Upload
internet
View
112
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Gustavo Garcia
Luiz Gustavo Gardinassi
Thais Herrero
pDCs play off scratch
Modelo de desenvolvimento das células dendríticas
Função das células dendríticas
Subpopulações de Células Dendríticas
CD45+
LC- células de Langerhans
IDEC- células dendríticas epidermal inflamadas.
PDC- células dendríticas plasmocitóides
CD123- cadeia alfa do receptor da IL-3
RT-PCR
J. Exp. Med- September 17, 2001
Nature Reviews Immunology 8, 259-268 (April 2008)
Importância da produção dos IFNs do tipo 1
•Expressam TLR7 e TLR9
•Produz grande quantidade de interferons tipo 1
•pDC são população de células circulantes
• Ausentes na pele normal, porém migram para pele inflamada
LL37/CRAMP- peptídeo antimicrobiano catelicidina
Controle da infecção/lesão Autoimunidade
Objetivo: Avaliar o papel das células dendríticas plasmocitóides
(pDCs) durante a lesão da pele e no processo de cicatrização
Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs?
Derme Quantificação das células dérmicas
Digestão com 1mg/ml de colagenase por 2h
Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs?
Assim, lesões na pele induz uma infiltração rápida e robusta de
pDCs paralela à infiltração por neutrófilos no local da lesão.
Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I?
Pele total (0, 6, 24, 48 e
72h)
Análise da expressão gênica por Real-time PCR
As pDCs são a principal fonte de IFN-α/β na lesão, enquanto as citocinas
inflamatórias IL-6 e TNF são produzidas por outros tipos celulares que não as
pDCs.
Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I?
48hs
24hs
2 Acs (PDCA1 e
mAb 927) ou IgG como controle antes da
lesão
48hs
24hs
Acs (anti-Ly6C) ou IgG
como controle antes da
lesão
24h
Demonstrando que a pele danificada induz uma rápida infiltração e ativação de
pDCs.
Os TLRs estariam envolvidos na ativação pDCs e produção de INF-α/β?
MyD88 -/-
Pele total (24h)
Análise da expressão gênica por
Real-time PCR
Lesão
IRS 954 (0, 1, 10 ou 100μg)
Lesão Pele total (24h)Análise da
expressão gênica por real-time
PCR
As catelicidinas são induzidas neste modelo de injúria de pele?
Pele total (0, 6, 24, 48 e
72h)
Análise da expressão de catelecidina
(CRAMP) por Real-time PCR
pDCs do baço
Overnight
• DNA
• CRAMP
• CRAMP+DNA
• scCRAMP+DNA
• scCRAMP
ELISA
Sugere-se um potencial papel das catelicidinas na quebra da tolerância inata para ácidos
nucléicos próprios.
As catelicidinas estariam também envolvidas com a quebra da tolerância inata contra ácidos nucléicos in vivo?
CRAMP
scCRAMP
Salina
Pele total (0, 24 e 48h)
• FACs
• Real-time PCR
Sim, CRAMP é suficiente para quebrar a tolerância inata e induzir a ativação de
pDCs e produção de IFNs na pele in vivo.
Pele total (24h)Análise da
expressão gênica por Real-time PCR
Com ou sem lesão
CRAMP -/-
As catelicidinas são necessárias para a ativação das pDCs na pele danificada?
Assim, as cetelicidinas são suficientes, mas não necessárias para a quebra da
tolerância inata a ácidos nucléicos e induz a produção de IFN-α/β pelas pDCs
na pele danificada.
As pDCs induzem uma resposta inflamatória na pele danificada?
2 Acs (PDCA1 e
mAb 927) ou IgG como controle antes da
lesão
Pele total (24h)Citocinas
inflamatórias por Real-time PCR
Com ou sem lesão
Estes resultados demonstram que as pDCs infiltrantes, desenvolvem um papel importante na indução da resposta imune inflamatória na pele danificada, e em particular a indução de IL-6 e citocinas Th17
As pDCs teriam um papel na reepitelização da pele danificada?
Pele com lesão Análise da expressão de Keratina 6 (K6)
Imunofluorescência
Estes resultados indicam que a infiltração das pDCs na pele danificada
desenvolvem um papel importante na pele danificada promovendo uma rápida
reepitelização da lesão.
Qual seria o papel dos IFN-α/β neste processo?
IFNAR -/-
Pele com lesão Quantificação da Keratina 6 (K6) e análise da expressão das citocinas inflamatórias por Real-time PCR
Estes resultados sugerem que a capacidade das pDCs dispararem uma rápida resposta
inflamatória e promoverem o reparo do tecido esta relacionado a ativação dos TLR mediada
por ácidos nucléicos e produção de IFN-α/β.
E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade?
Biópsias antes e 24h depois da lesão
7 voluntários
• Fita adesivaImunoistoquímica para
BDCA2 (marcador específico de pDCs
humana) e Real-time PCR
Sim, similar aos resultados obtido no modelo murino, as pDCs foram ativadas e
produziram IFN-α na pele danificada.
E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade?
Biópsias antes e 24h depois da lesão
7 voluntários
• Lauril sulfato de sódio (SLS)
Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs
humana)
Assim como no modelo de lesão mecânica, o modelo de lesão química induziu
uma rápida infiltração de pDCs e uma significante indução da expressão de mRNA
de IFN-α na pele danificada.
Conclusão
Controle da infecção/reparo tecidual
Objetivo:Investigar o papel das pDCs na inflamção da
pele de indivíduos suscetíveis a doença autoimune
Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos?
Linhagem 129
Tape stripping
24hCitometria de fluxo
Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos?
Após a inflamção, pDCs e neutrófilos infiltram-se na pele, onde pDCs produzem IFN- e neutrófilos produzem NETs.
Linhagem 129
Tape stripping
24hImunomarcação
INFAR-/- ou WT
Naive/Tape stripping
24hReal Time PCR
Os IFN tipo I atuam na indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada?
A indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada envolve a sinalização via
TLR?MyD88-/- ou WT
Naive/Tape stripping
24hReal Time PCR
O requerimento de MyD88 na indução de genes pró-inflamatórios demonstra um importante papel da
sinalização via TLR.
Naive/Tape stripping
24hReal Time PCR
Os TLR7 e TLR9 estão envolvidos na indução de genes pró-inflamatórios na
pele lesionada?IRS 954
Sim, a sinalização via TLR 7 e TLR 9 é necessária para mudanças na expressão de genes pró-inflamatórios na
pele danificada.
pDC e Neutrófilos são necessários para a indução de genes pró-inflamatórios na pele
lesionada?
Naive/Tape stripping
24hReal Time PCRAnti-120G8
Anti-GR1-Ly-6GWT
pDC e Neutrófilos são requeridos para a indução de genes pró-inflamatórios, porém promovem respostas
inflamatórias diferentes.
Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F1 na pele
lesionada?Tape
stripping
1, 4, 20d
Real Time PCRQuant. Lesão abertaHistologia
(NZBxNZW)F1
C57/BL6129
Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F1 na pele
lesionada?
Após a inflamação, (NZBXNZW)F1 desenvolvem lesões crônicas na pele, semelhantes a lesões observadas em CLE
de humanos.
pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões
cutâneas?
Tape stripping
15-23d Quant. Lesão
aberta
(NZBxNZW)F1
Anti-120G8 ouIRS 954
pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões
cutâneas?
As pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas, pois a depleção de pDC e a inibição dos receptores tanto antes, quanto durante a inflamação, resultam em uma
melhora da cicatrização.
Tape stripping
15-23d Quant. Lesão
abertaHistologia
(NZBxNZW)F14d
IRS 954
Conclusão
AutoimunidadeControle da infecção/reparo tecidual
?
Doença
Exacerbação da lesão