Guia de Metodos de Analisis Por HPLC

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELAESCUELA DE QUIMICAFACULTAD DE CIENCIASINSTRUMENTAL ANALITICO

GUIA DE METODOS DE ANALISIS POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

Caracas 2008Profa. Rosa AmaroProf. Luis Gómez

Prfa. Yosmery Vita

TABLA DE CONTENIDO

ContenidoDeterminación de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C.................................................................3

Justificación...............................................................................................................................................3

Objetivos....................................................................................................................................................3

Parte Experimentales.................................................................................................................................3

Referencia..................................................................................................................................................5

Determinación de cafeína en refresco (PEPSI)..............................................................................................6

Justificación...............................................................................................................................................6

Objetivos....................................................................................................................................................6

Parte Experimentales.................................................................................................................................7

Determinación cualitativa y cuantitativa de HAP en particulado atmosférico..............................................9

Justificación...............................................................................................................................................9

Objetivos....................................................................................................................................................9

Parte Experimental...................................................................................................................................10

Determinación del ácido hipúrico, y los isómeros orto, meta y para del ácido metil hipúrico en muestra biológica.......................................................................................................................................................13

Justificación.............................................................................................................................................13

Objetivos..................................................................................................................................................14

Parte Experimental...................................................................................................................................14

Referencias...............................................................................................................................................16

Bibliografía..................................................................................................................................................17

Determinación de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C.

Justificación

Objetivos.

General:General:

Determinar el contenido de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C usando la técnica de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC), a fin de familiarizar al alumno en el uso de dicha técnica.

Específicos:Específicos:

Adiestrar al alumno de forma general en el manejo de equipos de cromatografía líquida de alta eficiencia.

Aprender el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtración yAprender el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtración y desgasificación de los mismos.desgasificación de los mismos.

Ajustar los parámetros instrumentales, que permitan obtener una buena separación de los picos en la muestra de vitamina C.

Preparar patrones de ácido ascórbico. Analizar cuantitativamente la pastilla de vitamina mediante el uso de una

curva de calibración.

Parte Experimentales

Instrumentación

Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco

PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire.

Detector: UV/Vis – 2075 plus ( Fotomultiplicador)

Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL

Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Diámetro interno: 4.6 mm y

Tamaño de partícula: 5 (μm)

Preparación del Sistema HPLC

1. Emplear eluentes grado HPLC.

2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica.

3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con

ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He..

4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separación cromatográfica

para poder realizar la purga con estos.

5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la bomba

(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow

en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como

preestablecido luego de esto presionar el botón “pump” para encender la

bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente.

6. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo

contrario si se va emplear mezcla de eluente colocar programación de los

mismos.

7. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera se

hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a

la bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,1

en 0,1 mL/min hasta llegar a 1 mL/min.

8. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la

muestra a analizar y los patrones para la cuantificación.

Condiciones Experimentales

Volumen de inyección 10μL

Detección a 254 nm

Flujo: 1mL/min

Fase móvil: 50 mM de KH2PO4

Preparación de la curva de calibración.

Se prepara una madre de 200 ppm de acido ascórbico.

Se prepararon cuatro patrones de 5/10/15/ 20 ppm

Se inyectan al HPLC y se realiza una curva de calibración graficando los valores de área de pico en función de la concentración

Preparación de la muestra

Se pesa la pastilla inicialmente (Dato que debe ser colocado en el informe)

Se pulveriza la pastilla:Se pulveriza la pastilla:

se pesan tres muestras de 0.30000 gse pesan tres muestras de 0.30000 g

Se disuelven en agua y se enrazan en 100mL.Se disuelven en agua y se enrazan en 100mL.

Se realiza una dilución de 0.40mL en 25 mL de cada una despuésSe realiza una dilución de 0.40mL en 25 mL de cada una despuésde filtrar la muestra en un filtro de celulosade filtrar la muestra en un filtro de celulosa

Se inyectan al cromatografo

Referencia

Cavazos R, N. A.; Rivera Z, L.; Torres de Navarro, E. “Determinación de fósforo y cafeína en

bebidas de cola”. Educación química. V.12, pág. 116-120, año.2001.

http://www.fad.es/sustancias/psicofármacosestimulantes., Revisado 12/11/07.

Determinación de cafeína en refresco (PEPSI)

JustificaciónUn grupo importante de consumidores de refrescos es la población universitaria. Se

piensa que los refrescos de cola son bebidas relativamente inofensivas y que un

excesivo consumo de estos productos no causa más daño que caries dental y un aumento

de peso debido al alto contenido de azúcar. Un refresco contiene ácido fosfórico,

cafeína y nuez de cola entre sus componentes principales, estos elementos pueden llegar

a causar diferentes trastornos al organismo. El fósforo está relacionado con el calcio

tanto en la nutrición humana como en la absorción de este mineral... La cafeína, por su

parte, es la droga psicotrópica de mayor consumo en el mundo, es un compuesto

alcaloide (del grupo de las xantinas) que actúa como estimulante en los humanos. La

cafeína produce vasoconstricción; presenta efectos a nivel de los sistemas

cardiovasculares, respiratorios y gastrointestinales. Adicionalmente, actúa a nivel de los

músculos esqueléticos, del flujo sanguíneo renal, la glucogenólisis y de la lipólisis. El

consumo en cantidades muy grandes puede provocar una intoxicación. Sus síntomas son

insomnio, nerviosismo, excitación, cara rojiza, aumento de la diuresis y problemas

gastrointestinales. En algunas personas los síntomas aparecen consumiendo cantidades

muy pequeñas, como 250 mg por día. Más allá de un gramo al día puede producir

contracciones musculares involuntarias, desvaríos, arritmia cardiaca, y agitaciones

psicomotrices. Los síntomas de la intoxicación con cafeína son similares a los del

pánico y de ansiedad generalizada. La *LD50 estimada de la cafeína es de 10 g, cuyo

equivalente es de un promedio de 51 tazas de café.

Objetivos

General: Determinar el contenido de cafeína en una lata de refresco (PEPSI) por HPLC.

Específicos: Ajustar las condiciones experimentales para la determinación de la cafeína en el refresco. Determinar el contenido de cafeína en la muestra problema aplicando el método de calibración absoluta. Determinar la exactitud y la precisión de los resultados analíticos obtenidos a través del método aplicado.

http://es.wikipedia.org/wiki/LD50

http://es.wikipedia.org/wiki/Ansiedad

http://es.wikipedia.org/wiki/P%C3%A1nico

http://es.wikipedia.org/wiki/Estimulante

http://es.wikipedia.org/wiki/Metilxantina

http://es.wikipedia.org/wiki/Alcaloide

Parte Experimentales

Instrumentación










3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con ultrasonido o

3 min con burbujeo de gas He..



5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la bomba (solo

dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow en un

valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido

luego de esto presionar el botón “pump” para encender la bomba y dejar la purga

por 5 min. aproximadamente.

6. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo contrario si

se va emplear mezcla de eluente colocar programación de los mismos.


hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a la

bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1

mL/min hasta llegar a 1 mL/min.

8. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra a

analizar y los patrones para la cuantificación.



Detección a 254nm

Flujo: 1mL/min

Fase móvil: 60% agua, 40% metanol

Preparación de la curva de calibración.

Preparación de la muestra

Se prepara una madre de 2000 ppm de cafeína.

Patrón de 100 ppm

Se prepararon cinco patrones de 10/20/30/ 40/50 ppm

Se inyecta los patrones y se realiza una curva de calibración graficando los valores de área de pico en función de la concentración

La muestra es desgasificada en un ultrasonido por 15 min o una corriente de He por 3 min.

La muestra es diluida en un factor de ~1/4, se filtra en un filtro de celulosa y esta se inyecto directamente al cromatógrafo

Determinación cualitativa y cuantitativa de HAP en particulado atmosférico

JustificaciónEl particulado atmosférico contiene muchos metales pesados, óxidos acídicos, sustancias orgánicas y virus bacteriales, los cuales afectan el ambiente atmosférico y causan daños a la salud humana. Por lo tanto, el estudio del particulado atmosférico es un campo vital de la ciencia ambiental. Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) están ampliamente distribuidos en el ambiente, y algunos tipos de PAHs tienen características orgánicas carcinógenas y/o mutagénicas.Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son compuestos constituidos por anillos bencénicos condensados. Son compuestos cancerígenos cuyos efectos se activan por medio de una enzima, el citocromo P450, presente en el hígado. Esta enzima metaboliza el tolueno y otras sustancias xenobióticas (moléculas extrañas al organismo). La enzima incorpora oxígeno a la estructura del PAH, originando aductos tipo epóxidos, que reaccionan fácilmente con las bases heterocíclicas del ADN, alterando los genes.Los PAHs se forman como subproductos de la combustión del carbón. Aunque se encuentran presentes a bajas concentraciones en los gases de escape de los automóviles, su presencia aumenta en las partículas de hollín emitidas por los motores Diesel o en el humo desprendido en la quema de carbón o incendios forestales.En los últimos años, se ha focalizado la investigación de los PAHs en particulado atmosférico, en particular, se ha evaluado el tipo de particulado, distribución del tamaño de partícula, la concentración y fuentes de PAHs, específicamente, por técnicas cromatográficas acoplados a masas. Basados en todas la investigaciones previas, el objetivo de este trabajo es, determinar y cuantificar los PAHs presentes en muestras determinadas de particulado, atmosférico y de suelos, por medio de cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta eficiencia a fin de comparar los resultados obtenidos por ambas técnicas y establecer las ventajas y desventajas de cada técnica

ObjetivosGeneral

Análisis cualitativa de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en una

muestra de particulado atmosférico líquida de (naftaleno, antraceno,

fenantreno, fluoreno y criceno)

Determinación cuantitativa de los HAP en una muestra de Particulado

atmosférico.

Específicos

Familiarizar al estudiante con el uso de equipos de cromatografía de

líquidos (HPLC).

Adiestrar al estudiante en el procedimiento de inyección de la muestra y en

la manipulación y mantenimiento de la jeringa y la columna.

Estudiar los diferentes parámetros operativos que pueden afectar la

separación (fase móvil, flujo) y encontrar las condiciones óptimas de

análisis.

Realizar el análisis cualitativo por (HPLC) para la identificación de los

componentes de la muestra mediante el uso de estándares.

Análisis cuantitativo de HAP en particulado atmosférico.

Parte Experimental

Instrumentación





















la bomba. Al estabilizarse aumentar el flujo de 0,1 a 2 mL/min y esperar

unos 10 min.


muestra a analizar y los patrones para la identificación y cuantificación.



Detección a 254 nm

Flujo: 2mL/min

Fase móvil: 80% acetonitrilo-20% agua desionizada 5 min, 1 min para

llevar a 100% de acetronitrilo y 5 min

Preparación de muestra

Para la muestra pese 0,5 g y extraiga con 5 mL de acetronitrilo por una hora en un ultrasonido, filtre en forma cuantitativa la solución y recoja el filtrado en un balón de 25 mL. La muestra antes de inyectar debe ser filtrada con un filtro para jeringa para solvente orgánico de 0,45 um

Preparación de Patrones

Prepara los siguientes patrones disolviéndolos en Metanol:

Tabla 1. Concentración de los hidrocarburos aromáticos policiclicos.

Compuesto Peso (g)Pureza (%)

Volumen aforo (mL)

Concentración (ppm)

Naftaleno 50Antraceno 50Fenantreno 50Fluoreno 50Criceno 50

Con estas soluciones madres se hallara el factor de dilución de manera de no saturar el sistema, para ello inyecte estas soluciones y luego estime las diluciones necesarias.

Una vez obtenidas las diluciones de los patrones, inyecte los mismos para determinar los tiempos de retención de cada HAP.

Inyecte la muestra e identifique que componentes están presentes en la misma

Una vez identificado los componentes de la muestra realice las curvas de calibración directa de cada componentes preparando 4 patrones que se encuentren dentro de los rangos recomendados en la tabla 2

Tabla 2. Rango de concentración recomendados para prepara los patrones para la curva de calibración.

Compuesto Rango de concentración para la curva de calibraciónNaftaleno 1-5 ppmAntraceno 0,01-0,05 ppmFenantreno 0,5-1 ppmFluoreno 1-5 ppmCriseno 1-5 ppm

Inyecte la muestra por triplicado una vez encontrada la dilución adecuada de la misma.

Determinación del ácido hipúrico, y los isómeros orto, meta y para del ácido metil hipúrico en muestra biológica

JustificaciónLos solventes orgánicos se utilizan ampliamente en la industria química en general; constituyen los componentes básicos de productos comerciales como los adelgazadores, pinturas, tintas y adhesivos, entre otros. El abuso de estos productos puede causar dependencia hacia la sustancia inhalada, desarrollo de tolerancia a algunos de sus efectos y la presentación de un síndrome de abstinencia al suspender su consumo caracterizado por estados de ansiedad, depresión, irritabilidad, fatiga y falta de apetito (1).Los disolventes también están presentes en ciertos ambientes de trabajo. La exposición industrial afecta principalmente a los empleados que desempeñan su trabajo en la fabricación de pinturas, gomas, productos de limpieza, motores, pegamentos, tintas o cualquier otro servicio que involucre disolventes industriales. Entre los solventes orgánicos estudiados con particular énfasis dado su elevado grado de toxicidad están los hidrocarburos aromáticos, los cuales son compuestos derivados del petróleo, mediante una serie de procesos petroquímicos, en particular la destilación catalítica, la destilación del petróleo crudo y la alquilación de hidrocarburos aromáticos de las series más bajas (2). Las investigaciones que se han hecho sobre la toxicidad de los hidrocarburos aromáticos, están principalmente enfocadas sobre tres compuestos en particular: benceno, tolueno, y xileno, dado los efectos perjudiciales que ejercen sobre la salud: actúan directamente como depresores del sistema nervioso central, la intoxicación aguda por estos compuestos produce cefalea, náuseas, mareo, desorientación, confusión e inquietud. La exposición aguda a dosis altas puede incluso provocar pérdida de consciencia y depresión respiratoria. Uno de los efectos agudos más conocidos es la irritación respiratoria (tos y dolor de garganta). También se han observado síntomas cardiovasculares, como palpitaciones y mareos. Los síntomas neurológicos de la exposición crónica pueden ser cambios de conducta, depresión, alteraciones del estado de ánimo y cambios de la personalidad y de la función intelectual. Por lo que existen límites máximos de exposición, reportados en concentraciones de ppm, permitidos en personas expuestas. Estos hidrocarburos aromáticos se absorben fácilmente en el organismo humano por diversas vías: mediante inhalación, ingestión y en poca cantidad por vía cutánea, se metabolizan mediante la biooxidación del anillo; si existen cadenas laterales, preferiblemente de grupos metilo, éstas se oxidan y el anillo permanece sin modificar. En gran parte se convierten en compuestos hidrosolubles y posteriormente se conjugan con glicina, ácido glucurónico o ácido sulfúrico y se eliminan en la orina. Se presentan entonces ciertos metabolitos que pueden monitorearse biológicamente; los cuales serán indicativos de los niveles absorbidos por un individuo expuesto a estos compuestos. Para el tolueno el metabolito correspondiente es el denominado ácido hipúrico (AH) y los isómeros orto, meta y para, del acido metilhipúrico, los son de la exposición al xileno (3). El Ácido Hipúrico es un metabolito inespecífico del Tolueno, ya que se puede producir también en la metabolización del Etil-benceno, Ácido Benzoico, Benzoato de Sodio, ciruelas y arándanos 11(4). Además, la excreción urinaria del Acido Hipúrico se inhibe con el Etanol (5). Asimismo, hay supresión mutua del Tolueno con el Benceno (6). No obstante sigue utilizándose como un indicador clásico de los niveles de tolueno en orina, aunque últimamente se ha propuesto la medida de cresol, como indicador del mismo (3). Se recomienda tomar la muestra urinaria del Tolueno al final de

la jornada de trabajo, o incluso, durante la jornada de trabajo, ya que la vida media biológica de éste asciende a 1.5 hrs. Con respecto a los Ácidos Metilhipúricos Urinarios (orto, meta y para) si son metabolitos específicos de los Xilenos (o-m-p). En razón de la vida media biológica del xileno que es de 3.6 hrs. se recomienda que las tomas de muestras urinarias se realicen al final de la jornada de trabajo (4). Una parte insignificante se deposita en el tejido adiposo con una vida media biológica de 30 hrs. pero no tiene ningún efecto significativo en la excreción urinaria de los Ácidos Metilhipúricos 18(5). Dado que la determinación de estos metabolitos se realiza en muestras de orina, debe señalarse que el ácido hipúrico es un componente habitual de la orina, que presenta valores de referencia (0,00 - 0,37) g de AH/ g creatinina, en personas no expuestas, mientras que el valor límite de exposición reportado es (1,6 g de AH/ g creatinina), para el ácido metilhipúrico dicho valor límite es de (1,5g/gr creatinina), establecidos por la American Conference of Governmental Industrial Hygienists( ACGIH)(3), que determinan la cantidad mínima de éste ácido que debe contener un individuo para no encontrarse contaminado. Es importante señalar que estos valores de los metabolitos se reportan con respecto a la creatinina; porque esta se usa para normalizar las orinas diluidas o concentradas; dado que esta es un catabolito que se excreta, en términos generales, de manera uniforme y regular, salvo que haya alguna patología, sobre todo renal, que pueda trastocarla; por lo que la creatinina se debe medir en cada muestra(6).

ObjetivosGeneral

Determinar el ácido hipúrico y los isómeros (orto, meta y para) de ácido metilhipúrico en muestras de orina, utilizando un método de fase reversa con detector de ultravioleta/Cromatografía líquida de alta resolución.

Específicos

Familiarizar al estudiante con el uso de equipos de cromatografía de líquidos (HPLC).

Adiestrar al estudiante en el procedimiento de inyección de la muestra y en la manipulación y mantenimiento de la jeringa y la columna.

Evidenciar cualitativamente la presencia de ácido hipúrico y los isómeros del ácido metilhipúrico en orina de individuos expuestos y no-expuestos a solventes orgánicos.

Establecer las condiciones experimentales adecuadas para la aplicación del método al análisis cuantitativo.

Parte Experimental

Instrumentación





















la bomba. Al estabilizarse aumentar el flujo de 0,1 a 2 mL/min y esperar

unos 10 min.


muestra a analizar y los patrones para la identificación y cuantificación.


Velocidad de flujo: 1,4 mL/ min

Volumen de inyección: 10 µL

Detector: UV/Vis a 254 nm

Fase móvil: 1% ac. acético, 40% metanol, resto de agua desionizada (59%)

Presión del sistema:

Preparación de muestra

Se acidifican una alícuota de 20 mL a pH=2 con ácido clorhídrico concentrado se lleva a un balón de 25 mL y se filtra con filtros de 0,45 m, adaptables a jeringa de celulosa y posteriormente se inyecta directamente al puerto de inyección para su análisis por HPLC

Preparación de Patrones

Prepara los siguientes patrones disolviéndolos en la fase móvil:

Tabla 1. Concentración de las madres.

Compuesto Pureza % Peso (g) Vol aforo (mL) Concentración (ppm)

ac. Hipurico 99 50 1000

2-metil ac. hipurico 98 50 1000



Con estas soluciones madres se hallara el factor de dilución de manera de no saturar el sistema, para ello inicie con una solución de 100ppm

Una vez obtenidas las diluciones de los patrones, inyecte los mismos para determinar los tiempos de retención de cada ácido.

Inyecte la muestra e identifique que componentes están presentes en la misma

Una vez identificado los componentes de la muestra realice las curvas de calibración directa de cada componentes preparando 4 patrones que se encuentren dentro de los rangos recomendados en la tabla 2

Tabla 2. Rango de concentración recomendados para prepara los patrones para la curva de calibración.

Compuesto Rango de concentración para la curva de calibraciónac. Hipurico

2-metil ac. hipurico



Referencias

1. García Liñan, C. ¿Qué son las drogas?. Inhalables. Editorial Arbol S.A. de C.V. México, 1990.

2. Enciclopedia de la Salud y el Trabajo , pp.104-282.3. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el trabajo. Ministerio de Trabajo y

Asuntos Sociales, Vizcaya, España. Norma MTA/MB-022/A95. Determinación De los ácidos fenilglioxílico, mándelico, hipúrico y orto y para-metilhipúrico en orina. Método de Fase reversa con detector ultravioleta/Cromatografía líquida de Alta Resolución. www.mtas.es.

4. American Conference of Governmental Industrial Hygienists Inc. Documentation of the Threshold Limit Values and Biological Exposure Indices, 1991, Sixth Edition, Volume 1, BEI-171.

http://www.mtas.es/

5. SATO Akio et. al. Chapter 28. Effects of Ethanol on Uptake, Distribution, and Elimination of Inhaled Vapor of Organic Solvents, Biological Monitoring of Exposure to Industrial Chemicals, Editors: Vera Fiserova-Bergerova, Masana Ogata, ACGIH Inc.1990; pp. 155-158.

6. IKEDA Masayuki, Chapter 27, Suppression of Metabolism in Workers Exposed to Mixtures of Benzene and Toluene and to Thrichloroethylene and Tetrachloroethylene, Biological Monitoring of Exposure to Industrial Chemicals, Editors: Vera Fiserova-Bergerova, Masana Ogata, ACGIH Inc. 1990; pp. 151-154.

Bibliografía

Rubinson K, Rubinson J, “Análisis Instrumental”. Prentice Hall, España, Pág. 636-677.

Año 2001.

Daniel C Harris Análisis Químico Cuantitativo 3era Edición Editorial Reverte, Pag.

548-577 y 607-639. 2007 (Nota esta edición es la que tiene la información requerida)

Documents

Guia de Metodos de Analisis Por HPLC