Guia Farmacologia 2008-1 - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/ManualFarma1_24332.pdf · Farmacología I. Guión de Prácticas. ‐ 3 ‐ Tabla de contenido. PRÁCTICAS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

Farmacología I Clave de la materia 1408

Guión de Prácticas

2007

Andrés Navarrete Castro

Liana Medina Cruz

José Luis Balderas López

Farmacología I. Guión de Prácticas.

‐ 2 ‐

Este material se desarrollo con el apoyo del

Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza PAPIME con la clave PE205306

Proyecto: Desarrollo de procedimientos para la enseñanza de la farmacología experimental basada en el principio de las 3Rs: Reducción, Refinamiento y Reemplazo de animales de

laboratorio. El contenido de este material fue revisado por los profesores de Laboratorio de Farmacología I

del semestre 2007‐1.


‐ 3 ‐

Tabla de contenido.

PRÁCTICAS.

1. Marco conceptual del laboratorio de farmacología

2. Determinación de la ventana de actividad biológica y la dosis efectiva 50

con un sistema simulado.

3. Determinación de la concentración letal 50 (CL50) de dicromato de potasio

en Artemia sp.

4. Determinación de parámetros farmacocinéticos en un modelo de vidrio.

5. Determinación experimental de la dosis efectiva 50 (DE50) sedante en

ratones.

6. Influencia de la vía de administración sobre la respuesta farmacológica.

7. Excreción renal de ácido acetilsalicílico en voluntarios.

8. Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema simulado.

9. Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema de órgano

aislado.

APÉNDICES.

Apéndice I. Tabla de conversión de proporción a unidades Probit.

Apéndice II. Técnicas de manejo e identificación de animales de laboratorio (rata

y ratón).

Apéndice III. Instructivo para el uso del polígrafo Biopac System MP‐100.

4

9

13

21

29

36

40

46

54

63

64

69


‐ 4 ‐

1. Marco conceptual del laboratorio de farmacología.

La farmacología es una ciencia experimental por excelencia. Los métodos utilizados para evaluar

la seguridad y la eficacia de los fármacos utiliza sistemas biológicos que van desde fragmentos

celulares o macromoléculas aisladas hasta poblaciones enteras. En una gran parte del proceso

de investigación farmacológica se utilizan animales de laboratorio íntegros. Sin embargo, la

creciente sensibilidad respecto a la práctica de la experimentación en animales en la

investigación y en la enseñanza de las ciencias biomédicas, y la búsqueda de enfoques nuevos

en los aspectos prácticos de la misma son parte de un debate actual (Jukes y Chiuia, 2003).

La utilización de animales de experimentación en la enseñanza de las prácticas de diferentes

asignaturas de las Ciencias Biomédicas y en especial de la farmacología, ha venido siendo la

metodología más empleada por todos los profesores de esta disciplina. Gracias a la utilización

de estos animales, los estudiantes han podido apreciar los diferentes efectos farmacológicos y

los principios de la acción farmacológica. Entre las prácticas clásicas que se han realizado en la

mayoría de los laboratorios de farmacología, algunas de ellas tienen un componente importante

de crueldad y son de poca aceptación por algunos de los estudiantes. Una de las prácticas que

no se puede aceptar es la determinación de la dosis letal 50 (DL50) en ratas o ratones, parámetro

que está en duda su utilidad como parámetro para estimar la seguridad de los fármacos y

sustancias nuevas. Es obvio que el uso de animales era el único método del que disponían los

profesores hace algunos años para enseñar farmacología. Pero en los últimos años las cosas han

cambiado y el avance de la informática, de las tecnologías de la imagen y la disposición de líneas

celulares ha permitido el desarrollo de numerosas alternativas que no requieren el uso de los

animales para lograr los objetivos docentes que se plantean en las prácticas de laboratorio de

farmacología (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003; Eder et al., 2006).

Los métodos utilizados en la investigación, para la evaluación de la seguridad y/o toxicidad y en

la enseñanza están en continuo progreso ya que los científicos están en permanente búsqueda


‐ 5 ‐

de posibles alternativas que mejoren la calidad de su trabajo. Ello es debido, en parte, a la lógica

evolución de los conocimientos científicos y de sus aplicaciones tecnológicas, y en parte, a

consideraciones éticas, logísticas, económicas, sociopolíticas y legales (Sterling y Rispin, 2002).

El número de animales utilizados en Europa con fines educativos es relativamente pequeño

comparado con el número total de animales utilizados en investigación y se ha venido

reduciendo en los últimos años, pero a pesar de ello todavía se puede reducir más. En México el

uso de animales en docencia es alto aunque no se cuentan con datos precisos de cuantos

animales se sacrifican en cada ciclo escolar. Por otro lado la aplicación de la Norma Oficial

Mexicana (NOM‐062‐ZOO‐1999) ha sido lenta en los laboratorios de enseñanza de las ciencias

biomédicas. En cambio, en el artículo 25 de la Convención Europea para la Protección de los

Animales Vertebrados utilizados en Experimentación y otros Fines Científicos se especifica:

"aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o de entrenamiento … se deben

restringir a los absolutamente necesarios para los fines relativos a la enseñanza y el

entrenamiento y se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos por

métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente efectivos". En las legislaciones

relacionadas con la protección de los animales de todos los países de la Comunidad Europea se

considera fundamental aplicar el principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959

(Russell y Burch, 1959). Este principio nos indica la necesidad de Reemplazar los animales de

experimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que el nuevo método nos aporte

el mismo grado de información, de Reducir el número de animales de experimentación cuando

su uso sea necesario y se presente como el único método válido y finalmente, de Refinar las

técnicas empleadas con los animales, con el fin de mejorar su eficacia o disminuir el dolor o el

grado de sufrimiento infligido (van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003).

En el caso de la docencia se plantea el reemplazo de los animales de experimentación por otros

métodos. Entre los métodos propuestos se pueden citar:

a) Modelos, maniquíes y simuladores mecánicos.

b) Películas y vídeos.


‐ 6 ‐

c) Simulaciones de ordenador y sistemas de realidad virtual.

d) Autoexperimentación en el propio individuo.

e) Experimentos con vegetales incluyéndose hongos y algas.

f) Uso de material procedente de los rastros.

g) Estudios in vitro con líneas celulares, organismos inferiores como bacterias, nematodos,

insectos o peces en etapa temprana.

h) Aprovechamiento de animales muertos de forma natural o utilizados después de un

procedimiento científico (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003).

En el Laboratorio de Farmacología I se plantea el desarrollo de procedimientos experimentales

y actividades en los que bajo el principio de las “tres erres” se reduzca, se reemplace y se refine

el uso de animales de laboratorio para cubrir los objetivos de la enseñanza experimental de la

farmacología.

Considerando lo anterior, en el laboratorio de farmacología se realizarán actividades de tres

tipos:

1) Simulaciones. Se realizarán simulaciones en la computadora que permita a los

estudiantes la comprensión de aspectos que sin la necesidad de repetir muchos

experimentos puedan comprender los conceptos y los procedimientos para definir

parámetros farmacológicos.

2) Prácticas. Desarrollo de prácticas sencillas, con lo que se pretende conozca técnicas y

hábitos del laboratorio de farmacología.

3) Demostraciones. En esta categoría se realizan experimentos los cuales debido a las

siguientes razones no es posible que la realicen los estudiantes en forma individual o en

grupos pequeños:


‐ 7 ‐

a. El experimento requiere de cierta destreza que en una o dos sesiones no es

posible que las aprenda el estudiante.

b. La existencia de equipo de laboratorio en un número reducido.

c. El tiempo limitado para la sesión de laboratorio.

4) Autoexperimentación. Sin poner en riesgo en ningún grado la integridad y la salud de los

estudiantes. Se realizará una práctica para observar algunos procesos farmacocinéticos

de un fármaco (Ácido acetilsalicílico).

Cualquiera que sea la modalidad del procedimiento que se realice cada uno de ellos debe

comprender las siguientes partes: familiarización con el procedimiento, ejecución del

procedimiento y discusión del procedimiento.

Con estos procedimientos se pretende:

• Facilitar el aprendizaje de los aspectos fundamentales de la farmacología.

• Familiarizar a los estudiantes con el método científico en experimentos de farmacología.

• Enseñar técnicas y hábitos del laboratorio de farmacología.

• Motivar a los futuros farmacéuticos hacia la investigación y estudio de la farmacología

como área de desarrollo profesional.

BIBLIOGRAFÍA.

• Eder C, Falkner E, Nehrer S, Losert U y Schoeffl H. (2006). Introducing the concept of the

3Rs into tissue engineering research. Altex‐Alternativen Zu Tierexperimenten. 23:17‐23.

• Jukes N, Chiuia M. (2003). From Guinea Pig to Computer Mouse. 2ª Edición. InterNICHE.

Lóndres.


‐ 8 ‐

• Meyer B, Ferrigni N, Putnam J, Jacobsen L, Nichols D, McLaughlin J. (1982). Brine Shrimp:

A convenient general bioassays for active plant constituents. Planta Medica. 45:31‐34.

• Russell W, Burch R. (1959). The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen,

Lóndres.

• Tallarida R. (2000). Drug synergism and dose‐effect data analysis. Chapman & Hall/CRC.

EUA.

• Van der Valk J, Dewhurst D, Hughes I, Atkinson J, Balcombe J, Braun H, Gabrielson K,

Gruber F, Miles J, Nab J, Nardi J, Van Wilgenburg H, Zinko U y Zurlo J. (1998). Alternatives

to the use of animals in higher education. ATLA 27:39‐52

• Vinardell P. (2003). Alternativas al uso de animales de experimentación en las prácticas

de fisiología. Boletín de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas. 6(1).


‐ 9 ‐

2. Determinación de la ventana de actividad biológica y la dosis efectiva 50 con un sistema simulado.

Número de sesiones sugeridas: 1 sesión (ejecución y análisis). Temas relacionado con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría, curva dosis respuesta cuantal.

I. INTRODUCCIÓN

Dentro de las ciencias biológicas, entre ellas la Farmacología, los animales muchas veces tienen

un papel central en las clases prácticas en el laboratorio. Cientos de millones de animales son

usados para experimentos o sacrificados para su disección cada año en todo el mundo.

La visión actual del uso de animales es una educación completamente humana, donde los

objetivos de la enseñanza son alcanzados usando métodos alternativos, y donde la compasión,

respecto a la vida, y el pensamiento crítico son valorados y desarrollados. Es una visión donde

los alumnos tienen libertad de conciencia y la relación negativa con los animales ha sido

transformada al pensamiento positivo en lugar del uso dañino de animales (Jukes y Chiuia

2006).

Un gran número de compuestos y fármacos cuentan con la determinación experimental de los

valores de dosis efectiva 50 (DE50), dosis tóxica 50 (DT50) y dosis letal 50 (DL50). El cálculo de este

parámetro se puede predecir mediante ecuaciones que explican el fenómeno farmacológico

(Tallarida, 2000). Por lo que utilizando los valores descritos en la literatura es posible simular la

adición de diferentes dosis o concentraciones de diferentes fármacos en un sistema en

computadora, donde el alumno podrá construir curvas dosis‐respuesta y por lo tanto

determinar la DE50, sin el uso de animales de laboratorio.


‐ 10 ‐

II. OBJETIVOS

Los objetivos de esta práctica son:

1. Comprender la importancia de la determinación la ventana de actividad biológica de los

fármacos.

2. Aprender el uso de un sistema simulado en computadora.

3. Calcular la DE50 de una serie de fármacos por medio de la ecuación de Hill, con los datos

obtenidos en el sistema simulado.

III. MATERIAL

a) Software

• Se utilizará el software SimCDR ver. 1.0 desarrollado ex profeso para la práctica por el M.

en C. José Luis Balderas de la Facultad de Química de la UNAM.

El software puede ser descargado del siguiente vínculo:

http://www.paginasprodigy.com/luisbald

El software deberá ser instalado en una PC o compatible con Microsoft Windows 98 ó

posterior.

IV. PROCEDIMIENTO

a) Manejo del software SimCDR ver. 1.0

Para el uso adecuado del software se dividirá su manejo por procedimiento con

referencia al esquema siguiente:


‐ 11 ‐

1) Inicio del programa y ejecución de un nuevo experimento simulado.

a) Para iniciar el programa se debe oprimir el siguiente icono:

b) En la casilla de Fármaco se selecciona el fármaco que se utilizará en la simulación. En

la ventana Información del fármaco, aparecerán una breve descripción del mismo así

como su actividad farmacológica más importante.

c) Se seleccionan el número de dosis a utilizar así como las unidades que se utilizarán,

en las casillas Núm. de dosis y Unidades, respectivamente.

d) Se llenan las casillas que aparecen en la ventana Dosis a probar y se oprime el botón

Calcular el % de efecto. Si alguna de las casillas anteriores están en blanco, aparecerá

un mensaje de error.

Información básica del fármaco a utilizar

Selección del fármaco a utilizar

Selección del número de dosis que

se evaluarán

Selección de las unidades de dosis que se utilizarán

Casillas de captura de datos donde se colocarán las dosis a

evaluar

Casillas de datos de la simulación

Botón de borrado de todos los datos

Botón para el cálculo de los datos


‐ 12 ‐

e) En la ventana Resultados aparecerán lasa dosis que se administraron simuladamente

y los porcentajes de respuesta que darían dichas administraciones.

f) Para iniciar un nuevo experimento simulado, se deberá oprimir el botón Borrar

datos, o si se prefiere, cambiar los datos en las casillas correspondientes.

V. ANÁLISIS DE RESULTADOS

1. Con los datos obtenidos en los experimentos simulados:

a) Construir las curvas dosis respuesta de los fármacos utilizados.

b) Calcular la DE50 para la actividad principal de los fármacos utilizados mediante la

Ecuación de Hill.

II. BIBLIOGRAFÍA

• Tallarida R. (2000). Drug Synergism and Dose‐effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC.

EUA.

• Jukes N, Chiuia M. (2003). From Guinea Pig to Computer Mouse. 2ª Edición. InterNICHE.

Lóndres.


‐ 13 ‐

3. Determinación de la Concentración Letal 50 (CL50) del dicromato de potasio en Artemia salina.

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis) Tema relacionado con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría, curva dosis‐respuesta cuantal.

I. INTRODUCCIÓN

Un bioensayo puede ser definido como cualquier prueba que involucra organismos vivos, a su

vez se puede señalar como cualquier método por medio del cual alguna propiedad de una

sustancia o material, es medida en términos de la respuesta biológica que produce. La relación

entre la respuesta biológica y la dosis o la concentración de una sustancia activa se relaciona en

la llamada curva dosis‐respuesta. Esta relación puede darse de forma graduada o la respuesta

puede ser de tipo todo o nada, también conocida como cuantal.

En esta práctica se realizará un experimento en el cual se analizará el segundo tipo de relación

curva dosis respuesta, es decir se analizará la curva dosis‐respuesta cuantal, que debido a la

forma en la que se realizará propiamente se debe referir como la curva concentración‐respuesta

cuantal. Se utilizará como sistema biológico el crustáceo Artemia salina en su forma adulta y

como larva o nauplio, y como sustancia de prueba al dicromato de potasio.

II. OBJETIVOS


1. Manejar un sistema biológico alterno a los mamíferos y roedores para la determinación

de una curva concentración‐respuesta cuantal.

2. Comprender el significado y la utilidad de la CL50.

3. Realizar el cálculo de la CL50 mediante el análisis Probit


‐ 14 ‐

III. MATERIAL

1. Utilizando Artemia salina Adulta.

a) Material biológico

• De 100 a 200 ejemplares adultos de Artemia salina.

b) Materiales, cristalería y equipo

• Un vaso de precipitado de 500 mL

• Una pipeta graduada de 2 mL

• Una pipeta volumétrica de 10 mL

• 24 frascos viales marcados para un volumen de 5 mL

• Una lámpara de escritorio.

• 1 Pipeta Pasteur con bulbo

• Aereador con manguera y filtro

c) Reactivos

• 100 mL de disolución de dicromato de potasio, K2Cr2O7 (50 mg/mL).

Disolver 5 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto

aforar a un volumen de 100 mL con agua destilada.

2. Utilizando nauplios de Artemia salina.


• Huevecillos liofilizados de Artemia salina.

a) Materiales, cristalería y equipo

• Pecera de vidrio capacidad 2 L

• Pecera de 500 mL


‐ 15 ‐

• 24 frascos viales marcados para un volumen de 2 mL

• Pipetas de vidrio

• Jeringas de 1 mL

• Foco sumergible de 5 W

• Termómetro para pecera

• Matraz Erlenmeyer de 1 L

• Vasos de precipitados de 100, 500 mL

• 5 Pipetas Pasteur con bulbo

• Aereador con manguera y filtro

b) Reactivos


Disolver 5 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar

a un volumen de 100 mL con agua destilada.


Disolver 2 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar

a un volumen de 100 mL con agua destilada.

• 500 mL de agua de mar artificial.

Disolver 16 g de sal marina (o en su defecto cloruro de sodio, NaCl) en 500 mL de agua y

colocar dos gotas de anticloro. Dejar reposar por 10 minutos y filtrar si es necesario.

• Anticloro (tiosulfato de sodio, Na2S2O3, al 1 %).

IV. PROCEDIMIENTO

1. Utilizando la Artemia salina Adulta.

a) Preparación de la Artemia Salina

1) Mantener a la Artemia salina en el vaso de precipitado con aeración constante.


‐ 16 ‐

2) Por triplicado rotular los frascos viales con las siguientes concentraciones: 0, 4, 6, 8, 12,

16 y 20 mg/mL y coloque una marca a un volumen de 5 mL.

3) Colocar 10 artemias en cada vial con ayuda de la pipeta Pasteur como se muestra en la

figura siguiente. Utilice la luz de una lámpara como fondo para facilitar el conteo. La

cantidad total de agua que resulta de la adición de las artemias debe ser de

aproximadamente 1 mL, si es necesario retire el excedente.

1 hora de exposición bajo luz blanca

1

2

3

CONCENTRACIONES (mg/mL)

Control 4 6 8 10 12 16 20

Artemia salina

Volumen final de los viales: 5 mL

Pipeta Pasteur


‐ 17 ‐

b) Adición del dicromato de potasio

1) Adicionar las siguientes cantidades de dicromato de potasio indicadas en la siguiente

cuadro:

Concentración (mg/mL)

Volumen de la disolución de dicromato de potasio (mL)

0 (Control) 0

4 0.4

6 0.6

8 0.8

10 1.0

12 1.2

16 1.6

20 2.0

2) Inmediatamente después de la adición de la solución de dicromato de potasio se

adiciona la cantidad necesaria de la solución de agua de mar para llevar a un volumen

final de 5 mL.

3) Dejar durante una hora en exposición bajo luz blanca.

c) Lectura de resultados

1) Al término del periodo de exposición se contarán las artemias que sobrevivieron de la

siguiente manera:

a. Las artemias que presentan movimiento, aunque sea este mínimo, se

consideran vivas.

b. Las artemias que permanecen inmóviles, se consideran muertas.

2. U

a) In

1. Se

2. Se

3. Co

te

in

4. Co

5. Ad

(a

m

b) Pr

A

co

de

tilizando na

ncubación de

e arma el dis

Pec

e colocan 30

olocar una c

emperatura

ncubación.

onectar los d

dicionar los

aproximadam

mL. Dejar incu

reparación d

partir de es

on artemias

e 25 mg/mL

auplios de Ar

e los huevec

spositivo de

cera con dispo

00 mL de agu

cantidad de

de 26‐28°C

dispositivos

huevecillos

mente 10 µg

ubar durante

de los viales

te momento

adultas, colo

de dicromat

Farmacología

rtemia salin

cillos de la A

incubación

sitivos de incu

ua de mar ar

e agua corrie

y dejar que

de aeración

s en la pece

g de hueveci

e 48 h.

s y realizació

o se seguirán

ocando en lu

to de potasi

a I. Guión de P

‐ 18 ‐

na.

Artemia Salin

como se mu

bación (1), aer

rtificial en la

ente en la p

e alcance el

y luz.

era de incu

llos), coloca

ón del exper

n los pasos a

ugar de esta

o.

Prácticas.

na

uestra en la s

ración (2) e ilum

pecera de i

pecera may

equilibrio c

bación con

r en la zona

rimento.

a), b) y c) de

as a los naup

siguiente fig

minación (3).

ncubación.

or, aproxim

con el agua

una espátu

obscura de

l experimen

plios y utiliza

ura.

madamente a

de la pece

ula limpia y

la pecera d

to llevado a

ndo la disolu

a una

ra de

seca

e 500

cabo

ución


‐ 19 ‐


1. Se tabulan los datos obtenidos en el siguiente cuadro:

2. Con los resultados obtenidos:

• Realice la curva concentración‐respuesta cuantal para el dicromato de potasio.

• Calcule la CL50 y sus límites de confianza del dicromato de potasio por medio del análisis

Probit. Utilice la tabla de conversión de probabilidad a unidades Probit del Apéndice I.

3. Con la gráfica realizada y los valores calculados analice:

• Los datos encontrados con respecto a los datos informados en la literatura.

• Las ventajas y desventajas de los bioensayos con respecto a los ensayos con organismos

superiores.

ni ri ni ri ni ri Σ ni Σ ri pi yi

CONTROL

4

6

8

10

12

16

20

ni = número de artemias utilizadas por concentración por cada repetición Σ ni = número de artemias totales utilizadas por concentración

ri = número de artemias muertas por concentración por cada repetición Σ ri = número de artemias totales muertas por concentración

pi = probabilidad por concentración (pi = Σ ri / Σ ni) yi = unidad probit calculada por tablas a partir de pi

CONCENTRACIÓN (mg/mL)

DATOS FINALES1 2 3

REPETICIONES DEL EXPERIMENTO


‐ 20 ‐

VI. BIBLIOGRAFÍA

• Infante S y Calderón L. (1994). Manual de análisis probit. Colegio de Posgraduados.

México.

• McLaughlin J. (1991). Crow gall tumors on potato disc and Brine Shrimp lethality; two

simple bioassay for higher plant screening and fractionation. Methods in Plant

Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA: 1‐30.


New York.


‐ 21 ‐

4. Determinación de parámetros farmacocinéticos en un modelo de vidrio.

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis) Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, cálculo de parámetros farmacocinéticos

I. INTRODUCCIÓN

La farmacocinética es la rama de la farmacología que estudia el curso temporal de los fármacos

a través del organismo. Comprende los procesos de absorción, distribución y eliminación de los

fármacos. La eliminación a la vez comprende los procesos de excreción y biotransformación.

La curva de concentración en función del tiempo se utiliza para determinar los parámetros

farmacocinéticos. La forma de la curva concentración‐tiempo y los parámetros que se calculan a

partir de ella, depende de la vía de administración y del fluido biológico en el que se lleve a cabo

el muestreo y análisis del fármaco. Después de una administración intravenosa es posible

determinar los parámetros farmacocinéticos: constante de eliminación (k), volumen aparente

de distribución (Vd), concentración plasmática al tiempo cero (Cp°), depuración total (ClT), área

bajo la curva (ABC) y el tiempo de vida media (t½). Para cuando el fármaco se administra por una

vía que requiere de un proceso de absorción, es decir, el paso del sitio de aplicación a la

circulación general, se pueden calcular los parámetros farmacocinéticos: constante de absorción

(Ka), concentración plasmática máxima (Cpmax), (tiempo al que se alcanza la concentración

plasmática máxima (tmax), además de k, t½ y ABC.

En esta práctica, mediante el uso de un modelo de vidrio es posible hacer una simulación de la

administración de fármaco por vía intravenosa o por una vía que requiere de un proceso de

absorción. También es posible simular la toma de muestras en sangre y en orina y con ello

realizar los cálculos de los parámetros farmacocinéticos correspondientes a dichas simulaciones.


‐ 22 ‐

II. OBJETIVOS


1. Utilizar un modelo de vidrio para simular la administración intravascular y una vía

extravascular.

2. Calcular los parámetros farmacocinéticos para la administración intravascular y

extravascular.

3. Que el alumno comprenda la influencia de la vía de administración sobre el

comportamiento cinético del fármaco

III. MATERIAL

a) Materiales, cristalería y equipo

• Dos vasos de precipitado de 500 mL con brazo recto

• Pipeta graduada de 5 mL

• Perilla

• Dos vasos de precipitado de 500 mL


• 6 matraz volumétrico de 10 mL

• Un matraz volumétrico de 25 mL

• Una pipeta volumétrica de 1 mL

• Dos placas de agitación

• Dos soportes universal

• Dos pinzas con nuez

• Un embudo de separación de 1 L

• Un anillo para soporte universal

• Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL


‐ 23 ‐

• Un cronometro

• 24 Tubos de ensayo

• 4 litros de agua corriente

• Dos barras magnéticas de agitación

• 2 agitadores magnéticos

• Balanza analítica

• Espectrofotómetro

b) Reactivos

• Disolución de Rojo Congo (4 mg/mL)

Disolver 100 mg del colorante Rojo Congo en 15 mL de agua y aforar a un volumen de 25

mL con agua destilada.

IV. PROCEDIMIENTO

1. Vía intravascular

a) Colocar el material de acuerdo al siguiente esquema:

AC


‐ 24 ‐

b) Colocar agua corriente en el embudo de separación, mantener el mismo volumen

durante todo el experimento.

c) Mantener la agitación constante en el vaso de precipitado A.

d) Medir la velocidad de flujo del goteo y llevarla a un flujo constante de 20 mL/min.

e) Adicionar agua corriente al vaso de precipitado A, llevándolo a un volumen muy cercano

para que se inicie el goteo.

f) Adicionar 5 mL de la disolución del colorante al vaso de precipitado A. El momento en

que inicia el goteo del vaso se toma como referencia para la toma de muestras.

g) Cuando inicia el goteo, inmediatamente se toma una muestra de 2 mL del vaso A.

h) Se deja correr el experimento y se toman muestras de 2 mL del vaso A de acuerdo a los

tiempos indicados en el siguiente cuadro.

ABSORBANCIACONCENTRACIÓN

(mg/mL)

CONTROL

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

60

75

90

120

TIEMPO (min)

VASO AVÍA INTRAVASCULAR


‐ 25 ‐

2. Vía extravascular

a) Colocar el material de acuerdo al siguiente esquema:

b) Colocar agua corriente en el embudo de separación, mantener el mismo volumen

durante el experimento.

c) Mantener la agitación constante en los vasos de precipitado.

d) Medir la velocidad de flujo del goteo y llevarla a un flujo constante de 20 mL/min.

e) Adicionar agua corriente a los vasos de precipitado, llevándolos a un volumen muy

cercano para que inicie el goteo.

f) Adicionar 5 mL de la solución del colorante al vaso de precipitado A. La hora en que inicia

el goteo del vaso A al B se toma como referencia para la toma de muestras.

g) Cuando inicia el goteo se toma una muestra de 2 mL del vaso A y del B.

h) Se deja correr el experimento y se toman muestras de 2 mL del vaso A y B de acuerdo al

cuadro siguiente.

BA

C


‐ 26 ‐

3. Determinación de las concentraciones del colorante

a) Realizar una curva estándar del pesando 1 mg del colorante, disolverlo en agua

destilada, aforar a 10 mL y continuar con se indica en el esquema siguiente:

ABSORBANCIACONCENTRACIÓN

(mg/mL)ABSORBANCIA


CONTROL

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

60

75

90

120

VASO A VASO BVÍA EXTRAVASCULAR

TIEMPO (min)

Disol. Stock100 µg/mL

5 mL5mL

5 mL

Cada matraz debe aforarse a 10 mL

5 mL5 mL

50 µg/mL 25 µg/mL 12.5 µg/mL 6.25 µg/mL 3.125 µg/mL


‐ 27 ‐

b) Leer las absorbancias de la curva estándar y de las muestras obtenidas en los

experimentos en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 490 nm.

c) Determinar la concentración de las muestras interpolando el valor de las lecturas en la

curva estándar.


1. Elaborar una gráfica por cada vía de administración, considerando el logaritmo natural

de la concentración [µg/mL] contra tiempo [min].

2. Calcular los parámetros farmacocinéticos t½, Vd, k, ka, ClT, Cmax, tmax, ABC y F; según la vía

de administración simulada.

3. Analizar la importancia de los modelos farmacocinéticos in vitro y de los parámetros

farmacocinéticos calculados

TUBOCONCENTRACIÓN

(µg/mL)ABSORBANCIA

BLANCO 0

1 3.125

2 6.25

3 12.5

4 25

5 50

6 100

CURVA ESTÁNDAR DE ROJO CONGO


‐ 28 ‐

VI. BIBLIOGRAFÍA

• Gumtow R, Proudfoot J y Talada A (1989). An in vitro pharmacokinetic system for use in

the undergraduate pharmaceutics laboratory: a one‐ and two‐compartment

pharmacokinetic Bench Model; the glassman patient. Revista Mexicana de Ciencias

Farmacéuticas, 20(3):25‐30.

• Rowland M y Tozer T (1995). Clinical pharmacokinetics 3rd. Ed. Lea and Febiger. EUA.

• Shargel L, Wu‐Pong S y Yu A (2004). Applied biopharmaceutics and Pharmacokinetics. 5th

Edition. McGraw‐Hill Medical, EUA.


‐ 29 ‐

5. Determinación experimental de la dosis efectiva 50 (DE50) sedante en ratones.

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis) Tema relacionado con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría y Farmacodinamia, tipo de acción farmacológica

I. INTRODUCCIÓN

La farmacodinamia es la rama de la farmacología que estudia el mecanismo de acción de los

fármacos. Los fármacos pueden ejercer su acción por la acción sobre un receptor, alterando el

efecto de un agonista endógeno, mediante la inhibición de procesos de transporte, modificando

la actividad enzimática o por otros mecanismos. Entre los receptores que tiene una

participación muy importante en la depresión del SNC se encuentra el receptor GABA, los

receptores a serotonina, los receptores a dopamina, los receptores colinérgicos, los receptores

a histamina, entre otros.

En esta práctica se utilizará un modelo sencillo basado en el comportamiento de los roedores de

explorar un ambiente extraño. El número de levantamientos sobre sus extremidades traseras

está relacionado con un estado de alerta. La disminución del número de levantamientos por el

efecto de un fármaco está relacionado con un efecto tranquilizante y en varios trabajos de

investigación se ha utilizado para medir el efecto sedante de fármacos depresores del SNC

(Oliva et al., 2004; Ugalde et al., 2005; González‐Trujano et al., 2006).

En esta práctica se contempla determinar la DE50 sedante de pentobarbital sódico y del etanol

utilizando el modelo de Cilindro de Exploración en ratones.


‐ 30 ‐

II. OBJETIVO


1. Determinar la DE50 para el efecto sedante del pentobarbital y etanol en ratón utilizando

el modelo del Cilindro de Exploración.

2. Aplicar la metodología para el cálculo de dosis, administración de fármacos, observación

y manejo de datos de un experimento farmacológico en roedores.

III. MATERIAL


• Ratones ICR ó CD1 machos de 25‐30 g de peso


• Cilindro de exploración (cilindro de vidrio de 11 cm de diámetro interno por 30 cm de

altura).

• Jeringas de 1 mL con aguja del número 27

• Balanza para pesar animales

• Marcador de tinta indeleble

• Papel

• Cronómetro

• Contador manual

• Matraz volumétrico de 10 mL

• 6 frascos viales de 10 mL

c) Fármacos y reactivos

• Anestesal® (pentobarbital sódico 6.3 g/100 mL, uso veterinario). Pfizer.


‐ 31 ‐

• Disolución de Pentobarbital sódico 3 mg/mL.

Transfiera 0.47 mL de Anestesal® a un matraz volumétrico de 10 mL y llévelo al aforo con

disolución salina.

• Etanol absoluto.

• Disolución salina fisiológica (0.9%).

IV. PROCEDIMIENTO

A. EFECTO SEDANTE DE PENTOBARBITAL

a) Pesado y marcaje de animales

Cada grupo de trabajo recibirá 6 ratones. Marque a sus animales con el marcador de

tinta indeleble en la base de la cola, péselos y registre el peso de cada animal.

b) Preparación de las disoluciones de pentobarbital sódico

Rotule 6 frascos viales con las siguientes leyendas 0, 2.5, 5, 10, 15 y 30 mg/kg. Agregue la

cantidad indicada en el cuadro siguiente de la disolución de pentobarbital de 3 mg/mL y

de disolución salina al 0.9%(p/v):

c) Administración del fármaco

Asigne aleatoriamente las dosis que recibirá cada ratón. Administre por vía

intraperitoneal 0.1 mL de la disolución correspondiente del fármaco o de la disolución

salina por cada 10 g de peso del animal y registre el tiempo al que lo administró.

PENTOBARBITAL ( mg/kg)

DISOLUCION SALINA

1 CONTROL 0 3 0

2 2.5 0.25 2.75 0.25

3 5 0.5 0.5 0.5

4 10 1 1 1

5 15 1.5 1.5 1.5

6 30 3 0 3

FRASCO VIALDOSIS (mg/kg)

VOLUMENES A AGREGAR (mL)CONCENTRACIÓN

(mg/mL)


‐ 32 ‐

d) Desarrollo del experimento

Cilindro utilizado en la prueba de exploración.

1) Cerciórese de que el cilindro de vidrio está seco y limpio.

2) Coloque el cilindro sobre un trozo de papel mayor al diámetro del cilindro (pueden ser

hojas recicladas).

3) 30 minutos después de haber administrado el fármaco o la solución salina introduzca

al animal en el cilindro de exploración.

4) Ponga a funcionar el cronómetro y registre el número de levantamientos que realiza

el animal en un período de 5 minutos. Sólo una persona deberá cuantificar esta

conducta para que sean analizados bajo el mismo criterio.

5) Limpie húmedo con solución hidroalcohólica el interior del cilindro y cambie el papel.

6) Continúe con el mismo procedimiento para los 5 animales restantes. No olvide limpiar

el cilindro entre cada prueba.

7) El animal que recibió la solución salina se toma como control.

11 cm d.i.

30 cm

Admón. Inicio Final

1 0 30 35

2 6 36 41

3 12 42 47

4 18 48 53

5 24 54 59

6 30 01:00 01:05

Peso (g)Núm. de

levantamientos

Tiempo (h:min)Dosis (mg/kg)Ratón


‐ 33 ‐

B. EFECTO SEDANTE DE ETANOL

a) Preparación de las soluciones de etanol absoluto

Rotule 6 matraces aforados de 10 mL con las siguientes leyendas 0, 500, 1000, 2000,

2500 y 3000 mg/kg. Agregue la cantidad indicada en el cuadro siguiente de etanol

absoluto y afore con solución salina al 0.9% (p/v):

b) Administración del fármaco

Asigne aleatoriamente las dosis que recibirá cada animal. Administre por vía

intraperitoneal 0.1mL de la solución correspondiente del fármaco o de la solución salina

por cada 10 g de peso y registre el tiempo al que lo administró.

c) Desarrollo del experimento

1) Cerciórese de que el cilindro de vidrio está seco y limpio.

2) Coloque el cilindro sobre un trozo de papel mayor al diámetro del cilindro (pueden ser

hojas recicladas).

3) 5 minutos después de haber administrado el fármaco o la solución salina introduzca al

ratón en el cilindro de exploración.

4) Registre el número de levantamientos que realiza el animal en un período de 5

minutos. Sólo una persona deberá cuantificar esta conducta para que sean analizados

bajo el mismo criterio.

5) Limpie húmedo con solución hidroalcohólica el interior del cilindro y cambie el papel.

ETANOL ABSOLUTODISOLUCION

SALINA

1 CONTROL 0 10 0

2 500 0.63 9.37 50

3 1000 1.26 8.74 100

4 2000 2.52 7.48 200

5 2500 3.16 6.84 250

6 3000 3.8 6.2 300


FRASCO VIALDOSIS (mg/kg)

VOLUMENES A AGREGAR (mL)


‐ 34 ‐

6) Continúe con el mismo procedimiento para los 5 ratones restantes. No olvide limpiar

el cilindro entre cada prueba.

7) El animal que recibió la disolución salina se toma como control.


a) Cálculo de la DE50

1) Calcule el porcentaje de efecto por cada dosis, considerando que el número de

levantamientos promedio de los ratones control es igual al 0% de efecto.

2) Determine el modelo que siguen los datos obtenidos.

3) Calcule la DE50 para el efecto sedante de acuerdo al modelo determinado.

b) Cálculo de la potencia relativa

1) Calcule la potencia relativa del efecto sedante entre etanol y pentobarbital. Con la

relación:

Admón. Inicio Final

1 0 5 10

2 6 11 16

3 12 17 22

4 18 23 28

5 24 29 34

6 30 35 40

Peso (g)Núm. de

levantamientos

Tiempo (h:min)Dosis (mg/kg)Ratón


‐ 35 ‐

VII. BIBLIOGRAFÍA

• González‐Trujano M, Martínez A, Reyes A, Reyes B y Navarrete A. (2006). Palmitote

isolated from Annona diversifolia induces an anxiolytic‐like effect in mice. Planta Medica.

72(8):703‐707

• Oliva I, González‐Trujano M, Arrieta J, Enciso‐Rodríguez R y Navarrete A. (2004).

Neuropharmacological profile of hydroalcoholic extract of Valerina edulis ssp. procera

roots in mice. Phytotherapy Research. 18(4):290‐296.


New York.

• Ugalde M, Reza V, González‐Trujano M, Avula B, Khan I y Navarrete A. (2005).

Isobolographic analysis of the sedative interaction between six central nervous system

depressant drugs and Valeriana edulis hydroalcoholic extract in mice. Journal of

Pharmacy and Pharmacology. 57:631‐639.


‐ 36 ‐

6. Influencia de la vía de administración sobre la respuesta farmacológica.

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis) Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, vías de administración de fármacos.

I. INTRODUCCIÓN

La respuesta farmacológica se puede ver modificada en función de la vía por la cual se

administra el fármaco. La modificación puede consistir en un simple retraso en la acción y en

otros casos puede cambiar o anular totalmente el efecto del fármaco. Algunos fármacos pueden

sufrir transformaciones en el sitio de aplicación, dando origen a nuevas moléculas que no

necesariamente van a presentar el mismo efecto farmacológico o van a seguir la misma

farmacocinética. En otros casos, debido a las propiedades fisicoquímicas del fármaco, no es

posible administrarlo por una vía determinada, por ejemplo un fármaco no soluble en

soluciones acuosas no es posible administrarlo por vía intravenosa. Los fármacos irritantes

también limitan su aplicación por alguna vía determinada, así que la elección de la vía de

administración más adecuada para un fármaco es importante para lograr que se consiga el

efecto deseado a una velocidad y a una intensidad adecuada.

En esta práctica se evaluará la forma en la cual la vía de administración modifica la respuesta de

un fármaco bien caracterizado como es el pentobarbital, para el cual se medirán el período de

latencia y la duración del efecto cuando se administra por distintas vías.


‐ 37 ‐

II. OBJETIVOS


1. Determinar la influencia de la vía de administración en la acción farmacológica del

pentobarbital.

2. Comprender el significado del período de latencia de la acción farmacológica del

pentobarbital.

III. MATERIAL


• 4 ratas Wistar machos de 200‐250 g de peso


• Jeringas de 1 y 3 mL

• Cánula para administración esofágica

• Balanza para pesar animales

• Cronómetro

c) Fármacos y reactivos

• Anestesal® (pentobarbital sódico 6.3 g/100 mL, uso veterinario). Pfizer.

• Disolución de Pentobarbital sódico 40 mg/mL.

Transfiera 6.35 mL de Anestesal® a un matraz volumétrico de 10 mL y llévelo al aforo con

disolución salina.

• Disolución salina fisiológica (0.9%).


‐ 38 ‐

IV. PROCEDIMIENTO

1) Pesado y marcaje de animales

Cada grupo de trabajo recibirá 4 ratas. Marque a sus animales con el marcador de tinta

indeleble, péselos y registre el peso de cada animal.

2) Desarrollo del experimento

a) Asigne aleatoriamente el tratamiento que recibirá cada animal: vía oral, intraperitoneal,

subcutánea o intramuscular y anótelo en el cuadro de abajo. Administre 0.1 mL por cada

100 g de peso de la solución del fármaco por la vía de administración que le corresponde

a cada animal y registre el tiempo al que lo administró en el cuadro de abajo.

b) Registre el tiempo en el cual el animal pierde el reflejo de enderezamiento, que se

caracteriza por el hecho que al ponerlo sobre su dorso no presenta resistencia para

intentar volver a su posición natural.

c) La duración del efecto corresponde al lapso de tiempo entre la pérdida del reflejo de

enderezamiento y el tiempo en el cual el animal vuelve a su posición natural.

d) Cubra al animal con un lienzo de franela para reducir la hipotermia producida por el

fármaco.

e) Registre sus datos en el cuadro siguiente.

INICIO (min)TÉRMINO (min)

DURACIÓN (min)

1

2

3

4

EFECTORATA NÚM.

PESO (g)VÍA DE

ADMINISTRACIÓN

VOLUMEN A ADMINISTRAR

(mL)

TIEMPO DE ADMINISTRACIÓN

(min)


‐ 39 ‐


a) Construya una gráfica para el período de latencia y otro para la duración del efecto en

función de la vía de administración.

b) Realice el análisis estadístico correspondiente para indicar si hay o no influencia de la vía

de administración en el efecto del pentobarbital.

VI. BIBLIOGRAFÍA

• Rowland M y Tozer T. (1995). Clinical pharmacokinetics. 3rd Edition. Lea and Febiger,

EUA.

• Shargel L, Wu‐Pong S y Yu A. (2004). Applied biopharmaceutics and Pharmacokinetics. 5th

Edition. McGraw‐Hill Medical, EUA.


‐ 40 ‐

7. Excreción renal de ácido acetilsalicílico en voluntarios.

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis) Tema relacionado con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, excreción de fármacos

I. INTRODUCCIÓN

La eliminación de fármacos comprende dos procesos la excreción y la biotransformación. La

excreción renal es la principal vía de eliminación para una gran cantidad de fármacos. Cuando

existe una disminución en la eliminación de fármacos por esta vía puede tener complicaciones

importantes, ya que se debe modificar el esquema de dosificación y la dosis del fármaco.

En esta práctica se determinará la eliminación de un fármaco muy común el ácido

acetilsalicílico, cuantificando en la orina la cantidad de salicilatos totales excretados después de

la administración de dos tabletas de 500 mg de este fármaco en voluntarios sanos.

II. OBJETIVOS


1. Comprender la importancia de la excreción renal como uno de los procesos principales

de la eliminación de fármacos.

2. Determinar la eliminación por excreción del ácido acetilsalicílico en voluntarios sanos, así

como los factores que influyen en la misma.


‐ 41 ‐

III. MATERIAL

a) Sujetos de estudio

Criterios de inclusión: Voluntarios adultos jóvenes sanos, de 18 a 20 años de edad, de 55‐65

kg de peso, preferentemente del género masculino.

Criterios de exclusión: No entrarán en el grupo personas con problemas gastrointestinales

(úlcera gastroduodenal, gastritis), historia de alergias, problemas en su función renal o

intolerancia a salicilatos, mujeres con problemas de hemorragias menstruales, ni sujetos

que hayan tomado salicilatos en las últimas 24 horas. Cualquiera de estas contingencias

debe ser informada al profesor.


• Un matraz Erlenmeyer de 100 mL

• 5 matraces Erlenmeyer de 50 mL

• Una gradilla

• 10 tubos de ensayo de 10 mL




• Una probeta de 500 mL




• Un matraz volumétrico de 25 mL

• Seis matraces volumétricos de 10 mL

• Placa de calentamiento

• Cronómetro

• Espectrofotómetro

• Potenciómetro


‐ 42 ‐

d) Fármacos y reactivos

• Agua potable

• Tabletas de ácido acetilsalicílico de 500 mg

• Salicilato de sodio

• Reactivo de Trinder para salicilatos

Se disuelven 10 g de cloruro mercúrico en 200 mL de agua destilada caliente. Cuando la

disolución es completa, se enfría y se añaden 30 mL de ácido clorhídrico 1 N.

Posteriormente se disuelven 10 g de nitrato férrico en la disolución y se afora a 250 mL

con agua destilada.

• Amoniaco acuoso (hidróxido de amonio)

• Disolución de ácido clorhídrico 0.1 N

IV. PROCEDIMIENTO

a) Preparación y toma de muestras

Rotular 5 matraces Erlenmeyer (donde se colocarán la muestras de orina) y 5 tubos de

ensayo con los tiempos 0, 40, 60, 80 y 100 minutos. Anotar en el cuadro adjunto la hora en

la cual se realizarán cada una de las tareas.

Obtención de la muestras se realizará de acuerdo con el cuadro siguiente.


‐ 43 ‐

Tiempo (min)

Hora Actividad a realizar

Desechar la primera orina. Tomar 750 mL de agua potable.

0

Colectar la orina (mínimo 100 mL). Esta será la orina basal. Medir su volumen y anotarlo. Tomar dos tabletas de ácido acetilsalicílico de 500 mg en un volumen de agua igual al orinado. a) Poner 30 mL de esta muestra en un vaso de precipitados.

Ajustar el pH a 7 ± 0.5 con Amoniaco acuoso y/o HCl al 0.1 N. b) De esta muestra pasar 0.5 mL al tubo de ensayo

correspondiente a los cero minutos.

40

Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo. Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo etiquetado con 40 minutos.

60

Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo. Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo rotulado con 60 minutos.

80

Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo. Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo rotulado con 80 minutos.

100

Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo. Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo rotulado 100 minutos.


‐ 44 ‐

b) Análisis de salicilato en orina

Para cada muestra de orina se cuantifica la cantidad de salicilatos excretados de acuerdo al

siguiente procedimiento.

1) Calentar a ebullición los tubos de ensayo con las muestras durante 10 minutos.

2) Enfriar los tubos con agua fría

3) Añadir al tubo 2.5 mL de reactivo para salicilatos. La reacción da un color cuantificable

por espectrofotometría a 525 nm.

4) Realizar una curva estándar pesando 10 mg de salicilato de sodio, disolverlo en agua

destilada, aforar a 10 mL y continuar con se indica en el cuadro siguiente siguiente,

utilizando matraces volumétricos de 10 mL:

TUBO NÚM. VOLUMEN (mL) DE DISOLUCIÓN STOCK DE SALICILATO DE SODIO

(1 mg/mL)

CONCENTRACIÓN (µg/mL)

ABSORBANCIA

1 0 0

2 0.25 25

3 0.5 50

4 1 100

5 2 200

6 3 300

5) La muestra a tiempo cero será utilizada como blanco.

6) Interpolar los valores de absorbancia de las muestras en la curva estándar para obtener

la concentración de salicilatos en la muestra.

7) Los resultados obtenidos se anotarán en el siguiente cuadro.


‐ 45 ‐


1) Construya una gráfica de cantidad excretada acumulada de salicilatos contra el tiempo y

calcule la constante de excreción.

2) Calcule el porcentaje de fármaco excretado por orina en 100 minutos y compárela con la

de otros voluntarios.

VI. BIBLIOGRAFÍA

• Rowland M y Tozer T. (1995). Clinical pharmacokinetics. 3rd Edition. Lea and Febiger.

EUA.

• Shargel L, Wu‐Pong S, y Yu A. (2004). Applied biopharmaceutics and pharmacokinetics.

5th Edition. McGraw‐Hill Medical, EUA.

MUESTRA TIEMPO (min) pH VOLUMEN (mL) ABSORBANCIACONCENTRACIÓN

(µg/mL)CANTIDAD EXCRETADA DE SALICILATOS (µg)

CANTIDAD EXCRETADA ACUMULADA DE SALICILATOS (µg)

BLANCO 0

2 40

3 60

4 80

5 100


‐ 46 ‐

8. Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema simulado.

Número de sesiones sugeridas: 1 sesión (ejecución y análisis) Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacodinamia, agonistas y antagonistas; Farmacometría, relación dosis respuesta gradual.

I. INTRODUCCIÓN

Las lecciones prácticas son una parte importante de la enseñanza de la farmacología en diversas

áreas como la medicina, enfermería y farmacia. Los experimentos in vivo e in vitro han sido

ampliamente utilizados en las lecciones prácticas para ayudar a los estudiantes a adquirir

habilidades en los experimentos farmacológicos, reforzando su conocimiento aprendido con las

clases teóricas y libros.

Aunque los experimentos tradicionales en animales vivos son invaluables, tienen desventajas:

alto consumo de tiempo, dinero y sacrificio de animales; sólo pueden probarse un número

limitado de fármacos en un periodo de tiempo y requieren frecuentemente de un trabajo

constante e intenso.

Una variedad de software ha sido desarrollado para la enseñanza de la farmacología en

pregrado y posgrado. Evidencia previa ha mostrado que esta técnica innovadora de enseñanza

junto con los métodos de enseñanza tradicionales, facilita al estudiante el aprendizaje y mejora

su desempeño en farmacología

En esta sesión se utilizará un sistema de simulación para construir curvas concentración‐

respuesta de agonistas, tal y como se realizarían en un modelo de órgano o tejido aislado.


‐ 47 ‐

II. OBJETIVO


1. Demostrar el efecto concentración dependiente de la Histamina y Carbacol en un

sistema simulado.

2. Determinar el tipo de interacción farmacológica de la Atropina, Mepiramina y

Tubocurarina sobre la actividad de la Histamina y Carbacol en un sistema simulado.

III. MATERIAL

a) Software

• Se utilizará el software Organ Bath Simulation 2006 ver. 1.2 desarrollado por la

Universidad de Strathclyde, Escocia.

El software puede ser descargado del siguiente vínculo:

http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/media/2/OBSim%20V1.2%20Setup.exe

El software deberá ser instalado en una PC o compatible con Microsoft Windows 98 ó

posterior.

IV. PROCEDIMIENTO

A) Manejo del software Organ Bath Simulation 2006 ver. 1.2

Para el uso adecuado del software se dividirá su manejo por procedimiento con

referencia al esquema siguiente:


‐ 48 ‐

1. Inicio del programa y comienzo de un nuevo experimento.

Para iniciar el programa se debe oprimir el siguiente icono:

Para comenzar un nuevo experimento:

a) Seleccione en Tissue type, el tejido Guinea Pig Ileum. Este tejido es el que será

colocado dentro de la cámara de órgano aislado.

b) Oprima el botón New Experiment.

c) Oprime el botón Record, para comenzar la lectura dentro del área de registro.

d) Seleccione y aplique fármacos de la lista de agonistas o antagonistas como se indica a

continuación

Selección del agonista a utilizar

Selección de la concentración del agonista

Selección del volumen a administrar de agonista

Selección del tejido a utilizar

Selección del antagonista a utilizar

Selección de la concentración del antagonista

Selección del volumen a administrar de antagonista

Selección del sitio donde se administrará el antagonista

Botón para iniciar el experimento

Botón para finalizar el experimento

Botón para empezar un nuevo experimento

Área de registro de los datos

Botón de lavado del tejido / cámara

Cursor de medición de la fuerza de contracción


‐ 49 ‐

2. Adición de agonistas a la cámara de órgano aislado.

a) En el apartado Agonist, seleccione el agonista que se utilizará.

b) Seleccione la concentración molar que se utilizará.

c) Introduzca en el volumen a utilizar: 0.10 mL

d) Oprima el botón Add to Organ Bath, para agregar el agonista a la cámara. Registre

por 12 segundos (un cuadro en la línea de tiempo) que equivale a 3 minutos en la

simulación.

e) Para curvas acumulativas, agregue la siguiente concentración de agonista. Para

curvas por lotes o no acumulativas, oprima el botón, Flush Reservoir to Bath, para

lavar el tejido con disolución Krebs.

3. Adición de antagonistas a la cámara de órgano aislado.

a) En el apartado Antagonist, seleccione el antagonista que se utilizará.

b) Seleccione la concentración molar que se utilizará.

c) Introduzca en el volumen a utilizar: 0.10 mL

d) En la lista desplegable que se encuentra a la derecha del botón Add to, seleccione

Organ Bath, y oprima el botón Add to para agregar el antagonista a la cámara.

4. Medición de la respuesta del tejido.

Para medir la amplitud de los picos de las contracciones del tejido:

a) Oprima el botón Stop, para terminar el experimento.

b) Usando la barra de desplazamiento horizontal del área de registro, seleccione la

sección que contiene las contracciones del tejido que serán medidas.

c) Arrastre el cursor de medición al punto de la gráfica de registro que será medido. La

fuerza de contracción (en gramos) será mostrada debajo del cursor.

d) Se sugiere tomar al menos 5 lecturas cercanas dentro de la meseta o área de medida

y obtener el promedio de las lecturas para un mejor resultado.


‐ 50 ‐

B) Experimentos a realizar en el software de simulación.

Experimento 1. Curvas concentración respuesta de agonistas.

a) Seleccione como tejido al íleon de cobayo e inicie un nuevo experimento.

b) Seleccione a Histamina (Histamine) como el agonista a utilizar a una concentración de

1x10‐8 M y un volumen de 0.10 mL.

c) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.

d) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de

registro) y se oprime el botón Add to Organ Bath.

e) Cuando la contracción del músculo se estabilice (se registre una meseta) o hayan

transcurrido 3 minutos de la simulación (si es que no hay contracción), se agrega la

concentración de 1x10‐7 M y así sucesivamente hasta agregar la concentración de 1x100

M.

f) Al terminar la curva, se oprime el botón Stop, se guarda el registro. Y se calcula la fuerza

de contracción por cada concentración agregada.

g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol (Carbachol).

Experimento 2. Efecto de un antagonista en la curva concentración respuesta de agonistas.


b) Seleccione a Histamina como el agonista a utilizar a una concentración de 1x10‐8 M y un

volumen de 0.10 mL.

c) Seleccione a Mepiramina (Mepyramine) como el antagonista a utilizar a una

concentración de 1x10‐6 M y un volumen de 0.10 mL.

d) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.


‐ 51 ‐

e) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de

registro) y se agrega el antagonista a Organ Bath oprimiendo el botón Add to del

apartado Antagonist. Se deja incubar por 3 minutos de simulación.

f) Después de terminada la incubación. Se construye la curva concentración respuesta de

la Histamina como se describe en el experimento 1.

g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol como agonista y Atropina

(Atropine) como antagonista.

h) Adicionalmente realice el mismo experimento utilizando dos concentraciones más del

antagonista con el objeto de tener el efecto del antagonista a tres diferentes

concentraciones, en la acción del agonista.

Nota: Se puede experimentar con combinaciones de agonistas y antagonistas con los que

cuenta el software para demostrar la selectividad de estos últimos.

Experimento 3. Efecto relajante de antagonistas.


b) Seleccione a Histamina como el agonista a utilizar a una concentración de 1x10‐1 M y un

volumen de 0.10 mL.

c) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.

d) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de

registro) y se oprime el botón Add to Organ Bath.

e) Cuando la contracción del músculo se estabilice (se registre una meseta) o hayan

transcurrido 3 minutos de la simulación (si es que no hay contracción), se construye una

curva concentración respuesta con concentraciones crecientes de Mepiramina (de

1x10‐8 M a 1x100 M). Tome en cuenta que ahora la fuerza de contracción disminuirá en

lugar de aumentar.


‐ 52 ‐

f) Al terminar la curva, se oprime el botón Stop, se guarda el registro. Y se calcula la fuerza

de contracción por cada concentración agregada.

g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol a una concentración de 1x10‐3 M y

como antagonista Atropina.

Nota importante: Al igual que en los experimentos in vitro, la concentración real en la

cámara de órgano aislado es 100 menor debido a la dilución 1:100 que se realiza al agregar

0.01 mL de muestra en 10 mL de disolución que contiene la cámara.


1. Con los datos obtenidos del experimento 1:

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol.

b) Determinar el modelo al que se ajustan los datos.

c) Calcular la CE50 para la Histamina y el Carbacol de acuerdo con modelo determinado en

el inciso anterior.

2. Con los datos del experimento 2.

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol con cada uno

de los antagonistas utilizados.

b) Calcular la CE50 para las combinaciones de Histamina y de Carbacol con los antagonistas

utilizados de acuerdo con modelo determinado en experimento anterior.

c) Calcular cuántas veces se disminuyó el efecto del Carbacol y de la Histamina por la

presencia de sus antagonistas.

d) Con las tres curvas concentración‐respuesta de los antagonistas a diferente

concentración, calcule la potencia o pA2 del antagonista.


‐ 53 ‐

3. Con los datos del experimento 3.

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol con cada uno

de los antagonistas utilizados.


c) Calcular la CI50 (Concentración Inhibitoria media) para las combinaciones de Histamina y

de Carbacol con los antagonistas utilizados de acuerdo con modelo determinado en el

inciso anterior.

VI. BIBLIOGRAFÍA

• Samuelsson G. (1991). Assays for pharmacological activity: Non‐specific assays. Methods

in Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 261‐

280.

• Schwinghammer T y Kroboth P. (1988). Basic concepts in pharmacodynamic modeling.

Journal of Clinical Pharmacology. 28:388‐394.

• Tallarida R. (2000). Drug sinergism and dose‐effect data analysis. Chapman & Hall/CRC,

EUA.


‐ 54 ‐

9. Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema de órgano aislado.

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis) Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacodinamia, agonistas y antagonistas; Farmacometría, relación dosis respuesta gradual.

I. INTRODUCCIÓN

Las preparaciones de tejidos u órganos aislados son comúnmente usadas para estudiar los

efectos de un fármaco sobre un tipo específico de receptores. Estas preparaciones son también

utilizadas para bioensayos de fármacos, caracterización de receptores específicos o sus

subtipos, para determinar la curva concentración respuesta de un agonista y, para estudiar

antagonismo entre un fármaco y un nuevo fármaco descubierto.

El íleon de cobayo ha sido una preparación in vitro muy utilizada para estudiar cambios

mediados por receptores, para identificar nuevos receptores, y para determinar la variación en

especies producidas por fármacos anticolinérgicos. Varios receptores, incluyendo los de

histamina, los GABAérgicos y adrenorreceptores se pueden estudiar en este tipo de

preparaciones.

La preparación de íleon de rata puede ser usada para enseñar los conceptos básicos del

bioensayo y para demostrar la actividad espasmolítica de fármacos colinérgicos y

anticolinérgicos. Las ventajas de esta preparación son su bajo costo, fácil implementación y su

facilidad de manejo.

En esta práctica se utilizará la preparación de íleon de rata para determinar el efecto del

Carbacol y Atropina sobre los receptores colinérgicos presentes en la preparación.


‐ 55 ‐

II. OBJETIVOS


1. Demostrar el efecto concentración dependiente del carbacol en íleon de rata.

2. Determinar el tipo de interacción farmacológica de la atropina sobre la actividad del

carbacol en íleon de rata.

III. MATERIAL

c) Material biológico

• Una rata Wistar hembra de 200‐250 g de peso, con ayuno de 12 h y libre acceso al agua

d) Materiales, cristalería y equipo

• Vaso de precipitado de 1 L

• Pipetas graduadas de 1 mL

• 6 matraces aforados de 10 mL

• Estuche de disección

• Placa de agitación

• Balanza analítica

• Polígrafo Biopac System acoplado a una computadora con el software AcqKnowledge

versión 3.7

e) Reactivos

• Disolución Krebs‐Henseleit (KHS).

Composición en mM: NaCl 118, KCl 4.7, MgSO4.7H2O 1.2, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2, NaHCO3

25, glucosa (C6H12O6) 11.


‐ 56 ‐

Cantidades de las sales para preparar 1000 mL de disolución Krebs‐Henseleit (KHS)

D‐glucosa C6H12O6 1.998 g

Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4 7H2O 0.2956 g

Dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 0.1632 g

Cloruro de potasio KCl 0.351 g

Cloruro de sodio NaCl 6.903 g

Hidrógenocarbonato de sodio NaHCO3 2.1 g

EDTA disódico dihidratado C10H14O8N2Na2 2H2O 0.0117 g

Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 2H2O 0.3677 g

Se disuelven todas las sales, una por una, en aproximadamente 500 mL de agua

destilada. Disolviendo al último el cloruro de calcio. Una vez disueltas las sales y sin

signos de precipitación se lleva a un volumen de 1000 mL con agua destilada.

La disolución KHS deberá tener un pH de 7.4 a 37ºC y se mantendrá con burbujeo

constante de gas carbógeno (95% O2 y 5% CO2). Si presenta precipitación deberá

prepararse nuevamente.

• Disoluciones de Carbacol (1x10‐4, 3x10‐5, 1x10‐5, 3x10‐6 y 1x10‐6 M).

Preparación de la disolución Stock (1x10‐3 M).

Disolver 1.825 mg de carbacol en agua destilada y aforar a 10 mL .

Preparación de las disoluciones.

Una vez preparada la disolución stock deberá seguirse la serie de diluciones como se

muestra en el siguiente esquema, utilizando matraces aforados de 10 mL:


‐ 57 ‐

• Disolución de Sulfato de Atropina (1x10‐6 M).

Se pesan 1.692 mg de sulfato de atropina, se disuelven agua destilada y se afora aun

volumen de 10 mL (disolución Stock). A continuación se sigue el esquema de diluciones

como se indica:

IV. PROCEDIMIENTO

a) Manejo del Polígrafo Biopac System

Para el manejo adecuado del Polígrafo Biopac System por medio del software

AcqKnowledge, véase el Apéndice III de esta guía.

Disol. Stock1x10‐3 M

1x10‐4 M 1x10‐5 M 1x10‐6 M

3x10‐5 M 3x10‐6 M

1 mL1 mL

1 mL

1 mL0.3 mL

Cada matraz debe aforarse a

10 mL

Disol. Stock2.5x10‐4 M

5x10‐5 M

1 mL2 mL

2 mL

Cada matraz debe aforarse a 10 mL

1x10‐5 M 1x10‐6 M


‐ 58 ‐

b) Disección del íleon de rata

1) Sacrificar la rata en la cámara de CO2 o por dislocación cervical.

2) Abrir el abdomen y realizar la disección del íleon. La localización del íleon se muestra en

el siguiente esquema.

3) Disecar una longitud aproximada de 10–12 cm de íleon, lavarlo con disolución KHS hasta

que la luz intestinal quede libre materia orgánica.

4) Cortar segmentos de aproximadamente 1 cm de largo y colocarlos en disolución KHS,

con burbujeo continuo de gas carbógeno.

c) Montaje de preparación.

1) Cada preparación se suspenderá en una cámara para órgano aislado con ganchos de

alambre de nicromel, que se incrustan en el tejido. Uno de los extremos se fija a la

cámara y el otro al transductor de fuerza conectado al Polígrafo Biopac System, de

acuerdo a las siguientes figuras:

1. Estómago

2. Duodeno

3. Yeyuno

4. Íleon

5. Ciego

6. Colon


‐ 59 ‐

2) Cada cámara deberá contener 10 mL de solución KHS con burbujeo constante de gas

carbógeno a una temperatura de 37±1ºC.

3) El tejido se somete a una tensión inicial de 1 g dejándolo estabilizar por 20 minutos, con

un lavado intermedio a los 10 minutos.

4) Realizar 2 estimulaciones con 100 µL de carbacol (1x10‐4 M) a intervalos de 20 minutos,

con un lavado intermedio a los 10 minutos Después de cada estimulación se lava el

tejido con solución KHS dos veces para eliminar al Carbacol.

Nota: La concentración real en la cámara de órgano aislado es 100 veces menor debido a

la dilución (1:100).

5) El cronograma de los pasos 2 a 4 es el siguiente:

Tiempo corrido (min) Actividad

0 Inicio

(Oprimir el botón Start) 10 Lavado con KHS

20 Estimulación 1 y Lavado con KHS

30 Lavado con KHS


50 Lavado con KHS

60 Lavado con KHS

70 Inicio de las evaluaciones


‐ 60 ‐

d) Curva acumulativa concentración respuesta del Carbacol.

1) Estando estable el tejido, se registra una línea basal durante 5 minutos y se adicionan 0.1

mL de Carbacol 1x10‐6 M (disolución 1). Las siguientes disoluciones se agregarán

sucesivamente en el momento en que la disolución anterior alcance una meseta de

contracción.

Disolución Concentración de Carbacol

1 1x10‐6 M

2 3x10‐6 M

3 1x10‐5 M

4 3x10‐5 M

5 1x10‐4 M

2) Después de evaluar se lava el tejido por dos veces con disolución KHS dejando reposar

por periodos de 10 minutos entre cada uno.

d) Efecto de la Atropina en la acción del Carbacol

1) Estando estable el tejido, se registra una línea basal durante 5 minutos y se adicionan 0.1

mL de Atropina 1x10‐6 M.

2) Se deja incubar el tejido con la Atropina durante 5 minutos y posteriormente se realiza la

curva acumulativa concentración respuesta como se indicó en el inciso e).


1. Para analizar los datos es necesario descargar el software AcqKnowledge 3.9 Demo en la

siguiente dirección electrónica:

http://www.biopac.com/Demos.asp?did=4&PCDemoResearch=Y


‐ 61 ‐

Es necesario registrase para descargarlo, y debe instalarse como indican las instrucciones

del sitio web.

Con ayuda del software y de su profesor deberá llenar el cuadro de datos anexa.

2. Con los datos obtenidos:

a) Construir las curvas concentración respuesta de Carbacol y de Carbacol+Atropina.


1 2 3 4

Basal

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4

Basal

1

2

3

4

5

6

MUESTRA / CANAL

TABLA DE DATOS DEL EXPERIMENTO

EXPERIMENTO 1. CARBACOL

EXPERIMENTO 2. CARBACOL + ATROPINA (1X10‐6 M)

NÚM.CONCENTRACIÓN (M) CARBACOL

LOG [CONC (M)]MUESTRA / CANAL

NÚM.CONCENTRACIÓN (M) CARBACOL

LOG [CONC (M)]


‐ 62 ‐

c) Calcular las CE50 para el Carbacol y para Carbacol+Atropina, de acuerdo con modelo

determinado en el inciso anterior.

d) Calcular cuántas veces se disminuyó el efecto del carbacol por la presencia de la

Atropina.

e) Determinar el tipo de interacción de la Atropina sobre la acción del Carbacol.

VI. BIBLIOGRAFÍA

• Samuelsson G. (1991). Assays for pharmacological activity: Non‐specific assays. Methods

in Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 261‐

280.

• Schwinghammer T y Kroboth P. (1988). Basic concepts in pharmacodynamic modeling.

Journal of Clinical Pharmacology. 28:388‐394.

• Tallarida R. (2000). Drug sinergism and dose‐effect data analysis. Chapman & Hall/CRC,

EUA.


‐ 63 ‐

APÉNDICE I. Tabla de conversión de proporción a unidades Probit.

TABLA DE CONVERSIÓN DE PROPORCIÓN (pi) A UNIDADES PROBIT (yi)

pi 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

0.00 ‐‐‐ 2.673 2.945 3.119 3.249 3.355 3.445 3.524 3.595 3.659

0.10 3.718 3.773 3.825 3.874 3.920 3.964 4.006 4.046 4.085 4.122

0.20 4.156 4.194 4.228 4.261 4.294 4.326 4.357 4.388 4.417 4.447

0.30 4.476 4.505 4.532 4.561 4.588 4.615 4.642 4.669 4.695 4.721

0.40 4.747 4.773 4.798 4.824 4.849 4.874 4.900 4.925 4.950 4.975

0.50 5.000 5.025 5.050 5.075 5.100 5.125 5.151 5.176 5.202 5.227

0.60 5.253 5.279 5.305 5.331 5.358 5.385 5.412 5.439 5.467 5.495

0.70 5.524 5.553 5.582 5.612 5.643 5.674 5.706 5.739 5.771 5.806

0.80 5.841 5.878 5.915 5.954 5.994 6.036 6.080 6.126 6.175 6.227

0.90 6.282 6.341 6.405 6.476 6.555 6.645 6.751 6.881 7.054 7.327

pi 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009

0.97 6.88 6.896 6.911 6.927 6.944 6.960 6.978 6.996 7.014 7.034

0.98 7.054 7.075 7.097 7.121 7.145 7.171 7.198 7.227 7.258 7.291

0.99 7.327 7.366 7.409 7.458 7.513 7.576 7.652 7.748 7.879 8.091

APÉND

I. MANEJ Los raton

cola, la b

levantado

ratones d

podría es

Para la i

proceder

Se toma

sobre la r

con los d

mano de

inmoviliz

DICE II. Td

JO DEL RATÓ

nes, así com

base de la

o en posició

distancias co

scalar la mism

Figura 1. Form

nmovilizació

rá de la sigui

al ratón co

reja de la ca

edos índice

e manera q

ación evita q

Técnicasde labor

ÓN.

o la mayoría

cola es suje

ón vertical.

ortas. Se deb

ma y morde

ma correcta de ma

ón del ratón

ente maner

omo se expli

ja (figura 3)

y pulgar se t

que el vien

que el ratón

Farmacología

s de manratorio (

a de los anim

etada entre

Esta técnic

be tener cui

r la mano (fi

anejar un ratón.

n con el ob

a:

icó anterior

, se toma ah

toma de la p

ntre del rat

se voltee o

a I. Guión de P

‐ 64 ‐

nejo e id(rata y ra

males de lab

los dedos

ca resulta m

dado de no

igura 1 y 2).

Figura

jetivo de ad

mente, y el

hora la cola d

piel de la nu

tón quede

se mueva a

Prácticas.

dentificaatón).

boratorio, p

pulgar e índ

muy útil par

sujetarlo po

a 2. Forma incorre

dministrarle

peso del c

del ratón po

ca (figura 4

expuesto (

l momento d

ación de

ueden ser le

dice y el ra

ra manejar y

or la punta

ecta de manejar un

e un fármac

uerpo del r

or medio del

y 5). Se volt

(figura 6 y

de la admini

animale

evantados p

atón entonc

y trasladar

de la cola ya

n ratón.

o o sustanc

atón es apo

l dedo meñi

ea y se leva

7). Una b

istración.

es

por su

es es

a los

a que

cia se

oyado

que y

nta la

buena

Una vez

teniendo

II. MANE La rata d

tiempo d

en distan

Para la i

explicará

Fig

inmovilizado

o cuidado de

JO DE LA RA

debe maneja

debido a los

ncias muy co

nmovilizació

n las más ut

ura 3.

F

o el ratón se

sujetarlo fir

ATA.

arse por la

movimiento

ortas y no se

ón de la rat

tilizadas.

Farmacología

Figura 6.

e puede pro

rmemente.

base de la c

os que realiz

deberá suje

Figura 8. Forma co

ta de labora

a I. Guión de P

‐ 65 ‐

Figura 4.

oceder a la

cola y evitar

za (figura 8)

etar por la pu

orrecta de maneja

atorio existe

Prácticas.

Figura 7.

administrac

r levantarla

. El traslado

unta de la co

ar a una rata.

en muchas

Figura 5.

ión del fárm

de esta ma

o se realizará

ola.

técnicas. A

maco o susta

anera por m

á de esta ma

continuació

ancia,

mucho

anera

ón se

Técnica 1 Se sujeta

el cuello

extremid

levanta l

(figura 1

expuesto

Técnica 2 Se sujeta

el cuello

queden a

cierra ést

se sujeta

1.

a la rata po

de la rata

ades anterio

a mano y la

2 y 13). Se

o el vientre.

Fig

2.

a la rata po

de la rata e

a la altura d

ta de maner

la cola con

or la base de

entre los

ores y el ab

a cola es su

levanta la

ura 9.

Figura 12

or la base de

entre los de

de las extrem

ra que las ex

la mano der

Farmacología

e la cola con

dedos med

domen sin

ujetada con

mano y la

2.

e la cola con

edos pulgar

midades ant

xtremidades

recha para d

a I. Guión de P

‐ 66 ‐

n la mano de

io e índice.

hacer presió

la mano iz

cola es suje

Figura 10.

n la mano de

e índice (fig

teriores. Con

s anteriores

ejar expuest

Prácticas.

erecha y con

. La rata en

ón sobre el

zquierda par

etada con l

Figura

erecha y con

gura 14 y 15

n el movimi

de la rata q

to el vientre

n la mano izq

ntonces es

cuello (figur

ra dejar exp

a mano de

Figura 11.

13.

n la mano izq

5) de mane

ento natura

ueden cruza

e (figuras 16

quierda se c

sujetada po

ra 9, 10 y 11

puesto el vi

recha para

quierda se c

ra que los d

al de la man

adas, se leva

6, 17 y 18).

oloca

or las

1). Se

entre

dejar

oloca

dedos

no, se

anta y

III. MARC La técnica

realiza en

muestra

en exper

Figura 1

Figu

CAJE DEL RA

a recomend

n la cola de

en las figura

imentos mu

19. Marcaje en la c

ura 14.

Figura 17

ATÓN Y LA RA

ada para el

el animal po

as 19 a 24. E

y cortos en

cola con marcador

Farmacología

7.

ATA.

marcaje de

or medio de

Esta técnica

duración.

r. Figura 20. Rató

a I. Guión de P

‐ 67 ‐

Figura 15.

ratones y ra

e un marcad

se recomie

n marcado con el

Prácticas.

Figura

tas en el Lab

dor indelebl

nda cuando

número 1. Figura

Figura 16.

18.

boratorio de

e, siguiendo

se utilizan

a 21. Ratón marcad

e Farmacolog

o la clave q

pocos anima

do con el número

gía se

ue se

ales y

2.

Figura

IV. BIBLIO

• Sh

an

22. Ratón marcad

OGRAFÍA

hort D y Wo

nd technique

o con el número 3

odnott D (ed

es. Charles C

Farmacología

3. Figura 23. Rató

Figura 25. Ratón

ditores). (19

C. Thomas‐P

a I. Guión de P

‐ 68 ‐

n marcado con el

n marcado con el

63). The A.T

ublisher, EU

Prácticas.

número 4. Figura

número 6.

T.A. manual o

UA: 47‐57.

a 24. Ratón marcad

of laborator

do con el número

ry animal pra

5

actice


‐ 69 ‐

APÉNDICE III. Instructivo para el uso del polígrafo Biopac System MP‐100.

I. MATERIALES Y REACTIVOS.

• Polígrafo Biopac System MP‐100A‐CE

• Gas carbógeno (oxigeno 95%‐dióxido de carbono 5%).

• Disolución Krebs‐Henseleit (KHS)

Disolución Krebs‐Henseleit (KHS)

D‐glucosa C6H12O6 1.998 g

Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4 7H2O 0.2956 g

Dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 0.1632 g

Cloruro de potasio KCl 0.351 g

Cloruro de sodio NaCl 6.903 g

Hidrógenocarbonato de sodio NaHCO3 2.1 g

EDTA disódico dihidratado C10H14O8N2Na2 2H2O 0.0117 g

Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 2H2O 0.3677 g

Preparación: Se disuelven todas las sales en aproximadamente 500 mL de agua

destilada. Disolviendo en último término al Cloruro de calcio. Una vez disueltas las sales

y sin signos de precipitación se lleva a un volumen de 1000 mL con agua destilada.

• Disolución de Acetilcolina 3x10‐5 M

• Disolución de Norepinefrina 1x10‐6 M

• Disolución de Carbacol 1x10‐4 M

II. PROCE

A

1.

2.

3.

Se

de

4.

EDIMIENTO.

. Calibración

. Se verifica q

. Se enciend

. Se verifica

e enciende y

e agua que m

. En la panta

n del polígra

que todos lo

e la comput

que el nivel

y deja estab

mantiene la

lla de la com

Farmacología

afo.

os canales es

adora y el p

l de agua de

bilizar la tem

temperatur

mputadora s

a I. Guión de P

‐ 70 ‐

stén firmem

olígrafo opri

el baño recir

mperatura en

a de la disol

e selecciona

Prácticas.

ente conect

imiendo el b

rculador cub

n 37±1°C. Es

ución KHS a

a el icono

tados y ajust

botón en la p

bra la resiste

ste baño pro

dicha temp

tados.

posición ON.

encia y la bo

oporciona el

eratura.

.

omba.

l flujo


‐ 71 ‐

para iniciar el programa AcqKnowledge, el cual registra los datos provenientes del

Polígrafo.

5. Al comenzar el programa se abre la ventana que se ilustra enseguida.

6. Para comenzar la configuración del polígrafo se selecciona en el menú la opción

MP100, y posteriormente la opción Setup Channels que nos abrirá una ventana emergente.


‐ 72 ‐

7. En la ventana emergente Input Channels, se activan los canales que se utilizarán

seleccionando las casillas Acquire, Plot y Values con √ para cada canal An.

8. Para la calibración de cada canal se selecciona primero el canal y se oprime el

botón con el cual aparecerá la siguiente ventana emergente.

9. En las casillas Scale value se colocan 0 (cero) y 2 (dos) y en Units se coloca g (gramos)

como se muestra a continuación.


‐ 73 ‐

10. Con el valor Scale value = 0, se oprime el botón y el programa automáticamente

calculara el valor Input volts correspondiente a 0 g (cero). Con el valor Scale value = 2, se

coloca una pesa de 2 gramos sobre el transductor y se oprime el botón , el programa

entonces, automáticamente calculará el valor Input volts correspondiente a 2 g (dos

gramos). Al terminar se oprime el botón OK.

Este procedimiento se repite con cada canal que se utilizará.

11. Continuando con la calibración, se selecciona en el menú la opción MP100, y

posteriormente la opción Setup Acquisition.

12. Al seleccionar la opción Setup Acquisition se abrirá la siguiente pantalla emergente.


‐ 74 ‐

13. En la pantalla emergente Setup Acquisition, se seleccionará las opciones Record and

Save once to Disk acquisition. Posteriormente se seleccionará Acquisition Sample Rate

en 0.5 ó 1.0 samples /second, y en Total lengh se seleccionará el máximo en horas,

como se muestra a continuación.

14. El Polígrafo ya está calibrado y se puede seguir con el montaje del tejido.

B. Montaje del tejido.

1. Antes de montar el tejido se selecciona en el software AcqKnowledge se selecciona en

el menú la opción MP100, y posteriormente la opción Show Input Values.


‐ 75 ‐

2. Al seleccionar nos abrirá una ventana emergente que nos muestra los valores que se

registran en el Polígrafo.

En la ventana emergente se oprime el botón n y después el botón Options. En esta

última ventana se seleccionan Channel numbers, Units y Values, y el tamaño de letra

adecuado para su visualización (se recomienda de 14‐18 puntos). Al terminar se oprime

el botón OK.


‐ 76 ‐

3. Se realiza la disección del tejido a utilizar de acuerdo a lo reportado en la literatura. En

caso de íleon o tráquea de cobayo o aorta de rata el tejido se cortará en anillos para su

montaje.

4. Para aorta y traque el tejido es sujetado por medio de ganchos de alambre Nicromel

como se muestra en la figura.

Para íleon el tejido es montado de acuerdo a la siguiente figura, insertando el tejido en

los ganchos:

5. Los ganchos junto con el tejido son colocados dentro de la cámara de órgano aislado

previamente llena con KHS y con burbujeo constante de gas carbógeno, como se

muestra a continuación.

Tejido

Anillos deNicromel

Hilo

Tejido

Anillos deNicromel

Hilo


‐ 77 ‐

6. Se le da una tensión a cada tejido de cada cámara, por medio del tensor del

transductor de acuerdo con el siguiente cuadro.

Tejido Tensión

Aorta de rata 4.0 gramos

Traquea de cobayo 1.5 gramos

Íleon de rata 1.0 gramos

7. Se oprime el botón Start para comenzar el registro del experimento.

Cámara

Transductor

Medio KHS

Gas carbógeno


‐ 78 ‐

8. Al oprimir el botón Start, comenzará el registro como se muestra a continuación.

9. Para personalizar las opciones de visualización se recomienda consultar el siguiente

cuadro.

BOTÓN NOMBRE DEL BOTÓN EFECTO

Scope Mode

(muestra todos los canales juntos)

Chart Mode

(muestra cada canal por separado)


‐ 79 ‐

Show / Hide Journal

(Muestra / oculta la ventana de

anotaciones en la parte inferior)

Show / Hide Markers

(Muestra / oculta la barra de marcadores

de evento. Para agregar un marcador se

oprime la tecla F9)

Show / Hide Grid

(Muestra / oculta la rejilla)

Oprimir sobre el eje

Y

Set Screen Vertical Axis

(Cambia la visualización del eje Y. Se

recomienda un Scale Setting = 1 g)

Oprimir sobre el eje

X

Set Screen Horizontal Axis

(Cambia la visualización del eje X. Se

recomienda un Scale = 15 minutes)


‐ 80 ‐

C. Estimulación del tejido para el experimento.

1. Una vez montados los tejidos se procederá a su estimulación de acuerdo con el

siguiente cuadro.

Tejido Sustancia para estimulación

Concentración

Aorta de rata Norepinefrina 1x10‐6 M

Traque de cobayo Acetilcolina 3x10‐5 M

Íleon de rata Carbacol 1X10‐4 M

2. El cronograma de estimulación y lavado de los tejidos se realizará como sigue.

Tiempo corrido (min)

Actividad

0 Inicio (Oprimir el botón Start)

15 Lavado con KHS


40 Lavado con KHS


60 Lavado con KHS

70 Lavado con KHS

80 Inicio de las evaluaciones

3. En el minuto 80, se puede iniciar la evaluación de las sustancias de acuerdo a lo

reportado en la literatura y a los objetivos establecidos.


‐ 81 ‐

III. BIBLIOGRAFÍA

• Estrada S, et al. (1999). Nitric oxide/cGMP mediates the spasmolytic action of 3,4'‐

dihydroxy‐5,5'‐ imethoxybibenzyl from Scaphyglottis livida. Planta Medica. 65(2):109‐

114.

• Hsieh G, et al. (2003). YC‐1 potentiates the nitric oxide/cyclic GMP pathway in corpus

cavernosum and facilitates penile erection in rats. European Journal of Pharmacology.

458:83‐189.

• Sánchez‐Mendoza M, et al. (2007). Mechanisms of relaxant action of a crude hexane

extract of Gnaphalium liebmannii in guinea pig tracheal smooth muscle. Journal of

Ethnopharmacology. 111:142–147.

Documents

Guia Farmacologia 2008-1 - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/ManualFarma1_24332.pdf · Farmacología I. Guión de Prácticas. ‐ 3 ‐ Tabla de contenido. PRÁCTICAS