartoe geschikt recipiënt. Alle nodige
voorzorgen moeten worden genomen om elke wijziging van de eigenschappen van het
monster te voorkomen.
De verschillende recipiënten moeten op een unieke en makkelijk te identificeren manier
worden gecodeerd.
Om contaminatie te vermijden is het aangeraden om steeds nieuwe recipiënten te
gebruiken.
Tijdens de manipulaties worden een aantal veiligheidsmaatregels in acht genomen, zoals
het dragen van beschermkledij, handschoenen en een veiligheidsbril.
2.2.3 Bemonsteringsdiepte
Hoe diep er wordt bemonsterd is afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek. Bij
het TRIADE-onderzoek, dat een algemene beoordeling van de kwaliteit van het sediment tot
doel heeft, zal bij voorkeur de laag, waar de meeste uitwisseling met de waterkolom
plaatsheeft, bemonsterd worden. In de praktijk betekent dit een bemonsteringsdiepte van
maximum 20 cm.
16
2.2.4 Bemonsteringsfrequentie
De frequentie van de bemonstering hangt samen met de doelstellingen van het onderzoek.
Voor een screening wordt een éénmalige bemonstering en beoordeling uitgevoerd. Voor
een monitoring wordt meermaals bemonsterd in functie van de tijd.
2.3 Transport, opslag en bewaring
Aan sedimentmonsters wordt geen enkel bewaarmiddel toegevoegd. De monsters worden
zo snel mogelijk in het donker bewaard op 4°C. De fysico-chemische analysen moeten na
drogen worden uitgevoerd binnen een termijn van 1 week tot 3 maanden, afhankelijk van de
te analyseren parameter. Monsters waarin vluchtige en afbreekbare organische
verbindingen moeten worden geanalyseerd, verdienen speciale aandacht. De
ecotoxicologische onderzoeken moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd met een
maximum termijn van vijf weken. De biologische stalen moeten uiterlijk na drie dagen
gepreserveerd worden met alcohol of formaldehyde.
2.4 In situ metingen
Tijdens de bemonstering op het veld worden een aantal in-situ metingen uitgevoerd. Het
zuurstofgehalte, de pH, de geleidbaarheid en de temperatuur van het oppervlaktewater.
Aanvullend kunnen een aantal indicatieve chemische verbindingen zoals ammonium,
nitraat, nitriet en fosfaat gemeten worden met veldanalysesets. Deze meetresultaten
worden tijdens de bemonstering ingevuld op de veldprotocols en zijn belangrijk bij de
interpretatie van de gegevens in het bemonsteringsverslag.
2.5 Veldprotocol en bemonsteringsverslag
Ruime aandacht wordt besteed aan het opstellen van het bemonsteringsverslag. Tijdens de
bemonstering wordt steeds een veldprotocol ingevuld. Deze informatie is belangrijk tijdens
de interpretatie van de resultaten en het opstellen van het bemonsteringsverslag. Bij het
opstellen van het veldprotocol is men ervan uitgegaan dat veelzijdige informatie op een
snelle en eenduidige wijze moest worden verzameld en neergeschreven. Daarom wordt
gebruik gemaakt van een meerkeuze vragen systeem.
Bijlage 3 bevat een voorbeeld van een veldprotocol. In het bemonsteringsverslag worden
alle elementen van de bemonstering in de vorm van een overzicht gerapporteerd. Het
bemonsteringsverslag wordt overgemaakt aan de opdrachtgever(s).
17
3. Evaluatie van de bemonstering
De bemonstering wordt geëvalueerd in overleg met de deelnemers en de opdrachtgever(s).
18
Referenties
Mudroch, A. & Azcue, J.M. (1995). Manual of aquatic sediment sampling. Lewis Publishers.
AWZ (1990). Voorlopige richtlijnen voor de studie van onderhoudsbaggerprojecten.
Toepassing van de Milieu-Effect-Procedure (MEP)
Bestuur der waterwegen. Milieu-Effect-Procedure (MEP)
19
Bijlage 1: Voorbeeld van een prospectiefiche
Code: DE123 Waterloop : Gete Bekken : Demer Plaatsnaam : Halen Stafkaart : 25/5-6 X : 202780 Y : 182320 Vmm : 427000
Schets en opmerkingen
20
Bijlage 2: Van Veen grijper
21
Bijlage 3: Voorbeeld van een veldprotocol
Staalname datum (dd.mm.jj)............................................................ Staalname tijd (u.min) van..........................tot................................ code staal: / /
VMM nr. : .................................................. code vorig staal : ...................................... code volgende staal : ...............................
AANWEZIGE PERSONEN BEMONSTERING (naam, functie)
− opdrachtgever: .................................................................................................
− uitvoerder monstername: .................................................................................
− coördinator monstername: ...............................................................................
− anderen (firma/instelling, naam, functie, doel) ................................................. ............................................................................................................................. .............................................................................................................................
WEERSOMSTANDIGHEDEN dag van de bemonstering dag(en) voor de bemonstering
� opklaringen � opklaringen � regen (motregen/zwak/hard/buien) � regen (motregen/zwak/hard/buien) � wind (stil/matig/sterk/storm) � wind (stil/matig/sterk/storm) � bewolking (gesloten/zwaar/licht) � bewolking (gesloten/zwaar/licht) � mist � mist − temperatuur (°C) ...... − temperatuur (°C)......
BESCHRIJVING OMGEVING (rechter oever (RO) en linkeroever (LO)) � natuurgebied (naam) (RO/LO) ........................................................................ � recreatiezone (park, speeltuin, camping, sportterrein, vissport) (RO/LO) � woningzone (naam) (RO/LO) .......................................................................... � tuin �afvoerbuis � landbouwzone � weide (RO/LO) �afwateringsvoorzieningen �aanwezigheid vee (rund/paard/schaap/geit/pluimvee) � akkers (RO/LO) �afwateringsvoorzieningen � type gewas (tarwe/maïs/haver/bieten/aardappelen) � industriezone (RO/LO) � type industrie ............................................................................................... �afvoerpijpen � stortplaatsen (RO/LO) � oevers (RO/LO) �verstevigde oever (beton, stenen, rietmatten, betonnen tegels) �natuurlijke begroeiing (bomen, rietkraag, kruidachtige, gras)
22
BESCHRIJVING WATERLOOP - type waterloop (bevaarbaar-frequent gebaggerd/bevaarbaar-niet frequent
gebaggerd /onbevaarbaar- niet frequent gebaggerd) − naam waterloop .............................................................................................. − ligging staalnamepunt plaatsnaam ..................................................................................................... stafkaartnummer ........................................... (Lambert coördinaten) X............................... Y............................... − breedte (m) ................. − diepte (m).................... − stroomsnelheid (m/s)..................................... − troebelheid (Secchischijf (cm))...................... − kleur ................................................................................................................ − geur................................................................................................................. − aanwezigheid van biologisch leven (vissen, eenden, waterhoenen, reigers) ........................................................................................................................ − scheepsvaartfrequentie (aantal schepen/uur) ................................................. − historiek waterloop (verwachte verontreiniging, enz.) ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. .............................................................................................................................
BESCHRIJVING SEDIMENT − voor staalname (indien zichtbaar) ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. − na staalname − kleur ............................................................................................................. − geur.............................................................................................................. − vastheid (vloeibaar, vast, steekvast, stevig) − aanwezigheid organisch materiaal (bladeren, takken, humus) − aanwezigheid van biologische leven (muggelarve/mossel/vis/worm) − dikte van de sliblaag schatting : ............................................................................................. gegevens van AWZ : ............................................................................ − samenstelling sliblaag.................................................................................. beschrijving grijpstaal/steekstaal (verschillende lagen)................................ ........................................................................................................................ − geologische gegevens ................................................................................. geologische lagen, aluviale vlakten
23
IN SITU METINGEN � rechtstreeks in de waterloop � in een schepmonster � met doorvloeicel
water Bodem (cm)
methode calibratie datum
PH electrode/pH papier
O2 (mg/l) electrode
Geleidbaarheid (mS/cm)
electrode
Temperatuur (°C) pH meter
STAALNAME (schema bemonsteringsplaatsen te plaatsen op blad 5) Gevolgde bemonsteringsprocedure : �homogene zone �heterogene zone �bemonstering op/afwaarts Type monstername
volume (l)/eenheid
aantal
totaal volume (l)
diepte (cm)
Van Veen 6 l
Van Veen 2 l Bemonstering � vanop de oever (kraan, manueel)(naam verhuurfirma)................................... � vanop een boot (naam verhuurfirma, naam boot) ........................................... � met vlot (buitenboord motor (j/n), lier (j/n)) � met zodiak � bemonstering stroomop/stroomafwaarts
24
BEHANDELING STAAL − mengstaal (j/n) aantal deelstalen per mengstaal ..................................................................... mengtechniek (mengton/at random verdeling) totaal mengvolume.......................................................................................... uitzicht staal na menging................................................................................. − bewaarcondities bewaarmiddelen (j/n) doelgroep ........................................................................................................ koelkast (4°C, donker) andere condities ............................................................................................. − transport staal transportcondities (bewaarcondities/anderen) ................................................
25
SCHEMA BEMONSTERINGSPLAATS
− aanduiding zone waar de grijpstalen genomen zijn (afstanden in meters aanduiden).
− aanduiding zone waar de steekstalen genomen zijn (afstanden in meters aanduiden).
− afmetingen waterloop, bemonsteringszone. − aanduiding industrie/woonzones, afvoerpijpen, enz. − aanduiding stroomrichting
26
OPMERKINGEN
− opgetreden problemen en mogelijke oplossingen. − reden van het niet uitvoeren van bemonstering zoals afgesproken. − reden voor bijkomende bemonsteringen.
27
FYSISCH-CHEMISCHE ANALYSEN
1. Voorbehandeling van waterbodemmonsters
1.1 Toepassingsgebied
Deze methode beschrijft de voorbehandeling van waterbodemmonsters en is van
toepassing op de bepaling van organische koolstof, lutum, zware metalen, PAK’s, apolaire
koolwaterstoffen, organochloorpesticiden, PCB’s en EOX. Uitgangspunt voor de
toepasbaarheid is de sterke adsorptie aan de waterbodem (verdelingscoëfficiënt K
bodem/water > 10).
1.2 Werkwijze
Verwijder een waterlaag bovenstaand op het slib door decanteren of pipetteren. Zorg ervoor
dat hierbij geen vast materiaal verdwijnt.
Zeef het monster over een zeef met een maaswijdte van 2 mm. In geval voor bepaalde
monsters het nat zeven echter niet uitvoerbaar is, verwijder dan de grove delen zoals
schelpen, stenen, takjes, glasscherven e.d. handmatig. In geval lyofilisatie bij de preparatie
gebruikt wordt, kan het zeven ook na de lyofilisatiestap uitgevoerd worden. Lyofilisatie kan
gebruikt worden bij de analyse van zware metalen, PAK’s, PCB’s en
organochloorpesticiden.
Meng het monster tot een homogeen monstermateriaal bekomen wordt. Voor het mengen is
geen universele techniek voorhanden. Het mengen kan handmatig gebeuren door roeren
met een spatel. Hierbij kan ook gebruik gemaakt worden van mechanische
monstermengers.
Neem uit het verkregen homogeen mengsel met een spatel de benodigde hoeveelheid
monstermateriaal voor de verdere opwerking voor de analyse en voor de bepaling van het
droge stofgehalte.
1.3 Analysetermijnen
In de volgende tabel staat een overzicht van de uiterste termijn waarbinnen een bepaalde
parameter geanalyseerd moet worden gebaseerd op het OVAM/VITO compendium. De
termijnen in de tweede kolom zijn de termijn tussen drogen van het monster en de extractie.
28
In de derde kolom staat de termijn tussen extractie en analyse weergegeven. De gedroogde
monsters dienen droog en donker bewaard te worden. Een zo kort mogelijke termijn voor
analyse is echter aangeraden.zijn .
parameter termijn tussen drogen en
extractie
termijn tussen staalname of
extractie en analyse
droogrest 1 week
TOC 1 week
PAK’s 3 maand 30 dagen
PCB’s 3 maand 30 dagen
OCP’s 3 maand 30 dagen
EOX 1 maand 7 dagen
zware metalen (behalve kwik) 14 dagen tot lyofilisatie
14 dagen tot destructie
3 jaar
6 maand
kwik 14 dagen tot lyofilisatie
14 dagen tot destructie
3 jaar
1 maand
totaal fosfaat 14 dagen tot lyofilisatie
14 dagen tot destructie
3 jaar
6 maand
Kjeldahl stikstof 28 dagen
Referenties
NEN 5719 (ontwerp) (1995). Bodem: Voorbehandeling van waterbodemmonsters.
Nederlands Normalisatie Instituut, Januari 1995
EPA 3545 (1996). Pressurized fluid extraction (PFE).
29
2. Bepaling van droge stofgehalte
2.1 Toepassingsgebied
De beschreven methode laat de bepaling van de droogrest toe in waterbodems. De
bepaling van de droogrest is noodzakelijk bij de omrekening van analyseresultaten naar het
droge stofgehalte.
2.2 Werkwijze
Vóóraleer de analyse te starten, de porseleinen kroesjes drogen bij 105°C in de droogoven
en laten afkoelen in de exsiccator tot op kamertemperatuur. Onmiddellijk vóór de
ingebruikname de kroesjes, tot op 0.1 mg nauwkeurig afwegen (ma).
Een deel (min. 50 g) van het goed gehomogeniseerd vers slib afwegen tot op 0.1 mg
nauwkeurig in een porseleinen kroes (mb).
Dit materiaal drogen in een droogstoof bij 105°C totdat het residu droog lijkt. Daarna de
kroes laten afkoelen in een exsiccator tot kamertemperatuur en wegen. Herhaal vervolgens
het droogproces gedurende minimaal 1 uur. Het droog residu (mc - ma) wordt als constant
beschouwd, als de massa bekomen na een verder uur drogen niet meer dan 0.5% verschilt
van de vorige meting.
Herhaal het droogproces tot een constante massa werd bereikt. In de gevallen dat ook
achter het derde droogproces nog geen constante waarde kon bekomen worden, noteer
dan de waarde bepaald na minimaal 12 uur drogen en vermeld dit in het analyserapport.
Uit het verschil in gewicht wordt het droge stofgehalte van het staal berekend :
D.S. (%) =( m -m )
( m -m 100
c a
b a )
×
Referenties
NEN 12880 (1997). Characterization of sludges : Determination of dry residue and water
content. European Committee for standardization, mei 1997.
30
NEN 6620 (1986). Afvalwater en slib : Bepaling van de indamprest en de gloeirest.
Gravimetrische methode. Nederlands Normalisatie Instituut, november 1986.
3. Bepaling van totaal organische koolstof (TOC) in waterbodems
3.1 Toepassingsgebied
De beschreven methode laat de bepaling van het TOC-gehalte (Total Organic Carbon) in
waterbodems toe. Deze bepaling wordt gebruikt voor de berekening van het organische
stofgehalte. Het berekende organische stofgehalte is het gemeten % organische koolstof
vermenigvuldigd met een factor 1.724. De gebruikte factor is afkomstig van de aanname dat
organisch materiaal gemiddeld uit 58% organische koolstof bestaat.
De methode is toepasbaar voor waterbodems die meer dan 0.1 %C (w/w) bevatten.
3.2 Principe
Het TOC gehalte wordt bepaald als het verschil tussen het totale koolstofgehalte (TC) en
het gehalte aan anorganische koolstof (IC). Bij de bepaling van TC worden de organische
stoffen aanwezig in het monster bij 900°C in een zuurstofatmosfeer en met behulp van een
katalysator (een mengsel van Co3O4 en PtO) geoxydeerd tot CO2. Voor de bepaling van IC
wordt het anorganische koolstof, door aanzuren met fosforzuur en verwarmen tot 200°C,
omgezet tot CO2. Het gevormde CO2 wordt door middel van een zuurstofgasstroom naar
een infrarood-detector geleid.
3.3 Werkwijze
Voor zowel de TC- als de IC-meting telkens ongeveer 1 g monster afwegen in een bootje.
Voor de IC-meting het monster afdekken met een laagje glaswol.
Het bootje voor de TC-analyse in de TC-oven brengen. Aan het bootje voor de IC-analyse
0.5 ml fosforzuur toevoegen vooraleer het in de IC-oven te brengen. De TC-oven
verwarmen tot 900°C, de IC-oven tot 200°C. De hoeveelheid CO2 wordt bepaald via de
infrarood-detector.
Voor een beschrijving van de werking, calibratie en gebruik van de TOC-analyzer wordt
verwezen naar de gebruiksaanwijzing van het desbetreffende toestel.
31
De calibratie van TC gebeurt door middel van glucose, de calibratie van IC door Na2CO3.
Het TOC-gehalte wordt berekend als TC - IC. Iedere meting dient minstens in dubbel
uitgevoerd.
Referenties
Standard Methods for the examination of water and waste water (1992). Total Organic
Carbon (TOC), 5310 B. Combustion-infrared Method, 5 / 11-13.
32
4. Bepaling van extraheerbare organo-halogenen in waterbodems
4.1 Toepassingsgebied
De bepaling van in slib aanwezige extraheerbare organische halogeenverbindingen (Cl-, Br-
en I-verbindingen) waarvan het gehalte, berekend als organochloor, hoger is dan 1 mg/kg
droge stof. Onder EOX wordt verstaan de verbindingen die kwantitatief worden
geëxtraheerd in een mengsel aceton/n-hexaan.
4.2 Principe
De organisch gebonden halogenen worden met een mengsel aceton/n-hexaan uit het slib
geëxtraheerd. Na drogen over natriumsulfaat en indampen onder N2 wordt het extract
verbrand bij 850°C in een zuurstof-argon atmosfeer en het gevormde waterstofhalogenide
wordt coulometrisch bepaald. Om geen te snelle verdamping van het extractiemiddel te
hebben bij de verbranding, wordt een hoogkokende vloeistof toegevoegd.
4.3 Werkwijze
De extractie dient uitgevoerd te worden in een laboruim vrij van halogeen bevattende
oplosmiddelen. Weeg een equivalent van 10 g droge stof af. Voeg een overmaat
natriumsulfaat (vóór gebruik 4 uur bij 600°C gloeien) toe en meng tot een korrelig droog
materiaal. Breng dit mengsel kwantitatief over in een extractiehuls, en plaats deze in het
extractieapparaat. Spoel het recipiënt 2 maal met 5 ml aceton/n-hexaan (1/1) en voeg 75 ml
aceton/n-hexaan (1/1) toe in het Soxhlet extractie-apparaat. Extraheer gedurende minstens
4 uur.
Droog het extract over natriumsulfaat en damp het solvent d.m.v. Kuderna Danish in tot 20
ml. Na afkoeling van het extract, 100 µl n-hexadecaan toevoegen en in een waterbad onder
stikstofstroom indampen tot 5 ml. Spuit 100 µl van het extract in de coulometer.
Als standaard wordt 4-chloorfenol gebruikt.
Voor de werking en het gebruik van de coulometer wordt verwezen naar de bijhorende
gebruiksaanwijzing.
33
Opmerking:
Anorganische chloriden worden semi-kwantitatief bepaald met microcoulometrie wat tot een
schijnbare verhoging van het EOX-gehalte kan leiden. Bij verhoogde EOX gehalten (vanaf
klasse 3) is derhalve een controle van pH en anorganische chloriden nodig. Hiertoe wordt
het bovenstaand water, bekomen na uitzakken van het slib, gebruikt. Indien de pH van het
water kleiner is dan 7, is interferentie met HCl mogelijk. Om deze interferentie te vermijden,
wordt de pH van het mengsel >7 gebracht door toevoegen van Ca(OH)2 vooraleer men
EOX bepaalt. Controleer het bovenstaand water op de aanwezigheid van anorganische
chloriden en vermeld de mogelijke invloed ervan op een verhoogde EOX als opmerking.
Referenties
OVAM/VITO (1996), Compendium Afvalstoffenanalyse, methode AAC3/N, extraheerbare
organische halogeenverbindingen in vaste afvalstoffen.
34
5. Bepaling van apolaire koolwaterstoffen in waterbodems met behulp van infrarood spectrofotometrie
De beschreven methodologie is een samenvatting van de methode AAC3/R (ontwerp 96) uit
het OVAM / VITO Compendium voor afvalstoffenanalyse.
5.1 Toepassingsgebied
Het kwantitatief bepalen van minerale olie in waterbodems, met tetrachlooretheen (TCE) als
extractiemiddel. De methode is niet geschikt voor het bepalen van hoeveelheden kleiner
dan 50 mg/kg droge stof.
5.2 Principe
Het staal wordt na homogenisatie en chemische droging onderworpen aan extractie met
tetrachlooretheen. Vervolgens wordt aan het extract florisil toegevoegd om de polaire
stoffen te verwijderen. Het gehalte aan extraheerbare apolaire stoffen wordt bepaald door
opname van een infraroodspectrum van 3200 cm-1 tot 2700 cm
-1, waarbij de gemeten
extincties van de CH2-absorptieband bij 2925 cm-1, de CH3-absorptieband bij 2958 cm
-1 en
de aromatische CH-absorptieband bij 3030 cm-1 een maat zijn voor de aanwezige
hoeveelheid extraheerbare verbindingen.
5.3 Werkwijze
5.3.1 Controle reagentia
• Tetrachlooretheen:
Tetrachlooretheen bevat een stabilisator (gewoonlijk N-methylmorfoline), die IR-licht
absorbeert en voor gebruik uit het oplosmiddel moet verwijderd worden. Men schudt
daarom 1 l TCE met 10 g geactiveerde florisil (zie hieronder) gedurende 30 min.
De bruikbaarheid van tetrachlooretheen controleren door het infraroodspectrum op te
nemen van 3200 tot 2700 cm-1 in een cuvet met een weglengte van 1 cm t.o.v. een gelijke
lege cuvet. Tetrachlooretheen is bruikbaar indien de transmissie in het gebied van 3030 tot
2925 cm-1 groter is dan 74 %.
• Florisil (60-100 mesh), geactiveerd (16 u verhitten bij 140°C) :
35
De kwaliteit van het gebruikte florisil controleren door aan 40 ml van een oplossing van 2 g
dodecaanzuur in 1000 ml tetrachlooretheen 3 g florisil toe te voegen en het geheel
gedurende 30 minuten te schudden. De oplossing moet na decanteren en meten met
gebruikmaking van een cuvet van 10 mm in het gebied van 3030 cm-1 tot 2925 cm
-1
minimaal 95 % transmissie vertonen. Indien de transmissie kleiner is dient de florisil
opnieuw geactiveerd te worden.
5.3.2 Extractie en zuivering
Weeg 30 g van het met Na2SO4 vermengd staal in een vooraf gewogen erlenmeyer van 250
ml, die voorzien kan worden van glazen stop en sluitklem. Voeg hieraan exact 100 ml
tetrachlooretheen toe. Sluit de erlenmeyer af en schud krachtig of soniceer het geheel
gedurende 1 uur.
Laat van het extract de vaste fase bezinken, neem van de bovenstaande vloeistof ongeveer
25 g en breng deze in een vooraf gewogen erlenmeyer van 50 ml. Bepaal het gewicht m1
van de overgebrachte vloeistof nauwkeurig. Voeg 3 g florisil toe en schud het geheel
krachtig gedurende 30 minuten.
Filtreer de oplossing over een zwartband- of glasvezelfilter en vang het filtraat op in een
vooraf gewogen maatkolf van 25 ml voorzien van een glazen stop. Spoel de 50 ml
erlenmeyer en de filter na met enkele ml tetrachlooretheen, voeg deze bij het filtraat in de
25 ml maatkolf en weeg het geheel. Bepaal de totale massa m2 van de oplossing en hieruit
de verdunningsfaktor als zijnde de verhouding m2/m1.
Is de bovenstaande vloeistof na schudden met florisil en bezinken volledig helder dan kan
de filtratiestap weggelaten worden en wordt van de bovenstaande vloeistof rechtstreeks een
hoeveelheid overgebracht naar de meetcuvet.
Alternatief aan de bovenstaande zuiveringsstap kan men het tetrachlooretheenextract laten
percoleren doorheen een kolommetje gevuld met 3 g florisil. Alleen de eerste 10 ml van het
eluaat worden opgevangen en overgebracht naar de meetcuvet.
Opmerking:
De adsorptiecapaciteit van florisil bedraagt ca. 40 mg/g. Bevat het tetrachlooretheenextract
een belangrijke hoeveelheid polaire stoffen dan volstaat de bovenstaande zuiveringsstap
niet en moet de zuiveringsstap herhaald worden tot men een constante waarde voor de
absorbantie krijgt.
36
5.3.3 Meting van het monsterextract
Neem het infraroodspectrum van 2700 tot 3200 cm-1 op van het met florisil gezuiverde
tetrachlooretheenextract van het bodemmonster. Trek een basisrechte die de absorbanties
bij 3100 cm-1 en 2800 cm
-1 verbindt en bepaal de absorbantiemaxima bij ca. 2925 cm
-1,
2958 cm-1 en 3030 cm
-1 t.o.v. deze basisrechte. Wordt bij één van de bovenstaande
golfgetallen een overschrijding van de absorbantiewaarde van 0.8 vastgesteld dan moet het
extract verdund worden. Bedragen de absorbanties minder dan 0.1 dan kan gebruik
gemaakt worden van 40 mm cuvetten. Bereken uit de gemeten absorbanties het gehalte
aan apolaire koolwaterstoffen.
Referenties
OVAM/VITO (1996). Compendium Afvalstoffenanalyse, methode AAC3/R, met
tetrachlooretheen extraheerbare stoffen en met tetrachlooretheen extraheerbare apolaire
stoffen in bodem.
37
6. Bepaling van PAK’s in waterbodems
6.1 Toepassingsgebied
De methode beschrijft de opwerking en analyse van polycyclische aromatische
koolwaterstoffen (PAK’s) in waterbodems. Onder de groep van polycyclische aromatische
koolwaterstoffen worden de 6 van Borneff bepaald : fluorantheen, benzo(b)fluorantheen,
benzo(k)fluorantheen, benzo(a)pyreen, benzo(g,h,i)peryleen en indeno(1,2,3-c,d)pyreen.
Voor de verschillende componenten wordt 0.01 mg/kg droge stof als ondergrens
vooropgesteld.
Een alternatieve GC-MS methode wordt uitgebreid beschreven in het OVAM/VITO
afvalstoffen-compendium (methode AAC/3/B).
6.2 Principe
De PAK’s worden door middel van een Soxhlet- of ASE-apparaat geëxtraheerd met
dichloormethaan of aceton/hexaan. Ter verwijdering van interfererende componenten wordt
een cleanup uitgevoerd. Voor de identificatie en kwantificering kan gekozen worden tussen
analyse door middel van GC-MS of na solventuitwisseling met acetonitrile via HPLC met
fluorescentie- en UV-detectie.
6.3 Werkwijze
6.3.1 Monstervoorbereiding
Meng het slibstaal grondig en verwijder hierbij ‘vreemde’ objecten als takken, stenen,
bladeren e.a. Vervolgens het monster drogen. Hiervoor bestaan verschillende
mogelijkheden :
• chemisch drogen : neem 10g slib en voeg een overmaat natriumsulfaat of een
evenwaardig droogmiddel als diatomeeënaarde toe om het overtollige water te binden.
Meng de twee producten goed door elkaar tot een korrelig droog materiaal bekomen
wordt.
• lyofilisatie : ongeveer 10g nat slib wordt in een glazen petrischaal brengen en na
invriezen lyofiliseren. Indien niet nat gezeefd werd, het gelyofiliseerde monster verder fijn
maken en vervolgens over een metalen zeef met 2 mm maaswijdte leiden.
38
6.3.2 Extractieprocedure
De volgende extractieprocedures kunnen aangewend worden :
• soxhlet extractie : breng voor analyse 5 tot 10g (op basis van drooggewicht) slib over in
een soxhlet-apparaat en extraheer gedurende 24 uur met dichloormethaan of
hexaan/aceton (1/1 v/v).
• ASE extractie : breng voor analyse 5 tot 10g (op basis van drooggewicht) slib over in
een extractiehuls en extraheer met dichloormethaan of hexaan/aceton (1/1 v/v). De
extracties worden uitgevoerd bij hoge temperatuur (100°C) en druk (2000 psi).
Naargelang de gebruikte extractiehuls dienen bijkomende parameters geoptimaliseerd te
worden tot een volledige extractie bekomen wordt.
In geval hexaan/aceton gebruikt werd, de aceton eerst wegwassen met 3 maal 50 ml water,
waarna het extract drogen over watervrij natriumsulfaat. Het extract indampen, eventueel
met Kuderna Danish als tussenstap, onder N2 tot 1 ml.
6.3.3 Zuivering
De meeste extracten van waterbodems zijn dermate vervuild dat bijkomende zuivering
nodig is. Verschillende cleanup procedures zijn in de literatuur beschreven en kunnen
gebruikt worden, doch dienen steeds op eventuele verliezen gecontroleerd te worden. Voor
routinematige analyses kan gebruik gemaakt worden van silicagel of aluminiumoxide.
• Silicagel : het ingedampte dichloormethaanextract op een met geconditioneerde
silicagel SPE cartridge brengen en vervolgens elueren met 3 ml dichloormethaan.
• Aluminiumoxide : breng het ingedampte hexaanextract over een met 2 gram
aluminiumoxide (gedeactiveerd met 11% water) gevulde kolom en elueer met 12 ml
petroleumether.
Het gezuiverde extract onder N2 indampen tot 1 ml. In geval van HPLC analyse is er een
omzetting naar acetonitrile nodig. Het eindvolume acetonitrile is 1 ml.
6.3.4 Analysetechniek
Voor de identificatie en kwantificering kunnen twee analysetechnieken gebruikt worden :
HPLC met UV en fluorescentiedetectie of GC-MS.
39
6.3.4.1 HPLC - methode
• Identificatie
Voor de scheiding wordt gebruik gemaakt van een reversed-phase octadecylsilaan (C18)
kolom, in combinatie met een water/acetonitrile gradiënt. Verschillende kolommen
gemodificeerd voor de analyse van PAK’s zijn verkrijgbaar.
De herkenning van de PAK’s in een monsterextract gebeurt aan de hand van de te
verwachten retentietijden. Bovendien dient een positief signaal verkregen te worden voor
zowel de UV- als de fluorescentie-detector, waarbij variabele golflengtes gebruikt worden. In
de onderstaande tabel worden mogelijke golflengtes weergegeven. Ter controle van de
retentietijden wordt 6-methylchryseen als inwendige standaard gebruikt.
Fluorescentie UV PAK-component Excitatie (nm) emissie (nm) (nm)
Fluorantheen 280 450 254 6-methylchryseen 270 390 254 Benzo(b)fluorantheen 304 430 254 Benzo(k)fluorantheen 304 430 254 Benzo(a)pyreen 304 430 254 Benzo(g,h,i)peryleen 304 480 300 Indeno(1,2,3-cd)pyreen 304 480 300
• Kwantificering
Voor de kwantitatieve bepaling van PAK’s wordt gebruik gemaakt van de externe
standaardmethode. Kwantificering van de componenten gebeurt aan de hand van de
piekhoogtes t.o.v. de calibratielijnen bekomen via de standaardoplossingen. Het
eindresultaat is in principe het gemiddelde tussen de concentraties bekomen via de UV- en
de fluorescentiedetector. Indien de verhouding tussen de hoogste en laagste concentratie
echter groter is dan 1.25, wordt de laagste concentratie als resultaat genomen. Bij sterke
storing van een signaal van een detector zal enkel het signaal van de andere detector
gebruikt worden.
6.3.4.2 GC-MS - methode
• Identificatie
De analyse gebeurt met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS). De
chromatografische scheiding van de componenten wordt uitgevoerd op een apolaire of
semi-polaire capillaire kolom met chemisch gebonden fase.
40
Identificatie van de PAK's wordt uitgevoerd op basis van de relatieve retentietijden van de
pieken in het ionchromatogram in de selected ion monitoring (SIM)-mode, maar kan ook
gebeuren aan de hand van geselecteerde ionen uit in full scan opgenomen spectra. Diverse
gedeutereerde PAK’s verbindingen zijn verkrijgbaaar en kunnen als inwendige standaarden
gebruikt worden.
• Kwantificering
Voor de kwantitatieve bepaling van de PAK's wordt gebruik gemaakt van de interne
standaardmethode op basis van de geïntegreerde piekoppervlakken van de meest
karakteristieke ionen van de verschillende verbindingen.
Referenties
EPA 610 (1984). Polynuclear aromatic hydrocarbons.
NEN 5734 (ontwerp) (1992). Bodem: Bepaling van de gehalten aan tien polycyclische
aromatische koolwaterstoffen met behulp van hoge druk vloeistof chromatografie.
Nederlands Normalisatie Instituut, Januari 1992
OVAM/VITO (1994). Compendium Afvalstoffenanalyse, methode AAC3/B, polyaromatische
koolwaterstoffen.
EPA 3545 (1996). Pressurized fluid extraction (PFE).
41
7. Bepaling van organochloorpesticiden en polychloorbifenylen in waterbodems
7.1 Toepassingsgebied
De methode beschrijft de opwerking en analyse van de hieronder vermelde
organochloorpesticiden (OCP’s) en polychloorbifenylen (PCB’s) in waterbodems. Onder de
groep organochloorpesticiden beschouwen we: alfa-HCH, beta-HCH, gamma-HCH
(lindaan), hexachloorbenzeen, heptachloor, heptachloorepoxide, o,p-DDD, p,p’-DDD, o,p-
DDE, p,p’-DDE, o,p-DDT, p,p’-DDT, aldrin, dieldrin, endrin en alfa-endosulfan. Onder de
groep polychloorbifenylen beschouwen we : PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 118, PCB
138, PCB 153 en PCB 180. Voor de verschillende verbindingen wordt een ondergrens van 1
µg/kg droge stof vooropgesteld.
De onderstaande methode is bruikbaar in combinatie met GC-ECD, mits gebruik van een
dubbelkolom-systeem, of GC-MS. Alternatieve GC-MS methodes worden uitgebreid
beschreven in het OVAM/VITO afvalstoffencompendium (methode AAC/3/G voor
organochloorpesticiden en methode AAC/3/A voor polychloorbifenylen).
7.2 Principe
De betreffende organochloorpesticiden en pcb‘s worden door middel van een Soxhlet- of
ASE-apparaat geëxtraheerd met een mengsel van hexaan/aceton (1/1). Via ontzwaveling,
cleanup over aluminiumoxide en groepenscheiding over silicagel wordt het monsterextract
gezuiverd. Voor de identificatie en kwantificering kan gekozen worden tussen analyse door
middel van GC-ECD over een dubbelkolom-systeem of door middel van GC-MS.
7.3 Werkwijze
7.3.1 Monstervoorbereiding
Meng het slibstaal grondig en verwijder hierbij ‘vreemde’ objecten als takken, stenen,
bladeren e.a. Vervolgens het monster drogen. Hiervoor bestaan verschillende
mogelijkheden :
• chemisch drogen : neem 10g slib en voeg een overmaat natriumsulfaat of een
evenwaardig droogmiddel als diatomeeënaarde toe om het overtollige water te binden.
Meng de twee producten goed door elkaar tot een korrelig droog materiaal bekomen
wordt.
42
• Lyofilisatie : ongeveer 10g nat slib in een glazen petrischaal bengen en na invriezen
lyofiliseren. Indien niet nat gezeefd werd, het gelyofiliseerde monster verder fijn maken
en vervolgens over een metalen zeef met 2 mm maaswijdte leiden.
7.3.2 Extractieprocedure
De volgende extractieprocedures kunnen aangewend worden :
• soxhlet extractie : breng voor analyse 5 tot 10g (op basis van drooggewicht) slib over in
een soxhlet-apparaat en extraheer gedurende 24 uur met hexaan/aceton (1/1 v/v).
• ASE extractie : breng voor analyse 5 tot 10g (op basis van drooggewicht) slib over in
een extractiehuls en extraheer met hexaan/aceton (1/1 v/v). De extracties worden
uitgevoerd bij hoge temperatuur (100°C) en druk (2000 psi). Naargelang de gebruikte
extractiehuls dienen bijkomende parameters geoptimaliseerd te worden tot een volledige
extractie bekomen wordt.
Teneinde aceton te verwijderen, het bekomen extract uitschudden met 3 x 50 ml water.
Vervolgens het extract drogen over watervrij natriumsulfaat. Het gedroogde monsterextract
indampen, eventueel met Kuderna Danish als tussenstap, onder N2 tot 2 ml.
7.3.3 Zuivering
De graad van zuivering is afhankelijk van het monster. De meeste waterbodems bevatten
zwavel zodat ontzwaveling noodzakelijk is. In geval van aanwezigheid van PCB’s is een
groepenscheiding eveneens noodzakelijk. Alternatieve cleanups zijn mogelijk doch dienen
op mogelijke verliezen gecontroleerd te worden.
• Cleanup over aluminiumoxide
In een chromatografiekolom 2 g gedeactiveerd (met 11% water) aluminiumoxide brengen.
Op het aluminiumoxide brengt men een laagje natriumsulfaat. Het extract overbrengen op
de chromatografiekolom. Spoel drie keer het recipiënt na met 0.5 ml petroleumether en
breng telkens op de kolom. Elueer met 12 ml petroleumether. Het solvent onder
stikstofstroom indampen tot 2 ml.
• Groepenscheiding over silicagel
In een chromatografiekolom wordt 2 g gedeactiveerde (met 5% water) silicagel gebracht.
Breng boven de silicagel een laagje natriumsulfaat aan. Breng het volledige extract op de
kolom. Spoel drie keer het recipiënt na met 0.5 ml petroleumether en breng telkens op de
kolom. Elueer de kolom achtereenvolgens met 12 ml petroleumether (fractie A) en 12 ml
43
van een solventmengsel petroleumether/diethylether 9/1 (fractie B). Damp beide fracties
onder stikstofstroom in tot 2 ml. De fractie A bevat de PCB’s en de apolaire OCP’s
(hexachloorbenzeen , heptachloor, o,p-DDE, p,p’-DDE, o,p-DDT, p,p’-DDT en aldrin). De
fractie B bevat de wat meer polaire OCP’s (alfa-HCH, beta-HCH, gamma-HCH,
heptachloorepoxide, dieldrin, endrin en alfa-endosulfan). o,p-DDD en p,p’-DDD zijn verdeeld
over beide fracties.
• Ontzwavelen
Bereid het tetrabutylammonium-sulfiet (TBA-sulfiet) reagens door eerst 3.4 g tetrabutyl-
ammoniumwaterstofsulfaat op te lossen in 100 ml water en vervolgens 25 g natriumsulfiet
toe te voegen.
Voeg aan het 2 ml extract van fractie A 1 ml TBA-sulfiet reagens toe en 1 ml isopropanol en
schud gedurende 1 minuut. Voeg vervolgens 5 ml water toe, meng en wacht tot er een
duidelijke scheiding is tussen de lagen. Met een pipet zuigt men voorzichtig de
onderstaande waterige laag weg. Voeg opnieuw 5 ml water toe en herhaal de voorgaande
bewerking.
7.3.4 Analysetechniek
Voor de identificatie en kwantificering kunnen twee analysetechnieken gebruikt worden :
dubbelkolom GC-ECD of GC-MS.
7.3.4.1 GC-ECD methode
• Identificatie
De gaschromatografische scheiding gebeurt op twee kolommen met verschillende polariteit
(bvb. DB-5 / DB-1701 of CP-sil-8 / CP-sil-19). De herkenning van de organochloorpesticiden
en PCB’s gebeurt aan de hand van de verwachte retentietijden op de beide kolommen. Een
component wordt als aanwezig beschouwd als deze in de juiste fractie tegelijkertijd voor de
beide kolommen op de verwachte retentietijden een piek vertoont. Ter controle van de
retentietijden worden de interne standaarden Mirex en PCB 29 toegevoegd.
• Kwantificering
Kwantificering van de componenten gebeurt aan de hand van de relatieve piekhoogtes t.o.v.
de inwendige standaard Mirex en de overeenkomende calibratielijnen van de externe
standaardmengsels. Het eindresultaat is in principe het gemiddelde van de concentraties
bekomen via de beide electron capture detectoren. Indien de verhouding tussen de hoogste
en laagste concentratie echter groter is dan 1.25, wordt de laagste concentratie als
44
eindresultaat genomen. Ter controle van het recuperatierendement wordt PCB 112 aan het
monster toegevoegd en mee bepaald. Bij een rendement < 75% dient de analyse herhaald
te worden. Er wordt geen correctie voor het rendement uitgevoerd.
7.3.4.2 GC-MS methode
• Identificatie
De analyse gebeurt met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS). De
chromatografische scheiding van de componenten wordt uitgevoerd op een apolaire of
semi-polaire capillaire kolom met chemisch gebonden fase.
Identificatie van de PCB's en organochloorpesticiden wordt uitgevoerd op basis van de
relatieve retentietijden van de pieken in het ionchromatogram in de selected ion monitoring
(SIM)-mode. Bij gebruik van klassieke injectietechnieken kunnen de vooropgestelde
detectiegrenzen in de full scan mode niet bereikt worden. Diverse gelabelde verbindingen
zijn verkrijgbaaar en kunnen als inwendige standaarden gebruikt worden.
• Kwantificering
Voor de kwantitatieve bepaling van de PCB's en organochloorpesticiden wordt gebruik
gemaakt van de interne standaardmethode op basis van de geïntegreerde
piekoppervlakken van de meest karakteristieke ionen van de verschillende verbindingen.
Referenties
NEN 5734 (ontwerp) (1990). Bodem: gaschromatografische bepaling van de gehalten aan
organochloorbestrijdingsmiddelen (ocb’s) en polychloorbifenylen (pcb’s) in grond.
Nederlands Normalisatie Instituut, november 1990.
45
8. Bepaling van ammoniakale en organische stikstof in water-bodems (kjeldahl)
8.1 Toepassingsgebied
De Kjeldahl destructiemethode laat toe de organisch gebonden stikstof te bepalen afkomstig
van verontreinigingen aanwezig in waterbodems, vooropgesteld dat zij onder de gekozen
werkomstandigheden geoxideerd kunnen worden tot ammoniumionen.
In de beschreven methode wordt stikstof, vervat in de nitraat en/of nitriet-ionen, niet
aangetast. De vrije ammoniumionen worden eveneens meebepaald daar zij niet vooraf
worden verwijderd.
8.2 Principe
De bepaling gebeurt in drie stadia, nl. een mineralisatie met zwavelzuur en selenium bij zeer
hoge temperatuur, een stoomdestillatie in neutraal milieu, en tenslotte de meting van het
gevormde ammoniak. Dit ammoniak kan gemeten worden of via terugtitratie van de
overgedestilleerde stikstofcomponenten in een boorzuuroplossing met een verdunde
waterstofchloride-oplossing of via een fotometrische bepaling waarbij gebruik gemaakt
wordt van het Nessler reagens.
8.3 Werkwijze
8.3.1 Monsterdestructie
• 2 à 3 g goed gehomogeniseerd vers slibmateriaal afwegen in een Büchikolf;
• daaraan ongeveer 1 g seleenmengsel en 10 ml H2SO4 96% toegevoegen;
• plaats de kolven in de verwarmingsblok en zorg hierbij voor de afzuiging van de
kookdampen;
• ongeveer 15 minuten verwarmen op maximum temperatuur en dan nog eens 45
minuten op gereduceerd vermogen (80%);
• alvorens over te gaan tot de volgende stap, de oplossingen laten afkoelen.
46
8.3.2 Destillatie
Plaats na afkoelen de destructiekolven in het destillatieapparaat en voeg 50 ml water en 50
ml natriumhydroxide oplossing (40%) toe.
Het destillatieproces duurt 3 minuten (langer voor sterk verontreinigde stalen) en via een
gesloten systeem wordt het destillaat opgevangen in een 2% boorzuuroplossing (voor de
titrimetrische methode) of in 0.1M zoutzuur (voor de fotometrische methode). Een pH-meter
controleert de evolutie van de destillatie.
Voor een gedetailleerde beschrijving van de instelling en werking van het destillatietoestel,
wordt verwezen naar de bijhorende handleiding.
8.3.3 Analyse
8.3.3.1 Titrimetrische bepaling
Een automatische titrator zorgt voor de neutralisatie van het destillaat met HCl 0,1 N
(nauwkeurigheid ongeveer 1 µl). Hieruit de Kjeldahl stikstof berekenen :
Kjeldahl - N = t 0,1 14
M103 (mg / kg vers slib)
× ××
waarin t = aantal ml titrans (HCl 0.1 N)
M = afgewogen hoeveelheid staal (g)
8.3.3.2 Fotometrische bepaling
Laat het bekomen destillaat afkoelen. Aan 50 ml van het destillaat 1 ml Nessler-reagens
toevoegen. Laat de kleur ± 10 minuten optimaal ontwikkelen. De extinctie van het monster
bij 440 nm meten, na overbrengen in een cuvet met een weglengte van 1 cm.
Referenties
COTTENIE, A., VERLOO, M., KIEKENS, L. & VELGHE G., (1976). Analyseme-thoden voor
planten en gronden. I.W.O.N.L. - Centrum voor de Studie van de Scheikundige
Vruchtbaarheid van de bodem, Faculteit Landbouwwetenschappen, Rijksuniversiteit Gent.
OVAM/VITO (1996). Compendium Afvalstoffenanalyse, methode 2/I/B.5, Kjeldahl stikstof.
47
9. Mineralisatie met koningswater voor de bepaling van totale P en zware metalen in waterbodems
9.1 Toepassingsgebied
Binnen de Triade-studie werd voor analyse van zware metalen gekozen voor een
mineralisatie met koningswater. Binnen deze studie ligt de nadruk op een ecologische
beoordeling. Indien we te maken hebben met baggerspecie is hierop het Vlarea van
toepassing. Binnen dit kader van afvalstoffenwetgeving zijn totaalanalyses van toepassing.
Deze totaalanalyses impliceren een ontsluiting met waterstoffluoride. Deze ontsluiting wordt
beschreven in het OVAM/VITO afvalstoffencompendium (methodes AAC/2/II/A.3.1 en
AAC/2/II/A.3.2).
De analyse van metalen laat keuzes in het gebruik van apparatuur toe in zoverre volgende
detectiegrenzen kunnen gehaald worden: As (2 mg/kgds), Cd (0.2 mg/kgds), Cr (5
mg/kgds), Cu (3 mg/kgds), Hg (0.02 mg/kgds), Ni (4 mg/kgds), Pb (10 mg/kgds) en Zn(20
mg/kgds).
9.2 Principe
Voor de bepaling van het totale P en de zware metalen (As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Zn)
wordt een destructie- of ontsluitingsmethode op het te analyseren monster toegepast.
Hierbij worden de aanwezige metalen omgezet in de vrije metaalvorm zodat ze aansluitend
kunnen gemeten worden met inductief gekoppeld plasma atoom emissie spectrometrie
(ICP-AES), atomaire absorptie spectrometrie (AAS) of andere methoden (vlamloze
atoomabsorptie, atomaire fluorescentiespectrometrie).
9.3 Werkwijze
9.3.1 Mineralisatie
• breng van een gedroogd (105°C, 16u) of gelyofiliseerd monster, na homogenisatie en
zeven over 2 mm maaswijdte, 5 g over in een reactiekolf van 250 ml met geslepen
hals;
• voeg 6 ml HNO3 65% en 18 ml HCl 36% toe;
• plaats onder terugvloeikoeler, verwarm tot kooktemperatuur en laat gedurende 2 uur
koken;
48
• spoel na afkoeling de koeler en filtreer de oplossing over een 0.45 µm membraanfilter
in een maatkolf van 100 ml;
• spoel verscheidene keren het onoplosbaar residu dat op de filter achterblijft;
• leng aan tot volume.
9.3.2 Koude damp methode
Voor de bepaling van Hg:
• voer de mineralisatie uit zoals beschreven in 8.3.1.
• voeg aan 5 ml gedestrueerd monster 0.5 ml 5.6N HNO3 + 0.5 ml 18N H2SO4 + 50 µl
KMnO4 5% toe en laat dit 15 minuten reageren
• voeg tenslotte 0.5 ml HONH3Cl 10% toe.
9.3.3 Analyse
De bepaling van P, As, Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, en Zn kan gebeuren met plasma-emissie
spectrome-trie (ICP-AES). Alternatief kunnen vlam-AAS en hydride-AAS (As) gebruikt
worden.
Elementen die op deze manier niet kunnen bepaald worden omwille van hun te lage
concentratie, worden gemeten met AA-oven (met deuterium-achtergrondcorrectie).
De bepaling van Hg gebeurt door middel van vlamloze atoomabsorptie of atomaire
fluorescentiespectrometrie. Hiervoor kan apparatuur gebruikt worden waarbij oplossingen
van 4% SnCl2 (als reductans) automatisch toegevoegd worden. De calibratie kan gebeuren
met een standaardreeks van HgCl2 of Hg(NO3), die identiek aan de monsters behandeld
wordt.
Referenties
NPR 6425 (1992) Algemene richtlijnen voor atomaire emissiespectrometrie met inductief
gekoppeld plasma.
Standard Methods for the examination of water and waste water (1992). Metals, 3 / 1-103.
49
10. Kleigehalte
De methodologie voor de bepaling van het kleigehalte is volledig beschreven onder de
methode 2\II\A.6 van het OVAM/VITO Compendium voor afvalstoffenanalyse (1996).
10.1 Toepassingsgebied
De granulometrie van een sediment is een belangrijke parameter voor de fysisch-chemische
karakterisatie van het sediment. Het klei- of lutumgehalte (fractie < 2 µm) wordt gebruikt bij
de omrekening naar standaardcondities. De referentiemethode voor de fractie aan deeltjes
kleiner dan 2 µm is de pipetmethode van Robinson-Köhn. Resultaten bekomen via de
laserdiffractiemethode of via de sedigraaf kunnen gebruikt worden in zoverre de relatie met
de pipetmethode werd vastgelegd.
Een bijkomende bepaling van de fracties <16µm, <25µm, <32µm, <50µm, <63µm, <125µm,
<500µm, <1000µm en <2000µm kan gewenst worden doch wordt hier buiten beschouwing
gelaten. De resultaten worden uitgedrukt als % minerale delen.
10.2 Principe
De analyse wordt uitgevoerd op de fijne aarde (<2mm), na afscheiding van de grove
elementen. Om een goede dispersie van de fracties te bekomen, dienen alle cementerende
materialen als organisch materiaal en CaCO3 en eventueel ijzeroxiden verwijderd te
worden.
De fijne fracties (leem en klei) worden gescheiden van het zand door natte zeving op een
zeef van 50µm. De fracties groter dan 50µm kunnen bepaald worden met behulp van
zeven, de fracties van delen kleiner dan of gelijk aan 50µm met behulp van een pipet van
Robinson-Köhn na dispersie van de colloïdale fractie met een dispergerende stof. De tijd en
de diepte van de pipetopname worden afgeleid van de Wet van Stokes.
10.3 Werkwijze
10.3.1 Voorbehandeling
• Monster drogen
50
Het staal gedurende minstens. 12 uur drogen bij 60°C tot constant gewicht. Om te
vermijden dat de droge stalen te harde klompen vormen, het staal in een dunne laag drogen
in petrischaaltjes.
• Afscheiden van de grove fractie
De grove fractie (>2 mm) verwijderen door het droge staal te zeven op een zeef van 2mm
maaswijdte. Indien het staal toch aan elkaar gekoekt is, het in een mortier voorzichtig
verkruimelen.
• Vernietiging van de carbonaten
De fijne fractie (< 2 mm) testen op de aanwezigheid van carbonaten door enkele druppels
HCl 2N toe te voegen. Indien een bruisende reactie optreedt de carbonaten als volgt
vernietigen :
- ongeveer 30 g exact afwegen (massa m) in een hoge beker van 1 liter (beker vooraf
gedroogd bij 105°C en gewogen na afkoeling : Mb)
- 200 ml CH3COONa (pH 5) toevoegen en schudden gedurende 30 minuten;
- op zandbad plaatsen gedurende 6 uur (suspensie op 60°C houden);
- aanlengen met gedemineraliseerd water, roeren en laten overnachten;
- bovenstaande vloeistof afzuigen.
Deze procedure herhalen tot de bovenstaande vloeistof troebel is. Het monster wordt
drooggedampt in een droogoven bij 105°C en na afkoeling gewogen (Mc). De massafractie
aan carbonaten kan berekend worden volgens :
%100m
Mc- m) + (Mb% xcarbonaten =
• Vernietiging van organisch materiaal
Indien de methode voor het vernietigen van de carbonaten werd uitgevoerd, verder werken
met dit monster. Indien deze behandeling niet uitgevoerd werd, ongeveer 30 g exact
afwegen in een hoge voorgewogen beker van l liter.
- voorzichtig 50 ml verdund H2O2 toevoegen (de vorming van schuim onder controle
houden door toevoeging van ethanol);
- de beker afdekken met een horlogeglas en laten overnachten;
51
- 25 ml geconcentreerd H2O2 toevoegen (in kleine fracties indien hevige reactie optreedt)
en lichtjes opwarmen op een kookplaat (tot reactie ongeveer stilvalt). Dit minstens driemaal
herhalen (3x voor 1% organisch materiaal + 1x meer per extra 0.5%).
- spoelen met gedemineraliseerd water, laten sedimenteren (overnacht) en
bovenstaande vloeistof afhevelen;
- droogdampen in een droogoven bij 105°C en wegen na afkoeling (Mom).
Indien de procedure voor het vernietigen van carbonaten werd uitgevoerd, wordt het gehalte
aan organisch materiaal op de volgende manier berekend :
%organisch materiaalMc Mom
mx =
−100%
Indien de procedure voor het vernietigen van carbonaten niet werd uitgevoerd, wordt in
bovenstaande formule Mc vervangen door (Mb+m).
• Vernietiging van Fe-oxiden
Voor monsters met een hoog gehalte aan ijzer (roestkleurig) is een bijkomende ontbinding
van de ijzeroxiden noodzakelijk.
- 300 ml HCl 2N toevoegen aan het staal na de vernietiging van het organisch materiaal;
- gedurende 1 uur verwarmen op een zandbad bij 60°C, de beker af en toe omschudden;
- laten sedimenteren (overnacht) en de bovenstaande vloeistof afzuigen;
- staal wassen met 100 ml gedemineraliseerd water, afzuigen na bezinking.
- wassen en afzuigen herhalen tot de pH van de vloeistof ongeveer 6 bedraagt;
- staal drogen in droogoven bij 105 °C en wegen na afkoeling (Ms).
Het gehalte oxiden wordt berekend :
%ijzeroxidenMs Mom
mx=
−100%
52
10.3.2 Bepaling van het kleigehalte
Voor de bepaling van het kleigehalte wordt gebruik gemaakt van de pipetmethode van
Robinson-Köhn. Een beschrijving van het gebruik van de pipet is terug te vinden in het
afvalstoffencompendium.
• Afscheiding van de zandfractie
- ongeveer 20 g van het voorbehandelde droge staal exact afwegen (= G)
- zeven op een zeef met een maaswijdte van 50µm onder een waterstraal (spuitfles met
gedest. water) waarbij licht met de vingertoppen over de zeef gewreven wordt (dragen van
handschoenen!)
- het filtraat opvangen in opvangschaal en overbrengen naar een sedimentatiecilinder van 1l
- het zeven wordt beëindigd zodra het doorstromend water helder is (volume filtraat dient
<1l, indien dit niet het geval is indampen)
- het filtraat kwantitatief overbrengen in de sedimentatiecilinder
- de zandfractie kwantitatief overbrengen in een weegflesje
- het weegflesje laten drogen in de warme luchtoven bij 105°C gedurende minimum 12 uur
- het weegflesje laten afkoelen in de exsiccator en wegen (= Z).
• Bepaling van de kleifractie
- 20 ml dispergeermiddel toevoegen aan het filtraat en de inhoud van de cilinder op precies
1000 ml brengen;
- een getuigecilinder klaarmaken met enkel dispergeermiddel en gedistilleerd water;
- de sedimentatiecilinders afsluiten en min. 2 uur schudden op een roterend schudtoestel.
- de sedimentatiecilinder in het gethermostatiseerd bad plaatsen, het monster op
temperatuur laten komen
- de suspensie homogenizeren met de lange glazen of metalen staaf en de chronometer
starten (t = 0)
- de suspensie in de pipet opvangen in een weegflesje en de pipet naspoelen
- het weegflesje laten drogen in de warme luchtoven bij 105°C gedurende minimum 12 uur
(tot constant gewicht);
53
- het weegflesje laten afkoelen in het droogtoestel en wegen (= K + L+D);
- 20 ml opzuigen uit de getuigecilinder, drogen en afwegen (= D).
- de opname van klei is gebaseerd op de relatie tussen de sedimentatiesnelheid en de
korrelgrootte van de partikels en kan gebeuren op een variërende diepte op een vooraf
bepaald tijdstip ofwel op een gefixeerde diepte na een bepaalde tijdspanne. De
sedimentatietijden en corresponderende opnamediepten zijn in tabel gegeven.
- 30 seconden voor het einde van de sedimentatietijd voorzichtig de pipet (met gesloten
opening) in de suspensie dompelen op de gewenste diepte;
- de suspensie langzaam opzuigen, zodanig dat het einde van de sedimentatietijd precies
samenvalt met het midden van de duur van de opname;
- de suspensie in de pipet opvangen in een weegflesje;
- het weegflesje laten drogen in de warme luchtoven bij 105 °C gedurende minimum 12 uur
(tot constant gewicht);
- het weegflesje laten afkoelen in de exsiccator en wegen (= K+D).
• Berekening
De verschillende fracties kunnen als volgt berekend worden :
Zandfractie 50-2000 µm:
Z ZxG
% =100
(in gewichts % )
Leemfractie 2-50 µm:
L% = [(K+L+D) - (K+D)] x f ’x 100/G
Kleifractie (0-2 µm):
K% = [(K+D) - D] x f’ x 100/G
met:
G = gewicht monster
Z = gewicht van de zandfractie
L = gewicht van de leemfractie
K = gewicht van de kleifractie
D = gewicht van dispergeermiddel in blanco oplossing
54
f’ = f x p
f = verdunningsfactor (volume sedimentatiecilinder/theoretisch volume pipet)
p = (theoretisch volume pipet) / (werkelijk volume pipet)
Opmerking: De Pipet van Robinson-Köhn dient vooraf geijkt te worden door de inhoud van
de pipet te controleren. De eventuele correctiefactor (p) wordt met de verdunningsfactor (f)
vermenigvuldigd.
Naast de kleifractie dienen als kwaliteitscontrole van de meting de leemfractie en de totale
zandfractie bepaald te worden. Op deze manier kan de som van de drie fracties
gecontroleerd worden.
Tabel : Sedimentatietijd en corresponderende opnamediepte (in cm) voor de bepaling van
het kleigehalte in functie van temperatuur.
Temperatuur diepte (d) sedimentatietijd (t) °C (t = 8 uur) (d = 10 cm)
18 9.5 8u24' 19 9.8 8u12' 20 10.0 8u00' 21 10.3 7u49' 22 10.5 7u38' 23 10.8 7u27' 24 11.0 7u17' 25 11.3 6u57’ 26 11.5 7u07’ 27 11.8 6u48' 28 12.1 6u39' 29 12.3 6u31' 30 12.6 6u23'
Referenties
OVAM/VITO (1996). Compendium Afvalstoffenanalyse, methode 2\II\A.6, kleigehalte
(pipetmethode van Robinson-Köhn)
55
ECOTOXICOLOGISCHE TESTEN
1. Staalbehandeling en bewaring
Sedimentstalen zijn onderhevig aan chemische, biologische en fysische veranderingen
vanaf het moment van de staalname. Staalmanipulatie en verwerking moeten er dan ook op
gericht zijn om deze veranderingen zo minimaal mogelijk te houden.
1.1 Behandeling
Om onnodige behandelingen te vermijden wordt het sedimentstaal opgesplitst in eenvoudig
manipuleerbare hoeveelheden (PVC emmers van 10 l). Alle containers worden voorzien van
een waterbestendig label. Tijdens de manipulaties worden een aantal
veiligheidsmaatregelen in acht genomen, zoals het dragen van beschermende kledij,
handschoenen en veiligheidsbril, en werken in een voldoende geventileerde ruimte.
1.2 Bewaring
Verschillende studies hebben aangetoond dat sedimentstalen tijdens bewaring onderhevig
zijn aan (chemische) veranderingen. Afhankelijk van het type staal kan de toxiciteit dalen of
stijgen (Malueg et al, 1986, EPA/USACE, 1994), of treden er geen waarneembare
veranderingen in de effecten op (Othoudt et al, 1991). Door ontbreken van een juist inzicht
omtrent de invloed van bewaringstechnieken op de toxiciteit van sedimentstalen wordt
algemeen aangeraden de tijd tussen staalname en verwerking (uitvoering van de
toxiciteitstesten) zo kort mogelijk te houden. Stalen dienen bij voorkeur getest te worden
binnen de maand na collectie (EPA/USACE, 1994).De stalen worden bewaard bij 4 °C in
het donker, in tot aan de rand gevulde PVC emmers. Na extractie moet het poriënwater
binnen de 24 uur na extractie worden opgezet aangezien reeds chemische veranderingen
binnen deze periode kunnen optreden. Poriënwater wordt tot gebruik bewaard bij 4°C in
amberkleurige glazen flessen (tot aan de rand gevuld) in het donker (Hulbert & Brindle,
1975).
56
2. Bioassays op het poriënwater
2.1 Algengroei-inhibitietest met de alg Raphidocelis subcapitata
2.1.1 Inleiding
Deze procedure beschrijft de standaard testprocedure voor de evaluatie van de toxiciteit
van het poriënwater voor de alg R. subcapitata (vroeger Selenastrum capricornutum
genaamd). Deze test is conform met de OECD richtlijn 201: “OECD guideline for testing of
chemicals 201: Alga, growth inhibition test” (OECD, 1984).
2.1.2 Definities
Algenmedium: wordt gebruikt als verdunningsmedium (= gedesioniseerd water gefilterd tot
op 0,2 µm en nutriëntenmedium (eindconcentratie 1 %).
Blanco: concentratiereeks van milieustaal in verdunningsmedium zonder wierent bedoeld
voor de correctie van de gemeten ruis ten gevolge van vlokvorming (Coulter
counter/optische densiteit) of kleur (optische densiteit).
Controle: blootstelling van het organisme aan het algenmedium in afwezigheid van
contaminanten en bedoeld voor de evaluatie van de gezondheidstoestand van de
testorganismen en de kwaliteit van het algenmedium. Het resultaat van de controle is
bepalend voor de geldigheid van de test gebruikmakend van vooraf gedefinieerde criteria
(zie 2.1.4.7.).
E(b)C50: de concentratie waarbij 50 % reductie van de groei (uitgedrukt als biomassa) wordt
waargenomen.
Nutriëntenmedium: stockoplossing (10 %) met macro - en micronutriënten om een optimale
groei van de wieren te garanderen.
Poriënwater: is het water dat zich bevindt in de ruimtes tussen sedimentpartikels en voor de
algentest afgezonderd wordt van het bulksediment via centrifugatie.
Wierent : Exponentieel groeiende wiercultuur die gebruikt wordt als startmateriaal voor de
Algengroei-inhibitie test.
57
2.1.3 Principe van de testmethode
Exponentieel groeiende culturen van het groenwier R. subcapitata worden gedurende 72
uur aan verschillende concentraties van het poriënwater blootgesteld. De populatiegroei
wordt na de blootstellingsperiode vergeleken ten opzichte van de populatiegroei in de
controle.
2.1.4 Standaard testprocedure
2.1.4.1 Extractie van poriënwater uit sedimentstaal
Verschillende methoden (centrifugatie, filterpers, dialyse en zuigers) worden in de literatuur
vermeld voor het scheiden van poriënwater uit sedimenten (Burton, 1991). De keuze van de
extractietechniek wordt in grote mate bepaald door de hoeveelheid staal die dient verwerkt
te worden. Ongeacht het type extractietechniek moet er bij de toxiciteitsevaluatie rekening
gehouden worden met de kans dat bij centrifugatie en persing, al dan niet gevolgd door
filtratie, een gedeelte van de toxiciteit, door verwijdering van partikels met specifieke
contaminanten of door adsorptie van de contaminanten aan de filters, verloren gaat (Burton,
1991). Aangezien het volume benodigd poriënwater voor de uitvoering van de
geselecteerde bioassays slechts 500 ml bedraagt is centrifugatie de aangewezen
extractietechniek (min 2 500 g, 15 min). De centrifugatie wordt bij voorkeur bij een
temperatuur van 4 °C uitgevoerd om mogelijke artefacten (zoals vervluchtiging) te
vermijden. Indien geen gekoelde centrifuge voorhanden is dient men erop toe te zien
worden dat de temperatuur van het poriënwater tijdens de centrifugatie de 20 °C niet
overschrijdt. Het poriënwater moet gefilterd worden tot 0,45 µm voor de aanvang van de
algengroei inhibitie test. Het totaal benodigde volume poriënwater bedraagt 400 ml voor de
conventionele wiertest (OECD-richtlijn, n° 201) en 200 ml voor de AlgaltoxkitFTM
. Voor de
aanvang van de testen worden de volgende parameters in het poriënwater gemeten: pH,
ammoniumgehalte, chloridegehalte, hardheid, saliniteit, conductiviteit en zuurstof. Deze
gegevens worden bij de interpretatie gebruikt om te evalueren in welke mate de
randvoorwaarden voor het organisme (zie 2.1.4.7) overschreden werden.
2.1.4.2 Aanmaak van het nutriëntenmedium (OECD, 1984; ISO, 1987)
Het medium bestaat uit 4 stockoplossingen waarvan de samenstelling wordt weergegeven
in tabel 2.1. De bereiding van de stockoplossingen en van het nutriëntenmedium gebeurt in
gefilterd (0,2 µm) gedesioniseerd water.
58
Tabel 2.1: Samenstelling van het nutriëntenmedium
Stockoplossing A Stockoplossing B Stockoplossing C Stockoplossing D macro-nutriënten (g/l) FE-EDTA (mg/l) sporenelementen (mg/l) NaHCO3 (g/l)
NH4Cl: 1.5 FeCl3.6H2O: 80 H3BO3: 185 NaHCO3: 50 MgCl2.6H2O: 1.2 Na2EDTA. MnCl2.4H2O: 415 2H2O: 100 CaCl2.2H2O: 1.8 ZnCl2: 3 MgSO4.7H2O: 1.5 CoCl2.6H2O: 1.5 KH2PO4: 0.16 CuCl2.2H2O: 0.01 Na2MoO4.2H2O: 7
Bij de algengroei-inhibitietest wordt een 10% nutriëntenoplossing gebruikt met 100 ml/l van
stockoplossing A en 10 ml/l van elk van de overige stockoplossingen B, C en D.
2.1.4.3 Aanmaak van algenmedium
Het algenmedium wordt bereid door een 1/10 verdunning van het nutriëntenmedium (10%)
in gedesioniseerd water en vervolgens gefiltreerd (0.45 µm). Na evenwichtsinstelling moet
de pH van het algenmedium 8.0 ± 0.1 zijn. Zoniet wordt de pH met NaOH of HCl bijgesteld.
2.1.4.4 Benodigde materialen
• standaard labo uitrusting
• testrecipiënten van een geschikt volume (bv. 100 ml erlenmeyers of “long cell
cuvetten”a
• Coulter counter of spectrofotometera
• pH meter
• steriele werkbank
• microscoop
• algenincubator of lichttafel in een gethermostatiseerde ruimte (23°C ± 2°C) met witte
fluorescentielampen, lichtintensiteit: 0.72 1020 photonen/m2s ± 20% = 8 000 lux ± 20%
(gemeten met een sferische collector, lichttemperatuur: ± 4 200 K)
a = uitrusting nodig bij de Algaltoxkit FTM
2.1.4.5 Testinitiatie
Testcondities
59
• Testorganismen: R. subcapitata ent (afkomstig van een wiercultuur in exponentiële
fase)
• Medium: gedesioniseerd water (gefilterd over 0,2 µm) en nutriënten (10%), deze
oplossing wordt op pH 8,0 (± 0,1) gebracht.
• Hoeveelheid testoplossing/erlenmeyer: 50 ml of hoeveelheid testoplossing/cuvet: 25 mla
• Incubatie 72 h bij 25 °C omgevingstemperatuur (watertemperatuur 23 ± 2°C)
• Wierent bij aanvang test: 1.104 cellen/ml
• Continue belichting (8000 lux ± 20%)
• 5 concentraties per staal en 1 controle, 3 replica’s per concentratie, 6 replica’s voor de
controle
• Eindpunt: populatiegroei (biomassa) na 72 h
a = testvolume bij de Algaltoxkit FTM
Voorbereiding wierent
De benodigde wierent (wieren in exponentiële fase) voor de initiatie van de test kan
afkomstig zijn van:
• een precultuur (afkomstig van een continue cultuur) of
• geïmmobiliseerde algena
Opzetten van de test
• Breng het gefilterde (0,45 µm) poriënwater (US EPA, 1989) voor het begin van de test
op de gewenste testtemperatuur (23 ± 2°C).
• Voeg een hoeveelheid nutriëntenmedium (10%) toe aan iedere testrecipiënt zodat de
eindconcentratie van het nutriëntenmedium (na toevoeging van algen, gedesioniseerd
water voor verdunning en poriënwater) nog 1 % zal bedragen.
• Maak een 1/2 verdunningsreeks van het poriënwater. Per staal worden minstens 5
testconcentraties (90%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%) bereid waarvan 3 replica’s per
concentratie. Om te voorkomen dat bij eventuele vlokvorming de elektronische
deeltjesteller (Coulter Counter) of de optische densiteitsmeting een verkeerde meting
zou geven, wordt voor iedere concentratie één blanco (zonder wierent) voorzien. Zwaar
troebele stalen (opmerking: de troebeling manifesteert zich soms pas gedurende de
60
test) kunnen niet getest worden. Meestal gaat men dan bij het onverdunde staal voor
de O.D meting buiten schaal (> 1.999) of worden met de coulter abnormaal hoge
waarden gemeten. Het expert judgement van de operator is hier nodig om een oordeel
te kunnen vellen (vb afwezigheid duidelijke groei of groene kleur, maar toch zeer hoge
waarden kunnen niet getest worden). Er worden 6 controle’s (0 % poriënwater) bereid.
Het aanlengen tot de gewenste concentraties gebeurt met gefilterd (0,2 µm)
gedesioniseerd water.
• Voeg een gepaste hoeveelheid wierent toe aan de testoplossing zodat een initiële
celdichtheid van 1.104 cellen/ml bekomen wordt.
• Sluit de testrecipiënten af mits luchtverversing mogelijk is en incubeer gedurende 3
dagen bij vermelde testcondities.
• Gedurende de test worden de algen in suspensie gehouden door dagelijks de
recipiënten minimaal 3 maal te schudden of door het gebruik van een continu
schudapparaat.
2.1.4.6 Aflezen van de test
• Het aflezen van de testen gebeurt door een dagelijkse meting (d.w.z. na 24h, 48h en
72h blootstelling) van de wiercelconcentratie in de testoplossing met de Coulter
Counter of door meting van de optische densiteit met de spectrofotometer. Dagelijks
wordt de blanco gemeten en als achtergrond afgetrokken. Per replica wordt 1 meting
uitgevoerd. Per concentratie wordt dan aan de hand van de resultaten voor de
verschillende replica’s het gemiddelde berekend. De pH wordt bij het begin van de test
en na 72h gemeten in alle testrecipiënten. Deze mag per recipiënt niet meer dan
anderhalve pH eenheid verschillen gedurende de test.
2.1.4.7 Geldigheidscriteria
• De celdichtheid in de controleculturen moet na 72h minimaal met een factor 16 zijn
toegenomen.
• pH-afwijking na 72h: ± 1,5 eenheden. (De OECD richtlijn 201, oorspronkelijk opgesteld
voor het testen van zuivere stoffen, laat maximaal een verschil toe van 1 pH eenheid.
Deze voorwaarde wordt echter bij veldstalen zoals effluenten en poriënwaters zelden
vervuld zodat hier een afwijking van 1,5 pH eenheden wordt toegestaan).
61
• Randvoorwaarden: in tabel 2.2 wordt een overzicht gegeven van de randvoorwaarden
voor R. subcapitata. Een overschrijding van deze randvoorwaarden kan betekenen dat
negatieve effecten kunnen optreden ongeacht de verontreinigingsgraad van het staal.
Tabel 2.2: Overzicht van de randvoorwaarden voor R. subcapitata
Testorganisme Criterium Bereik Referentie
pH
Wieren R. subcapitata
geen acute effecten
7-9
Database LABRAP
Hardheid (in mg/l CaCO3)
geen acute effecten
72 h E(b)C50
< 1 000
2 750 (1 900-3 600)
Database LABRAP Database LABRAP
NH4+ (mg/l) bij pH 8
geen acute effecten
72 h E(b)C50
10-32
125 (109-141)
Database LABRAP Database LABRAP
Cl- (mg/l)
geen acute effecten
72 h E(b)C50
< 560
1 180 (1 120-1 240)
Database LABRAP Database LABRAP
2.1.4.8 Berekening 72h E(b)C50
Een groeicurve wordt opgesteld door de celconcentratie (aantal cellen/ml) of optische
densiteit voor elke concentratie van het onderzochte staal en voor de controle uit te zetten
in functie van de tijd. Om de relatie tussen groei en concentratie te evalueren wordt de EC50
berekend voor elk tijdstip waarop de biomassa tijdens de test werd gemeten (24, 48, 72h ).
Het effect wordt ingeschat door de oppervlakte onder de groeicurven als maat voor de groei
te gebruiken (E(b)C50: maat voor effect op biomassa = concentratie waarbij de oppervlakte
onder de groeicurve de helft bedraagt van de oppervlakte onder de groeicurve van de
controle). De curven worden geconstrueerd met de gemiddelde waarden van de replica’s.
De oppervlakte onder een groeicurve wordt voor elk van de onderzochte tijdstippen als volgt
berekend:
AN N
tN N N
t tN N N
t tn nn n=
−× +
+ −× − +
+ −× −−
−
1 01
1 2 02 1
1 01
2
2
2
2
2( ) ( )
62
met:
A: oppervlakte
N0: nominaal aantal cellen of gemeten absorptie op tijd t0
N1: gemeten aantal cellen of gemeten absorptie op tijd t1
Nn: gemeten aantal cellen of gemeten absorptie op tijd tn
t1: tijdstip waarop de eerste meting is gebeurd na het begin van de test
tn: tijd van de nde meting na het begin van de test
Het procent groei-inhibitie voor iedere testconcentratie wordt berekend d.m.v.:
IAc Aa
Aca =
− ×( ) 100
met:
Ia: percent inhibitie van concentratie a
Ac: oppervlakte van controle groeicurve
Aa: oppervlakte van de groeicurve van concentratie a
De concentratie-effect curven en de EbC50 worden bepaald door middel van lineaire
regressieanalyse.
2.2 Acute mortaliteitstest met het kieuwpootkreeftje Thamnocephalus platyurus
2.2.1 Inleiding
Deze procedure beschrijft de standaard testprocedure voor de evaluatie van de toxiciteit
van het poriënwater voor het kieuwpootkreeftje T. platyurus. Deze microbiotest werd door
het Laboratorium voor Biologisch Onderzoek van Waterverontreiniging ontwikkeld (Centeno
63
et al 1995). De gevolgde procedure is conform het standaardtestprotocol van de
Thamnotoxkit FTM (SOP Thamnotoxkit FTM,).
2.2.2 Definities
Controle: blootstelling van het organisme aan het EPA medium in afwezigheid van
contaminanten en bedoeld voor de evaluatie van de gezondheidstoestand van de
testorganismen en de kwaliteit van het verdunningsmedium. Het resultaat van de controle is
bepalend voor de geldigheid van de test gebruikmakend van vooraf gedefinieerde criteria
(zie 2.2.4.7.).
Cysten: cryptobiotische stadia waarin de organismen zich bevinden in een “slaap”toestand
tot de omstandigdheden (licht, vochtigheid en temperatuur) gunstig worden.
LC50: concentratie waarbij 50 % van de testorganismen een effect (hier mortaliteit) vertonen.
Poriënwater: is het water dat zich bevindt in de ruimtes tussen sedimentpartikels en kan
afgezonderd worden van het bulksediment via centrifugatie, persen, dialyse enz.
2.2.3 Principe van de testmethode
Deze microbiotest maakt gebruik van de instar II-III nauplii van het kieuwpootkreeftje T.
platyurus om de acute toxiciteit van het poriënwater te evalueren. De testorganismen
worden gedurende 24h blootgesteld aan verschillende concentraties van het poriënwater.
Na de blootstellingsperiode wordt het aantal dode organismen geteld en de 24h LC50
bepaald.
2.2.4 Standaard testprocedure
2.2.4.1 Extractie van poriënwater uit sedimentstaal
Verschillende methoden (centrifugatie, filterpers, dialyse en zuigers) worden in de literatuur
vermeld voor het scheiden van poriënwater uit sedimenten (Burton, 1991). De keuze van de
extractietechniek wordt in grote mate bepaald door de hoeveelheid staal die dient verwerkt
te worden. Ongeacht het type extractietechniek moet er bij de toxiciteitsevaluatie rekening
gehouden worden met de kans dat bij centrifugatie en persing, al dan niet gevolgd door
filtratie, een gedeelte van de toxiciteit, door verwijdering van partikels met specifieke
contaminanten of door adsorptie van de contaminanten aan de filters, verloren gaat (Burton,
1991). Aangezien het volume benodigde poriënwater voor de uitvoering van alle
geselecteerde bioassays slechts 500 ml bedraagt is centrifugatie de aangewezen
64
extractietechniek (min 2 500 g, 15 min).De centrifugatie wordt bij voorkeur bij een
temperatuur van 4 °C uitgevoerd om mogelijke artefacten (zoals vervluchtiging) te
vermijden. Indien geen gekoelde centrifuge voorhanden is dient erop toe gezien te worden
dat de temperatuur van het poriënwater tijdens de centrifugatie de 20 °C niet overschrijdt.
Omdat de test met T. platyurus ook kan uitgevoerd worden op ongefilterde stalen wordt de
voorkeur gegeven aan het niet verder filteren van het poriënwater. Bij filtratie hebben we
immers een verwijdering van contaminanten door adsorptie aan het filtermateriaal. Het
totaal benodigde volume poriënwater bedraagt 10 ml. Voor de aanvang van de test worden
de volgende parameters in het poriënwater gemeten: pH, ammoniumgehalte,
chloridegehalte, hardheid, saliniteit, conductiviteit en zuurstof van het staal gemeten. Deze
gegevens worden bij de interpretatie gebruikt om te evalueren in welke mate de
randvoorwaarden voor het organisme zijn overschreden (zie 2.2.4.7).
2.2.4.2 Aanmaak gematigd hard EPA-medium (Horning and Weber, 1985)
Het EPA medium (gematigd hard) bevat volgende zouten:
NaHCO3 96 mg/l
CaSO4.2H2O 60 mg/l
MgSO4 60 mg/l
KCl 4 mg/l
Deze stoffen worden opgelost in gefilterd (0,2 µm) gedesioniseerd water. De pH van het
belucht EPA water bedraagt na evenwichtsinstelling 7,6 ± 0,2. (wat overeenstemt met een
hardheid van het medium tussen 80 en 100 mg/l CaCO3 met een alkaliniteit van 60- 70 mg/l
CaCO3).
2.2.4.3 Benodigde materialen
• standaardlaboratorium uitrusting
• cysten van het kieuwpootkreeftje, T. platyurusa
• petrischalena
• testrecipiënten in glas of polystyreen van een geschikt volume ( bv. 24-well plaata ,
testvolume= 1 ml/replica)
• parafilma
65
• zouten voor bereiding verdunningsmediuma
• protocol en databladena
• zuurstofmeter
• Incubator of gethermostatiseerde ruimte (~25 °C)
• Stereomicroscoop (vergroting 5-12x)
2.2.4.4 Testinitiatie
Testcondities
• Testorganismen: instar II-III nauplii van T. platyurus (uit rusteieren)
• Verdunningswater: EPA medium
• Incubatie van 24 uur in het donker bij 25°C (omgevingstemperatuur).
• Minimum 5 concentraties per staal en 1 controle, 30 organismen per testconcentratie (3
replica’s), 10 organismen/replica (1ml testoplossing),
• Geen voeding
• Geen aëratie
• Statische test
• Eindpunt: mortaliteit na 24h
Afzondering testorganismen
• De testorganismen worden ontloken uit rusteieren (cysten). De ontluiking gebeurt door
de rusteieren in contact te brengen met EPA-medium 20h voor de aanvang van de test.
De voorbevochtigde cysten (na 10 minuten) worden dan overgebracht in een
petrischaaltje met EPA-medium en gedurende 20-22 uren geïncubeerd bij 25°C onder
continue belichting. Na de incubatie worden de ontloken nauplii (instar II-III)
blootgesteld aan het poriënwater.
Opzetten van de test
• Breng het ongefilterde poriënwater voor het begin van de test op de gewenste
testtemperatuur (23 ± 2°C).
66
• Maak een 1/2 verdunningsreeks van het ongefilterd staal. Per staal worden 5
testconcentraties en één controle (100%; 50%; 25%; 12,5%; 6,25% en 0% = EPA-
medium) bereid waarvan 3 replica’s per concentratie en 1 ml per replica.
• Vul 4 testrecipiënten (3 test + 1 spoelvaatje) met het staal (100%).
• Vul de volgende recipiënten op dezelfde manier met de overige verdunningen.
• Vul 4 vaatjes met controle medium (EPA-medium).
• Breng in elk spoelvaatje met behulp van een pipet 50 nauplii. Contact met de oplossing
moet vermeden worden om contaminatie tegen te gaan.
• Breng, startend met de laagste concentratie (controle), vanuit de spoelrecipiënten
telkens 10 nauplii naar de uiteindelijke testoplossingen over. Deze transfer gebeurt op
een lichttafel met een plastieken pipet.
• Dek na de overbrenging van de organismen in de testoplossingen de testrecipiënten af
met parafilm en een deksel om de verdamping van de testoplossingen tegen te gaan.
De incubatie gebeurt bij 25°C (watertemperatuur: 23 ± 2 °C) in het donker gedurende
24 uur.
2.2.4.6 Aflezen van de test
• Elk testrecipiënt wordt onder een stereomicroscoop bekeken waarbij het aantal dode
(afwezigheid van zwembewegingen) organismen wordt geteld.
2.2.4.7 Geldigheidscriteria
• Een test wordt als geldig beschouwd indien de mortaliteit in de controle < 10 %.
• Concentratie opgeloste zuurstof bij aanvang van de test ≥ 60%. Indien het
zuurstofgehalte bij aanvang van de test lager is dan 60 % wordt het poriënwater
belucht. Het meten van zuurstof op het einde van de test is mogelijk (micro-
zuurstofelectrode, respiratiemeting) maar is minder routinematig toe te passen (lange
evenwichtstijden electrode).
• Randvoorwaarden: in tabel 2.3 wordt een overzicht gegeven van de randvoorwaarden
voor T. platyurus. Een overschrijding van deze randvoorwaarden kan betekenen dat
negatieve effecten kunnen optreden ongeacht de verontreinigingsgraad van het staal.
Tabel 2.3: Overzicht van de randvoorwaarden voor T. platyurus.
67
Testorganisme Criterium Bereik Referentie
pH
Invertebraten T. platyurus
geen acute effecten
5-11
Database LABRAP
Hardheid (mg/l CaCO3)
geen acute effecten
< 1 000
Database LABRAP
NH4+ (mg/l) bij pH 8
geen acute effecten
24 h LC50
< 5
36 (29-43)
Database LABRAP Database LABRAP
Cl- (mg/l)
geen acute effecten
24 h LC50
< 600
2 400 (1 400 -3 400)
Database LABRAP Database LABRAP
2.2.4.8 Berekening 24h LC50
De 24h LC50 wordt berekend met de ‘moving average’ methode of de Probit methode
(Stephan, 1977). Indien deze methode niet kan toegepast worden (bij het ontbreken van
partiële mortaliteit) wordt de binomiaal methode gebruikt. Met behulp van de ‘Moving
average/Probit’ methode worden de 24h LC50 waarden berekend.
3. Bioassay op het bulksediment
3.1 Acute sedimentcontacttest met de amfipode Hyalella azteca
3.1.1 Inleiding
Deze procedure beschrijft de standaard testprocedure voor de evaluatie van de toxiciteit
van het bulksediment voor benthische organismen. De gebruikte testprocedure is conform
de richtlijn ASTM standaard E 1706: “Standard methods for measuring the toxicity of
sediment associated contaminants with freshwater invertebrates” (ASTM, 1998)
3.1.2 Definities
Bulksediment: hiermee wordt het volledige sediment bedoeld inclusief poriënwater
Controle: blootstelling van het organisme aan het referentiesediment (vrij van
contaminanten) en bedoeld voor de evaluatie van de gezondheidstoestand van de
68
testorganismen. Het resultaat van de controle is bepalend voor de geldigheid van de test
gebruikmakend van vooraf gedefinieerde criteria.
Referentie sediment: is bij voorkeur gelijkaardig in fysisch-chemische karakteristieken als
het te onderzoeken staal en met lage achtergrondconcentraties aan contaminanten of
hoeveelheden waarvan bekend is dat zij geen rechtstreekse of onrechtstreekse effecten
kunnen veroorzaken bij H. azteca. Bij voorkeur worden die referentiegebieden gebruikt die
voor de drie assen van de TRIADE klasse 1 geven en die geen toxiciteit vertonen voor de
amfipode H. azteca (mortaliteit < 20%). Andere referentiegebieden kunnen gebruikt worden
mits kan aangetoond worden dat fysisch chemisch klasse 1, biologisch klasse 1 en
ecotoxicologisch klasse 1 wordt weergevonden en dat het sediment qua granulometrische
samenstelling gelijkaardig is aan het te onderzoeken staal.
3.1.3 Principe van de testmethode
Deze sedimentcontacttest maakt gebruik van de amfipode H. azteca om de acute toxiciteit
van een verontreinigd sediment te evalueren ten opzichte van een referentiesediment. Na
een blootstellingstijd van 10 dagen wordt het aantal overlevende organismen geteld.
Significant verhoogde mortaliteit ten opzichte van de controle (= referentiesediment) wordt
nagegaan aan de hand van een statistische significantietoets en uitgedrukt als percent
mortaliteit.
3.1.4 Standaard testprocedure
3.1.4.1 Bereiding sediment-water systeem:
Voor het uitvoeren van de sedimentcontacttesten wordt een twee fasen systeem gebruikt.
Voor de opzet van de test dient het sediment opnieuw gehomogeniseerd te worden . Dit
gebeurt in een mengton met behulp van een mixer met inox mengstaaf. Eventueel
aanwezige in situ-gecollecteerde organismen worden met de hand uitgesorteerd (verwijder
vooral andere amfipoden en bloedzuigers die o.a. kunnen azen op de testorganismen).
Verder wordt grof organisch materiaal (takken, bladeren) zoveel mogelijk verwijderd.
Vervolgens wordt 1 volume (200 ml = ± 2 cm sedimentdiepte) vooraf gehomogeniseerd
sediment samen met 4 volumes (800 ml) EPA water (zie 3.1.4.2) samengevoegd in een
glazen testrecipiënt. Het sediment wordt eerst overgebracht in de recipiënten; het water
wordt vervolgens toegevoegd waarbij erop toegezien wordt dat het sediment minimaal wordt
verstoord. Een handige manier om dit te bewerkstelligen is het gebruik van een
kunststofschijf met handvat die op het sediment kan geplaatst worden tijdens de toevoeging
van het water. Hierna volgt een conditioneringsperiode van 24h waarbij de sediment-water
opstelling de gewenste testtemperatuur bereikt en alle zwevende deeltjes bezonken zijn.
69
3.1.4.2 Aanmaak gematigd hard EPA-medium (Horning and Weber, 1985)
Het overstaande water tijdens de sedimentcontacttest is een artificieel water (EPA medium,
gematigd hard) met de volgende samenstelling:
NaHCO3 96 mg/l
CaSO4.2H2O 60 mg/l
MgSO4 60 mg/l
KCl 4 mg/l
Deze stoffen worden opgelost in gefilterd (0,2 µm) gedesioniseerd water.
De pH van het belucht EPA water bedraagt na evenwichtsinstelling 7,6 ± 0,2. (wat
overeenstemt met een hardheid van het medium tussen 80 en 100 mg/l CaCO3 en een
alkaliniteit van 60-70 mg/l CaCO3)
3.1.4.3 Benodigde materialen
• Glazen testrecipiënten (minimum 1 liter) met glazen deksel
• Glazen collectiepan
• 2 liter aquarium
• katoengaasjes
• Cetyl-alcohol
• Plastieken pasteurpipetten
• 40 ml plastieken transfervaatjes
• Zeven : 355 µm en 500 µm maaswijdte
• Mixer met inox mengstaaf
• Mengton
• Inox lepel
• Lichtbak
• Fotoperiode: 16 licht/8uur donker (~500- 1000 lux)
70
• Cylindervormige kunststofschijf met handvat
• Glazen pasteurpipetten voor aëratie
• Gethermostatiseerde ruimte (25 °C)
3.1.4.4 Testinitiatie
Testcondities
• Testorganismen: 7-14 dagen oude juvenielen
• Incubatie: 10 d bij 25°C (watertemperatuur 23 ± 2°C) en fotoperiode van 16 L/8D
• 20 organismen per replica, 5 replica’s per staal en referentiesediment
• voeding: bij aanvang van de test en na 5 dagen wordt voedsel toegevoegd ad libitum.
Verschillende voedseltypes worden beschreven (ASTM, 1998), waarvan droogvoer
voor konijnen (korrels) de meest eenvoudige is. Schimmelvorming door een teveel aan
voedsel moet vermeden worden.
• Doorvloeisysteem of semistatisch: (50 % verversing/dag)
• Overstaand water: EPA medium
• Continue beluchting: Concentratie opgeloste zuurstof in het overstaande water moet
gedurende de test > 60 %. Indien dit criterium niet wordt gehaald dan wordt zwaarder
belucht.(opmerking: continue beluchting in de meeste gevallen noodzakelijk ten
gevolge van de sediment zuurstofvraag)
• Eindpunt: mortaliteit
Afzondering testorganismen
Benodigde testorganismen kunnen bekomen worden uit eigen stockculturen of aangekocht
worden bij commerciële leveranciers. Voor gedetailleerde informatie over de verschillende
kweekmethoden voor H. azteca wordt verwezen naar de literatuur (ASTM, 1998). Testen
met H. azteca worden geïnitieerd met juveniele organismen (tweede tot derde instar, 7 tot
14 dagen oud). Verschillende werkwijzen zijn mogelijk voor het bekomen van de
testorganismen. Testorganismen, uniform in leeftijd (< 1 week) kunnen afgezonderd worden
uit individuele opgezette broedkamers, waarin enkel volwassen organismen werden
overgebracht. Na 3 dagen worden de volwassen organismen opnieuw overgebracht naar de
stock culturen. De 0-3 dagen oude neonaten worden dan veder opgekweekt gedurende 7
dagen alvorens de test te initiëren. Een andere methode voor de afzondering van de
71
juveniele testorganismen is het gebruik van een zeefsysteem bestaande uit een bovenste
zeef van 500 µm en een onderste zeef van 355 µm. Hiertoe wordt uit de stock cultuur daags
voor aanvang van de test katoengaasjes samen met voedsel aangeboden. De amfipoden
van gemengde leeftijd die zich de volgende dag op het gaasje bevinden worden dan
overgebracht naar het zeefsysteem en voorzichtig afgespoeld van de gaasjes met
cultuurwater. De organismen die achterblijven op de zeef van 500 µm worden opnieuw
overgebracht naar de stockcultuur. De juveniele amfipoden die overblijven op een zeef van
355 µm worden overgebracht in een aquarium van 2 liter gevuld met 1 liter EPA water.
Volgens Winger & Lassier (1994) hebben de amfipoden die passeren doorheen een zeef
van 500 µm en teruggevonden worden op een zeef van 355 µm een gemiddelde lengte van
1,54 mm (SD 0,09) wat overeenstemt met de grootte van organismen van 6 dagen oud
(afkomstig van leeftijdsgestandaardiseerde culturen). Om te vermijden dat de organismen
gestresseerd zouden geraken in afwezigheid van substraat worden katoengaasjes als
kunstmatig substraat toegevoegd. Om de oppervlaktespanning te verminderen wordt
eveneens een stukje cetyl-alcohol toegevoegd. Op deze manier wordt vermeden dat
organismen die de neiging hebben om naar de oppervlakte te zwemmen door de
oppervlaktespanning worden gevangen. Voorzie een minimale aëratie en plaats het
aquarium in de gethermostatiseerde ruimte (25 °C). De testorganismen worden pas na 3
dagen gebruikt (gemiddelde lengte :1,84 mm, SD: 0,11) voor de testen. In deze periode
worden de testorganismen geëlimineerd die tijdens het afzonderen beschadigd werden.
Opzetten van de test
• Controleer de conditie van de testorganismen en plaats het aquarium op de lichtbak.
Met behulp van een stuk zwart plastiek wordt ervoor gezorgd dat een klein deel van het
aquarium wordt afgeschermd van de lichtbron. H. azteca vertoont een negatief
fototaxisch karakter waardoor de meeste organismen zich zullen verzamelen aan de
donkere zijde wat het transfereren van de testorganismen vereenvoudigt.
• Transfereer de testorganismen met behulp van een plastieken pasteurpipet (met
afgeknipte tip) naar de collectiepan (niet op de lichtbak!) gevuld met EPA water + cetyl-
alcohol. De organismen laat men onder water uit de pipet zwemmen.
• De organismen worden at random toegewezen aan 40 ml transfervaatjes tot maximaal
10 organismen per vaatje. Controleer elk transfervaatje op het aantal organismen en de
kwaliteit van de testorganismen.
• Breng de organismen at random over in de testrecipïenten (20 organismen per
recipïent) door voorzichtig het transfervaatje in de bovenstaande vloeistof te brengen
en het om te keren. Controleer de wanden van het transfervaatje bij verwijdering op
organismen die misschien zijn blijven kleven.
72
• Controleer na 30 minuten elk testrecipiënt op drijvende organismen. Vervang deze
organismen door nieuwe organismen.
• Plaats de recipiënten in de gethermostatiseerde ruimte (~25°C) bij een
watertemperatuur van 23 ± 2°C en een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker.
• De test wordt geincubeerd gedurende 10 dagen (dag 0 = tijdstip waarop de organismen
aan de testrecipïenten worden toegevoegd). Dagelijks wordt het watervolume 50 %
ververst hetzij manueel (semi-statisch) hetzij via een doorvloeisysteem.
• Voeding: bij aanvang van de test en na 5 dagen wordt voedsel toegevoegd ad libitum.
Verschillende voedseltypes worden beschreven waarvan konijnenkorrels de meest
eenvoudige zijn. Schimmelvorming door een teveel aan voedsel moet vermeden
worden.
• Meet dagelijks de zuurstofconcentratie. Indien het zuurstofgehalte lager is dan 60%
dan wordt de beluchting iets hoger gezet. Observeer en registreer eveneens eventueel
afwijkend gedrag van de organismen (vb. organismen die vrij rondzwemmen in de
waterkolom om het sediment te ontwijken).
3.1.4.5 Aflezen van de test
• Bij het beëindigen van de test worden de organismen uit het sediment gezeefd.
Organismen die niet worden teruggevonden worden als dood beschouwd aangezien de
organismen snel uit elkaar vallen na sterfte. Teruggevonden volledige organismen die
dood worden aangetroffen na zeven (manipulatie mortaliteit) worden verondersteld
levend geweest te zijn bij het beëindigen van de test (Tomasovic et al, 1995).
3.1.4.6 Geldigheidscriteria
• Een test wordt als geldig beschouwd indien de mortaliteit in de controle
(referentiesediment) bij beëindiging van de test < 20%
• De opgeloste zuurstofconcentratie tijdens de test steeds hoger is dan 60%.
3.1.4.7 Verwerking van de resultaten
Significant (p< 0,05) verhoogde mortaliteit ten opzichte van de controle (=
referentiesediment) wordt nagegaan aan de hand van een statistische significantietoets
(ANOVA = analysis of variance). De mortaliteitsdata (uitgedrukt in %) worden vooraf
boogsinus getransformeerd om te voldoen aan de assumptie van een normaal verdeling (bij
het niet voldoen aan de assumptie van een normaalverdeling wordt overgegaan naar niet –
73
parametrische testen vb. Kruskal-Wallis). Homogeniteit van variantie wordt nagegaan met
behulp van bvb. de Bartlett test. De post hoc vergelijking kan dan gebeuren met de Duncan
multiple range test (of Dunnett). Het significantieniveau wordt op 0,05 geplaatst. (voor meer
details omtrent de gebruikte statistische methodes zie Sokal & Rohlf, 1981). Niet
significante resultaten worden als niet acuut toxisch beschouwd.
74
Referenties
ASTM, 1998. Standard methods for measuring the toxicity of sediment associated
contaminants with freshwater invertebrates. Method E1706-95b. Annual Book of ASTM
Standards, Vol. 11.05. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA.
Burton G.A. Jr., 1991. Assessing the toxicity of freshwater sediments. Environ. Toxicol. Chem.
10, 1587-1627.
Centeno M.D., Persoone G. and Goyvaerts M., 1995. Cyst-based Toxicity Tests: IX. The
potential of Thamnocephalus platyurus as test species in comparison with Streptocephalus
proboscideus (Crustacea, Branchiopoda, Anostraca). Environmental Toxicology and Water
Quality, 10, 25-34.
EPA/USACE., 1994. Evalution of dredged material proposed for discharge in waters of the
U.S. Testing Manual (Draft). EPA-823-b-94-002, Washington D.C.
Horning, W.B. and C.I. Weber, 1985. Short term methods for estimating the chronic toxicity
of effluents and receiving waters to freshwater organisms. EPA/600/4-85/014. U.S.
Environmental Protection Agency, Cincinnati, OH, 417 p.
Hulbert, M.H. and Brindle, M.P., 1975. Effects of sample handling on the composition of
marine sedimentary porewater. Geol. Soc. Am. Bull. 86, 109-110.
ISO, 1987. Water quality - Algal growth inhibition test. Draft International Standard ISO/DIS
8692. Geneva, Switzerland.
Malueg K.W., Schuytema, G.S. and Krawczyk, D.F., 1986. Effects of sample storage on a
copper-spiked freshwater sediment. Environ. Toxicol. Chem., 5, 245-253
OECD, 1984. Alga Growth Inhibition Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, N°
201. Organization for Economic Cooperation and Development, Geneva.
Othoudt R.A., Giesy, J.P., Grzyb, K.R., Verbrugge, D.A., Hoke, R.A., Drake, J.B. and
Anderson, D., 1991. Evaluations of the effects of storage time on the toxicity of sediments.
Chemosphere. 22, 801-807.
Sokal R.R. and F.J. Rohlf, 1981. Biometry. Editor Wilson., 822 p.
Sprague, J.B. & Ramsay, B.A., 1965. Lethal levels of mixed copper-zinc solutions for
juvenile salmon. Journal Fish. Res. Board. Can., 22, 425-432.
75
Stephan, C., 1977. Methods for calculating an LC50. ASTM (American Society for Testing and
Materials). Special Technical Publication 634, 65-84.
Tomasovic M.J., Dwyer F.J., Greer I.E. and Ingersoll C.G., 1995. Recovery of known-age
Hyalella azteca (amphipoda) from sediment toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem., 14, 1177-
1180
US EPA, 1989. Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and
receiving waters to freshwater organisms. Test method: algal (Selenastrum capricornutum)
growth test. Report n°: EPA/600/4-89/001, p. 147-174.
Winger P. and Lasier P. , 1994. Method for estimating the age of Hyalella azteca from
mixed-age laboratory cultures. In sediment toxicity testing : comparison of methods and
evaluation of influencing factors, (eds. Gorsuch, Dwyer, Ingersoll and La Point),
Environmental toxicology and risk assessment : second volume, ASTM STP 1216, p. 640-
662.
76
Bijlage
Toxiciteits-Identificatie-Evaluatie: bijdrage ammoniumtoxiciteit
1. Inleiding
De geobserveerde acute toxiciteit van de verschillende poriënwaters moet steeds geplaatst
worden in het kader van de weergevonden ammoniumconcentraties. Ammonium is een
natuurlijk microbiologisch afbraakproduct waarbij vooral de niet geïoniseerde vorm (NH3) de
meest toxische vorm is voor aquatische organismen. De niet-geïoniseerde vorm domineert
bij pH-waarden hoger dan 9.3 , terwijl de geïoniseerde vorm meer voorkomt bij pH-waarden
lager dan 9.3.
+ →← 4
9,3 =pka 3 NH NH
Binnen het pH-bereik van zoetwater- en mariene sedimenten (6-8.3) kan het percentage
NH3 met een factor 250 wijzigen. De toxische werking van ammoniumconcentraties kan de
uitkomst van toxiciteitstesten dusdanig beïnvloeden dat de toxiciteit, veroorzaakt door
andere componenten, gedeeltelijk of volledig wordt gemaskeerd. Daarom wordt getracht de
bijdrage van het ammonium aan de geobserveerde toxiciteit te kwantificeren aan de hand
van een beperkte toxiciteits-identificatie-evaluatie waarbij het kieuwpootkreeftje T. platyurus
als testorganisme wordt gebruikt.
2. Methodebeschrijving
De methode die gevolgd wordt voor het bepalen van de bijdrage van ammoniak aan de
geobserveerde toxiciteit wordt hieronder beknopt weergegeven. Bij de gevolgde werkwijze
wordt de ammoniumconcentratie van de geteste poriënwaters gemeten en vergeleken met
toxiciteitgegevens, LC50 waarden, afkomstig van toxiciteitstesten met gekende
ammoniumconcentraties. Tabel 5.1 geeft de 24h LC50 waarden (in functie van de pH en
uitgedrukt als totaal ammonium) voor T. platyurus. Aan de hand van deze tabel wordt de
theoretische ammoniumbijdrage aan de waargenomen toxiciteit van het poriënwater
berekend. De theoretische bijdrage is de verhouding van de actuele ammoniumconcentratie
in het poriënwater tot de LC50 waarde (voor zuiver ammonium) voor het beschouwde
organisme bij de eind pH waarbij de test wordt uitgevoerd. Wanneer het vermoeden
aanwezig is dat de gemeten ammoniumconcentraties mogelijk verantwoordelijk kan zijn
77
voor de waargenomen toxiciteit, wordt een beperkte Toxiciteits-identificatie-evaluatie (T.I.E.)
uitgevoerd. Deze evaluatie is gesteund op het principe dat selectief groepen van
contaminanten onbeschikbaar worden gemaakt waarna aan de hand van een toxiciteitstest
wordt nagegaan of de toxiciteit ten opzichte van het onbehandelde staal verdwenen of
toegenomen is. Om ammonium te identificeren als causale factor worden poriënwatertesten
uitgevoerd bij pH 6 en pH 8.5. Wanneer ammonium verantwoordelijk is voor de
waargenomen toxiciteit, moet de toxiciteit bij pH 6 quasi verdwijnen en bij pH 8.5 gevoelig
toenemen. Door de pH afhankelijkheid van de toxiciteit is het essentieel dat deze gedurende
het verloop van de test constant en zo dicht mogelijk bij de ingestelde waarde wordt
gehouden. Hiertoe worden buffers aan het poriënwater toegevoegd (bvb pH 6: MES (2-(N-
Morpholino)ethanesulfonic acid); pH 8.5: MOPS (3-N-Mopholino)propanesulfonic acid).
3. Voorbeeld
Ter illustratie wordt hier de bijdrage van ammonium aan de geobserveerde toxiciteit van een
poriënwater berekend:
• Bij aanvang van de test werd de ammoniumconcentratie gemeten en die bedroeg 64
mg/l
• De pH bij aanvang van de toxiciteitstest bedroeg 7.3
• Bij het aflezen van de toxiciteitstest (na 24h) werd de pH opnieuw gemeten en bedroeg
deze 8.3.
• Uit de mortaliteitsgegevens kon de 24h LC50 berekend worden. Omgezet naar
effecteenheden betekende dit een geobserveerde toxiciteit van 2.9 E.E.
• De theoretische bijdrage van ammonium aan de geobserveerde toxiciteit werd
bekomen door de gemeten ammoniumconcentratie (64 mg/l) te delen door de gekende
24h LC50 waarde van ammonium bij de gemeten eind pH (21.1 mg/l bij pH 8.3) wat dus
een theoretische bijdrage levert van 3.3 E.E.
• Aangezien er een sterk vermoeden was dat de waargenomen toxiciteit te wijten kan zijn
aan de verhoogde ammoniumconcentraties werd een beperkte T.I.E. uitgevoerd.
• Hiertoe werd de pH van de test respectievelijk op pH 6 en pH 8.5 gebracht. Bij pH 6
werd geen toxisch signaal meer waargenomen en bij pH 8.5 werd een verhoogde
toxiciteit (5.9 E.E.) waargenomen. Deze waarnemingen bevestigden het vermoeden dat
de verhoogde ammoniumconcentratie aan de basis lag van de waargenomen toxiciteit.
78
Tabel 5.1: 24h LC50-waarden van ammoniak (uitgedrukt in mg/l totaal ammonium) voor
Thamnocephalus platyurus in functie van de pH bij 25°C
pH 24h LC50b
6.0 163.2 6.1 161.4 6.2 159.5 6.3 157.1 6.4 153.9 6.5 150.4 6.6 146.6 6.7 141.8 6.8 135.8 6.9 129.3 7.0 121.8 7.1 113.7 7.2 104.9 7.3 95.7 7.4 85.9 7.5 76.2 7.6 67.2 7.7 58.2 7.8 50.1 7.9 42.6 8.0 36.0
a
8.1 30.2 8.2 25.3 8.3 21.1 8.4 17.6 8.5 14.8 8.6 12.3 8.7 10.4 8.8 8.8 8.9 7.5 9.0 6.5
a = experimenteel bepaalde waarde (gemiddelde van 6 afzonderlijke testen)
b = geëxtrapoleerde waarde
79
BIOLOGISCHE INDEXEN
1. Behandeling en verwerking monsters
Indien de monsters niet binnen de 24 uur na staalname zullen verwerkt worden, dienen ze
gefixeerd (*) met formaldehyde 40 % (eindconcentratie 4 %). Deze fixatie gebeurt dan best
zo snel mogelijk (ev. ter plaatse op het veld). Bewaring tijdens het transport naar het labo
behoeft geen extra maatregelen.
Het al dan niet gefixeerde monster wordt vervolgens gespoeld over een zeef met
maaswijdte 0.5 mm. Indien men te maken heeft met grote hoeveelheden sediment, wordt
het monster in verschillende keren gespoeld. Het materiaal dat op de zeef achterblijft komt
dan in aanmerking voor de verdere verwerking (zie 2) en kan in afwachting daarvan in grote
plastic potten gebracht worden en bewaard in alcohol (70 % gedenatureerde alcohol-
oplossing). Hierbij dient erop gelet te worden dat de volledige inhoud in de plastic potten in
contact komt met de toegevoegde alcohol, eventueel door zachtjes te schudden.
(*) Opmerking: Het dient benadrukt te worden dat fixatie met formaldehyde de verdere
verwerking van het monster bemoeilijkt :
• formaldehyde is uiterst toxisch;
• uitsorteren van dode organismen vergt meer aandacht;
• door fixatie verbleken de organismen, wat ze minder zichtbaar maakt;
• uitsorteren van niet-gefixeerde monsters werkt aangenamer.
Om deze redenen wordt het ten zeerste aangeraden om :
• indien mogelijk de spoeling van het bodemmonster reeds op het terrein uit te voeren,
onmiddellijk na de staalname (dit vermindert de hoeveelheid te transporteren materiaal
drastisch, maakt de vele liters spoelwater overbodig en vermindert tevens de
hoeveelheid formaldehyde nodig voor eventuele latere fixatie van het staal);
• de organismen, aanwezig in het resterende gespoelde staal, uit te sorteren binnen de 3
dagen na staalname. Het gespoelde staal, aangevuld met water, kan zolang in een
koelcel (toegelaten temperatuur range = +3 tot +8 °C)in bv. de staalname emmers of
plastic potten bewaard worden zonder verlies aan organismen door rotting.
80
2. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse
Het eventueel in alcohol bewaarde materiaal wordt nadien opnieuw gespoeld (verwijderen
van alcohol) en overgebracht in een witte fotobak met vakverdeling. Bengaal Rose (i.e. een
oplossing van 1 g Bengaal Rose in 100 ml 70 % gedenatureerde alcohol) kan toegevoegd
worden om bepaalde organismen beter zichtbaar te maken (vnl. Oligochaetae). Hiervoor
volstaat het om enkele druppels Bengaal Rose in de witte fotobak met het restmateriaal te
mengen en enkele minuten te laten indringen, waarna het mengsel opnieuw gespoeld moet
worden. Met behulp van een verplaatsbare loep met ingebouwd licht en een pincet worden
de organismen dan ruw gesorteerd in grote taxonomische groepen.
De organismen worden vervolgens gedetermineerd met behulp van een
dissectiemicroscoop (vergroting 40 x) en, indien nodig een lichtmicroscoop (vergroting 10 x
40 en 10 x 60). De determinaties gebeuren tot op de respectievelijke niveaus gegeven in
tabel 1.
Volgende determinatiewerken kunnen hierbij gebruikt worden: Tachet et al. (1980), Higler &
Dresscher (1982), Webb & Scholl (1985), Sansoni (1988) en De Pauw & Vannevel (1991).
Voor verder onderzoek naar afwijkingen in de kopkapsels van muggenlarven worden de
larven van de familie Chironomidae (Diptera) apart bewaard.
Tabel 1: Determinatieniveaus voor de verschillende taxonomische groepen.
Taxonomische groep: Determinatieniveau:
Plathelminthes genus
Oligochaetae aanwezigheid
Hirudinea genus
Mollusca genus
Crustacea familie
Plecoptera genus
Ephemeroptera genus
Trichoptera familie
Odonata genus
Megaloptera genus
Hemiptera genus
Coleoptera familie
Diptera familie
Hydracarina aanwezigheid
81
3. Chironomiden-onderzoek
(Heylen & De Pauw, 2000)
Muggenlarven van de familie Chironomidae (Diptera) worden uitgesorteerd.
Enkel de Chironomus-larven van het vierde larvale stadium worden verder geanalyseerd
(zie 3.1 e.v.). Volgende determinatiewerken kunnen gebruikt worden : Paine (1956), Klein
(1967), Mason (1968), Moller Pilot (1978), Wiederholm (1983) en Webb & Scholl (1985).
3.1 Identificatie van de Chironomus-larven
De familie van de Chironomidae wordt onderverdeeld in 7 subfamilies (Wiederholm,1983) :
1. subfamilie Tanypodinae
2. subfamilie Chironominae
3. subfamilie Orthocladiinae
4. subfamilie Diamesinae
5. subfamilie Podonominae
6. subfamilie Prodiamesinae
7. subfamilie Telmatogetoninae
De subfamilie Chironominae bestaat uit ongeveer 15 genera die opgesplitst zijn in twee
stammen, de Tanytarsini en de Chironomini. Binnen de stam van de Chironomini bevindt
zich het genus Chironomus.
Enkele belangrijke kenmerken (*) van de larven van Europese soorten van het genus
Chironomus zijn (cf. Paine, 1956; Mason, 1968; Wiederholm, 1983; Webb & Scholl, 1985;
De Pauw & Vannevel, 1991) :
1. kopkapsel goed ontwikkeld;
2. gepaarde schijnpootjes op het eerste borststuksegment en op het achterste
achterlijfsegment;
3. twee paar ventrale ademhalingsbuisjes op het elfde (= laatste) lichaamssegment (**);
4. het mentum bestaat uit 6 paar laterale tanden en een trifide middentand.
82
(* om praktische redenen zal deze reeks van kenmerken gebruikt worden voor de
identificatie van Chironomus-larven, wetende dat deze lijst onvolledig is, zie bv. **)
(** bij twee soorten, C. nudiventris en C. salinarius ontbreekt dit kenmerk. Deze twee
soorten worden echter om praktische redenen niet opgenomen in het onderzoek).
3.2 Identificatie van het 4de larvale stadium
Alleen de Chironomus-larven in het vierde of laatste larvaal stadium (= 4de instar) worden
op misvormingen gecontroleerd. Hiervoor wordt naar de ontwikkeling van de imaginale
schijven op de drie borstsegmenten gekeken (figuur 1). Deze structuren zijn groepen van
cellen die de aanleg vormen van adulte structuren zoals antennen, poten en vleugels en die
enkel voorkomen in het vierde larvaal stadium. Wanneer deze schijven moeilijk te zien zijn
met een dissectiemicroscoop, kunnen ze eerst opgehelderd worden door de larven 15
minuten onder te dompelen in een oplossing van 50 % glycerine en 50 % melkzuur.
Voor een verdere beschrijving van de methode om de organismen in het vierde larvaal
stadium te onderscheiden van de andere stadia, wordt verwezen naar Goddeeris (1990).
figuur 1. Imaginale schijven in enkele substadia in het 4de larvaal stadium van een
Chironomus-larve; h = halter, l1 = voorpoot, l2 = middenpoot, l3 = achterpoot, w = vleugel.
83
3.3 Prepareren van de kopkapsels
Om eventuele afwijkingen in de kopkapsels duidelijk te kunnen zien, moeten de kopkapsels
eerst in preparaat gebracht worden.
Hiervoor worden de kopkapsels van de organismen gescheiden van de rest van het
lichaam. Tien kopkapsels worden telkens in een glazen petrischaal gebracht, gevuld met
KOH (10 %). Deze petrischalen worden daarna afgesloten en 30 minuten in een broedstoof
geplaatst (40°C). Dit is nodig om het achtergebleven week materiaal op te lossen en om de
kopkapsels op te klaren. Soms is het noodzakelijk om de tijdsduur in de broedstoof te
verlengen; dit is voornamelijk afhankelijk van de grootte van de individuen en van het
genus.
Na het opklaren worden de kopkapsels opgezogen met een pipet om de kopstructuren zo
weinig mogelijk te beschadigen. Vervolgens worden ze overgebracht in kleine plastic
buisjes van 1.5 cm hoogte en 1.2 cm diameter. Eén uiteinde van deze buisjes moet
afgesloten worden door middel van een synthetisch netje met maaswijdte 400 x 400 µm
(figuur 2).
Een ‘multi-well’-plaat gevuld met respectievelijk 70 %, 80 %, 96 % en 100 % alcohol
(gedenatureerd), kan gebruikt worden om de kopkapsels te dehydrateren (figuur 2). De
plastic buisjes met elk tien kopkapsels worden achtereenvolgens 15 minuten in de
respectievelijke concentraties alcohol gebracht.
84
figuur 2. ‘Multi-Well’-plaat en een plastic buisje voor de dehydratatie van de kopkapsels van
Chironomiden
Na ontwatering moeten de kopkapsels in preparaat worden gebracht. Hiervoor worden ze
telkens per 10 (2 x 5) op een draagglaasje in een druppel Canada Balsam of Euparal
gelegd. Canada Balsam droogt snel en wordt gebruikt om permanente preparaten te
maken. Euparal droog trager en kan achteraf terug in oplossing worden gebracht. Euparal
heeft tevens de bijkomende eigenschap om het resterende weefsel te doen verdwijnen en
heeft ook een licht verhelderend effect.
De kopkapsels worden met de ventrale kant omhoog gelegd en de mandibels (kaken)
worden, indien mogelijk, naar achteren geklapt. Door zachtjes op het draagglaasje te duwen
85
kunnen de kopkapsels in de juiste positie gebracht worden. Op deze manier kan een goed
zicht op het mentum van de organismen verkregen worden.
3.4 Evaluatie van de morfologische misvormingen
Voor de evaluatie van de geprepareerde kopkapsels geldt als uitgangsbasis de benadering
van Warwick (1988). Enkel de menta (enk.: mentum; figuur 3) van de larven dienen
bekeken te worden. Om enige subjectiviteit in de beoordeling te vermijden, moet het echter
ondubbelzinnig duidelijk zijn wat verstaan wordt onder een misvorming van het mentum.
Daarom zijn volgende stappen noodzakelijk:
• vergelijking van het aantal en de vorm van de aanwezige tanden van het mentum met
het ‘normale’ aantal en de ‘normale’ vorm van de tanden (figuur 3 en 4);
• identificatie van eventuele verschillen als ‘misvorming’ of ‘sleet’. Alleen duidelijke
misvormingen worden als dusdanig genoteerd en kunnen als volgt worden
omschreven:
1. “gespleten middentand” (figuur 4.1): bij deze afwijking is de top van de grootste,
middelste tand van het mentum ontdubbeld, waardoor het lijkt dat deze tand twee
toppen omvat.
2. “Köhn-holte” (figuur 4.2): deze misvorming vertoont zich als een perforatie van het
mentum en komt meestal voor in de omgeving van de middentand. De perforatie
wordt gekenmerkt door een perfect gave rand en kan daardoor niet verwisseld
worden met een mechanische afwijking.
3. “ontbrekende tand” (figuur 4.4): een normaal mentum omvat 15 tanden,
symmetrisch geordend rond de centrale middentand (figuur 3.b). Men kan aldus
links en rechts van de middentand 7 tanden onderscheiden: aan de buitenkant van
het mentum zijn steeds 4 gelijkaardige tanden aanwezig, waarnaast zich twee
geleidelijk in grootte toenemende tanden bevinden en tot slot een kleinere tand die
de middentand flankeert. Het ontbreken (in aantal) van één van die tanden uit de
symmetrische configuratie wordt aangeduid als een “ontbrekende tand”.
4. “extra tand”: in dezelfde trend als omschreven in het vorige punt kan het gebeuren
dat meer dan 15 tanden worden opgemerkt. Opnieuw moet de normale,
symmetrische configuratie vergeleken worden met het preparaat. Opmerking: de
combinatie van een extra tand en een ontbrekende tand levert het “normaal” aantal
tanden (15), maar moet aanzien worden als een misvormd mentum!
86
5. in extreme gevallen kan de normale configuratie van een mentum niet meer
herkenbaar zijn (figuur 4.3). Ook deze gevallen moeten als misvorming
geregistreerd worden.
• bepalen van de frequentie van voorkomen van misvormde menta.
Het verschil tussen gebroken of ‘afgesleten’ tanden en ‘misvormde’ tanden kan gemaakt
worden daar het mentum van chironomiden-larven bestaat uit een aantal platen die niet
synchroon breken of verslijten (figuur 5). Dit verschil kan reeds bij een kleine vergroting
vastgesteld worden (vergroting 10 * 20). In het geval van echte misvormingen is de rand
van de tanden glad en kan geen onderscheid gemaakt worden tussen de afzonderlijke
platen van het mentum (Warwick, 1990). Gebroken of afgesleten tanden worden niet als
een misvorming beschouwd. In geval van twijfel wordt aangeraden het mentum niet verder
bij de beoordeling te betrekken.
Voor een verdere beoordeling aan de hand van misvormingen wordt verwezen naar
Janssens de Bisthoven et al., 1995 en Vermeulen, 1998.
figuur 3. Normaal mentum van een Chironomus-larve
87
figuur 4. Enkele voorbeelden van mentummisvormingen : (1) gespleten middentand; (2)
Köhn-holte; (3) versmolten tanden; (4). ontbrekende tand.
88
figuur 5. Illustratie van het verschil tussen een misvorming (A en B) en een afwijking als
gevolg van mechanische schade (C en D).
89
4. Gegevensverwerking
Met de verzamelde gegevens worden onderstaande kwaliteitsindexen berekend.
4.1 Biotische waterbodem index (BWI)
(De Pauw & Heylen, 2000)
Voor de bepaling van de BWI dienen al de organismen gedetermineerd te worden tot op de
respectievelijke niveaus, zoals aangegeven in tabel 1 (zie 2). De berekening van de BWI
gebeurt op dezelfde wijze als van de Belgische Biotische Index (BBI, De Pauw &
Vanhooren, 1983), maar uitgaande van onderstaande tabel 2. In tegenstelling tot de BBI,
houdt de BWI wél rekening met taxa waarvan slechts 1 individu werd gevonden. Vooreerst
wordt nagegaan hoeveel verschillende taxa door één of meerdere individuen
vertegenwoordigd zijn in het volledige staal. Alle macroinvertebrate taxa, die worden
aangetroffen in het bodemstaal, worden hierbij in rekening gebracht. Dit getal past in één
van de vier kolommen in de rechter helft van tabel 2. Vervolgens dient nagegaan te worden
welke indicator-groepen aanwezig zijn in het staal (zie kolom 2, tabel 2). De indicator-groep
met de laagste tolerantieklasse (wat overeenkomt met de hoogste gevoeligheid) bepaalt de
rij waaruit de BWI moet worden afgelezen. Binnen deze laagste tolerantieklasse dient
echter eveneens naar de frequentie van de desbetreffende score gekeken te worden (i.e.
het aantal maal dat een bepaalde waarde voorkomt).
Door het aflezen in de passende kolom (= het aantal verschillende taxa in het staal) en in de
passende rij (=frequentie van de laagste tolerantieklasse) bekomt men de gewenste BWI.
90
Tabel 2. Tabel voor de berekening van de BWI
Tol. kl. Indicator-groepen Klasse-
frequentie
Aantal taxa
0-1 2-5 6-10 >11
1. Trichoptera ≥ 2 - 8 9 10
1 4 7 8 9
2. Bivalvia, Sialis ≥ 2 - 7 8 9
Gammaridae 1 3 6 7 8
3. Gastropoda (excl. Physa) ≥ 2 - 4 5 6
Asellidae, Hirudinae 1 2 3 4 5
4. Chironomidae groep non thummi-plumosus
1 1 2 3 -
5. Oligochaeta en Chironomidae groep thummi-plumosus
1 1 1 2 -
Geen van bovenvermelde groepen aanwezig
0 1 - -
4.2 % Misvormingen Chironomus-larven
(Van Urk & Kerkum, 1991; Madden et al., 1992; Janssens de Bisthoven et al., 1995;
Vermeulen, 1995 & 1998; Heylen & De Pauw, 1998)
Het percentage Chironomus-larven (Diptera : Chironomidae) met een misvormd kopkapsel
t.o.v. het totaal aantal larven geeft een indicatie over het voorkomen van toxische
contaminanten in de waterbodem. Het al dan niet voorkomen van Chironomus-larven is in
principe afhankelijk van de fysische samenstelling van de bodem. Toxische contaminanten
kunnen dit echter beïnvloeden. Tevens zijn deze stoffen verantwoordelijk voor het
91
voorkomen van misvormingen bij deze larven. Het is echter een zeer complex proces
waardoor scherpe grenzen waarboven of waaronder wel of geen sprake is van een ‘gering’
of ‘ernstig’ toxisch effect niet zijn aan te geven. Om toch richtlijnen voor biologische
monitoring te kunnen geven zijn arbitraire grenzen vastgesteld. Deze grenzen moeten
derhalve beschouwd worden als signaalwaarden.
• Criterium 1 : meer dan 8 % van het totaal
• Criterium 2 : meer dan 16 % van het totaal
• Criterium 3 : meer dan 32 % van het totaal
Deze grenzen gelden echter alleen voor waterbodems waar 100 of meer Chironomus-larven
verzameld werden. Aangeraden wordt om 140 larven op het voorkomen van afwijkingen te
onderzoeken. Wanneer in een staal minder dan 100 larven aanwezig zijn en dus minder
dan 100 kopkapsels kunnen gecontroleerd worden op een afwijking in het mentum, moet
worden overgegaan tot het berekenen van een chi²-waarde die naargelang de waarde kan
geplaatst worden in één bepaalde kwaliteitsklasse. Wanneer minder dan 10 larven voor
onderzoek in aanmerking komen, wordt het afgeraden om het onderzoek uit te voeren. De
klasse-indeling van de chi²-waarden gebeurt eveneens op basis van drie criteriumgrenzen.
De berekening van deze drie criteriumgrenzen is gebaseerd op de arbitraire
criteriumgrenzen, gebruikt voor de classificatie van de percentiele afwijkingen in stalen
waarbij minstens 100 larven werden onderzocht, nl.
percentage afwijkingen chi²-waarde
Klasse 1 <= 8 % <= 6.38
Klasse2 <= 16 % <= 10.66
klasse3 <= 32 % <= 15.05
klasse4 > 32 % > 15.05
De oorsprong van deze chi²-criteriumgrenzen is de volgende.
Voor de berekening van de eerste criteriumgrens wordt een chi²-test uitgevoerd, waarbij een
staal met 100 larven en 0 % afwijking (staal 2) vergeleken wordt met een staal met 100
larven en 9 % afwijking (staal 1), en wel op volgende manier :
92
#misvormde larven #normale larven totaal #
staal 1 8 = a 92 = b 100 = a+b
staal 2 0 = c 100 = d 100 = c+d
totaal # 8 = a+c 192 = b+d 200 = n
Via deze formule wordt een chi² bekomen van 6.38. Deze waarde is de criteriumgrens
tussen klasse 1 en 2.
Via diezelfde formule en tabel kan de chi²-waarde berekend worden tussen twee stalen van
100 larven met respectievelijk 8 en 19 % afwijkingen. Men bekomt dan een chi²-waarde
4.28. De som van de eerste criteriumgrens en 4.28 geeft de tweede criteriumgrens, nl 6.38
+ 4.28 = 10.66.
De berekening van deze criteriumgrens gebeurt aldus door de vergelijking van een staal
met 8 % afwijking t.o.v. een staal met 19 % afwijking. Men zou echter verwachten dat,
analoog aan de grenswaarden gebruikt bij de percentiele afwijkingen, deze vergelijking zou
gebeuren met een staal met 16 % afwijking. De verklaring hiervoor ligt in het feit, dat bij
voldoende larven (van 100 tot 140) het verschil tussen 8 en 16 % misvorming gevoelsmatig
al een dermate groot verschil is, dat deze waarden zonder meer geaccepteerd worden als
grenzen tussen de verschillende klassen. Het verschil tussen beide percentages is echter
net niet significant op het 5 % niveau (chi² = 2.32, p > 0.05). Het verschil tussen 8 en 19
percent is daarentegen wel significant (chi² = 4.28, p < 0.05). Bij kleine aantallen larven kan
één misvormde larve meer of minder een groot verschil in percentage veroorzaken.
Hierdoor is het noodzakelijk de grenzen strikter vast te stellen, waarbij een significant
verschil tussen beide criteriumgrenzen een voorwaarde is.
Het is op een analoge wijze dat Van Urk & Kerkum (1991) voorstelt om tot een beoordeling
te komen van de afwijkingen in de menta van muggenlarven. Met het oog op sanering is het
echter van belang om een beter onderscheidend vermogen te krijgen in de zeer vervuilde
klasse (> 16 %). Daarom werd voorgesteld om een derde criterium (arbitrair) in te voeren,
nl. ‘meer dan 32 %’. Analoog aan dit extra criterium voor stalen met 100 tot 140
onderzochte larven, moest dus ook een extra criterium berekend worden voor de stalen
waar minder dan 100 larven werden onderzocht op hun afwijkingen.
))()()((
)2/)((²
2
dbcadcba
nbcadnChi
++++
−−=
93
Opnieuw wordt aldus een chi²-waarde berekend, nu tussen twee stalen met 100 larven en
respectievelijk 19 en 33 % afwijking. Dit levert een chi² = 4.39 (p < 0.05) op, die opgeteld bij
de tweede criteriumgrens de derde criteriumgrens oplevert, nl. 15.05. De aangepaste
percentages 19 en 33 zijn opnieuw gebruikt om het verschil tussen de criteriumgrenzen
significant te maken.
Aldus worden drie criteriumgrenzen gebruikt, wat een klassering van iedere berekende chi²-
waarde toelaat in één van de vier kwaliteitsklassen.
Wat betreft de berekening van de chi²-waarden voor de onderzochte stalen, wordt op
dezelfde manier te werk gegaan als bij de berekening van de criteriumgrenzen. In de bijlage
van dit hoofdstuk zijn twee duidelijke voorbeelden uitgewerkt (bijlage 1).
Samenvattend levert dit volgend beoordelingsschema op :
Kwaliteitsklasse Percentiele criteriumgrenzen
# larven = 100 tot 140
criteriumgrenzen voor chi²-test
# larven = 10 tot 100
Klasse 1 ≤ 8 % ≤ 6.38
Klasse 2 ≤ 16 % ≤ 10.66
Klasse 3 ≤ 32 % ≤ 15.05
Klasse 4 > 32 % > 15.05
94
Referenties
De Pauw, N. & Vanhooren, G. (1983). Method for biological quality assessment of
watercourses in Belgium. Hydrobiologia 100, 153-168.
De Pauw, N. & Vannevel, R. (1991). Macro-invertebraten en waterkwaliteit. Stichting
Leefmilieu, dossier nr. 11, Antwerpen, 316p.
De Pauw, N. & Heylen, S. (2000) Biotic index for sediment quality assessment of
watercourses in Flanders, Belgium. Aquatic Ecology (submitted).
Dudok van Heel, H. C., Smit, H. & Wiersma, S. M. (1992). Macrofauna in de diepe
waterbodem van het noordelijk deltabekken. Publikaties en rapporten van het project
‘Ecologisch Herstel Rijn en Maas’. RIZA, notanr. 91.051, 113p. + bijlagen.
Goddeeris, B. R. (1990). Life cycle characteristics in Tanytarsus sylvaticus (van der Wulp,
1959) (Chironomidae, Diptera). Annls limnol., 26, 51-64.
Heylen, S. & De Pauw, N. (1998). Ontwikkeling van een biologische beoordelingsmethode
voor waterbodems van onbevaarbare en bevaarbare waterlopen in Vlaanderen.
Eindrapport. Studie in opdracht van het Ministerie van de Vlaamse Gemeenschap,
Departement Leefmilieu en Infrastructuur, AMINAL, Brussel, 52 p.
Heylen, S. & De Pauw, N. (2000). Mentum deformations in Chironomus larvae for
assessment of freshwater sediments in Flanders. Verh. Internat. Verein. Limnol.
(submitted).
Higler, L. W. G., & Dresscher, G. N. (1982). De nederlandse bloedzuigers. Hirudinea.
Koninklijke Nederlandse Natuurhistorische Vereniging, 63p.
Janssens de Bisthoven, L., Ollevier, F., Beyst, B. & De Pauw, N (1998). Morfologische
misvormingen in Chironomidae-larven (Chironomus spp.) als bioindicatoren voor
microverontreiniging van waterbodems. In: De Pauw, N. & Vannevel, R. (in voorbereiding).
Macro-invertebraten en waterkwaliteit. Stichting Leefmilieu, dossier nr. 11, Antwerpen,
316p.
Klein, W. L., Jr. (1967). Picture-key to the genera of aquatic midges. Laboratory
investigations N° 5, Cincinnati, Ohio, 25p.
Madden, C. P., Suter, P. J., Nicholson, B. C. & Austin, A. D. (1992). Deformities in
chironomid larvae as indicators of pollution (pesticides) stress. Netherlands Journal of
Aquatic Ecology, 26, 551-557.
95
Mason, W. T., Jr. (1968). An introduction to the identification of chironomid larvae. Division
of Pollution Surveillance, Federal water pollution control Administration, Ohio, 89p.
Moller Pilot, H. K. M. (1978). De larven der Nederlandse Chironomidae (Diptera).
Nederlandse Faunistische Mededelingen, 1, 105p.
Paine, G. H., Jr. (1956). Illustrated flow chart to certain groups of chironomid larvae. Robert
A. Taft Sanitary Engineering Center, Cincinnati, Ohio, 1-9.
Sansoni, G. (1988). Macroinvertebrati dei corsi d’aqua italiani. Centro italiano studi di
biologia ambientale, Trento, 190p.
Tachet, H., Bournaud, M. & Richoux, P. (1980). Introduction à l’étude des macroinvertébrés
des eaux douces. Systematique élémentaire et aperçu écologique. Université Lyon I,
Association francaise de limnologie, 155p.
Van Urk, G. & Kerkum, F. C. M. (1991). Biologische beoordeling van sedimentkwaliteit met
Chironomus (Diptera, Chironomidae). RIZA, Notanr. 91.017, 40p.
Vermeulen, A.C. (1995). Elaborating chironomid deformities as bioindicators of toxic
sediment stress: the potential application of mixture toxicity concepts. Ann. Zool. Fennici,
32, 265-285. Helsinki, November 1995.
Vermeulen, A.C. (1998). Head capsule deformation in Chironomus riparius larvae (Diptera):
causality, ontogenesis and its application in biomonitoring. PhD thesis, Catholic University of
Leuven, faculty of Science, Department of Biology, Laboratory of Aquatic Ecology: 207 p.
Warwick, W. F. (1988). Morphological deformities in Chironomidae (Diptera) larvae as
biological indicators of toxic stress. Offprints from: Toxic contaminants and ecosystem
health; a Great Lake Focus. National Water Research Institute, 501 University Crescent,
Winnipeg, Manitoba, Canada, 283-319.
Warwick, W. F. (1990). Morphological deformities in Chironomidae (Diptera) larvae from the
Lac St. Louis and Laprairie Basins of the St. Lawrence River. J. Great Lakes Res., 16 (2),
185-208.
Webb, J. B. & Scholl, A. (1985). Identification of larvae of European species of Chironomus
Meigen (Diptera: Chironomidae) by morphological characters. Systematic Entomology, 10,
353-372.
Wiederholm, T. (1983). Chironomidae of the holarctic region. Keys and diagnoses. Part 1.
Larvae. Entomol. Scand. Suppl., 19, 457p.
96
Bijlage
voorbeelden voor de berekening van de chi²-waarde van een staal.
Als eerste voorbeeld, stel dat in het onderzochte staal 11 kopkapsels met een afwijking en
42 normale kopkapsels aanwezig zijn. In totaal werden dus 42 + 11 = 53 kopkapsels
onderzocht op afwijkingen. Er moet dus een chi² berekend worden, gezien het aantal
onderzochte kopkapsels kleiner is dan 100 (53 < 100). In de eerste plaats wordt het
onderzochte staal vergeleken met een fictief staal met 100 larven en 0 % afwijking :
#misvormde larven #normale larven totaal #
Onderzocht staal 11 = a 42 = b 53 = a+b
fictief staal 0 = c 100 = d 100 = c+d
totaal # 11 = a+c 142 = b+d 153 = n
Toepassing van de hoger vermelde formule levert dan de chi²-waarde die in dit geval 19.36
is. Deze waarde is duidelijk groter dan criteriumgrens 6.38, waaruit kan besloten worden dat
het onderzochte staal niet in klasse 1 ligt, maar in een hogere klasse (2, 3 of 4).
De berekeningen moeten daarom verder gezet worden, wat betekent dat een berekening
van chi² tussen het onderzochte staal en een fictief staal met 100 larven en 8 % afwijking
moet gebeuren:
#misvormde larven #normale larven totaal #
Onderzocht staal 11 = a 42 = b 53 = a+b
fictief staal 8 = c 92 = d 100 = c+d
totaal # 19 = a+c 134 = b+d 153 = n
De formule levert een chi² = 4.08. Deze waarde moet nu opgeteld worden bij criteriumgrens
1 om ze te kunnen vergelijken met criteriumgrens 2. Dit geeft een waarde van 10.46 (6.38 +
4.08). Bij vergelijking van deze som (de chi² voor het onderzochte staal) met criteriumgrens
2 (= 10.66) blijkt dat de berekende chi² kleiner is dan de tweede criteriumgrens (10.46 <
10.66). Dit doet ons besluiten dat het onderzochte staal tot kwaliteitsklasse 2 behoort.
97
In het geval een chi² berekend zou worden die groter is dan 10.66, zou opnieuw een chi²
moeten berekend worden tussen het onderzochte staal en een fictief staal met 100 larven
en 19 % afwijking. Door bij de met de formule berekende chi², criteriumgrens 2 (=10.66) op
te tellen wordt een waarde verkregen die vergeleken kan worden met criteriumgrens 3. Is de
waarde groter dan deze grens, dan hoort het staal thuis in kwaliteitsklasse 4. In elk ander
geval behoort het staal tot kwaliteitsklasse 3.
In het tweede voorbeeld zal dit duidelijk worden. Stel er wordt een waterbodemstaal
onderzocht, waarbij 40 misvormde menta worden aangetroffen op een totaal van 99
kopkapsels (= 40 misvormde + 59 normale menta). Het minimum aantal onderzochte
kopkapsels, vereist om simpelweg de percentiele afwijking te mogen berekenen, nl. 100,
wordt niet gehaald. Er zal derhalve een chi²-berekening moeten worden uitgevoerd om tot
een juiste beoordeling van dit staal te komen.
In een eerste stap wordt aldus het onderzochte staal vergeleken met een fictief staal met
100 larven en 0 % afwijking d.m.v. deze statistische test :
#misvormde larven #normale larven totaal #
onderzocht staal 40 = a 59 = b 99 = a+b
fictief staal 0 = c 100 = d 100 = c+d
totaal # 40 = a+c 159 = b+d 199 = n
Volgens bovenstaande tabel en formule wordt een chi²-waarde van 48.08 verkregen. Deze
waarde is duidelijk groter dan de eerste criteriumgrens, zijnde 6.38, waaruit kan besloten
worden dat het staal niet tot de kwaliteitsklasse 1 behoort, maar wel tot een hogere klasse
(48.08 > 6.38). Daarom wordt in een tweede stap het onderzochte staal vergeleken met een
fictief staal met 100 larven en 8 % afwijking :
#misvormde larven #normale larven totaal #
))()()((
)2/)((²
2
dbcadcba
nbcadnChi
++++
−−=
98
onderzocht staal 40 = a 59 = b 99 = a+b
fictief staal 8 = c 92 = d 100 = c+d
totaal # 48 = a+c 151 = b+d 199 = n
Met dezelfde chi²-formule als eerder wordt een chi²-waarde van 26.80 berekend. Vooraleer
echter deze waarde kan vergeleken worden met de tweede criteriumgrens, moet de eerste
criteriumgrens erbij worden opgeteld :
26.80 + 6.38 = 33.18
Deze waarde, 33.18, is opnieuw duidelijk groter dan de tweede criteriumgrens (33.18 >
10.66). Dit wil zeggen dat het staal niet tot klasse 2 behoort, maar tot een hogere klasse.
Om te weten of het staal tot klasse 3 of klasse 4 behoort moet de laatste stap uitgevoerd
worden. Hierbij wordt het onderzochte staal vergeleken met een fictief staal met 100 larven
en 19 % afwijking :
#misvormde larven #normale larven totaal #
onderzocht staal 40 = a 59 = b 99 = a+b
fictief staal 19 = c 81 = d 100 = c+d
totaal # 59 = a+c 140 = b+d 199 = n
Gebruik makende van de chi²-formule wordt een chi²-waarde van 9.92 berekend. Deze
waarde dient nu opgeteld te worden bij de tweede criteriumgrens : 9.92 + 10.66 = 20.58.
Het is deze som die vergeleken wordt met de derde criteriumgrens, zijnde 15.05. Nu blijkt
dat de berekende som groter is dan de derde criteriumgrens (20.58 > 15.05). Dit wil zeggen
dat het onderzochte staal niet tot klasse 3 behoort en aldus een kwaliteitsklasse 4 zal
toegewezen krijgen
99
KWALITEITSBEOORDELING
In de triade worden de drie onderdelen (fysico-chemie, biologie, ecotoxicologie) van de
beoordeling gebruikt, en wordt aan elk van de drie beoordelingen een gelijk gewicht
toegekend. Het principe van de classificatie van de waterbodems berust op een evaluatie
van de afwijking t.o.v. een referentietoestand, zowel fysisch-chemisch, ecotoxicologisch
als biologisch. Dit betekent dat in de drie gevallen een referentietoestand moet gedefinieerd
worden. Dit schept de mogelijkheid om zonder bestaande normering waterbodems in te
delen en ze op kaart weer te geven.
1. Fysisch-chemische classificatie
1.1 Fysisch-chemische variabelen
De chemische parameters die in aanmerking komen voor de berekening van de fysisch-
chemische toestand van de waterbodem zijn:
• klei (%) en organische stof (%)
• apolaire koolwaterstoffen (APKWS)
• extraheerbare organohalogenen (EOX)
• som van de pesticiden (SOCP)
• som van 7 PCB’s (PCB7)
• som van 6 PAK’s van Borneff (PAK6)
• zware metalen Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, Hg, Zn en As
100
1.2 Correctie voor bodemtype
De gemeten concentraties in de referentiewaterbodems en de waterbodems uit het
onderzochte gebied worden omgerekend naar standaardcondities voor waterbodems (5%
organische stof en 11% klei)1.
Voor zware metalen geldt:
N(11,5)=N(x,y).(A+B.x+C.y)/(A+B.11+C.5)
waarbij:
N: de concentratie in de waterbodem bij een kleigehalte van x% of 11% en een
organische stof van y% of 5%
A, B, C: constanten afhankelijk van het metaal (tabel)
x: het kleigehalte in het staal (%)
y: het gehalte organische stof in het staal (%)
Tabel 1: De constanten voor de omrekening van zware metalen naar concentraties voor een
standaard waterbodem
Element A B C
Arseen (As) 10.81 0.10 0.09
Cadmium (Cd) 0.74 0.00 0.005
Chroom (Cr) 24.32 0.72 0.04
Koper (Cu) 27.23 0.22 0.31
Kwik (Hg) 0.20 0.002 0.002
Lood (Pb) 34.72 0.26 0.26
Nikkel (Ni) 14.63 0.28 0.12
Zink (Zn) 196.00 0.50 1.79
1 Dit gebeurt analoog aan de voorwaarden voor omrekening van achtergrondwaarden en bodemsaneringsnormen
uit VLAREBO.
101
De omrekening gebeurt binnen de grenzen van 1% en 50% klei en van 1% en 20%
organische stof. Buiten deze grenzen worden de concentraties omgerekend met de
grensgehalten.
Voor organische verbindingen geldt:
N(5) = 5.N(y) / y
waarbij:
N: de concentratie in het staal bij een organische stofgehalte van 5% of y%
y: het procent organische stof in het staal (%)
De omrekening gebeurt binnen de grenzen van 1% en 20% organische stof. Buiten deze
grenzen worden de concentraties omgerekend met de grensgehalten
1.3 Fysisch-chemische referentietoestand
In de Triade worden de concentraties, die omgerekend zijn naar een standaardbodem
relatief uitgezet t.o.v. een referentie. De referentietoestand wordt aangegeven als het
geometrisch gemiddelde van de concentraties in 12 referentiewaterbodems. Op die manier
wordt voor elke parameter onder beschouwing een referentiegehalte (µ) bekomen.
Tabel 2: Referentiewaarden voor de verschillende variabelen als het geometrisch gemiddelde van 12
referentiewaterlopen en de verschillende niveau’s ter indeling van de klassen
Microverontreiniging Referentiewaarde
Arseen 11 mg/kg DS Cadmium 0.38 mg/kg DS Chroom 17 mg/kg DS Koper 8 mg/kg DS Kwik 0.05 mg/kg DS Lood 14 mg/kg DS Nikkel 11 mg/kg DS Zink 67 mg/kg DS APKWS 37 mg/kg DS EOX 31 mg/kg DS Som OCP 3.9 µg/kg DS Som 7 PCB’s 5.1 µg/kg DS 6 PAK’s van Borneff 0.220 mg/kg DS
1.4 Berekening van de verhouding t.o.v. de referentie (VTR)
Eens de referentiegehalten voor elke chemische parameter gekend zijn, en zij samen met
de gemeten concentraties naar een standaardbodem zijn omgerekend, kan de verhouding
(of de VTR) van de twee concentraties voor elke chemische parameter i berekend worden.
102
VTRi = Ns,i(11,5)/Nr,i(11,5); 1<VTRi<100 (dimensieloos)
waarbij:
Ns(11,5): de naar een standaardbodem van 11% klei en 5% organische stof
omgerekende concentratie van de betreffende chemische parameter i in het
staal
Nr(11,5): de naar een standaardbodem van 11% klei en 5% organische stof
omgerekende concentratie van de betreffende chemische parameter i in het
referentiestaal
De grenzen van de VTR’s worden op 1 en 100 ingesteld. Waarden kleiner dan 1 worden
aan 1 gelijkgesteld, waarden groter dan 100 worden gelijk aan 100 gesteld.
Van elke VTR’s per chemische variabele i worden vervolgens de logaritme genomen om
een normale verdeling van de VTR’s te bekomen. De grenzen worden aldus respectievelijk
0 en 2.
LogIndexi = log(VTRi) 0<LOGINDEXi<2 (dimensieloos)
1.5 Indeling in klassen
Om het staal per chemische parameter te klasseren, wordt de volgende (arbitraire) klasse-
indeling gebruikt:
LogIndex Klasse Betekenis (afwijking t.o.v. referentie)
0 - < 0,4 1 niet afwijkend
0,4 - < 0,8 2 licht afwijkend
0,8 - < 1,2 3 Afwijkend
1,2 - < 2 4 sterk afwijkend
Op die manier wordt per staal voor elke chemische parameter onder beschouwing een
klasse bekomen. De hoogste van alle klassen van alle chemische parameters wordt de
globale klasse van het staal. Evenwel kan een staal terugvallen tot een lagere klasse,
wanneer de concentraties van ten hoogste twee parameters kleiner zijn dan het midden van
die klasse.
Een voorbeeld:
103
Parameter LogIndex Klasse
Cr 0 1 Pb 0 1 As 0,2 1 Cd 0,96 3 Cu 0,24 1 Hg 0 1 Ni 0 1 Zn 0,52 2
Totaal 2
Het globale eindoordeel is 2 omdat de LOGINDEX van Cd = 0,96 kleiner is dan het
klassemidden van klasse 3 (zijnde 1). Het staal valt terug van klasse 3 naar klasse 2.
1.6 Weergave op kaart
Aan elke klasse wordt een kleur toegekend. Op die manier kunnen de fysisch-chemische
resultaten op kaart worden weergegeven.
Klasse Kleur
1 blauw
2 groen
3 geel
4 rood
104
STROOMSCHEMA FYSISCH-CHEMISCHE BEOORDELING WATERBODEMS
GEMIDDELDE CONCENTRATIE IN
REFERENTIEWATERBODEM
µ
GECORRIGEERDE
CONCENTRATIE IN
WATERBODEM
Ns(11,5)
GECORRIGEERDE CONCENTRATIE
IN REFERENTIEWATERBODEM
Nr(11,5)
CONCENTRATIE IN
WATERBODEM
Ns(x,y)
CONCENTRATIE IN
REFERENTIEWATERBODEM
Nr(x,y)
BODEMTYPE CORRECTIE BODEMTYPE CORRECTIE
BEREKENING VAN LOGINDEX
LOGINDEX = log(RTR) (0<LOGINDEX<2)
BEREKENING VAN RATIO TO REFERENCE
RTR = Ns(11,5)/µ (1<RTR<100)
KLASSIFIKATIE
aanvaardbaar ?
literatuur,
veilige conc.
nee
ja
105
2. Ecotoxicologische beoordeling
2.1 Ecotoxicologische variabelen
Voor een ecotoxicologische beoordeling van waterbodems volgens de Triade worden drie
testen of bioassays voorgesteld, waarvan 2 poriënwatertesten en 1 vaste fase test :
Poriënwatertest: Raphidocelis subcapitata
Thamnocephalus platyurus
Vaste fase test: Hyalella azteca
2.2 Omrekenen naar effecteenheden (E.E.)
Om de effectniveau’s die berekend zijn als procent verdunning van de stalen
(poriënwatertesten) gemakkelijker te kunnen interpreteren worden de L(E)C50 waarden
getransformeerd in effecteenheden (E.E.) met de formule voorgesteld door Sprague &
Ramsay (1965):
Een L(E)C50 van 1 effecteenheid betekent dat het onverdunde staal (100%) in de betrokken
testperiode een effect veroorzaakt bij 50% van de testorganismen. Een L(E)C50 van 10 E.E.
houdt in dat wanneer het staal 10 keer verdund wordt bij deze verdunning nog steeds 50%
effect optreedt, m.a.w. hoe hoger het aantal E.E.’s hoe groter de toxiciteit van het staal.
Bij de vaste test wordt de significant verhoogde mortaliteit ten opzichte van de controle
(=referentiesediment) nagegaan aan de hand van een statistische significantietoets
(ANOVA met Tukey honest significant difference test). Het significantieniveau wordt op 0.05
geplaatst.
2.3 Ecotoxicologische referentietoestand
Een referentiebodem wordt gedefinieerd als een waterbodem waarbij geen acute toxiciteit
wordt waargenomen. Dit criterium wordt arbitrair gelijkgesteld met 0.01 Effect Eenheden
teneinde een deling door nul te voorkomen.
100)(
1..
50
×=CEL
EE
106
2.4 Berekening verhouding t.o.v. de referentie
De resultaten van de testen op het poriënwater worden voor elke test omgerekend naar een
verhouding t.o.v. de referentie (VTR). Bij de bulksedimenttest wordt een verhoogde
mortaliteit nagegaan t.o.v. de controle (=referentiesediment).
2.5 Indeling in klassen
Met behulp van de gemiddelde VTR waarde voor de totale poriënwaterbatterij worden de
volgende 4 klassen vooropgesteld:
VTRgemidd Klasse Betekenis
1 1 Geen acute impact op pelagische biota
1 – 150 2 Licht acute impact op pelagische biota
150 – 300 3 Acute impact op pelagische biota
> 300 4 Ernstige acute impact op pelagische biota
De resultaten van de geselecteerde sediment contacttest met de amfipode worden arbitrair
in de volgende klasse ingedeeld:
Mortaliteitgemidd Klasse Betekenis
Niet significant verschillend t.o.v.
referentie
1 Geen acute impact op bentische biota
20 – 50a 2 Licht acute impact op bentische biota
50 – 75a 3 Acute impact op bentische biota
75 – 100a 4 Ernstige acute impact op bentische biota
a = significant verhoogde mortaliteit (p<0.05)
De uiteindelijke ecotoxicologische klasse wordt bepaald door de hoogste klasse van de
twee beoordelingen (poriënwater en bulksediment) en bepaald de acute impact op
aquatische biota.
107
2.6 weergave op kaart
Aan elke klasse wordt een kleur toegekend. Op die manier kunnen de ecotoxicologische
resultaten op kaart worden weergegeven.
Klasse Kleur
1 Blauw
2 Groen
3 Geel
4 Rood
108
3. Biologische beoordeling
3.1 Biologische variabelen
Voor de biologische kwaliteit van waterbodems worden twee indexen gebruikt namelijk de
biotische waterbodemindex en kaakafwijkingen bij muggenlarven.
3.2 Biologische referentietoestand
Een referentiewaterbodem wordt gedefinieerd als een waterbodem met een gezonde
bentische levensgemeenschap met een hoge diversiteit en waar geen (of zéér weinig)
kaakafwijkingen bij muggenlarven werden gevonden.
3.3 Indeling in klassen
Beide geselecteerde indexen (BWI en % misv.) worden ingedeeld in vier kwaliteitsklassen
met bijhorende kleurcode.
De 10 mogelijke BWI-waarden worden als volgt ingedeeld:
BWI Betekenis klasse
7 – 10 goede biologische kwaliteit 1
5 – 6 matige biologische kwaliteit 2
3 – 4 slechte biologische kwaliteit 3
0 – 2 zeer slechte biologische kwaliteit 4
Voor het % misv. worden drie criteria onderscheiden:
criterium 1: meer dan 8%;
criterium 2: meer dan 16%.
criterium 3: meer dan 32%.
Dit resulteert dan in de volgende vier kwaliteitsklassen:
109
% misv. klasse Betekenis
<8 1 Niet afwijkend van de referentie
8-16 2 Matig afwijkend van de referentie
16-32 3 Sterk afwijkend van de referentie
>32 4 zeer sterk afwijkend van de referentie
Voor de beschrijving van de referentie wordt verwezen naar Van Urk en Kerkum (1991).
Deze grenzen moeten echter beschouwd worden als signaalwaarden, aangezien
misvormingen veroorzaakt worden door een zeer complex proces waardoor scherpe
grenzen waarboven of waaronder wel of geen sprake is van een 'gering' of 'ernstig' toxisch
effect niet zijn aan te geven.
Hoger vermelde criteria gelden echter alleen indien meer dan 100 muggenlarven bekeken
werden. Indien dit niet het geval is, worden volgende criteria voor de Chi²-waarden
voorgesteld:
criterium 1: Chi² > 6.38;
criterium 2: Chi² > 10.66;
criterium 3: Chi² > 15.05.
De resulterende klassen zijn dan:
Chi² klasse
< 6.38 1
6.38 – 10.66 2
10.66 – 15.05 3
> 15.05 4
Uiteindelijk wordt het sterkste signaal (hoogste klasse) van beide indexen op de biologische
as aangeduid.
110
3.4 Weergave op kaart
Aan elke klasse wordt een kleur toegekend. Op die manier kunnen de biologische resultaten
op kaart worden weergegeven.
Klasse Beoordeling Kleur
1 Goede biologische kwaliteit blauw
2 Matige biologische kwaliteit groen
3 Slechte biologische kwaliteit geel
4 Zeer slechte biologische kwaliteit rood
111
4. Geïntegreerde verwerking
De geïntegreerde verwerking van de gegevens volgens de Triade houdt in dat de drie
componenten een gelijk gewicht krijgen voor een globale kwaliteitsbeoordeling van
waterbodems. Deze beoordelingsmethode geeft een eerste beschrijving van de kwaliteit
van de waterbodems en biedt de mogelijkheid een eerste rangschikking naar prioriteiten
voor te stellen. De saneringsprioriteit en saneringsplanning kan pas uitgewerkt worden na
een geïntegreerde evaluatie waarbij andere factoren en beleidskaders worden in
beschouwing genomen. Tenslotte wanneer specie aan land wordt gebracht, bestaat de
mogelijkheid van een nieuwe (land)bodemverontreiniging door een verontreinigde
waterbodem. Een ex-situ evaluatie is in dit geval noodzakelijk.
Voor de berekening van de Triade kwaliteitsbeoordeling worden klassen omgezet in
signalen. De fysisch-chemische klassen 3 en 4 krijgen de signaalfunctie (+). Klassen 1 en 2
krijgen een minteken (-), of geen signaal. Biologisch en ecotoxicologisch worden de klassen
2, 3 en 4 als signalen beschouwd (+). Klasse 1 betekent hier geen signaal (-) (zie Tabel 1).
Op basis van de signalen, bekomen in de drie beoordelingen afzonderlijk, kunnen de
waterbodems gerangschikt worden in volgorde van globale kwaliteitsbeoordeling (Tabel 2).
De redenering daarbij is de volgende: het samengaan van een chemisch met een biologisch
en een ecotoxicologisch signaal (+) kan wijzen op effecten, die te wijten zijn aan
verontreiniging. Dergelijke waterbodems krijgen een slechte kwaliteitsbeoordeling op basis
van de Triade. Wanneer de 3 componenten van de Triade niet in dezelfde richting wijzen,
resulteert dit meteen in een lagere rangschikking of een betere kwaliteitsbeoordeling. Het
ontbreken van de signalen (-) in alle drie de beoordelingen wijst op een ‘zuivere’
waterbodem.
Tabel 3: Omzetting van klassen in signalen (- of +) als hulpmiddel bij de globale
kwaliteitsbeoordeling
Signaal
Klasse Fysisch-chemisch (C) Ecotoxicologisch (E) Biologisch (B)
1 - - -
2 - + +
3 + + +
4 + + +
112
Tabel 4: Triade kwaliteitsbeoordeling
Chemie Ecotoxicologie Biologie Globale klasse
+ + + 4
- + +
+ + - 3
+ - +
- - +
- + - 2
+ - -
- - - 1
In het kader van rivierherstel kan voor een waterbodem met een hoge prioriteit voor saneren
en na evaluatie van andere factoren zoals habitatkwaliteit, functietoekenning van het
oppervlaktewater enz. een globale saneringsprioriteit voorgesteld worden.
