Gyors folyamatok Dr. Kengyel András Enzim-szubsztrát Stopped flow... · 1 Dr. Kengyel András Gyors kinetikai módszerek Gyógyszerész előadás 2016. Máj. 2. Gyors folyamatok

1

Dr. Kengyel András

Gyors kinetikai

módszerek

Gyógyszerész előadás 2016. Máj. 2.

Gyors folyamatok

Receptor-ligandEnzim-szubsztrát

Lizozim - poliszacharid

Inzulin - receptor

Fehérje-gyógyszer

2012 © A*STAR Experimental Therapeutic Centre

http://www.trinity.edu/lespey/biol3449/lectures/lect10/lect10.htm

http://pixshark.com/enzyme-active-site.htm

Steady-state vs tranziens kinetika

0 1 2 3 Idő (s)

Steady-state

Tranziens

A B C

[C]

A B C

• biológiai mechanizmusok megértése

• biológiai folyamatok időskáláján (ms) mérnek

• fehérje-fehérje, fehérje-ligandum kölcsönhatások

vizsgálata

• kinetikai paraméterek meghatározása

Gyors kinetikai módszerek jelentősége

Reakciókinetika

Reakciókinetika

REAKCIÓSEBESSÉG: a reakció jellemzésére szolgáló paraméter

időbeli koncentráció változás

Reakciósebesség függ:

• résztvevő anyagok minősége

• koncentrációk

• hőmérséklet

• katalizátor / inhibitor

MOLEKULARITÁS

• Egy reakcióban hány molekula vesz részt

ELEMI REAKCIÓK: nem bonthatók egyszerűbb lépésekre

• Elemi reakciók rendűségét a reakció molekularitása határozza meg.

ÖSSZETETT REAKCIÓK

mA: sztöchiometriai együtthatók!

a, b: reakciórendek

(Nem sztöchiometriai együtthatók!)

k: sebességi állandó (s-1)

A B C Dm A m B m C m D

( ) a b

t tv t k A B

2

A komponensek koncentrációja lineárisan változik az idő függvényében

Reakciósebesség független a reaktánsok koncentrációjától (a=0, b=0)

Pszeudozérus-rend: reaktáns koncentrációja nagy [A]t = [A]0

pl. enzimkatalízis (ha az enzim koncentrációja kicsi) - NEM elemi reakció!

Nulladrendű reakció

1. t1/2

2. t1/2

3. t1/2

0 t

Kiindulási

anyag

Termékek

[A]

[B]

[C]

B

C

A

A → B + C

( ) v t k

( ) a b

t tv t k A B

A komponensek koncentrációja exponenciálisan változik az idő függvényében.

A reakciósebesség egyetlen anyag koncentrációjától függ

A felezési idő állandó, nem függ a koncentrációtól

Pszeudó-elsőrendű reakció: egyik reaktáns nagy feleslegben

Elsőrendű reakció

1. t1/2

2. t1/2

3. t1/2

0 t

Termékek

B

C

A

Kiindulási

anyag

A → B + C

0

ln -

tA

ktA

-

0 kt

tA A e

( ) t

v t k A

( ) a b

t tv t k A B[A]

[B]

[C]

Elsőrendű reakció

Reakciósebesség koncentráció-függése

Példa: Fehérje foszforiláció (pszeudo-elsőrendű: ATP nagy feleslegben)

0

Kezdeti koncentráció

Kezdeti sebesség

Idő0

Koncentráció (kezdeti)

0,4

0,3

0,2

0,1Ke

zd

eti

se

be

ss

ég

●

●

●

●

●

●

●

●

●

● ●vmax

Km

Fehérje + ATP Fehérje-P + ADP

Fe

hé

rje

ko

nce

ntr

ác

ió (p

illa

na

tny

i)

enzim

0.,08

0,06

0,04

0,02

1

2

3

4

5

2

3

4

5

1

A komponensek koncentrációja hiperbola függvény szerint változik az

idő függvényében.

Másodrendű reakció

1. t1/2

2. t1/2

3. t1/2

0 t

Termékek

B

C

A0

Kiindulási

anyag

2

t tv k A

t t tv k A B

2A → B + C[A]

[B]

[C]

2 AAt

dcv kc

dt

• Sorozatos kémiai reakciók:

• Párhuzamos kémiai reakciók:

• Egyensúlyi kémiai reakciók:

sebességmeghatározó lépés: B → C A → B

Egyensúlyi állandó:

Összetett reakciók

1 2 k k

A B C

1 2k k

A

B

C

Re

lativ

ko

nce

ntr

áció

Idő

A

B

C

Rela

tiv k

on

cen

tráció

Idő

1 2k k

1

2

k

k

A B

A C

1

2

B

A

k cK

k c

• biológiai mechanizmusok megértése

• biológiai folyamatok időskáláján (ms) mérnek

• fehérje-fehérje, fehérje-ligandum kölcsönhatások

vizsgálata

Meghatározható paraméterek:

• maximális reakciósebesség (vmax),

• KD (disszociációs állandó) meghatározása

• KM (Michaelis konstans, „affinitás”)

• sebességmeghatározó lépés

• polimerizáció, depolimerizáció időbeli követése

Gyors kinetikai módszerek jelentősége

3

Gyors kinetikai módszerek

Módszer Időskála Leírás Jel

Ke

veré

se

s m

ód

szere

k

Kifagyasztott áramlás (quench flow)

ms – s Reakció megállítása kifagyasztással,

nincs spektroszkópiai jel

Nem

spekt

Megállított áramlás(stopped flow)

ms – s Áramlás megállítása, spektroszkópiai

mérés

Sp

ektro

szkó

pia

i

Folyamatos áramlás (continuous flow)

μs – msKeverés után folyamatos áramlás,

távolság korrelál az idővel

SPR (felületi plazmon rezonancia)

μs – ms Felszín megváltozása interakció

esetén, jelölésmentes

Villanófény fotolízis μs – ms Kötött molekula felszabadítása

fényimpulzussal, nincs keverés

Re

laxá

ció

s

mó

dszere

k

T-jump (hőmérséklet ugrás)

μs – min Gyors hőmérséklet-változtatást

követő új egyensúly beállása

P-jump (nyomás ugrás)

μs – h Gyors nyomás-változtatás követő új

egyensúly beállása

TCSPC (időkorrelált egyfoton számlálás)

fs – ns Ultragyors lézeres gerjesztést követő

emisszió

100 10-3 10-910-6 10-12

s ms ms ns ps

Lombik reakció

Quench flow(„kifagyasztott áramlás”)

Stopped flow(„megállított áramlás”)

Temperature jump

Pressure jump

Villanófény fotolizis

Felületi plazmon rezonancia

Egyfoton-számlálás (TCSPC)

Ultragyors tranziens abszorpció

Gyors kinetikai módszerek időskálája

10-15

fs

Megállított áramlású reaktor

„Stopped flow”

Folyamatos és megállított áramlás

Folyamatos áramlású technika „Continuous flow” (Hartridge and Roughton, 1923)

Megállított áramlású technika „Stopped flow” (Chance and Gibson, 1964)

Folyamatos áramlású technika

Fecskendő

Meghajtó motor

Mérőcella

Keverő

Szűrő

Lencse

CCD-kamera

Mikro-gyöngy

140 mM belső kapilláris

10 mM üveg tüskék

Kvarc mérőcella

250 mM csatorna

Meghajtó: 5 atm

Áramlási sebesség: 10 m/s

Reakció úthossz: 600 mm

Holtidő: 60 ms

(Shastry, 1998)

Fényforrás Monokromátor Lencse

http://www.photophysics.com/sx20.php

Stopped flow

fényforrás

monokromátor

reaktor

számítógép

PMT vezérlő

tápegység

http://www.photophysics.com/sx20.php

4

Stopped flow alkalmazásának feltétele

Egy alkalmas spektroszkópiai jel

intrinsic: Triptofán, NADH, flavin

extrinsic: fluorofór

Ami változik a reakció során

Tipikus spektroszkópiai jelek:

• Abszorbció

• Fluoreszcencia intenzitás

• Fényszórás

• Anizotrópia

Detektor

Detektor

Termosztált cella:

20 – 100 ul

Optikai kábel

4 bar nyomás

Fecskendők és keverés

Stopped flowStopped flow működése

A B

Meghajtó motor

Megállító

fecskendő

Végállás-

kapcsoló

Mérőcella

Keverő

Meghajtó motor

Reaktánsok

Fényforrás


A B

Megállító

fecskendő

Végállás-

kapcsoló

Mérőcella

Keverő

Meghajtó motor

Reaktánsok

Fényforrás


A B

Megállító

fecskendő

Végállás-

kapcsoló

Mérőcella

Keverő

Meghajtó motor

Reaktánsok

Fényforrás


A B

Megállító

fecskendő

Végállás-

kapcsoló

Mérőcella

Keverő

Meghajtó motor

Reaktánsok

Fényforrás

5


A B

Megállító

fecskendő

Végállás-

kapcsoló

Mérőcella

Keverő

Meghajtó motor

Reaktánsok

Fényforrás


A B

STOP

Megállító

fecskendő

Végállás-

kapcsoló

Mérőcella

Keverő

Meghajtó motor

Reaktánsok

Abszorbancia

Fluoreszcencia

Fényforrás

Detektálás

spektroszkópiai jel változzon a reakció során

– abszorpció

– fluoreszcencia intenzitás

– anizotrópia

– fényszórás

• Fényforrás: Xenon ívlámpa, Hg-gőz lámpa, lézer

• Monokromátor

• Szűrők

• Detektor: PMT, fotodióda

• Számítógép: vezérlés és

adatfeldolgozás

• Analitikai szoftver

merőleges detektálás

párhuzamos detektálás

Stopped flow mérés

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

1

2

34

5

Idő (s)

Am

plitú

dó

1. Előző reakció

2. Folyadékcella feltöltése

3. Folytonos áramlás

4. Áramlás megállítása

5. Reakció

Holtidő

ln( ) ln( )

dkt

obs tot

obs tot d

A A e

A A kt

0 k (s-1)

lnΔ

Ao

bs

●●

●●

●● ●

●

Atot

• A folyadékok összekeverése és a hasznos mérés kezdete között eltelt idő

• Tipikusan: 0,5 – 1 ms

• Függ: flow rate, távolság, keverési sebesség

• Keverési hatékonyság vs holtidő

y b ax

-0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

kontrol

c1

c2

mérési adatok

exponenciális illesztés

mérés kezdete

reakció kezdete

td

Idő (s)

Am

plitú

dó

Atot

Aobs1

Aobs2

Ep

Példa: Stopped flow mérés

Miozin ADP kibocsájtás mérés:

leszoritás („single turnover”)

Mio

zin

Akti

n

1 u

M M

an

nt-

AD

P

1 m

M A

TP

AMAM-ADP

ADP

AM-ATP

ATP

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

5,85

5,90

5,95

6,00

6,05

6,10

6,15Double exponential

y0 + A1e^(-x/t1) + A2e^(-x0/t2)

y0=5,88134±0,00457

A1=0,16854±0,02026

t1=0,08609±0,01153

A2=0,10771±0,01914

t2=0,37319±0,09081

Man

nt-

AD

P f

luo

reszcen

cia

(A

U)

Idõ (s)

6

Példa: Stopped flow mérés Single vs. double mixing

Mérőcella

1. Keverő

1. Meghajtó motor

Reaktánsok

A B

2. Keverő

2. Meghajtó motor

Reaktánsok

C D

Késleltető

hurok

Megállító

fecskendő

Végállás-

kapcsoló

Mérőcella

Keverő

Meghajtó motor

Reaktánsok

Abszorbancia

Fluoreszcencia

Fényforrás

A B

Abszorbancia

Fluoreszcencia

Egyszerű keverés Többszörös keverés

• Cryo-SF:

nagyon gyors (inorganikus) reakciók, -90 °C

• Conductivity SF:

fém ligand kötés, micella képződés, proton

exchange, ion exchange, redox reakció

• FT-IR SF

Raman, infravörös spektroszkópiai módszerek

• High pressure SF:

2000 bar

Speciális stopped flow alkalmazások

„Quench flow”

Quench flow

Nincs spektroszkópiai jel

Két lépéses keverés

1. A+B: keverendő oldatok összekeverednek egy

késleltető hurokban (cellában),

reakció indul

2. (A+B) + Q: „quenching” oldat

megállítja a reakciót, bizonyos

t idő után

Reakció termékek mérése (pl.

radioaktivitás)

Időbeli érzékenység: 2 - 100 ms

Mintagyűjtés

1. Keverő

Meghajtó motor

Reaktánsok

A B

2. Keverő

Kioltó oldat

C

Késleltető

hurok

Villanófény fotolízis

„Flash photolysis”

7


• Rövid élettartamú reakciók nyomon

követése

• Kémiailag kötött, „caged molekula”

• Nagy fényintenzitás hatására

„kiszabadul” indul a folyamat

• Előnye: A és B molekula már egymás

mellett van (keverés nem vesz el időt)

• Fény detektálása a spektroszkópiás

mérés nulla időpontja


1. caged-ATP bekötés

2. Akto-miozin disszociáció (k1k+2)

3. ATP → ADP + Pi

4. Aktin – miozin újrakötés (kATPase)

1.

2.

3.

4.

Fé

ny

szó

rás

Idő (s)

AM

M-ATP M-ADP.Pi

AMAM-ATP AM-ADP.Pi AM-ADP

ATP Pi

Aktin disszociált

ADP

Aktin kötött

Gyenge keresztkötött

állapot

Erős keresztkötött

állapot

AM

M-ATP M-ADP.Pi

AMAM-ATP AM-ADP.Pi AM-ADP

ATP Pi

Aktin disszociált

ADP

Aktin kötött

Gyenge keresztkötött

állapot

Erős keresztkötött

állapot

1.2.

3.

4.


„Surface plasmon resonance”

(SPR)


üveg

fémlemez (pl. arany v. ezüst)

fényforrás detektor

A partner

B partner

Felületi plazmonok: Fémek felületén egy speciális fénysugárral hullámszerű

mozgásra kényszerített elektronok.

Rezonancia feltétele: A gerjesztés a fény egy adott beesési szögénél történik

meg és ilyenkor a fém felületről visszavert fény intenzitásában egy minimum

észlelhető (abszorpció!).



pola

rizál

t fén

y visszavert fény

üveg

I.II.A kötés megváltoztatja

a visszaverődés szögét.


pola

rizál

t fén

y visszavert fény

üveg

I.II.A kötés megváltoztatja

a visszaverődés szögét.


A bekötődés megváltoztatja a felülettel érintkező réteg törésmutatóját

rezonancia szög eltolódás érzékeny detektálás


kötés disszociáció

regeneráció

rezo

nan

cia

je

l

idő (s)

Documents

Gyors folyamatok Dr. Kengyel András Enzim-szubsztrát Stopped flow... · 1 Dr. Kengyel András Gyors kinetikai módszerek Gyógyszerész előadás 2016. Máj. 2. Gyors folyamatok