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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
CITOGENÉTICA COMPARATIVA DE PEIXES CICLÍDEOS POR
MEIO DE HIBRIDIZAÇÃO in situ GENÔMICA (GISH) COM
ÊNFASE EM Oreochromis niloticus
GUILHERME TARGINO VALENTE
Orientador: Prof. Dr. Cesar Martins
BOTUCATU – SP
2009
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de PG em Biologia/AC:genética
Livros Grátis
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Agradecimentos
Seria injusto se o primeiro agradecimento não fosse para minha família!
Aos meus pais, por tudo que me deram, ensinaram e por serem minha principal
inspiração. Apesar de tudo que passamos conseguir chegar até aqui é algo
quase inacreditável, mas acreditem: isso só ocorreu porque vocês existem .
Obrigado por tudo que sou e por me amarem. Amo vocês! Ao meu querido
irmão, por ser o meu melhor e mais fiel amigo. É também o meu único vínculo
com o passado e aquele que, no futuro, provavelmente nunca me deixará na
mão (Sunscrean). Te amo!
A Tatiana de Campos Melo, que sempre me apoiou e me afagou enquanto eu pensava
que nada daria certo. Meu pessimismo é sempre ofuscado pela calmaria de suas
palavras. Te amo minha princesinha!
Aos meus tios Edmir e Margarete, por serem pessoas que sempre me ajudaram e me
deram a mão nos momentos em que precisei e que sempre desejam muitas
coisas boas para mim. Muito obrigado!
Ao meu orientador, amigo e mentor Dr. Cesar Martins, primeiramente por me dar
oportunidade e o prazer de trabalhar com ele, por garantir o meu
desenvolvimento profissional e pessoal, por confiar à mim seriedade de uma
pesquisa, depositando assim uma inegável confiança. Agradeço também os
elogios, “broncas”, ensinamentos, por ser acessível, confiável, honesto,
verdadeiro e além de tudo, companheiro.
Ao CNPq, pelo auxílio financeiro e concessão de bolsa de estudos.
A profª. Dra. Adriane Wasko, por ser uma pessoa extremamente divertida e agradável
além de, inconscientemente, ser uma pessoa que eleva a minha auto-estima.
Ao profº. Dr. Luis Grassi e sua esposa profª. Msc. Fátima (UEMS), por serem as
pessoas que mais me incentivaram a entrar em uma pós-graduação e por serem
grandes amigos.
Ao profº. Dr. Paulo Vênere (UFMT), pelo companheirismo, caronas, colaborações e
ensinamentos, que não foram poucos.
Aos professores doutores, Guaracy Tadeu Rocha (UNESP - Botucatu) e Marta
Svartman (UFMG), por aceitarem participar da banca de mestrado.
Aos colegas de laboratório Andréia Poletto, Danillo Pinhal (amigo de república
também), Diogo Mello (risos), Juliana Mazzuchelli, Irani Ferreira, Wellcy Teixeira,
Gilberto (Provisório), Marcela (Scargot), Jéssica, e Rubens, pelas “botecadas”,
brincadeiras, ensinamentos, cooperações, discussões científicas e pelo
3
companheirismo eminente. Agradecimento especial ao Diogo e Danillo, por
conselhos e discussões durante a elaboração do trabalho.
Aos colegas de outras instituições, Carlos Schneider, Claudia Gross e Eliana Feldberg
do INPA (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) pela amizade, conselhos
e colaboração no trabalho.
As professoras Cristiane Kioko Shimabukuru-Dias e Maeli Dal Pai Silva, por
participarem da minha banca de qualificação.
Aos amigos e amigas do meu estado, que são inúmeros, mas destaque especial para
o Manolo Sanches (o índio menos índio do Brasil), Brunão (gordo e barbudo
sempre), Gago e Baxada. Saudades de vocês!
A Ligiane Baggio, amiga e companheira, além de ser a criadora da minha nova vida.
Te adoro!
Aos amigos de república, Renato (Kékú), Adriano (Xurupito), Ângelo (Roseana), Caiqui
(Xapeleta), Danillo (Jacú), Juan “(não vai a utilizar? Passa para mim!)”, Sérgio
(Parrudo), e moradores itinerantes como o Guilherme (Caruncho) e Fabrício pela
amizade e companheirismo
Aos companheiros da UNESP, Konrado, Dani, Kelly, Fio, Varvito, Alf, Marlon, Cristiane
Dias, Monge, Esponja, Robson, Edimárcia, Antônio Sérgio (obrigado pelos
ensinamentos), Japa da genética, Emanuel, Guiodai, Moçoila, Claudinha,
Caruncho, Ricardo Benini (obrigado pelos ensinamentos), Waldo (professor da
UNEMAT), Márcio, Menudo, Vanessa, Tati, Magrela, Jú Silvério, Japa, Heraldo,
pelo companheirismo desde que cheguei à Botucatu.
Aos amigos Sérgio e Márcia, que são pessoas que fazem com que eu me sinta muito
bem.
Ao todos os funcionários do departamento de Morfologia do Instituto de Biociências da
UNESP de Botucatu, em especial a dona Terezinha e Luciana, que fazem esse
departamento funcionar.
Aos técnicos de Laboratório e amigos, Zé Eduardo (os turbinados), Ricardo e Renato.
Agradecimento especial ao Zé, que foi uma das pessoas que mais me incentivou
a essa vida Botucatuense.
A quase todos os professores credenciados no departamento de genética, pelas
disciplinas e conversas.
Aos funcionários da secretaria da pós-graduação, por serem compreensíveis e ágeis
no seu trabalho.
Ganhar? Não sei. Desistir nem tão fácil.
Muito obrigado!
4
Resumo
A família Cichlidae é a família mais especiosa dentre os Perciformes. Os ciclídeos são
apreciados na aquariofilia, na pesca esportiva ou alimentação, sendo a espécie
Oreochromis niloticus mais cultivada em todo o mundo. Além disso, O. niloticus é
atualmente um dos ciclídeos mais utilizados nos estudos genéticos e isto tem elevado
esta espécie a um patamar de “modelo experimental”. As análises citogenéticas dos
ciclídeos são ainda incipientes, porém em O. niloticus, as análises de heterocromatina
por bandamento C, citogenética molecular e outras ferramentas moleculares,
revelaram que o maior par cromossômico e a região pericentromérica de todos os
cromossomos são ricas em heterocromatina e em seqüências repetitivas. Análises de
complexo sinaptonêmico e de citogenética molecular revelaram que o maior par
cromossômico pode ser o par sexual da espécie. No presente estudo, a comparação
entre o genoma de O. niloticus e de outros ciclídeos, tanto africanos como sul-
americanos, por meio de GISH (técnica de citogenética molecular que utiliza o DNA
genômico total como sonda), demonstrou que pelo menos alguns elementos contidos
na heterocromatina pericentromérica dessa espécie são espécie-específicos e que
grande parte do braço longo do maior par possui seqüências conservadas, ao menos
dentro da tribo Tilapiini (compostas pelos gêneros Oreochromis, Tilapia e
Sarotherodon). Foi observado também que o genoma de O. niloticus é mais
semelhante ao genoma de Hemichromis, pelo menos em relação aos elementos
repetitivos. O maior par cromossômico é rico em seqüências repetitivas por ser um
suposto cromossomo sexual ou por resultar de uma fusão entre cromossomos que
possuíam elementos repetitivos dispersos. A hipótese de que seja um cromossomo
sexual é bastante discutível, pois os marcadores ligados ao sexo estão presentes em
outro grupo de ligação nessa espécie. De qualquer forma, a região heterocromática do
braço longo desse cromossomo, por ser uma cromatina rica em seqüências repetitivas
com alta taxa evolutiva, parece ter se tornado específica da tribo Tilapiinae.
Palavras-chave: Ciclídeos, seqüências repetitivas, cromossomos, heterocromatina,
evolução.
5
Abstract
The Cichlidae family is the most species-rich group of Perciformes order. This group
captures the attention of aquarium hobbyists, sport fishing and feeding, being
Oreochromis niloticus the most important in aquaculture today. In addition, this species
is currently used in studies for different areas and it has been upped to a level of
‘experimental model’ for the family. Cytogenetic analyses of the cichlids species are
still incipient, although O. niloticus has been characterized using classical and
molecular cytogenetics techniques, with special attention to the heterochromatin.
These studies have revealed that the q arm from the first chromosomal pair and the
pericentromeric regions are rich in heterochromatin and repetitive sequences. The
observation of the sinaptonemal complex and through molecular cytogenetic tools have
shown that probably the first chromosome is the sex bivalent of the species. In this
study was realized a comparison between the genome of O. niloticus and other
cichlids, from South America and Africa, using GISH technique. The results have
shown that at least some elements, contained in peri-centromeric heterochromatin of
Nile tilapia are specie-specific, and a large part of the q arm of the biggest
chromosome pair, presents sequence conservation within the Tilapiini tribe (composed
of the genus Tilapia, Oreochromis and Sarotherodon). It was also observed that
probably the genome of O. niloticus, compared with non-tilapiines tribes, is more
similar to the genome of Hemichromis, regarding for repetitive elements. It has been
observed that the first chromosome pair is rich in repetitive sequences and because
this it has supposed to be the sex chromosome or this accumulation is resultant of a
chromosome fusion. The first hyposthesis is highly debatable, due the marker sex
linked are present in another linkage group. Anyway our observations have
demonstrated that the heterochromatic region of the 1q apparently became specific to
the tribe Tilapiinae.
Keywords: Cichlidae, repeated DNAs, chromosome, heterochromatin, evolution.
6
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ........................................................
1.1. Biologia geral dos peixes ciclídeos..........................................................
07
07
1.2. Citogenética e genética de peixes ciclídeos............................................ 15
1.3. Hibridação in situ genômica (GISH) e seu potencial nos estudos de
evolução do genoma................................................................................
19
2. OBJETIVOS.......................................... ................................................... 22
3. MATERIAL E MÉTODOS .........................................................................
3.1. Material Biológico.....................................................................................
3.2. Obtenção dos cromossomos mitóticos através de preparações diretas.
3.3. Extração de DNA de tecidos sólidos........................................................
3.4. Análise qualitativa do DNA.......................................................................
3.5. Preparação do DNA de bloqueio..............................................................
3.6. Análise quantitativa do DNA.....................................................................
3.7. Marcação da sonda e inserção do DNA bloqueador................................
3.8. Hibridação in situ Fluorescente – FISH....................................................
3.8.1. Desnaturação dos cromossomos mitóticos..............................
3.8.2. Desnaturação da solução sonda/DNA bloqueador e
hibridação.................................................................................
3.8.3. Lavagem pós-hibridação, detecção e contra-coloração...........
3.9. Genomic in situ Hybridization (GISH)……………………………….………
3.9.1. Controle experimental..............................................................
3.10. Análise das hibridações e processamento das imagens...............
3.11. Análise dos sinais..........................................................................
3.12. Análise estatística..........................................................................
23
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29
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...............................................................
Comparative cytogenetics of cichlid fishes through genomic in situ
hybridization (GISH) with emphasis in Oreochromis niloticus…………...……
30
31
5. CONCLUSÃO........................................................................................... 47
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 48
7
1. Introdução e Justificativa
1.1. Biologia geral dos peixes ciclídeos
Mais da metade dos vertebrados ósseos viventes são animais conhecidos
como peixes (Helfmam et al., 1997; Venkatesh, 2003). É o grupo mais antigo,
diversificado e numeroso dentre os vertebrados, os quais acredita-se que incluam
mais da metade das espécies de vertebrados viventes conhecidas, sendo 25.000
espécies conhecidas e válidas para um total de 48.000 de espécies de vertebrados
conhecidas (Nelson, 2006). Além disso, a taxa de especiação mais rápida conhecida
em vertebrados é registrada entre os peixes. Como exemplo, aproximadamente 500
espécies de ciclídeos que vivem no lago Victória no leste africano surgiram por meio
de processos de especiação ocorridos nos últimos 100.000 anos a partir de poucos
ancestrais (Verheyen et al., 2003).
Os peixes com nadadeiras raiadas (Actinopterygii) compreendem
aproximadamente 23.700 espécies existentes (Nelson, 1994) e representam o grupo
mais diverso dentre os vertebrados, com vastas diferenças morfológicas e adaptativas.
Podem ser divididos em “teleósteos” (Teleostei) (grupo mais derivado) e “não
teleósteos” (Chondrostei e Holostei) (grupo mais basal). O grupo-irmão dos peixes de
nadadeiras raiadas são os peixes de nadadeiras lobadas, os quais incluem todos os
demais vertebrados ósseos (Sarcopterygii) (aproximadamente 23.600 espécies
viventes) (Venkatesh, 2003). As duas linhagens de vertebrados ósseos provavelmente
divergiram há aproximadamente 450 milhões de anos (Kumar e Hedges, 1998) (figura
1).
Os teleósteos são o maior grupo de vertebrados com aproximadamente 23.600
espécies (Maisey, 1996), compreendendo mais de 99% dos peixes viventes
(Venkatesh, 2003). Entretanto este número pode ser ainda maior, pois a cada ano
mais espécies são descritas. O mais antigo fóssil de teleósteo data de
aproximadamente 235 milhões de anos (Maisey, 1996) e evidências paleontológicas
sugerem que a radiação dos teleósteos ocorreu entre 150 a 250 milhões de anos
atrás. De qualquer forma, parece que os teleósteos têm passado por uma rápida
radiação, o qual é inigualável em relação a outros vertebrados (Venkatesh, 2003)
(Figura 1).
8
Figura 1 – Evolução dos vertebrados ósseos. Os números nos nós indicam o tempo de
divergência em milhões de anos (Kumar e Hedges, 199 8). O tempo de divergência dos
teleósteis está embasado no fóssil mais antigo do g rupo, o qual se estima ter
aproximadamente 235 milhões de anos (Maisey et al., 1996) e diversos fósseis de
telelósteos são relatados como sendo do Jurássico e Cretáceo. A seta vermelha indica onde
provavelmente ocorreu uma duplicação total do genom a em algum teleósteo ancestral
(revisado por Venkatesh, 2003).
Acredita-se que a vasta morfologia e diversidade de espécies de teleósteos
pode estar relacionada a duplicações gênicas independentes em larga escala ou a
duplicações totais do genoma que teria ocorrido em um teleósteo ancestral (Amores et
al., 1998; Taylor et al., 2003; Meyer e Schartl, 1999). A duplicação total do genoma
gera milhares de duplicações gênicas as quais podem ser seletivamente silenciadas
em diferentes populações ou serem retidas com função parcial, levando ao isolamento
genético e especiação. A grande diversidade nas famílias de peixes tetraplóides, como
salmonídeos e catostomídeos (Allendorf e Thorgaard, 1984; Ferris, 1984) são
exemplos da radiação de espécies após duplicações genômicas (Taylor et al., 2001).
Porém, a carência de diversidade entre anfíbios poliplóides e répteis indica que a
duplicação do genoma por si só não é suficiente para a diversificação de espécies
(Venkatesh, 2003).
Mais de 9.300 espécies de teleósteos pertencem a Ordem Perciformes, que é
tida como a mais importante linhagem deste grupo e compreende 25% de todos os
9
vertebrados. Este grupo começou a divergir de outros grupos durante o Triássico e
desta forma tem um ancestral comum há aproximadamente 200 milhões de anos
(Kocher et al., 2003) (Figura 2).
Figura 2 – Cladograma de Euteleostei, o maior grupo de teleóst eos (Kocher et al., 2003)
A família de peixes Cichlidae é o grupo mais especioso dentre os Perciformes e
de todos os vertebrados, com aproximadamente 3.000 espécies com representantes
distribuídos por toda a África, América do Sul, Central e parte da América do Norte
(inclui Texas nos Estados Unidos), Madagascar, Índia, Sri Lanka, Cuba, ilha
Hispaniola, Síria, Israel e Irã, exibindo portanto uma distribuição gonduânica (Stiassny,
1991; Zardoya et al., 1996; Chakrabarty, 2004; Kocher, 2004; Sparks e Smith, 2004;
Nelson, 2006) (Figura 3). Além disso, os ciclídeos representam o maior clado de
Euteleostei de água doce (Nelson, 2006). Somente o continente africano apresenta
mais de 1.500 espécies e a maior diversidade dentro da família, as quais são
encontradas nos grandes lagos do leste africano (Victoria, Tanganyika e Malavi)
(Trevawas, 1983; Turner e Genner, 2005), onde se estima terem surgido cerca de
2.000 espécies somente nos últimos 10 milhões de anos de anos (Kocher, 2004). Em
outro exemplo, aproximadamente 500 espécies de Ciclídeos que colonizaram o Lago
Victoria no leste Africano surgiram a partir de apenas alguns ancestrais há 100.000
anos (Verheyen et al., 2003). O principal fator que promove este tipo de adaptação a
novos ambientes é o fato de que eles se adéquam facilmente a condições extremas de
habitats e nichos (Moyle e Cech Jr., 2000). A distribuição desta família sugere terem
se originado na Gonduana há aproximadamente 100 milhões de anos. A grande
radiação adaptativa dos ciclídeos tem atraído uma maior atenção por parte dos
pesquisadores para este grupo de peixes. Além dos aspectos evolutivos, estes peixes
também exibem propriedades fisiológicas que os tornam valiosos modelos para estudo
em diversas áreas da biologia. Além disso, algu
importância para a aqüicultura mundial (Trewavas, 1983; Stiassny
al., 1996; Kocher et al., 200
Figura 3: Diversidade de espécies na família Cichli dae.
Smith et al. (2008)
monofilético e, corroborando Sparks e Smith (2004)
família é composta de
Ptychochrominae (ciclídeos de Madagascar)
Pseudocrenilabrinae (ciclídeos africanos) (
(Pseudocrenilabrinae) e os ciclídeos neotropicais (Cichlinae) são monofiléticos e
representam táxons irmãos (Smith
suportados por dados prévios (Sparks
em concordância com outros dados morfológicos e/ou moleculares combinados
(Farias et al., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004; Sparks e Smith, 2004).
(1998) havia incluído os Ptycochrominae como Cichlinae, mas agora os membros de
Madagascar desta subfamília estão
africanos+ciclídeos neotropicais e
um grupo-irmão de todas as outras subfamílias.
exceto os de Madagascar, representam um grupo monofilético (Smith
também exibem propriedades fisiológicas que os tornam valiosos modelos para estudo
em diversas áreas da biologia. Além disso, algumas espécies são de grande
importância para a aqüicultura mundial (Trewavas, 1983; Stiassny, 1991; Zardoya
., 2003; Kocher, 2004; Nelson, 2006).
Figura 3: Diversidade de espécies na família Cichli dae.
. (2008) demonstraram que a família Cichlidae é um grupo
corroborando Sparks e Smith (2004), suportam a hipótese de que a
família é composta de quatro subfamílias: Etroplinae (ciclídeos indianos),
Ptychochrominae (ciclídeos de Madagascar), Cichlinae (ciclídeos neotropicais) e
Pseudocrenilabrinae (ciclídeos africanos) (Figura 4). Os ciclídeos africanos
(Pseudocrenilabrinae) e os ciclídeos neotropicais (Cichlinae) são monofiléticos e
representam táxons irmãos (Smith et al., 2008). Estes resultados tamb
suportados por dados prévios (Sparks e Smith, 2004) e o clado de neotropicais estão
em concordância com outros dados morfológicos e/ou moleculares combinados
., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004; Sparks e Smith, 2004).
ia incluído os Ptycochrominae como Cichlinae, mas agora os membros de
adagascar desta subfamília estão incluídos como grupo-irmão do clado de ciclídeos
africanos+ciclídeos neotropicais e, além disso, a subfamília Etroplinae é considerada
todas as outras subfamílias.Todas as linhagens continentais,
exceto os de Madagascar, representam um grupo monofilético (Smith et al
10
também exibem propriedades fisiológicas que os tornam valiosos modelos para estudo
mas espécies são de grande
1991; Zardoya et
que a família Cichlidae é um grupo
suportam a hipótese de que a
subfamílias: Etroplinae (ciclídeos indianos),
(ciclídeos neotropicais) e
deos africanos
(Pseudocrenilabrinae) e os ciclídeos neotropicais (Cichlinae) são monofiléticos e
2008). Estes resultados também são
neotropicais estão
em concordância com outros dados morfológicos e/ou moleculares combinados
., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004; Sparks e Smith, 2004). Kullander
ia incluído os Ptycochrominae como Cichlinae, mas agora os membros de
do clado de ciclídeos
além disso, a subfamília Etroplinae é considerada
odas as linhagens continentais,
et al., 2008).
11
Figura 4 - Filogenia de Cichlidae combinando nove genes ( quatro mitocondriais e cinco nucleares)
e noventa e um caracteres morfológicos, incluindo o fóssil Proterocara (Smith et al., 2008).
Apesar da grande importância evolutiva do grupo africano, as relações
filogenéticas ainda são confusas (Takahashi et al., 1998). Os ciclídeos africanos
podem ser divididos em três grandes grupos: Pelmatochromine, Haplochromine e
Tilapiine (Lowe-McConnell, 1999), porém estes grupos não são reconhecidos como
unidades taxonômicas válidas por muitos pesquisadores e a classificação correta das
espécies africanas ainda permanece indefinida (Liem et al., 1991).
12
Os Haplochromine do leste e centro da África, especialmente os dos lagos do
Rift Valley, passaram por um evento de radiação extraordinário e atualmente são
considerados como um exemplo clássico de radiação adaptativa (Liem et al., 1991).
Acredita-se que existam 500 à 1.000 diferentes espécies adaptadas a nichos
específicos somente no Lago Malawi (Stiassny, 1991).
A tribo Tilapiine, cujas espécies são comumente denominadas de tilápias, inclui
os gêneros Sarotherodon, Oreochromis e Tilapia, e um quarto gênero, Danakilia, que
compreende uma única espécie (Kubitza, 2005). Os Haplocromineos diferem dos
Tilapiineos por diferenças na anatomia craniana e acredita-se que estas diferenças
tenham surgido num processo de divergência entre ambos há aproximadamente 10
milhões de anos (Trewavas, 1983).
Embora aproximadamente 70 espécies de ciclídeos recebam a denominação
de “tilápia”, somente Oreochromis niloticus, Oreochromis mossambicus e Oreochromis
aureus, e seus híbridos, têm grande importância na piscicultura mundial (Kubitza,
2005). Em cerca de 80 países em desenvolvimento as tilápias foram introduzidas com
o intuito de promover a subsistência de tais países e atualmente a sua produção
mundial ultrapassa 800.000 toneladas por ano (Lovshin, 1997; Boscolo et al., 2001).
As primeiras espécies a serem utilizadas para criação foram O. mossambicus e Tilapia
rendalli, mas a que apresentou características mais favoráveis à criação em cativeiro
foi Oreochromis niloticus (tilápia nilótica) (Popma e Masser, 1999). Mais recentemente,
a tilápia nilótica foi introduzida em vários países e atualmente é considerada a principal
espécie de tilápia cultivada no mundo, representando cerca de 75% da produção
pesqueira mundial (Stickney, 1996). Além disso, sua alta capacidade adaptativa a
ambientes de diferentes salinidades, permite atividades econômicas em águas
salobras e salgadas (Kubitza, 2005).
Além da importância social das espécies de ciclídeos, segundo Kocher et al.
(2003, 2004), os aspectos evolutivos são muito problemáticos na família e exibem
também propriedades fisiológicas que os tornam verdadeiros “ratos de laboratórios”.
Devido à notável robustez da espécie O. niloticus, por exemplo, é possível a
realização de diversas práticas experimentais, principalmente genéticas.
Todos esses fatores, fazem da tilápia nilótica um excelente modelo de estudos,
tornando-a um tipo de “organismo modelo” dentre os ciclídeos.
Os ciclídeos Neotropicais (Cichlinae) possuem 51 gêneros e aproximadamente
460 espécies (Kullander, 2003; Rican e Kullander, 2006; Chakrabarty e Sparks, 2007;
Schmitter-Soto, 2007). Além disso, o mais recente trabalho de filogenia no grupo,
designou que a subfamília Cichlinae possui sete tribos: Cichlini, Retroculini,
Astronotini, Chaetobranchini, Geophagini, Cichlasomatini and Heroini (Smith et al.,
13
2008) (figura 4). A região Neotropical possui também diversos fósseis importantes
(Casciotta e Arratia, 1993), como a espécie Proterocara, um fóssil do Eoceno
encontrado na Argentina (Malabarba et al., 2006) e que representa o fóssil mais antigo
de ciclídeos, atualmente incluído dentro da tribo Geophagini (Smith et al., 2008).
Na maior parte do século 20, a taxonomia dos ciclíneos seguiu Regan (1906).
O conhecimento da evolução dos ciclídeos alterou-se significantemente depois da
conclusão do trabalho de Cichocki (1976), avançando no conhecimento das relações
dos ciclídeos e ciclíneos. Posteriormente, ocorreram avanços no conhecimento das
inter-relações da família (Oliver, 1984; Stiassny, 1987, 1991). Porém, estes estudos
tiveram como ênfase as relações da família como um todo, proporcionando poucas
informações adicionais nas relações internas dos ciclíneos. Várias revisões e estudos
geográficos foram publicados, provendo um refinamento da taxonomia dos ciclídeos,
bem como a diagnose e descrição de diversos gêneros sul-americanos (Kullander,
1983, 1986, 1988; Kullander e Nijssen, 1989; Kullander e Staeck, 1990).
O conhecimento da filogenia dos ciclídeos sul-americanos aumentou com a
publicação de Kullander (1998), na qual foi proposta a primeira filogenia a nível de
gênero. Essa filogenia proposta foi baseada na análise de dados morfológicos que
avaliou e incorporou filogenias prévias e caracteres taxonômicos além de incluir
também novos caracteres nas análises.
Subseqüentemente, diversos estudos moleculares forneceram informações
sobre as relações entre os ciclíneos (Farias et al., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004;
Sparks e Smith, 2004). As combinações de estudos morfológicos e moleculares têm
demonstrado um monofiletismo para os “Chaetobranchini”, “Cichlasomatini”,
“Geophagini” (freqüentemente incluindo Crenicichla) e “Heroini” [incluindo todos os
membros da América Central (exceto poucos Cichlasomatini e Geophagini) e os
ciclídeos das Antilhas], mas as inter-relações desses clados (todos tratados como
tribos a partir de Smith et al., 2008) e a inter-relação e inclusão/exclusão dos gêneros
Acaronia, Astronotus, Cichla, Crenicichla e Retroculus permaneciam controversas
(revisado em Smith et al., 2008). A mais nova filogenia de ciclídeos (Smith et al., 2008)
foi baseada em cinco fragmentos de genes nucleares e quatro fragmentos de genes
mitocondriais, nos 91 caracteres morfológicos identificados por Kullander (1998), nos
dados morfológicos de Mazarunia (Kullander, 1990) e do fóssil Proterocara (Malabarba
et al., 2006). A subfamília Cichlinae foi recuperada como um grupo monofilético, mas
as relações dentro da subfamília diferiram de todas as hipóteses prévias. Atualmente
os ciclíneos incluem sete tribos, sendo que as grandes mudanças foram a alocação de
Chaetobranchini como tribo, a alocação de Crenicichla, Proterocara e Teleocichla
como Geophagini e a inclusão de Acaronia como Cichlasomatini. Houve uma falta de
14
resolução na topologia envolvendo rearranjos dos clados compostos por Crenicichla,
pelo fóssil Proterocara e por Teleocichla, devido à ausência de dados morfológicos
para Teleocichla e a ausência de dados moleculares para Proterocara (revisado por
Smith et al., 2008).
Kullander (1998) considera Cichla, Retroculus e Astronotus como os nomes
típicos para as subfamílias de ciclídeos e Sparks e Smith (2004) e Smith et al., (2008)
propuseram que Cichla, Retroculus and Astronotus devem ser tratados como tribos
monogenéricas dentro dos ciclídeos neotropicais (Cichlinae), sendo então
denominados de Cichlini, Retroculini e Astronotini, respectivamente. Smith et al.,
(2008) colocou os gêneros Astronotus, Cichla e Retroculus fora do clado composto de
Chaetobranchini, Cichlasomatini, Geophagini e Heroini (Figura 4).
Os Cichlini e Retroculini são grupos-irmão e formam um clado que é grupo-
irmão de todos os outros Cichlinae (Figura 4). A tribo Astronotini foi enquadrada como
grupo-irmão do clado composto pelas tribos Chaetobranchini, Cichlasomatini,
Geophagini e Heroini (Smith et al., 2008).
Kullander (1998) considera os Geophagini (denominação de tribo por Smith et
al., 2008) como a subfamília Geophaginae. Atualmente, essa tribo (Geophagini) é o
grupo-irmão de Chaetobranchini e juntos formam um clado que é grupo-irmão do clado
Cichlasomatini e Heroini (Smith et al., 2008) (Figura 4). Através de dados combinados
e análises combinadas, o gênero Crenicichla foi alocado dentro dos Geophagini
(Farias et al., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004; Sparks e Smith, 2004; Smith et al.,
2008), ao passo que Kullander (1998) alocou este gênero em Cichlinae (sensu stricto).
A tribo Cichlasomatini é grupo-irmão de Heroini (Smith et al., 2008) (Figura 4).
Entre os Heroini sul-americanos, a monofilia do gênero dentro do clado “deep-bodied”
(Heros, Mesonauta, Pterophyllum, Shymphysodon e Uaru) tem sido previamente
discutida (Kullander, 1986; Kullander e Silfvergrip, 1991; Bleher et al., 2007; revisado
por Smith et al., 2008).
Na primeira filogenia molecular em nível de família para os ciclídeos, Farias et
al. (1999) notaram que os ciclídeos neotropicais possuem níveis de variação genética
significantemente maiores do que o grupo-irmão Pseudocrenilabrini (grupo africano).
Argüiu-se que os Cichlinae têm passado por uma acelerada taxa de evolução
molecular e que uma taxa evolutiva particularmente alta foi encontrada dentro de
Geophagini. Em acordo com Farias et al. (2000, 2001), Smith et al. (2008)
demonstraram suporte para estas idéias pelo fato dos Geophagini possuírem ramos
comparativamente maiores. A respeito desses ramos encontrados dentro do
Geophagini (Farias et al., 1999), López-Fernández et al. (2005) sugeriram que o grupo
representou uma radiação adaptativa que foi caracterizada, em partes, por “curtos
15
ramos basais”. López-Fernández et al. (2005, p. 242) concluiram que foi “improvável
que a perda de resolução (do clado Geophagini) e suporte na base da árvore dos
Geophagini é devido a um dado insuficiente ou inadequado. Ao invés disso, os curtos
ramos na base da árvore sugerem que os diferentes gêneros de Geophagini podem
ter-se originado rapidamente e/ou sobre um curto período” de tempo.
Em termos econômicos, muitas espécies de ciclídeos sul-americanos
representam fontes importantes para aquariofilia, como as espécies dos gêneros
Symphysodon, Pterophyllum e Astronotus. Outras espécies, como aquelas
pertencentes ao gênero Cichla (tucunarés), são muito apreciadas para pesca esportiva
e consumo. No Brasil, os ciclídeos representam 6% da fauna dos peixes de água doce
(Feldberg, 2003), mas integram apenas 2% do total de peixes exportados e, além
disso, desempenham um papel muito importante, além da pesca, em atividades de
recreação, comércio e ecoturismo (Britski et al., 1986). Em suma, as espécies de
Ciclídeos existente na América do Sul apresentam um colorido fascinante, tornando as
espécies de pequeno porte as preferidas pelos aquariofilistas, enquanto as de grande
porte são muito utilizadas na alimentação e pesca esportiva (Axelrod, 1996).
1.2. Genética de peixes ciclídeos
Apesar das diversas filogenias descritas, poucos estudos genéticos foram
realizados sobre o ciclídeos Neotropicais, sendo a maioria deles relacionado a dados
citogenéticos (Feldberg et al., 2003; Mesquita et al., 2008; Mazzuchelli e Martins,
2008). Cerca de 135 espécies de ciclídeos já foram analisadas citogeneticamente, e
observou-se que o número diplóide varia de 38 a 60 cromossomos. O número diplóide
está intimamente relacionado à distribuição geográfica das espécies, uma vez que os
ciclídeos africanos apresentam 2n modal = 44 cromossomos enquanto que os da
região Neotropical possuem 2n modal = 48 cromossomos (Feldberg et al., 2003). Além
disso, não ocorre a presença de cromossomos sexuais, mas já foi relatada a
existência de cromossomos Bs (supernumerários) para algumas espécies como
Crenicichla reticulata, Cichla monoculos e Cichla sp. (Feldberg et al., 2004).
Assume-se que o número de espécies analisadas reflete poucos dados sobre a
família (Feldberg et al., 2004), visto que menos de 5% dos ciclídeos foram analisados
citogeneticamente e que a maioria dos estudos restrigem-se a trabalhos de
citogenética básica. Segundo Martins et al. (2004), as análises são principalmente
direcionadas para o conhecimento básico da estrutura cariotípica e poucos trabalhos
foram realizados visando o mapeamento cromossômico com a utilização de sondas de
DNA.
16
Em suma, a maioria dos trabalhos realizados visaram estabelecer o número
diplóide, organização da heterocromatina e localização das regiões de DNAr 18S.
Assim, avanços em relação à citogenética desta família de peixes são necessários e
mostram-se promissores para uma melhor compreensão dos mecanismos de rearranjo
cromossômico que estiveram envolvidos durante a diversificação dos ciclídeos. O
emprego de metodologias como a citogenética molecular, que visam estabelecer as
relações entre os genomas e sua organização cromossômica, é de extrema valia na
compreensão da história evolutiva desta família de peixes.
Os estudos genéticos e de citogenética molecular têm demonstrado que as
seqüências de DNA e genes podem ser muito úteis como ferramentas para definir a
estrutura e revelar a organização e evolução do genoma das espécies, além da
grande possibilidade de suas localizações nos cromossomos serem utilizadas como
marcadores entre diferentes espécies (Martins, 2007).
Diversos genomas de peixes encontram-se totalmente ou parcialmente
seqüenciados e à disposição da comunidade científica. Como exemplo pode-se
destacar os baiacús Fugu rubripes (Aparicio et al., 2002);
www.jgi.doe.gov/fugu/index.html) e Tetraodon fluviatalis (Crollius et al., 2002;
www.genoscope.cns.fr/extreme/tetraodon/), o paulistinha Danio rerio
(www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/) e o medaka Oryzias latipes (Shima et al., 2003).
Apesar dos Perciformes compreenderem aproximadamente 25% de todos os
vertebrados, eles não têm sido o foco de qualquer projeto de seqüenciamento de
genoma (Kocher et al., 2003).
Dentre os ciclídeos estudados até o momento, a espécie O. niloticus, devido ao
seu valor econômico e sua facilidade adaptativa, tornou-se um excelente modelo
experimental para estudos em genética. Esta espécie apresenta n=22 cromossomos
(Kornfield et al., 1979) (Figura 5) e 1,2 picogramas de DNA por núcleo haplóide (cerca
de 109 pares de bases) (Hinegardner e Rosen, 1972). Existe um mapa genômico de
Tilapiinae baseado em microssatélites e AFLPs (Amplified Fragment Length
Polymorphisms) de O. aureus, O. mossambicus e Sarotherodon galilaeus (Agresti et
al., 2000), bibliotecas genômicas para as espécies O. niloticus (Katagiri et. al., 2001),
Haplochromis chilotes (Watanabe et. al., 2003), mapas de ligação a partir de
microssatélites e AFLPs para a espécie O. niloticus (Kocher et. al., 1998; Lee et al.,
2005), mapa físico cromossômico de sequências repetidas de DNA em O. niloticus
(Martins et. al., 2004) e mapa físico cromossômico de BACs (Bacterial Artificial
Chromosomes) contendo seqüências repetidas de DNA da tilápia do Nilo (Ferreira e
Martins, 2008).
17
Os trabalhos de mapeamento físico cromossômico têm utilizado a técnica de
hibridização in situ fluorescente (FISH) para a análise da distribuição genômica de
seqüências de cópia única e de seqüências repetidas de DNA. As seqüências
repetidas constituem uma classe importante de marcadores de grande valor para a
citogenética molecular. Estudos das seqüências repetitivas de DNA têm-se mostrado
úteis no esclarecimento de uma miríade de questões, incluindo estrutura centromérica
e telomérica, origem e evolução de cromossomos sexuais e cromossomos B e
evolução do genoma como um todo. Tais seqüências podem ser usadas também para
o mapeamento físico do genoma, contribuindo para o desenvolvimento de marcadores
genéticos importantes para a biologia básica e aplicada das espécies (Galetti e
Martins, 2004).
Quanto ao mapeamento cromossômico em O. niloticus, diferentes estudos têm
demonstrado a existência de grande quantidade de seqüências repetitivas no par
cromossômico de maior tamanho dessa espécie (Oliveira et al., 1999, 2003; Harvey et
al., 2003; Ferreira e Martins, 2008).
Fig. 5– Cariótipo da Tilápia do Nilo ( Oreochromis niloticus). SM, cromossomo submetacêntrico, ST/A,,
cromossomos subtelo- acrocêntricos.
O maior par cromossômico de O. niloticus apresenta um não pareamento
durante a meiose e foi identificado como possível par sexual de um sistema XX/XY
(Carrasco et al., 1999). Outras evidências apontam-no como par cromossômico
sexual: análises revelam que ele é rico em seqüências repetidas de DNA e apresenta
o braço longo rico em heterocromatina (Majundar e McAndrew, 1986; Oliveira et al.,
1999, 2003; Harvey et al., 2003; Ferreira e Martins, 2007).
Entre os tilapiíneos, foram identificados ao menos dois locos principais
envolvidos na determinação sexual. Por meio de análises de FISH, demonstrou-se que
esses locos estão separados em cromossomos não homólogos. A utilização de
18
diversos marcadores moleculares apontam que o grupo de ligação 3 (LG3) localiza-se
no maior cromossomo da tilápia do Nilo e o marcador LG1 em um cromossomo menor.
Esses dois locus também diferem no modo de ação sendo o loco do LG1 um
determinador dominante masculino (XY) enquanto o loco LG3 um marcador dominante
feminino (ZW). Analisando a herança dos alelos ligados a determinação sexual, foi
possível verificar que o sexo heterogamético é diferente entre as espécies de
tilapiíneos e que há dois diferentes locus e não alelos para um simples locus de
determinação sexual. Acredita-se que esses dois locus contribuam para a
determinação sexual em algumas espécies (Cnaani et al., 2008). Por causa da não
total explicação das diferenças entre as proporções das progênies de tilapiíneos,
sugere-se um modelo mais complexo de cromossomos sexuais argumentando-se que
locus autossômicos também participam da determinação sexual (Hammerman e
Avtalion, 1979).
Citogeneticamente, o cromossomos portados do LG3 possui as características
de um cromossomo sexual relativamente antigo em O. niloticus, com uma ampla
região com supressão de recombinação e um acúmulo de elementos repetidos
(Cnaani et al., 2008). Foi relatado também um retardo no pareamento meiótico
(Carrasco et al., 1999) e o acúmulo de elementos repetitivos como transposons e
retrotransposons (Oliveira et al., 1999; 2003; Harvey et al., 2003; revisado em Martins
et al., 2004; Ferreira e Martins, 2007), como já mencionado. Sugere-se que a
supressão de recombinação e o pareamento incompleto do cromossomo maior (LG3)
em espécies como O. niloticus, espécie no qual os loci de determinação sexual estão
localizado no LG1, pode refletir uma história evolutiva inicial do cromossomo maior
como um cromossomo sexual diferenciado (Cnaani et al., 2008).
Acredita-se que o estado ancestral do clado Oreochromis spp. foi um sistema
com uma fêmea heterogamética com o maior locus determinante de sexo localizado
no LG3, como visto hoje em Oreochromis aureus e Oreochromis karongae (Cnaani et
al., 2008). O locus LG1 pode possuir um gene secundário de determinação sexual o
qual permaneceu polimórfico durante a diversificação do gênero Oreochromis. Em
poucas linhagens este gene parece ter tomado controle da via de determinação
sexual, mudando o mecanismo da via de determinação sexual de fêmea para machos
heterogaméticos. Talvez uma nova mutação em um locus de determinação sexual
tenha mudado-o, mudando conseqüentemente o sexo heterogamético (Cnaani et al.,
2008), como observado em Drosophila melanogaster (Pomiankowski et al., 2004).
Embora avanços tenham sido obtidos em relação ao mapeamento genético de
loci relacionados a sexo nas tilápias, as análises não foram ainda extrapoladas para a
citogenética. Dessa forma, o mapeamento físico do cromossômico de marcadores
19
presentes nos grupo de ligação 1 e 3, assim como de marcadores contendo
seqüências repetidas de DNA, podem trazer grandes contribuições ao entendimento
da origem e evolução dos cromossomos sexuais nestes organismos.
1.3. Hibridação in situ genômica (GISH) e seu potencial nos estudos de
evolução do genoma
Desde a publicação da primeira detecção de seqüências de DNA em
cromossomos e células de Xenopus por hibridização in situ (ISH), utilizando-se uma
sonda de RNAr 18S e 28S (Pardue e Gall, 1969), uma série de variações têm sido
criadas para esta técnica como o uso de fluoróforos na detecção das sondas e dos
cromossomos, uso DNA genômico como sonda (Genomic in situ Hybridization), FISH
com duas ou mais sondas hibridizando simultaneamente e diferencialmente marcadas,
CGH (Comparative Genomic Hybridization), Pintura cromossômica [Whole
Chromosome Painting (WCP) ou Partial Chromosome Painting (PCP)], SKY (Spectral
Karyotyping), M-FISH (Multicolor FISH), MCB (Chromosome multicolor banding),
sondas gênicas, sondas de seqüências repetidas, sondas de miRNA (micro RNA) e
outros tipo de RNA. Além disso, algumas das variações podem ser aplicadas em
células interfásicas, fibras de cromatina, cromossomos mitóticos e meióticos, tecidos e
até em embriões (Pinkel et al., 1986; Raap et al., 1996; Schröck et al., 1996; Stace e
Bailey, 1999; Liehr et al., 2002; Tönnies, 2002; Guerra, 2004; Padilla-Nash et al., 2007;
Schröck et al., 2006; Palevitch et al., 2007; Wheeler et al., 2007). Embora a FISH
venha sendo usada nos mais diversos organismos, os avanços são mais notórios em
plantas e mamíferos.
A técnica de GISH foi originalmente desenvolvida para linhagens de células
hibridas animais (Pinkel et al., 1986), porém o termo foi cunhado em um trabalhado
realizado em planta (Schwarzacher et al., 1989). Esta técnica envolve a extração de
DNA total de um organismo, o qual é utilizado como sonda para hibridação in situ em
uma célula alvo de outro organismo (Stace e Bailey, 1999).
A técnica de bloqueio pode também ser usada, por meio do qual a sonda é
misturada com um excesso de DNA não marcado de um genoma não alvo
(bloqueador), o que permitirá que hibridem apenas as seqüencias específicas do
genoma alvo (especialmente as porções contendo elementos repetidos dispersos,
como elementos transponíveis). A quantidade de bloqueador pode ser um fator crítico
para o experimento. Se o genoma alvo for muito divergente do genoma utilizado como
sonda, nenhum bloqueador necessita ser utilizado. No entanto, alguns trabalhos
utilizam até uma relação de 1:100 de sonda/bloqueador (revisado em Stace e Bailey,
1999; revisado em Kato et al., 2005).
20
A GISH pode ser utilizada também em células em qualquer estágio da divisão,
tanto em meiose quanto em mitose e, em alguns casos, os resultados são
semelhantes à FISH utilizando-se sondas de elementos repetidos dispersos por todo o
genoma (Lapitan et al., 1986; revisado em Stace e Bailey, 1999).
A GISH tem sido aplicada a quatro linhas principais de investigação:
1- Disposição dos cromossomos – A GISH essencialmente relaciona-se à
células híbridas somáticos ou sexuais, bem como poliplóides, em que dois ou mais
genomas diferentes ocorrem juntos na célula. Nesse caso, esta técnica pode ajudar a
identificar domínios cromossômicos ou genômicos (revisado em Stace e Bailey, 1999);
2- Identificação de genomas – A GISH pode ser usada para identificar
diferentes genomas em poliplóides naturais (Benabdelmouna et al., 2001; Guimarães
et al., 2008), artificiais (revisado em Stace e Bailey, 1999), híbridos somáticos (Zhao et
al., 2008), anfidiplóides (Chen e Wu, 2008) e anfiplóides parciais (Sepsi et al., 2008).
Nestes casos, os diferentes genomas podem ser distinguidos utilizando-se
simultaneamente sondas dos supostos genomas ancestrais. O uso de diferentes
fluoróforos em cada suposto genoma ancestral produz várias cores nos cromossomos
alvos (revisado em Stace e Bailey, 1999);
3- Reconhecimento de partes do genoma – A GISH é igualmente efetiva
na detecção de cromossomos sem um par ou segmentos de cromossomos em células
de outro organismo. Como exemplo pode-se identificar cromatina alien em um
organismo (Wetzel e Rayburn, 2000), o qual pode ser parte de cromossomos ou até
um cromossomo inteiro, através do uso de DNA genômico proveniente da espécie de
outra natureza em híbridos interespecíficos (revisado em Stace e Bailey, 1999; Zhou et
al., 2008). Recombinações e translocações intergenômicas (Bi e Bogart, 2006; Bi et
al., 2007) ou recombinações intergenômicas em células híbridas ou anfidiplóides
contendo dois ou mais genomas podem também ser demonstrados por GISH
(revisado em Stace e Bailey, 1999);
4- Cromossomos B – A GISH parece ideal para a investigação da origem
dos cromossomos B. Têm-se demonstrado que o cromossomo B pode ser
parcialmente ou completamente marcado com uma sonda genômica da mesma
espécie, porém sem B (revisado em Stace e Bailey, 1999; Endo et al., 2008).
Além dos usos descritos acima, esta técnica foi também usada para investigar
a conservação genômica de um grupo e detectar regiões espécie-especifica entre os
genomas de Didelphidae (marsupiais da América) (Svartman e Vianna-Morgante,
1999).
No presente trabalho utilizou-se a técnica de GISH com o objetivo de detectar
regiões espécie-específica no genoma do ciclídeo Oreochromis niloticus, em
21
comparação com o genoma de ciclídeos africanos e sul-americanos, os quais foram
utilizados como DNA bloqueador das regiões em comum com o DNA genômico total
da tilápia nilótica (utilizada como sonda).
22
2. Objetivo
Rastrear regiões espécie-específicas da espécie de Ciclídeo Africano
Oreochromis niloticus com o uso de uma variação da técnica de citogenética
molecular, a Genomic in situ Hybridization, e investigar o grau de conservação do
genoma de O. niloticus em relação a outras espécies de ciclídeos.
23
3. Material e métodos
3.1. Material Biológico
Foram utilizadas no presente trabalho as espécies apresentadas na tabela 1.
Tabela 1- Espécies analisadas no presente trabalho.
Espécies Utilização Grupo
Oreochromis niloticus Sonda, alvo e DNA bloqueador
ciclídeos africanos
Oreochromis karongae DNA bloqueador
Oreochromis aureus DNA bloqueador
Sarotherodon galilaeus DNA bloqueador
Haplochromis obliquidens DNA bloqueador
Hemichromis bimaculatus DNA bloqueador
Astronotus ocellatus DNA bloqueador
ciclídeos sul-americanos Geophagus brasiliensis DNA bloqueador
Crenicichla sp. DNA bloqueador
Aequidens tetramerus DNA bloqueador
Os espécimes foram mantidos em aquário aerado até o momento das
preparações cromossômicas e coleta de tecido para extração de DNA. A partir do
material coletado foram preparadas suspensões celulares para análises de
cromossomos mitóticos sendo também retiradas amostras de tecido (fígado ou
músculo) fixadas e estocadas em álcool 100% a -20° C para posterior extração de
DNA. Os exemplares foram fixados em formol 4% e conservados em álcool 70% para
armazenamento.
3.2. Obtenção dos cromossomos mitóticos através de preparações diretas
Os cromossomos mitóticos foram obtidos de acordo com a metodologia
adaptada para peixes por Bertollo et al. (1978). A espécie utilizada para as
preparações cromossômicas foi o ciclídeo africano Oreochromis niloticus (tilápia do
Nilo)
1. Injetar intraperitonealmente colchicina 0,0025% na proporção de 0,1 ml para
cada 100 g de peso do animal;
2. Deixar o peixe em aquário bem aerado por 40 minutos. Em seguida sacrificá-
lo e retirar a porção anterior do rim transferindo-o para uma solução hipotônica de KCl
0,075 M (6-8 ml);
3. Misturar bem o tecido com o auxílio de uma seringa de vidro. Retirar o
sobrenadante (suspensão celular) com o auxílio de uma pipeta Pasteur e colocar em
tubo de centrífuga;
4. Incubar a suspensão celular obtida em estufa a 37 °C por 23 minutos;
24
5. Pré-fixar com 6 gotas de metanol:ácido acético (3:1) e ressuspender o
material pipetando bem devagar por 100 vezes;
6. Deixar descansar por 5 minutos, adicionar fixador até encher o tubo e
posteriormente realizar a ressuspensão;
7. Centrifugar a 800 rpm por 10 minutos. Descartar o sobrenadante e completar
para 6ml com fixador pipetando por mais 100 vezes;
8. Centrifugar a 1.000 rpm por 10 minutos, descartar o sobrenadante e
completar novamente para 6ml de fixador, repetindo essa lavagem por mais duas
vezes;
9. Após a última lavagem, ressuspender o material em fixador até que tome um
aspecto um pouco turvo;
10. 24 horas antes da GISH, pingar 200 µl da preparação em uma lâmina pré-
aquecida em água destilada a 60°C 24 horas antes da GISH. Acondicionar o material
em uma estufa a 37 °C.
3.3. Extração de DNA de tecidos sólidos
A extração de DNA foi realizada segundo Sambrook e Russel (2001) com
pequenas modificações.
1. Secar o tecido (fígado ou músculo) em papel toalha a fim de retirar o
excesso de etanol;
2. Macerar em um cadinho contendo nitrogênio líquido aproximadamente
0,045g de tecido. A grande quantidade de DNA exigido justifica a grande
quantidade de tecido a ser utilizada na extração;
3. Acrescentar 10 ml da solução de digestão (NaCl 0,4 M; EDTA 0,1 M pH 8,0;
Proteinase K 100µg/ ml; SDS 0,1%) e homogeneizar com a ajuda de um
macerador;
4. Transferir o material para dois tubos Falcon de 15 ml, incubar em banho-
maria a 50 °C até dissolver todo o tecido restante. Homogeneizar o material
periodicamente;
5. Dobrar o volume com uma solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico
(50:48:2) e agitar suavemente por 15 minutos;
6. Centrifugar a 5.000 rpm por 5 minutos e transferir a fase superior para
novos tubos;
7. Repetir o passo 5 e posteriormente adicionar 1/20 de NaCl 1 M, dois
volumes de etanol 100% gelado e agitar suavemente até homogeneizar a
mistura;
8. Centrifugar a 5.000 rpm por 15 minutos e descartar o sobrenadante;
25
9. Secar em estufa e 37°C e eluir em 100-500 µl de água MilliQ estéril;
10. Unir as duas extrações para cada amostra em um único tubo eppendorf;
11. Adicionar 1 µl de RNAse 10mg/ml:50 µl de amostra;
12. Incubar a 37°C por 1h;
13. Incubar a 65°C por 10 minutos .
3.4. Análise qualitativa do DNA
1. Misturar 3 µl de cada amostra com 1 µl de Blue Green Loading Dye I (LGC
Biotecnologia) e aplicar em um gel de agarose 0,8% em TAE 1x;
2. Realizar a eletroforese por aproximadamente 40 minutos à 100 W;
3. Visualizar em transluminador UV com epi-iluminação de 250-300 nm.
As extrações devem demonstrar um alto peso molecular, pouca degradação e
nenhum excesso de RNA.
3.5. Preparação do DNA de bloqueio
Todas as espécies serviram como DNA bloqueador nos experimentos (tab 1).
Os DNAs bloqueadores devem possuir de 200-500 pb, a fim de facilitar o
bloqueio das seqüências em comum com a sonda.
1. Deixar a tampa do eppendorf semi-aberta e fixá-la com uma fita;
2. Inserir os eppendorfs em um Becker com papel toalha a fim de deixá-los em
posição vertical;
3. Autoclavar as amostras a 1Kgf/cm2 por 12 minutos ;
4. Verificar a fragmentação do DNA em gel de agarose 1% em TAE1x;
5. Repetir o passo 3 até que todos os bloqueadores atinjam de 200-500 pb.
3.6. Análise quantitativa do DNA
1. Analisar 1 µl de todas as amostras (tab. 1) em um espectofotômetro Thermo
Scientific NanoDropTM 1000.
A quantificação pode ser realizada em outros espectofotômetros, porém uma
boa quantificação é primordial para o sucesso desses experimentos, visto que
pequenos erros na quantificação podem ser desastrosos no final, devido à relação
DNA bloqueador/sonda ser alta.
3.7. Marcação da sonda e inserção do DNA bloqueador
A espécie Oreochromis niloticus fora utilizada com sonda em todos os
experimentos e seu DNA foi marcado pelo procedimento de nick translation.
1. Adicionar 1000 ng de DNA genômico total em tubo Eppendorf;
26
2. Adicionar 5,0 µl de dNTPs Mix (0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM
dTTP, 0,4 mM dATP e 0,4 mM dATP biotinilado [Biotin-14-dATP(Invitrogen)]
0,5 µl de DNA polimerase tipo I [DNA Polymerase I 5U/ µl (Roche)] , 0,5 µl
de DNase I [DNase I 4 kU 0,001x (GE Healthcare)] e água Mili-Q
autoclavada em quantidade suficiente para 25 µl. Misturar e centrifugar
rapidamente para recolher o líquido no fundo do tubo.
3. Incubar1 em termociclador a 16°C por 42 minutos ;
4. Adicionar rapidamente 5,0 µl de stop buffer (EDTA 0,5 M pH 8,0) a fim de
interromper a reação de marcação. Adicionar o DNA de bloqueio na
proporção desejada2, 1/10 de Acetato de Sódio 3 M, dobrar com etanol
100% e homogeneizar suavemente;
5. Precipitar a -20°C por 2h;
6. Centrifugar 15.000 rpm por 15 minutos a 4°C, d escartar o sobrenadante e
secar em uma estufa a 37°C;
7. Adicionar 6 µl de água Mili-Q autoclavada, agitar e deixar eluir durante 14
horas a 4°C.
No final desse procedimento, haverá aproximadamente 1.000 ng de sonda
marcada com biotina e aproximadamente 45x de DNA bloqueador, uma relação de
1:45.
A marcação também pode ser realizada através de kits disponíveis
comercialmente, seguindo as especificações do fabricante.
3.8. Hibridação in situ Fluorescente – FISH
3.8.1. Desnaturação dos cromossomos mitóticos
1. Desidratar a lâmina, preparada com 24 h de antecedência, em etanol 70%,
85% e 100%, gelados, por 5 minutos cada. Secar a temperatura ambiente (TA);
2. Desnaturar as lâminas por 42 segundos em uma solução contendo
formamida 70% e 2x SSC (solução salina de citrato de sódio) pH 7,0 a 67°C;
3. Transferir a lâmina rapidamente para etanol 70%, 85% e 100% gelados, por
2 minutos cada. Secar a TA;
1- A sonda deve possuir de 200-500 pb e para estipular o tempo necessário de incubação para a amostra, realizar o procedimento descrito e aplicar posteriormente 3 µl em um gel de agarose 1% em TAE1X. Tal procedimento é dispensável após estipular o tempo ideal de incubação.
2- No caso, a quantidade de DNA bloqueador foi de 45.000 ng, ou seja, 45x a quantidade de sonda.
27
4. Verificar a desnaturação em microscópio ótico com o condensador baixo.
Caso necessário, realizar novamente os passos 2 e 3, até que a desnaturação seja
completada;
3.8.2. Desnaturação da solução sonda/DNA bloqueador e hibridação
1. Adicionar no tubo contendo sonda/DNA bloqueador 15 µl de formamida
100% (concentração final de 50%), 6 µl de sulfato de dextrano 50% (concentração
final 10%) e 3 µl de 20x SSC (concentração final de 2x SSC). Homogeneizar e
centrifugar 10 segundos;
2. Desnaturar no termociclador a 95°C por 5 minutos ;
3. Transferir imediatamente ao gelo;
4. Aplicar todo o conteúdo em uma lamínula 24X40 limpa e inverter
vagarosamente a lâmina sobre a lamínula a fim de não formar bolhas;
5. Manter a lâmina com o material voltado para baixo em uma câmara
umedecida com 2xSSC e incubar em uma estufa a 37°C overnight.
3.8.3. Lavagem pós-hibridação, detecção e contra-coloração
1. Remover a lamínula cuidadosamente e lavar a lâmina em 2x SSC, pH 7,0, a
72°C por 5 minutos . Aquecer o SSC previamente e la var sem agitação;
2. Transferir a lâmina em uma solução 1x PBD3 a 45°C por 2 minutos;
3. Adicionar em um tubo 26 µl de Tampão C (0,1 M bicarbonato de sódio, pH
8,5 e 0,15 M de NaCl), 4 µl de Avidina-FITC (0,01mg/ml), homogeneizar, centrifugar
rapidamente, adicionar todo o volume sobre uma lamínula 24x60, limpa, e inverter a
lâmina sobre a lamínula. Incubar em câmara úmida a 37°C por 30 minutos ;
4. Remover a lamínula cuidadosamente e lavar com agitação moderada 3
vezes em 1x PBD a 45°C por 2 minutos ;
5. Adicionar em um tubo 1 µl de Anti-avidina [Monoclonal Anti-Avidin Biotin
Conjugate (Sigma)], 19 µl de 1xPBD, misturar gentilmente, centrifugar rapidamente,
adicionar todo o volume sobre uma lamínula 24x40 limpa e inverter cuidadosamente a
lâmina sobre a lamínula. Incubar em câmara úmida a 37°C por 10 minutos ;
6. Repetir o passo 4;
7. Repetir o passo 3;
8. Repetir o passo 4;
9. Adicionar em um tubo 20 µl de meio de montagem (Vectashield) e 0,7 µl de
iodeto de propídio (50µg/ml). Misturar e adicionar sobre uma lamínula 25x60 limpa e
inverter a lâmina sobre a lamínula;
3- Para 100 ml de 1x PBD, utilizar 20 ml de 20xSSC, 1 ml Triton X100, 1 g leite em pó desnatado e completar com água destilada. Como são feitas 10 lavagens e cada lavagem utiliza 60 ml, preparar 600 ml para cada experimento.
28
10. Acondicionar a lâmina a 4°C por poucos dias ou a -20°C por um período
mais prolongado, até a análise em microscopia fluorescente.
3.9. Genomic in situ Hybridization (GISH)
O procedimento de GISH procedeu-se utilizando a metodologia descrita acima
(tópicos 3.5-3.8).
Os alvos e sondas sempre foram oriundos de uma mesma espécie, a O.
niloticus. Porém, se simplesmente esta sonda marcada fosse hibridizada sem o uso de
um DNA bloqueador, não seria possível rastrear nenhuma região espécie-específica.
Contudo, usamos todos os ciclídeos listados na tab. 1 como um DNA bloqueador e
sendo assim, pela dinâmica do DNA, as regiões em comum entre alvo e bloqueador
são renaturadas durante a hibridação e as seqüencias da sonda que não encontrarem
similaridade com o bloqueador ficam livres para encontrar o seu alvo. Isso possibilita
que o rastreamento de regiões espécie-específicas de O. niloticus, em comparação
com o bloqueador, torne-se possível.
3.9.1. Controle experimental
1. Experimentos de GISH para controle foram realizados de duas maneira: (i)
com sonda marcada de O. niloticus sobre uma preparação de cromossômica mitótica
de O. niloticus e sem o uso de um DNA bloqueador (controle positivo); (ii) com sonda
marcada de O. niloticus sob uma preparação de cromossômica mitótica de O. niloticus
com o uso de um DNA bloqueador oriundo da espécie O. niloticus (controle negativo).
3.10. Análise das hibridações e processamento das imagens
1. Analisar as hibridações em um microscópio de fluorescência com os filtros
para FITC e iodeto de propídio;
2. Processar as imagens no software Adobe Photoshop CS2;
3. As medidas cromossômicas são realizadas a partir do centrômero utilizando-
se o software Image Tool. Realizou-se ao menos duas medidas para cada braço e
subseqüente fora feito uma média para cada um dos mesmos. Quando possível, foi
realizada ao menos duas medições para cada cromátide e com subseqüente cálculo
de média para cada uma das cromátides e posteriormente cálculo de média para cada
um dos braços;
4. Os cromossomos foram arranjados em ordem decrescente de tamanho e
baseados em uma classificação segundo o índice centromérico (IC=braço
px100/tamanho total do cromossomo). A alocação correta de cada cromossomo foi
baseada em uma ordenação prévia de um cariograma corado com Giemsa 2% à 10
29
minutos. Isso garantiu que os cromossomos possuíssem as mesmas posições nos
diferentes cariogramas.
3.11. Análise dos sinais
As diferenças de sinais entre cromossomos e entre cariogramas foram feitas
por uma análise visual, através da identificação de sinais mais evidentes,
medianamente evidentes e menos evidentes.
3.12. Análise estatística
1. A extensão do sinal da hibridação foi realizada com o software Image Tool.
Foram realizadas medições em toda a extensão de cada sinal de hibridação com
subseqüente cálculo de média para cada um dos mesmos. Foi considerado um sinal
apenas as marcações evidentes e características de uma FISH;
2. Foi realizado cálculo de porcentagem de hibridação para cada um dos
cariogramas, onde:
∑ tamanho total do lote diplóide = tamanho total do genoma de O. niloticus
(100%) no cariograma
∑ cobertura total da hibridação do lote diplóide = tamanho total das região
exclusivas do genoma de O. niloticus em comparação com a espécie bloqueio em
questão (X%).
Esses “tamanhos” não remetem o tamanho do genoma em números de
nucleotídeos;
3. As diferenças entre cada espécie usada como DNA bloqueador e O. niloticus
foram feitas por meio da somatória do comprimento dos braços horizontais seguindo a
filogenia apresentada por Smith et al. (2008). Posteriormente, cada distância foi
convertida em número de transformações, sendo que dez transformações
correspondem a 3,49 mm [(barra de calibração apresentada em Smith et al. (2008), a
qual corresponde a combinação de dados genéticos e morfológicos].
4. Através do software Excel foram realizadas análises de dispersão em que no
eixo X foram dispostos os números de transformações e em Y as percentagens de
hibridação. Foram calculados ainda o coeficiente de correlação de Pearson (r), o
coeficiente de determinação (R2) e a relação entre as duas variáveis (X e Y) por meio
de regressão (y = a+bx). O melhor ajustamento da curva foi feito seguindo o método
de mínimos quadrados.
30
4. Resultados e discussão
Os resultados e discussão são apresentados a seguir no formato de manuscrito
a ser enviado a revista científica da área de genética e citogenética.
31
Comparative cytogenetics of cichlid fishes through genomic in situ
hybridization (GISH) with emphasis in Oreochromis niloticus
Guilherme T. Valente and Cesar Martins
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual
Paulista - UNESP, Botucatu, SP, Brazil.
Keywords: Cichlidae, repeated DNAs, chromosome, heterochromatin,
evolution
Corresponding author and reprint request: Cesar Martins, UNESP -
Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia,
CEP 18618-000, Botucatu, São Paulo, Brazil. Telephone/Fax: ++55(14)38116264
e-mail: [email protected]
32
Abstract
The Cichlidae family is the most species-rich group of Perciformes order. This group
captures the attention of aquarium hobbyists, sport fishing and feeding, being
Oreochromis niloticus the most important in aquaculture today. In addition, this species
is currently used in studies for different areas and it has been upped to a level of
‘experimental model’ for the family. Cytogenetic analyses of the cichlids species are
still incipient, although O. niloticus has been characterized using classical and
molecular cytogenetics techniques, with special attention to the heterochromatin.
These studies have revealed that the long arm from the longest chromosome pair and
the pericentromeric regions are rich in heterochromatin and repetitive sequences. The
observation of the sinaptonemal complex and through molecular cytogenetic tools have
shown that probably the first chromosome is the sex bivalent of the species. In this
study was realized a comparison between the genome of O. niloticus and other
cichlids, from South America and Africa, using the GISH technique. The results have
shown that at least some elements, contained in the pericentromeric heterochromatin
of Nile tilapia are species-specific, and a large part of the long arm of the largest
chromosome pair presents sequence conservation within the Tilapiini tribe (composed
of the genus Tilapia, Oreochromis and Sarotherodon). It was also observed that the
genome of O. niloticus [compared with non-tilapiines tribes] is more similar to the
genome of Hemichromis, regarding for repetitive elements. It has been observed that
the largest chromosome pair is rich in repetitive sequences and because this it has
supposed to be the sex chromosome or this accumulation is resultant of a
chromosome fusion. Our observations have demonstrated that the heterochromatic
region of the 1q apparently became specific to the tribe Tilapiinae.
Keywords: Cichlidae, repeated DNAs, chromosome, heterochromatin, evolution.
33
Introduction
Cichlids represent the most species-rich group of Perciformes and in fact of all
vertebrates, and comprise more than 3,000 living species (Stiassny, 1991; Zardoya et
al., 1996; Chakrabarty, 2004; Kocher, 2004; Sparks and Smith, 2004; Nelson, 2006).
Only the African continent has more than 1,500 species and the greater diversity
among this family is found in the Great Lakes of East Africa (Victoria, Tanganyika and
Malawi (Trevawas, 1983; Turner and Genner, 2005). Almost 2,000 species of cichlids
have evolved in a short evolutionary time (approximately 10 million years) and they
have attracted the attention of researchers for various reasons (Kocher, 2004). For
instance, approximately 500 species of cichlids that colonized the Lake Victoria have
evolved from some few ancestrals in the last 100,000 years (Verheyen et al., 2003).
Thus, cichlid fishes have attracted an increasing scientific interest because of their
rapid adaptive radiation leading to an extensive ecological diversity and enormous
importance to tropical and subtropical aquaculture.
The family Cichlidae represents a monophyletic group and the limits and
interrelationships of all four subfamilies [Etroplinae (Indian), Ptychochrominae
(Malagasy), Cichlinae (Neotropicals) and Pseudocrenilabrinae (African)] were well
supported based on molecular and morphological data (Smith et al., 2008). The African
(Pseudocrenilabrinae) and Neotropical (Cichlinae) cichlids are both monophyletic and
represent sister groups (Smith et al., 2008). The African cichlids are often distributed in
the groups pelmatochromine, haplochromine and tilapiine (Lowe-McConnell, 1999), but
these groups are not recognized as valid taxonomic units. The Neotropical cichlids
(Cichlinae) are monophyletic and composed of 51 genera and 406 described species
(Kullander, 1998, 2003). The most recent proposed phylogeny of the group recognizes
the tribes Cichlini, Retroculini, Astronotini, Chaetobranchini, Geophagini,
Cichlasomatini and Heroini as part of the Cichlinae clade (Smith et al., 2008).
Most genetic/genomic information concerning cichlids are related to the Nile
tilapia Oreochromis niloticus and most species are poorly known. Despite the
morphological and ecological diversity of cichlid fishes, chromosome information in
known for 135 species and most cytogenetic data are only related to the determination
of haploid/diploid chromosome number. The African cichlids have a modal diploid
number of 44 chromosomes whereas the Neotropical cichlids 2n=48 chromosomes
(Feldberg et al., 2003). The mechanisms of chromosome evolution that have acted
during the karyotype diversification of cichlids are still uncertain and the application of
34
molecular cytogenetic techniques seems to be very promising in the clarification of the
chromosome evolution in the group.
Since the first publication of in situ detection of DNA sequences in the
chromosomes by hybridization (Pardue and Gall, 1969), a lot of variations of this
technique have been described. Genomic in situ hybridization (GISH) represents one
of these variations which consists in the use of whole genomic DNA of an organism
that is used as probe to hybridize to the target chromosomes of another organism.
GISH technique has been applied to the investigation of several topics in cytogenetics,
such as chromosome disposition in the genome, genomic identification, recognition of
part of genomes, B chromosomes, comparative cytogenetics and genomics (revised by
Stace and Bailey, 1999, Svartman and Vianna-Morgante, 1999).
In order to advance improve the knowledge of the organization of cichlid
genomes, we applied the GISH technique for purposes of comparative cytogenetics in
the group. Considering that some cichlid species are having their genomes completely
sequenced (The International Cichlid Genome Consortium, 2006), the economical
interest and the extraordinary evolution of this group, the cytogenetic information
provided here will be very useful in supplying genetic information at the chromosomal
level that can contribute expand the knowledge on cichlid biology.
35
Materials and methods
Biological samples, DNA extraction and chromosome preparation
The species used in the present study and their geographic origin are described
in Table 1. Oreochromis niloticus was the reference species used and its DNA was
used as probes against its own chromosomes. The DNA of the other cichlids were
used as blocking DNAs to block the hybridization of similar nucleotide sequences that
exists between O. niloticus and the other cichlids.
Table 1: Species analyzed and their origin.
Species Application Origin of specimens
African cichlids
Oreochromis niloticus Probe, chromosome
preparation and
blocking DNA
Tietê River, Botucatu, SP, Brazil
Oreochromis karongae Blocking DNA Institute of Aquaculture, University of
Stirling, Stirling, Scotland
Oreochromis aureus Blocking DNA Institute of Aquaculture, University of
Stirling, Stirling, Scotland
Sarotherodon galilaeus Blocking DNA Institute of Aquaculture, University of
Stirling, Stirling, Scotland
Haplochromis obliquidens Blocking DNA Aquarium Shop, Botucatu, SP, Brazil
Hemichromis bimaculatus Blocking DNA Aquarium Shop, Botucatu, SP, Brazil
South American cichlids
Astronotus ocellatus Blocking DNA Tietê River, Botucatu, SP, Brazil
Geophagus brasiliensis Blocking DNA Unknown
Crenicichla sp. Blocking DNA Unknown
Aequidens tetramerus Blocking DNA Unknown
Genomic DNAs of the species listed in Table 1 were extracted according to
standard phenol–chloroform procedures (Sambrook and Russel 2001). Mitotic
chromosomes of O. niloticus were prepared from anterior kidney cells with in vivo
colchicine treatment (Bertollo et al., 1978) and were submitted to GISH according to
the protocol described bellow.
Blocking DNAs and probe
DNA samples used for blocking were fragmented to 200-500 bp though
autoclavage of 1 Kgf/cm2 for at least 12 minutes. The DNAs used as probe and for
36
blocking were quantified in the spectrophotometer Thermo Scientific NanoDropTM
1000.
Genomic in situ hybridization (GISH)
Oreochromis niloticus DNA was used as a probe in all experiments after nick
translation labeling with biotin 14-dATP (BioNickTM Labeling System Invitrogen)
according to the specifications of the supplier. The chromosomal DNA was denatured
in 70% formamide/2x SSC pH 7,0 for 42 seconds at 67ºC pH 7. Hybridization mixtures
containing 1µg of biotin-labelled DNA probe, 45 µg of blocking DNA (1:45
probe/blocking DNA), 10 mg/ml dextran sulfate, 2xSSC, and 50% formamide in a total
volume of 30 µl were denatured for 5 minutes at 95ºC and dropped on chromosome
preparation. The hybridization was performed overnight at 37ºC in a 2xSSC moist
chamber and after was made one washing in 2xSSC at 5 minutes at 72ºC. Detection of
hybridized probes was carried out with 0.07% avidin-FITC conjugate (Sigma) in C
buffer (0.1 M NaHCO3 pH 8.5, 0.15 M NaCl) for 30 min followed by a signal
amplification using 5% anti-avidin biotin conjugate (Sigma) in blocking buffer (4xSSC,
0.5% triton and 1% nonfat dried milk) for 10 minutes, and then followed again by a
treatment with avidin-FITC for 10 minutes at 37ºC. Both treatments were conducted in
a 2xSSC moist chamber at 37 ºC and after each amplification step, the slides were
washed three times for 2 minutes each in blocking buffer at 45ºC. Chromosomes were
counterstained with propidium iodide (PI) (0.2%) diluted in antifade (Vectashield).
GISH using the O. niloticus probe and target and no blocking DNA, and a GISH
using the same specie like probe, target and blocking DNA, were made like positive
control for probe and blocking DNA respectively of the GISH experiments.
Amount of blocking DNA
The amount of blocking DNAs used for GISH can vary from 1-100 times (revise
by Stac and Bailey, 1999) and in the present study the quantity of blocking DNA was
adjusted using the genome of G. brasiliensis. Different amounts of blocking DNAs
varying from 10-50 µg (10-50 times the amount of probe DNA) were used in GISH
experiments and 45 µg proved to be more efficient to block the similar nucleotide
sequences in the genome of O. niloticus generating species-specific signals in this
species.
37
GISH signal analysis
Hybridized chromosomes were analyzed under an Olympus BX 61 microscope
and the images captured with a digital camera Olympus DP70 with the software Image-
Pro MC 6.0. The images were processed with the program Adobe Photoshop CS2 and
the chromosome arms were measure twice with the software Image Tool.
Chromosomes were arranged in decreasing size of according to Ferreira and Martins
(2008).
Based on signal intensity three patterns of signals were considered strong,
medium and low.
Statistical analysis
The extension of the hybridized signals were estimated in relation to the whole
extension of the chromosomes with the software Image Tool: the whole extension of
the chromosomes of O. niloticus was defined as 100% and the extension of the
hybridized segments was defined as a percentage of the O. niloticus genome that
hybridizes after blocking with the DNA of other cichlid species.
The evolutionary divergence between each species used as blocking DNA and
O. niloticus was determined through the measure, obtained with a pachymeter, of the
horizontal branches of the phylogeny proposed by Smith et al. (2008). The branch
lengths were converted to number of transformations [(10 transformations = 3.49
millimeters in the bar of calibration as stated by Smith et al., 2008)]. These
transformations are related to the genetic and morphological data (Smith et al., 2008).
The number of transformations were plotted against the percentage of GISH
hybridization and the coefficient of correlation of Pearson (r), the coefficient of
determination (R2), and the relationship between the two variables were determined
though regression analysis (y=a+bx).
38
Results and discussion
The chromosomes of O. niloticus were used as reference in the present study
and were subjected to hybridization using blocking DNAs of the African cichlids O.
niloticus (blocking control), O. aureus, O. karongae, Sarotherodon galilaeus,
Hemichromis bimaculatus and Haplochromis obliquidens, and the South American
cichlids Astronotus ocellatus, Crenicichla sp., Geophagus brasiliensis and Aequidens
tetramerus. In general, labeling patterns after GISH were very similar to the results
observed for the distribution of DNA sequences and constitutive heterochromatin in the
genome of O. niloticus, here evidenced by hybridization of the BAC-probe enriched of
repeated sequences (Figure 1). The distribution of repeated elements was previously
described for O. niloticus with a preferential localization in the pericentromeric region,
in the whole extension of the largest chromosome pair (pair 1) and in a less intense
pattern in the subtelomeric regions (Ferreira and Martins, 2008). The correlation
between GISH results and distribution of repeated elements was also evidenced for
other organisms like plants (revised by Stace and Bailey, 1999). The positive control of
GISH probe reveled a labeling throughout the genome, which were strongly labeled in
the heterochromatic areas. Moreover, the positive control of blocking DNA reveled no
labeling.
The hybridization pattern observed after GISH analysis reveals a remarkable
conservation among cichlid genomes. The most distinct region of the genome of O.
niloticus is represented by the pericentromeric regions of most chromosomes and the
largest chromosome pair. However, there are small differences in the GISH signals
generated by the different blocking DNAs (Figures 1, 2). Pericentromeric DNAs
comprise the most rapidly evolving DNA sequences in eukaryotic genomes, differing
even between closely related species (Haaf and Willard, 1997; Csink and Henikoff,
1998; Murphy and Karpen, 1998). The pericentromeric regions are associated to a
rapid evolutionary rate caused by recombination suppression that leads to the
accumulation of repeat sequences (Charlesworth et al., 1994; Topp and Dawe, 2006).
Although GISH technique does not allow to predict which specific sequences are being
detected, it seems clear that the differential hybridization pattern obtained is represents
the presence of repeated DNA sequences such as satellite DNA and transposable
elements.
Our results indicates that the pericentromeric constitutive heterochromatin of O.
niloticus is species-specific at least some elements of this chromatin. The largest
chromosome pair seems to be conserved among O. niloticus, O. karongae, O. aureus
39
and S. galillaeus (Figures 1, 2). On the other hand, remarkable differences in the
chromosome 1 of O. niloticus chromosome 1 was observed in relation to the
hybridization pattern observed with blocking DNAs of non-tilapiines and South
American cichlids. These data indicate that the genomes of the three tilapiines (O.
karongae, O. aureus and S. galillaeus) used as blocking DNAs are more similar to O.
niloticus than the others cichlids, which is in agreement with the phylogeny proposed
for this family (Smith et al., 2008). Although O. karongae has a karyotype composed of
2n=38 chromosomes (Harvey et al., 2002) and the other tilapiines analyzed herein
posses 2n=44 (Majumdar and McAndrew 1986), the karyotype differences do not
seems to reflect remarkable genomic differences among these species. In fact, the
existence of hybrids between O. niloticus and O. karongae (Harvey et al., 2002)
indicates a close genetic relationship among them. Viable interspecific hybrids between
O. niloticus and O. aureus (Wohlfarth, 1994; Hulata et al., 1983, 1993), hybrids among
Sarotherodon, Tilapia and Oreochromis, have also been already supported (Heinrich,
1967; Bauer, 1968; Fishelson, 1988; Rana et al., 1996).
Genomic DNA of the African cichlids Hemichromis bimaculatus and
Haplochromis obliquidens did not block the DNA of O. niloticus pair 1 even though they
are quite related to the tilapiines (Smith et al., 2008). The tilapiines have a typical
karyotype pattern (represented here by O. niloticus) composed of one pair (the largest
one), of subtelocentric (st), few meta-submetacentric chromosomes (m/sm) and
several subtelo-acrocentric (st/a) chromosomes (Majumdar and McAndrew 1986). On
the other hand, the karyotypes of non-tilapiine African cichlids are composed by a
typical large m/sm, a large st/a, several small m/sm and several small st/a. Our results
indicate that the pair 1 of tilapiines has exclusive genomic sequences segments not
evidenced in the genome of other cichlids. In the same way, the hybridization pattern
observed with the use of blocking DNA of the non-tilapiine African cichlids H.
obliquidens was quite similar to the results observed when the South American species
were used for blocking. The GISH using blocking DNA of different South American
cichlid species revealed a similar hybridization pattern for all of them (Figures 1, 2). In
each case, all chromosomes of O. niloticus were blocked, except pair 1 and the
pericentromeric heterochromatin. This hybridization pattern is similar to the results
obtained with the use of H. obliquidens genomic DNA for blocking.
The most remarkable result obtained is related to the hybridization pattern of
the largest chromosome pair of O. niloticus. The genomic content for this chromosome
is similar in the tilapiines and diverges from the rest of the cichlids. The first
chromosome pair of O. niloticus is enriched in repeated DNA sequences (Harvey et al.,
40
2003; Ferreira and Martins, 2008) and is believed to be the sex chromosome of this
species, evidenced by unpaired segments in the terminal region of the long arm of
male heterogametic meiotic cells (Carrasco et al., 1999). The restriction of
recombination in the heterogametic genotype between the regions containing the sex-
determining genes is a general requirement in the process of sex chromosome
differentiation (Solari, 1994). Recombination is the primary force in the removal of
unnecessary DNA sequences and when suppressed, the accumulation of repeated
DNA sequences is exepcted (Topp and Dawe, 2006). Several classes of repeated
DNAs were identified in the largest chromosome of O. niloticus including LINES
(Oliveira et al., 1999), SINES (Oliveira et al., 2003), telomeric sequences (Chew et al.,
2002), non LTR transposons, Ron1 (mobile elemente), Tc1 transposon (Harvey et al.,
2003) and several non-classified transposon elements. FISH analysis using Cot-1 DNA
(DNA enriched for highly and moderately repetitive DNA sequences), confirms that this
chromosome is rich in repeated elements (Ferreira and Martins, 2008). Moreover, C-
banding technique detected the presence of heterochromatin in the complete extension
of long arm of largest pair (Majundar and McAndrew, 1986) (herein indicate as pair 1)
that is supposed to contain repeated DNAs. The accumulation of repeated DNAs in the
chromosome 1 of O. niloticus can be a consequence of restricted recombination that is
acting in early stages of sex chromosome differentiation or result of chromosome
fusions that were involved in the origin of this karyotype element (Oliveira et al., 1999).
Besides major differences related to the first chromosome pair and peri-
centromeric region, minor variations were observed after the use of blocking DNAs of
different cichlid species. The chromosomal signals generated by blocking the
hybridization with H. bimaculatus, O. karongae and O. aureus were less evident, while
blocking with S. galilaeus showed more evident signals (Figure 1, 2). The use of
blocking DNA of H. obliquidens evidenced stronger signals compared to the other
African cichlids. It is interesting because Oreochromis are more related to
Haplochromis than Hemichromis (Smith et al., 2008). The results revealed a
relationship between the karyogram results obtained with GISH and the phylogenetic
data for the tilapiine cichlids. Although Haplochromis is considered closely related to
tilapiines (Smith et al., 2008), our results reveals that the genome of O. niloticus is
more similar to Hemichromis than to Haplochromis. The comparative analyses of
GISH-signals using blocking DNAs of South American cichlids reveals a similar
patterns to the blocking with Haplochromis genomic DNA (Figure 1, 2). Haplochromis is
characterized as a high diversity group compared to other African cichlids (Kornifield et
al., 1979; Liem, 1991) We could speculate that the differential pattern of hybridization
41
observed for Haplochromis could be related to the high genetic diversity observed in
this genus.
The comparative analysis of transformations based in the phylogeny of Smith et
al. (2008) and the percentage of hybridization allowed the establishment of a clear
correlation between the divergence of Cichlidae groups and the level of GISH
hybridization (Table 1, Figure 3). Such data support the use of GISH for comparative
genomics. Cytogenetics haves been neglected as a tool to be applied in understanding
the genome structure and evolution. GISH can be helpfull to solve several genomic and
cytogenetic problems among fishes involving sex chromosomes, B chromosomes and
chromosome rearrangements. Cytogenetic data can be integrated to nucleotide
sequence and other genetic mapping data to establish a most parsimonious scenario
for the complex evolutionary history of fishes.
42
References
As referências citadas no tópico Resultados e Discussão encontram-se
reunidas no final deste volume no item Referências Bibliográficas.
43
Table
Table 1: Number of transformations according to Smith et al. (2008) and
percentage of GISH-hybridization between different cichlid species and O. niloticus.
Sarotherodon galilaeus was the only tilapiine considered in the phylogeny of Smith et
al. (2008).
Blocking species Number of transformations Percentage of hybridization
Sarotherodon 41,604 15,14%
Hemichromis 80,946 21,19%
Haplochromis 85,301 26,79%
Astronotus 204,112 24,36%
Crenicichla 261,304 26,63%
G. brasiliensis 266,576 32,34%
Aequidens 251,361 28,36%
44
Figures
Figure 1. In situ hybridization of Oreochromis niloticus chromosomes using the BAC
clone C4E09 as probe (a), and the FISH using blocking DNA of O. aureus (b), O.
karongae (c), Sarotherodon galilaeus (d), Hemichromis bimaculatus (e), Haplochromis
obliquidens (f), Astronotus ocellatus (g), Crenicichla sp. (h), Geophagus brasiliensis (i)
and Aequidens tetramerus (j).
45
Figure 2: Relationship between the chromosome signals generated by GISH experiments. The genome of the species in the cladogram
(Smith et al., 2008) were used as blocking DNA. The number in the top refers to each chromosome pair of Oreochromis niloticus,
including long chromosome arm (q) information for chromosomes 1 and 2. Green, strong signal; red, medium signal; yellow, week signal;
X, no signal. The African and South American cichlid clades are indicated by top left and bottom left, respectively.
Chromosomes pairs
01
1q
02
2q
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Species
X
X X X X X X X
X X X
X X X X
X
X X
X
Figure 3 – Correlation between the number of transfor
among cichlid species and the percentage of hybridization.
of determination.
41,604; 15,14%
Sarotherodon
85,301; 26,79%
Haplochromis
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
0 50
pe
rce
nta
ge
of
hy
bri
diz
ati
on
Correlation between the number of transformations (Smith
among cichlid species and the percentage of hybridization. R2 indicates the
41,604; 15,14%
Sarotherodon
80,946; 21,19%
Hemichromis
85,301; 26,79%
Haplochromis 204,112; 24,36%
Astronotus 261,304; 26,63%
Crenicichla
251,361; 28,36%
Aequidens
R² = 0,628
50 100 150 200 250
number of transformations
46
mations (Smith et al., 2008)
indicates the coefficient
261,304; 26,63%
Crenicichla
266,576; 32,34%
G. brasiliensis
250 300
47
5. Conclusão
No presente trabalho foi possível concluir que:
1 - os genomas de Oreochromis niloticus em comparação com o de outros
ciclídeos são bastante conservados, sendo que basicamente a heterocromatina
pericentromérica é espécie-específica desta espécie, ao menos alguns elementos de
sua cromatina;
2 - o braço longo do par 1 de O. niloticus é específico da tribo a qual está
alocada esta espécie;
3 – o genoma da espécie referência parece ser mais semelhante ao genoma
de Hemichromis do que ao genoma de Haplochromis, pelo menos em relação aos
elementos repetitivos.
É relevante afirmar que essa técnica tem um grande potencial para estudos de
comparação de genomas, mesmo havendo restrições como: ser somente possível
analisar o genoma apenas de modo amplo; as análises serem restritas a regiões ricas
em DNA repetitivos; não há possibilidades de se conhecer as seqüências específicas
da espécie referência ou as seqüências conservadas de um genoma. Acredita-se que
o trabalho pôde contribuir com o cenário evolutivo dos ciclídeos corroborando algumas
hipóteses e demonstrando que, apesar de haver grande conservação entre os
genomas, há regiões que estão evoluindo independentemente entre as tribos e dentro
da tribo Tilapiinae, com referência a espécie Oreochromis niloticus.
48
6. Referências Bibliográficas
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