Guia de Labo QB

8/20/2019 Guia de Labo QB

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GUIA DE TRABAJOSPRÁCTICOS

QUÍMICA BIOLÓGICA

Departamento de Quimica Biológica

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - UBA

Pabellón II — 4to Piso

http://www.qb.fcen.uba.ar

2010

CARRERA

B Biologia

Quimica

Q


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REGIMEN DE PROMOCION 2010 - QUIMICA BIOLOGICA I

Firma de Trabajos Prácticos:

La aprobación (o firma) de los trabajos prácticos es requisito para aprobar la materia.

Firmarán los trabajos prácticos aquellos alumnos que hayan aprobado todos los informes de

laboratorio y obtengan una nota general delaboratorio igual o superior a 5 (cinco). Dado que los informes serán material de estudio, aquellos que sean desaprobados deberán sercorregidos y entregados para su aprobación. La nota general de laboratorio estará compuesta de la siguiente manera:

• 30% del promedio de las notas de parcialitos.

•

15% de trabajos especiales referidos a los TPs o problemas. Estos pueden incluir la preparación de esquemas experimentales previo a la realización de algún(os)

determinado(s) TP(s) o la resolución de problema(s), los cuales serán desarrollados en casa y entregados en tiempo y forma para que los docentes los evalúen.

• 5% del Estudio de un Caso Clínico. Esta tarea será desarrollada a lo largo del cuatrimestre por grupos de hasta 6 personas, en horario de problemas y se evaluará tanto la participación personal

en su desarrollo como en la presentación final en clase, incluyendo el informe escrito.•

50% restante corresponderá a la nota de 1 (un) parcial practico integratorio que abarcará todos

los temas incluidos en TPs y problemas. El parcial se aprobará con 5 (cinco),pudiéndose recuperaruna vez, sin que esto afecte la promoción general de la materia. En caso de desaprobar, la notadel recuperatorio será promediada con la del parcial. En dicho parcial no se podrán entregartemas sin realizar. Es decir: si un alumno saca menos de 5 puntos, recupera el parcial completo,

pero si saca 5 o más puntos y tiene un tema completo sin entregar, recupera ese tema y la notaobtenida se promedia con el 0 del tema correspondiente en el parcial original.

La nota de concepto, junto con el desempeño en los informes permitirá redondear la nota general de laboratorio en hasta 0,5 puntos

.

Tanto las clases de laboratorio como las de problemas son obligatorias, con asistencia igual o mayor al 80% en cada parte. En caso de faltar a una práctica de laboratorio, deberá recuperarla

en otro turno o según indique el Jefe de Trabajos Prácticos.

La aprobación de los trabajos prácticos es requisito para aprobar la materia.

CONFECCIÓN DE INFORMES DE LABORATORIO

Todos los trabajos prácticos concluyen con la confección de un informe de laboratorio, el cual deberáser entregado en el trabajo práctico subsiguiente para su corrección. Los informes entregados fuera de términoserán desaprobados y pueden o no ser corregidos por el Docente del turno.

Todos los informes seguirán una estructura que incluya:

Número y título de trabajo prácticoNombre(s) y apellido(s) del (los) autor(es)

1. Objetivos2. Metodología3. Resultados4. Discusión (este capítulo no solo incluirá las conclusiones sino también sediscutirá si se cumplieron o no los objetivos. Al final se incluirán las respuestasal cuestionario).


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Aprobación de temas teóricos:

Se tomarán 3 (tres) parciales consistentes en 3 (tres) temas cada uno.

Cada tema deberá aprobarse con 4 (cuatro) puntos o más.

Cada alumno tendrá oportunidad de recuperar hasta 3 (tres) temas entre los 3 (tres) parciales

teóricos, sin perder la posibilidad de promocionar. La nota obtenida del recuperatorio se promediará con la nota anterior de ese tema. El alumno que haya desaprobado más de 3 (tres) temas, pierde automáticamente la posibilidad de promocionar y deberá rendir un examen final.

Promoción sin examen final:

Promocionaran sin examen final aquellos alumnos que hayan obtenido un promedio de 7 (siete) o

más en los temas teóricos, sin tener algún tema por debajo de 4 (cuatro).

El alumno que promocione recibirá, como nota final de la materia, la resultante del 50% de la nota

promedio de los parciales teóricos y 50% de la nota final de laboratorio.

El alumno que, aun habiendo obtenido una nota de 4 o más en cada parcial (sin haberlos recuperado) no alcanzara la promoción, podrá recuperar hasta 3 (tres) temas de su elección para levantar la nota y conseguir la promoción. La nota obtenida en el recuperatorio se promediará conlanota del parcial original.

Examen final:

Aquellos alumnos que hayan aprobado la parte práctica, pero que no alcancen la promoción, irán aun examen final teórico que abarcará toda la materia, sin importar la nota individual que hayan

sacado en cada tema.


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CONFECCIÓN DE INFORMES DE LABORATORIO

Todos los trabajos prácticos concluyen con la confección de un informe de laboratorio, el cualdeberá ser entregado en el trabajo práctico subsiguiente para su corrección. Los informes entregados fuerade término serán desaprobados y pueden o no ser corregidos por el Docente del turno.

Todos los informes seguirán una estructura que incluya:

Número y título de trabajo prácticoNombre(s) y apellido(s) del (los) autor(es)

1. Objetivos2. Metodología3. Resultados4. Discusión (este capítulo no solo incluirá las conclusiones sino también se discutirá si

se cumplieron o no los objetivos y al final se incluirán las respuestas al cuestionario).


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TRABAJO PRÁCTICO IESPECTROFOTOMETRÍA Y CURVAS DE CALIBRACIÓN

Introducción

La revolución producida en el campo de la genética hizo caer poco a poco, en una especie de letargocercano al olvido, el dominio de las proteínas, muy estudiado hace unos años. Curiosamente es de notar que

justamente son estos avances en el campo de la genética, los que hicieron renacer el interés por las proteínas. Enefecto, para poder secuenciar las proteínas e identificar los genes correspondientes, hace falta purificarlas primero.Inmediatamente, una vez que los genes se han insertado en un vector que permita su sobre-expresión, es necesario

purificarlas nuevamente, ya sea para poner a punto una vacuna, para su utilización como agente terapéutico,como herramienta de diagnóstico, o para estudios acerca de la relación estructura función.

El dosaje de proteínas es una etapa muy importante dentro de un esquema de purificación. A través dela cuantificación de la proteína podremos localizar a esta en una u otra fracción de un proceso de separación, yde esta manera podremos medir la actividad biológica de la misma. Los distintos métodos de dosaje de

proteínas deberían responder a criterios específicos, los cuales determinarán que sean utilizados a lo largo del proceso de purificación o para el control de calidad. Durante el proceso de purificación, el dosaje debe ser rápido yfácil de poner en práctica, mientras que el control de calidad requerirá una respuesta específica así como gransensibilidad (medición de la actividad biológica, respuesta a los anticuerpos, ausencia de contaminantes).

Criterios importantes para una buena técnica de dosaje de proteínas:

1) Bajo umbral de detección.2) Buena especificidad.3) Facilidad de puesta en práctica.4)

Rapidez.5) Costo no muy elevado.6)

Fácil integración en un protocolo de purificación.

Frecuentemente es necesario estimar la concentración de una mezcla de proteínas al cabo de una etapa de purificación o de fermentación (ya sea para calcular el rendimiento de la purificación como la producción de una

proteína). Los diferentes métodos de dosaje de proteínas utilizan las propiedades físicas y químicasintrínsecas de las mismas. A continuación se resumen distintos métodos según el principio en el cual se basan. Para una descripción más detallada consultar el anexo teórico.

a) Métodos espectrofotométricos:

Medición de absorbancia

Medición de fluorescencia

b) Métodos que involucran fijación a colorantes:

Bradford (unión a Coomassie blue)

Fluorescamina (unión a fluorescamina)

c) Métodos en los que intervienen reacciones químicas:

Lowry (reactivo de Folin)

BCA (Ácido BiCinconínico)

d) Marcación radiactiva.


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Objetivos

- Conocer y comparar distintos métodos para el dosaje de proteínas.

- Aprender a diseñar curvas de calibración y confeccionar los protocolos correspondientes.

- Hallar la concentración de una muestra incógnita a partir de los parámetros matemáticos de la recta

graficada.

- Conocer la importancia de contar con una curva de calibración cuando se necesite vincular unamedición experimental -tal como la absorbancia- con una determinada magnitud como, porejemplo, la concentración de un dado compuesto.

a) Método de Bradford

Materiales

• Solución patrón: Seroalbúmina bovina (BSA) en concentración 0,5 mg/mL.

•

Reactivo de Bradford (modificado): 40 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250 + 50 mLetanol + 100 mL ácido fosfórico 85% y llevar a l litro con agua destilada.

Metodología

Se deberá construir una curva de calibración para dosaje de proteínas siguiendo el protocolo de Bradford. La solución patrón será BSA en concentración 0,5 mg/ml.

El método de Bradford indica que a 0,1 mL de la solución proteica a medir debenagregarse 2 mL del Reactivo de Bradford. Seguidamente, se debe agitar vigorosamente para,

pasados 2 min aproximadamente, medir la absorbancia de la solución a 595 nm. Se debe tener encuenta que el producto coloreado generado es estable sólo dentro de la primer hora de producida la

reacción.

En este Trabajo Práctico, la curva de calibración deberá cubrir el rango de proteínas entre 5µg y 25 µg. Las diluciones correspondientes deberán hacerse en agua destilada. También se deberáincluir un blanco de reactivos.

Es importante confeccionar el protocolo de la curva de calibración (para determinar lasconcentraciones proteicas y volúmenes a utilizar) antes de realizar las medicionesespectrofotométricas correspondientes.

Con la curva de calibración obtenida se deberá determinar la concentración de una muestra proteica incógnita.

Tubos Blanco 1 2 3 4 5Muestraincógnita

Proteínas (g)

Solución patrón (L) -

Muestra incógnita (L) - - - - - -

H2O destilada (L)


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Reactivo de Bradford (mL)

Mezclar y agitar bien y leer antes de 1 hora

A595

A595 – Blanco

b) Método de Lowry y col.

Materiales

• Reactivo de Folin-Ciocalteau: mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato disponiblecomercialmente que se diluye según se especifique.

• Solución patrón: Seroalbúmina bovina (BSA) o tripsina en concentración de 0.5 mg/mL

• Solución alcalina de cobre: Se prepara mezclando las soluciones A, B y C en relación 0,1

A : 0,1 B : 10 C. La preparación debe realizarse mezclando primero A + B y recién despuésagregando C. Se prepara antes de usar y se descarta luego de un día.

A)

Solución de tartrato de sodio y potasio al 2%B)

Solución de CuSO4. 5H2O al 1%C)

Solución de Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 N

Metodología

Se deberá, en este caso, confeccionar una curva de calibración para dosaje de proteínassiguiendo el protocolo descripto por Lowry y col. El mismo indica que a 0,4 mL de solución

proteica deben agregarse 2 mL de la solución alcalina de cobre. Luego de una agitación vigorosa,

se debe dejar 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, se agregan 0,2 mL del reactivo de Foliny se agita inmediatamente. Se debe, entonces, dejar la solución durante 30 min a temperaturaambiente para luego poder medir la absorbancia a 660 nm.

Se dispondrá de una solución patrón de BSA (0,5 mg/mL) con la que se deberá cubrir unrango de cantidad proteica de 25 µg a 125 µg. Las diluciones se realizarán con agua destilada,solvente con el que se hará el respectivo blanco de reactivos.

Una vez diseñado el protocolo de la curva de calibración se deberán realizar las medicionescorrespondientes para la confección gráfica de dicha curva y la consiguiente determinación de laconcentración de una muestra incógnita.

Tubos Blanco 1 2 3 4 5Muestraincógnita

Proteínas (g)

Solución patrón (l) -

Muestra incógnita (L) - - - - - -

H2O destilada (l)

Solución alcalina (mL)


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Mezclar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente

Reactivo de Folin

Mezclar inmediatamente y dejar reposar 30 minutos a temperatura ambiente

A660

A660 – Blanco

Cuestionario

1-

¿Por qué en la preparación de la solución alcalina de cobre no es lo mismo mezclar primero Acon B y luego agregar C que hacerlo en otro orden?

2-

¿Por qué, luego de agregar el reactivo de Folin en el método de Lowry, debe agitarinmediatamente? Justifique.

3-

Comparar el método de Lowry y de Bradford en cuanto a rango en el cual se cumple la Ley deBeer.

4-

¿Por qué el rango de masas de proteína utilizado en los dos métodos es diferente? ¿Cómo es lasensibilidad en ambos métodos?

5-

Se dispone de distintas proteínas patrón con las cuales se realizan las curvas de calibración por elmétodo de Lowry y Bradford. ¿Cómo serán ambos gráficos si se utilizan:

a)

dos patrones que difieren en el contenido de tirosina y triptofano?b)

dos patrones que difieren en la cantidad de aminoácidos básicos?

Bibliografía

Lowry O.H.; Rosebrough I.; Farr A.L. y Randall R.J. J. Biol. Chem. 193: 265-275. 1951.

Bradford M. Anal. Biochem 72: 248-254, 1976.


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TRABAJO PRÁCTICO II CRISTALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

Para el estudio estructural de proteínas y otras macromoléculas uno de los métodos mas utilizadoses la difracción de rayos X. La única limitación de esta técnica es que la obtención de cristales adecuadoslo suficientemente grandes y ordenados para que difracten resulta sumamente difícil. Los modelosestructurales obtenidos a partir de la cristalografía son usados ampliamente para revelar detalles

moleculares de los procesos biológicos que permiten revelar, entre otras cosas, el funcionamientoenzimático, mecanismos de transporte molecular, mecanismos de reconocimiento antígeno-anticuerpo, etc. La comprensión de la genética-estructura-función puede ayudar a los científicos a bloquearo realzar una determinada función de un sistema.

La cristalización es uno de los medios por el cual una solución sobresaturada metaestable puedealcanzar un estado estable de menor energía mediante la reducción de la concentración de soluto y laformación de uniones intermoleculares. El fundamento de la cristalización es crear un sistematermodinámicamente inestable que, al retornar al equilibrio, responda formando cristales.

En Química Orgánica se emplea con éxito la recristalización como método de purificación. Eneste curso de Química Biológica vamos a presentar técnicas para obtener cristales de proteínas apropiados para realizar estudios de difracción de rayos X. Para ser usados en cristalografía, los cristales de proteínas

deben reunir las siguientes condiciones:1) 0,2-0,5 mm de longitud en la dimensión menor.2)

Ser monocristales. 3) Tener buena resistencia mecánica. 4)

Poseer un alto grado de ordenamiento cristalino, para dar lugar a estructuras de alta resolución.

Hasta el día de hoy, la cristalización de proteínas es más un arte que una ciencia. Sin embargo, están bien establecidos los factores que afectan la aparición y el tamaño de los cristales. Estos pueden serfísicos, químicos y bioquímicos.

Físicos Químicos Bioquímicos

Temperatura: T pH Concentración de lamacromolécula

Gravedad Tipo de precipitante Pureza de la macromoléculaPresión Concentración de precipitante Estado de agregación de la

macromolécula

Tiempo Fuerza iónica Punto isoeléctricoVibraciones de todo tipo Iones específicos Simetría de la macromoléculaCampos electromagnéticos Grado de sobresaturación Proteólisis, hidrólisisSuperficies Ambiente oxidante o reductor Modificaciones pos-

traduccionalesMetodología utilizada Cross-linkers Modificaciones químicas y

genéticasPropiedades dieléctricas delmedio

Detergentes, anfolitos. Ligandos, inhibidores

Viscosidad del medio Impurezas ProcedenciaVelocidad de equilibrio pH Historia de la muestra

Homogeneidad de losnucleantes

Tipo de precipitante


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En todo ensayo de cristalización tenemos dos partes:

1) la muestra, que debe estar lo mas pura posible y en solución en un buffer con baja fuerza iónica.

2) el licor madre, esta formado por el precipitante, el buffer y los aditivos (a veces se puede prescindir de estos dos últimos)

Para obtener buenos cristales se necesita conocer algunas propiedades de la muestra con respecto al precipitante usado, como ser la integridad de la estructura de la proteína en su estado nativo, es decir evitarlos precipitantes que pueden desnaturalizar la muestra en forma irreversible.

Los primeros ensayos de cristalización se realizan para pescar condiciones en las cuales la proteínaexiste en forma cristalina, cabe remarcar que una determinada proteína puede cristalizar en numerosascondiciones con distinta simetría, grupo espacial, etc. Dichas condiciones presuponen el uso de

precipitantes, buffers y aditivos diferentes. Una vez que pescamos una condición lo importante esobtener monocristales perfectos y para ello disminuimos la cantidad de los centros de nucleación. Para lograreste objetivo jugamos con los factores físicos y químicos enumerados arriba para disminuir además eltiempo de aparición y crecimiento de los cristales. Los cristales reconocen la paciencia como una virtud y

premian a aquellos que la practican.

Como regla general: se obtienen mayor número de cristales y más defectuosos si el

crecimiento es acelerado. Lo inverso es válido para la obtención de cristales más grandes y de mayorcalidad.Cuando después de varios ensayos sin éxito no logramos cristalizar la muestra empezamos a analizar

las causas bioquímicas de ello, (enumeradas en la columna de la derecha de la tabla). En la mayoría de lasveces analizando la historia de la muestra y cambiando por ejemplo la forma de purificarla obtenemoscristales, otras veces agregándoles sus ligandos específicos.

Existen distintos métodos de cristalización: 1) en batch y microbatch, 2) por diálisis,3) por evaporación lenta, 4) por difusión en geles y, 5) por difusión de vapor. En la práctica de utilizaremoscomo método de cristalización el de difusión de vapor. En él se distinguen tres técnicas: a) gotacolgante, b) gota sentada y c) gota en sandwich . En la práctica se trabajará con la técnica de la gotacolgante.

Crearemos un sistema cerrado, sellando un recipiente con grasa de vacío, en el cual habremos

previamente colocado dos soluciones que contienen: la proteína a cristalizar y NaCl como agente precipitante y, la otra, sólo NaCl, pero más concentrado que el anterior. El método de difusión de vapor se basa en la igualación de los potenciales químicos de una sustancia en dos fases distintas de un sistemaevolucionando hacia el equilibrio. Como el NaCl está más diluido en la gota que en el pozo hay pasaje demoléculas del solvente (agua) desde la solución de la gota hacia la solución del pozo, tendiendo aigualar la concentración de precipitante en la gota y en el licor madre. Convirtiéndose la gota en unasolución sobresaturada que dará origen a los cristales esperados, cuando la concentración de la proteína yel agente precipitante sean las apropiadas.


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En este Trabajo Práctico se precipitará lisozima, enzima presente en la clara de huevo de gallinacapaz de hidrolizar polisacáridos de las paredes bacterianas

Objetivos

- Aprender un proceso de cristalización de una proteína tipo.

Materiales

• Lisozima 100 mg/mL en Buffer Acetato de Sodio 0,5 M pH 4,5.

• Cajas de cristalización, láminas siliconadas, grasa de vacío.

• Buffer Acetato de Sodio 0,5 M pH 4,5.

• NaCl 2 M en H2O.

• H2O destilada.

Metodología

En este caso se realizará una curva de distintas concentraciones de la proteína a cristalizar y deagente precipitante, dentro de la cual se esperará encontrar aquella combinación óptima deconcentraciones en la que se formen los mejores cristales.

Para ello se utilizarán placas multiwell de 24 pocillos. Se llenarán los pocillos con 1 mL desolución de NaCl (en la concentración necesaria). Por otro lado, se dispondrá también de 24 cubreobjetos,en cada uno de los cuales se deberá colocar 5 L de solución proteica (de una determinada concentración)

junto con 5 L de la solución de NaCl del pocillo sobre el que se vaya a colocar dicho cubreobjetos. Paralograr un sellado hermético, se deberá colocar grasa de vacío en el borde de cada pocillo sobre el que se

vaya a colocar un cubreobjetos.

Se sugiere, a continuación, un posible protocolo a seguir para realizar la curva requerida.

[proteína] enla gota

(mg/mL)

1[NaCl] base

del pozo

2[NaCl] base

del pozo

3[NaCl] base

del pozo

4[NaCl] base

del pozo

5[NaCl] base

del pozo5 0 0.5 0.75 1.00 1.50

10 0.25 0.5 0.75 1.00 1.5025 0.15 0.25 0.50 0.75 1.0050 0.10 0.15 0.25 0.50 0.75

Las placas se dejarán a temperatura constante (18°C) y se controlarán periódicamente Los cristalesse observarán al microscopio entre las 48 y 72 horas de realizado el experimento.


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TRABAJO PRÁCTICO IIIANÁLISIS ESTRUCTURAL DE MACROMOLÉCULAS

Herramientas informáticas para el estudio de la Estructura de proteínas

Conceptos: Forma y estructura tridimensional de moléculas. Estructura y características de losaminoácidos. Estructura primaria, secundaria y terciaria. (Repaso de QB) Tipos y características de las

interacciones que determinan la estructura.

Tareas a desarrollar: Visualización de estructuras (moléculas pequeñas, proteínas, complejos). Análisisde interacciones (puentes de Hidrógeno, clusters hidrofóbicos, etc.). Reconocimiento de dominios de

plegamiento e interacción proteína-sustrato.

Introducción

Las proteínas son macromoléculas (moléculas muy grandes) formadas por una cadena de moléculas más pequeñas, los aminoácidos. Las proteínas son las principales responsables de realizar las funciones biológicas, y es la estructura o forma de las mismas la que determina su función. Los aminoácidos sonmoléculas que contiene un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2) libres, más una cadena

lateral (R) característica. Para formar las proteínas los aminoácidos se unen entre sí, mediante lo que sedenomina el enlace peptídico. Éste se forma entre el grupo amino de un aminoácido y el carboxilo de otro,dando como resultado un enlace covalente CO-NH.

Existen aproximadamente 20 aminoácidos distintos componiendo las proteínas. Éstos se pueden clasificaren función de las características de su cadena lateral R en:

Hidrofóbicos: Aquellos no afines al aguaHidrofílicos: Aquellos afines al aguaÁcidos: Los cargados negativamente a pH fisiológicoBásicos: Los cargados positivamente a pH fisiológico

A la secuencia lineal de la cadena de aminoácidos se la conoce como estructura primaria de la proteína.En el espacio diferentes regiones de la cadena de aminoácidos adoptan formas preferenciales, como pueden ser: en forma de hélice (-hélice), adoptando una estructura de tipo lineal (hoja-β) o adoptandouna estructura de rulo o bucle (loop). A estas regiones con una estructura particular se las conoce comoelementos de estructura secundaria de la proteína. Los diferentes elementos de estructura secundaria secombinan y ordenan el espacio de una manera particular generando así finalmente la estructura de la

proteína propiamente dicha, o estructura terciaria. Conocer la estructura de una proteína consiste enconocer la posición espacial de todos sus átomos. Finalmente existen proteínas que están formadas pormás de una cadena (o subunidad) de aminoácidos. A la forma en que se ensamblan las subunidades se laconoce como estructura cuaternaria de la proteína.

La estructura de una proteína esta íntimamente ligada a su función. Por ejemplo, las proteínas que

catalizan reacciones químicas o enzimáticas (como la amilasa) deben poder acomodar al sustrato enalgún bolsillo, y poseer aminoácidos posicionados específicamente para realizar la reacción. Muchas

proteínas además poseen unidas moléculas orgánicas, o iones (cofactores) que ayudan a realizar sufunción. Por otro lado las proteínas estructurales que dan estructura a las células o tejidos poseen formassumamente complejas. Por último, las proteínas deben interactuar entre si o con otras macromoléculascomo el ADN formando así complejos macromoleculares de gran tamaño. El objetivo principal de esta

práctica es comenzar a comprender la estructura proteica y las formas que tienen los científicos hoy en díade representarla.


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Es importante notar, que las proteínas no poseen una estructura rígida sino que se mueven. Elmovimiento es esencial para su función, y existen varios métodos para encarar su estudio. Un métodorelativamente popular para el estudio de la dinámica proteica consiste en la realización de cálculoscomputacionales, que “simulan” el movimiento real de los átomos de una proteína, a lo largo del tiempo.Uno de los campos más interesantes de la química de proteínas actual, consiste en estudiar como y porque las

proteínas adoptan su estructura y uno de los métodos para este tipo de estudios es la simulacióncomputacional. El proceso por el cual una proteína recientemente “fabricada” en la célula, pasa de estar

completamente estirada a poseer una estructura espacial definida se lo conoce como plegamiento de la proteína. Al proceso inverso por medio del cual las proteínas “nativas” y activas funcionalmente, pasan aun estado inactivo debido a que pierden su forma y se despliegan se conoce como desnaturalización. Elsegundo objetivo de esta práctica consiste en visualizar la dinámica proteica así como el proceso de

plegamiento y desnaturalización inducida por factores externos.

Desarrollo

Parte 1- Manejo del programa, Visualización de estructura secundaria e interacciones,Identificación y comparación de Dominios de plegamiento (DP)

Como ya mencionamos anteriormente, conocer la estructura de una proteína consiste en conocer la posición

espacial (en coordenadas cartesianas x,y,z) de todos los átomos que la componen. Cuando un grupo deinvestigación determina la estructura de una proteína la deposita en una base internacional de libreacceso denominada Protein Data Bank (PDB). El archivo depositado con extensión “.pdb” contiene ademásde la estructura información acerca del proceso utilizado Para su obtención. Existen diferentes programas

para visualizar los archivos “.pdb” (estructuras de proteínas) uno de los más populares es el Rasmol y elque utilizaremos en esta práctica es el VMD (que es gratis y puede bajarse de la red).

i) Inicialización del VMD: Ejecute desde el Menú Inicio de Windows el programa VMD. Si todo anduvo bien deberían aparecer 3 ventanas. La ventana VMD Main, es la ventana de control del programa, yfunciona como cualquier programa de Windows. La ventana VMD OpenGL Display es donde serepresentara la proteína y la otra no la utilizaremos.

Para cargar nuestro primer archivo, vamos en VMD-MAIN: File-New Molecule- Aparece una nuevaventana que nos permite buscar los archivos, seleccionamos el archivo peptido1.pdb y lo abrimos conlos comandos open y luego load. Si todo anduvo bien aparecerá la proteína representada en laventana VMD OpenGL Display

ii)

Manejo de “VMD Display”: Al cargar una proteína, esta aparecerá inicialmente representada por“Líneas” (cada línea representa una unión covalente entre 2 átomos, que están en los vértices). Además el

programa representa los diferentes átomos de diferente color. La convención es: Carbono-Cian (oceleste-verdoso), Nitrógeno-Azul, Oxígeno-Rojo, Hidrógeno-Blanco, Azufre-Amarillo, etc.


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proteína-sustrato es un paso clave en el desarrollo de fármacos, ya que estos muchas veces se unen a la proteína en el mismo lugar que el sustrato y de una manera similar, bloqueando el acceso del mismo a laenzima e inhibiendo su fundón. Otro tema importante en enzimología consiste en conocer cómo lasenzimas catalizan la reacción química. Muchas veces las enzimas necesitan para realizar esta función de laayuda de cofactores, como son iones o moléculas orgánicas de tamaño medio. Como ya estudiamos enIBMyC los biólogos (los químicos si no lo saben le pueden preguntar a un compañero y/o docente) la α-amilasa degrada el almidón (un hidrato de carbono) utilizando un ión cloro como cofactor. Estudiemos ahora

su estructura.El pdb que estudiaremos corresponde a la estructura de α-Amilasa con un análogo de HdeC como inhibidor.

Tarea 4) a) Cargue en el VMD el archivo, amilasa.pdb ¿qué puede decir del fold global? (¿y del tamaño?) b) El análogo de sustrato (inhibidor) lleva el nombre de residuo ALM y el cloro Cl, ¿puede identificardónde se encuentran en la proteína (sugerencia represéntelos como VDW sobre la proteína representada como

New Cartoon), ¿Por qué cree que la enzima no fue cristalizada con el sustrato real?) b’) ¿Es usted capaz dedarse cuenta por qué el análogo de sustrato no es reactivo?

Para analizar la interacción Enzima sustrato analizaremos visualmente sólo esa parte de la proteína. Paraesto en el Menu GR seleccione una representación “within 5 of resname ALM” como Lines. Una2da Representación resname Cl como VDW, y una 3ra resname ALM como bonds.

c) ¿Cuántos monómeros posee el polisacárido?, ¿qué puede decir sobre la interacción α-amilasa – sustrato?,¿qué tipos de interacciones son las principales en este caso? d) ¿Qué y cuáles son los residuos responsables demantener al Cl en su lugar?, ¿Le sorprende esto? e) ¿Cuántas (y cuáles) interacciones carga-dipoloforma el Cl en el sitio activo de la α-amilasa? f) Identifique el enlace reactivo del sustrato, ¿cómo se diocuenta cuál era? (si no lo logra pregunte al docente)Tómese ahora 5 minutos para pensar y responda g) ¿Cuál es el posible mecanismo de reacción?, ¿quién esel residuo responsable? ¿Cómo lo demostraría experimental y teóricamente?


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TRABAJO PRÁCTICO IVPURIFICACIÓN ENZIMÁTICA

Purificación parcial de la enzima δδδδ-aminolevulínico dehidrasa(Parte 1: extracción, tratamiento térmico y salting out )

Introducción

La enzima δ-aminolevulínico dehidrasa (ALA-D) cataliza la condensación de dos moléculas deácido δ-aminolevulínico (ALA) para dar el monopirrol porfobilinógeno (PBG), que es precursoraromático de las porfirinas y otros compuestos tetrapirrólicos.

Esta enzima se encuentra ampliamente distribuida en animales, plantas y microorganismos; escitoplasmática, termoestable y sulfhídrica. En casi todos los sistemas estudiados el máximo de actividadsólo puede ser demostrado en presencia de compuestos tiólicos como el β-mercaptoetanol (β-Me), cisteína o glutatión, solos o combinados con zinc. La actividad se pierde rápidamente por exposiciónal aire debido a la oxidación de los grupos sulfhidrilo, por inhibición de estos residuos con reactivos degrupos -SH o metales pesados, o por desplazamiento del zinc por plomo o por quelación con EDTA.

El ALA-D es una enzima oligomérica de PM 280.000, que consta de 8 subunidades similaresde PM 35.000. Se ha encontrado que, dependiendo de las condiciones experimentales, puede formar

fácilmente agregados consigo misma dando lugar a la existencia de especies de distinto PM enequilibrio. La estructura mínima necesaria para la actividad es un dímero de PM 70.000 formados por dostipos distintos de subunidades que, aunque tienen similar composición, juegan distintos roles en lasíntesis de PBG.

El PBG obtenido por acción del ALA-D, es sustrato de otra enzima que cataliza la formaciónde un anillo tetrapirrólico, el cual luego de algunas descarboxilaciones, se convierte, por inserción de unátomo de hierro, en el hemo, grupo prostético de varias proteínas importantes (hemoglobina, mioglobina,catalasas, peroxidasas, citocromos, etc.). En plantas, al incorporar magnesio, da lugar a la formación declorofila.

En este trabajo práctico se aislará, purificará parcialmente y caracterizará la enzima ALA-D proveniente

de hígado de cerdo.

Objetivos

- Entender y poner en práctica los conceptos de purificación y rendimiento.

- Aprender a seleccionar las condiciones para, mediante el estudio de la velocidad de unareacción enzimática, conocer y comparar cantidades enzimáticas en una mezcla proteica.

- Construir un cuadro de purificación a partir de los resultados obtenidos en cada etapa y analizar laeficiencia alcanzada en cada una.


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a) Purificación inicial de ALA-D: extracción, tratamiento térmico y “salting out”

Materiales

• Fuente enzimática: hígado de cerdo• Buffer de extracción: buffer fosfato de sodio 20 mM pH 6,8 + NaCl 0,15 M + β-

Me 10 mM.• Buffer de resuspensión del precipitado de sulfato de amonio: buffer fosfato de sodio 50 mM pH

6,8 + β-Me 10 mM• Buffer de incubación: buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8• Sustrato: ALA en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8• Solución desproteinizadora: CuSO4 ss (solución saturada)

• Reactivo de Ehrlich: 2 gr de p-dimetilaminobenzaldehído disueltos en 25 mL de HCl (c) y 75mL de ácido acético glacial.

• β-Mercaptoetanol 200 mM y concentrado (14,34 M).

Metodología

Durante el proceso de purificación del ALA-D se deberá tener especial cuidado de mantenerlas muestras enzimáticas en frío para reducir la actividad de proteasas.

La secuencia de etapas a seguir para lograr la purificación parcial del ALA-D de hígado de cerdoes:

1. Homogenato: El hígado se corta en pequeños trozos y se homogeneíza en una licuadora en relación1:5 en el buffer de extracción (1 g de tejido: 5 mL de buffer). Se centrifuga a 5.000 g durante 5minutos, el sobrenadante resultante se denomina Fracción H. Cada comisión comienza la purificación a partir de 30-35 mL de este homogenato. Reservar 1 mL para medir actividad, proteínas y para electroforesis.

2. Sobrenadante: La Fracción H se centrifuga 15 minutos a 15.000 g, el precipitado se descarta y

el sobrenadante constituye la Fracción S. Reservar 1 mL para medir actividad, proteínas y paraelectroforesis.

3. Tratamiento térmico: La fracción S se divide en dos partes de igual volumen y se calientan a dostemperaturas diferentes cada una. Se elegirá (a indicación del docente) alguna Tº (t1) entre 45, 55ó 75ºC para una de las fracciones y t2: 62ºC para la otra, con agitación constante, en un bañode agua, manteniendo cada una de estas temperaturas durante 2 minutos y, luego, se enfríainmediatamente en un baño de hielo. Se centrifuga 15 minutos a 15.000 g descartándose el precipitado y guardándose los sobrenadantes (Fracciones C1 y C2), al que se les agrega ß-Me hastauna concentración final de 10 mM. Reservar 1 mL para medir actividad, proteínas y para

electroforesis.


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4. Fraccionamiento con (NH4)2SO4: A la fracción C2 se le adiciona sulfato de amoniofinamente dividido hasta llevarlo a 55% de saturación, manteniendo el pH entre 6,8 – 7,0 por laadición de hidróxido de amonio si fuera necesario. Se deja agitando durante 20 minutos y luegose centrifuga a 15.000 x g durante 15 minutos. El precipitado se resuspende en 5 mL de buffer deresuspensión, rotulándolo como Fracción P. Reservar esta fracción para medir actividad y

proteínas y para electroforesis y tamiz molecular.

b)

Determinación de la actividad de ALA-D y de proteínas totalesSobre una alícuota de cada fracción aislada se procederá a determinar la cantidad de ALA-D

midiendo su actividad y la masa de proteínas totales mediante el método de Bradford.

Medición de actividad enzimática

Metodología

La incubación se realizará a 37 °C y en aerobiosis durante 30 minutos. Cada mezcla dereacción contendrá la enzima, su correspondiente sustrato y el buffer de incubación adecuado, en la proporción que sigue:

• Buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8, hasta completar un volumenfinal de 1 mL.

• β-Me 200 mM, 0,1 mL.

• ALA (8,35 mg/mL), 0,1 mL.

• Solución enzimática: 0,1 - 0,5 mL, dependiendo de la fracciónenzimática.

De detendrá la reacción agregando 0,1 mL de CuSO4 ss (solución saturada), se agitará

vigorosamente y se centrifugará durante 15 minutos a 3.000 r.p.m. El producto de la reacción (elPBG) se determinará en el sobrenadante. Para ello, éste se trasvasará a otro tubo y se le agregará 1mL del reactivo de Ehrlich y se agitará inmediatamente. Se leerá absorbancia a 555 nm entre los8 y 15 minutos. Con estos datos, la cantidad de PBG en cada reacción podrá determinarse a partir de la Ley de Beer, siendo el coeficiente de absorción molar del PBG igual a 113.6mL/mg.

Se define 1 Unidad Enzimática (UE) como la cantidad de enzima que cataliza laformación de 1 nmol de PBG por hora de reacción en las condiciones descriptas (1 UE= 1 nmolPBG/h). Dato: PM del PBG = 226.

Determinación de proteínas totales

Metodología

La cantidad total de proteínas presentes en cada fracción se cuantificará empleando elmétodo de Bradford. En aquellos extractos en que hubiera β-Me en el medio, serealizarán los correspondientes blancos de reactivos en presencia de dicho compuesto.

Bibliografía

Mauzerall. D. and Granick, S. (1956) J. Biol. Chem. 219, 435


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Moore. D. J. and Labbe.R F. (1964) Clin. Chem. 10, 1105

Tomio, J. M. y San Martín de Viale, L. C. (1972) Bioquímica Clínica. VI , 217

Apéndice - Determinación de PBG

La determinación de PBG se basa en su reacción con el p-dimetil-aminobenzaldehído (DMABo reactivo de Ehrlich) en solución ácida para formar un compuesto rojo. El mecanismo de la reacción puede verse en la figura 1.

A temperatura ambiente y en solución ácida, un mol del pirrol reacciona reversiblemente con unmol de aldehído, formando un producto de condensación rojo inestable (ecuación I).

Treibs y Herrmann, estudiando esta reacción, han demostrado que el mecanismo es más complejoy que, posteriormente, tienen lugar otras transformaciones. Así, el compuesto de condensacióncoloreado adiciona una molécula más de pirrol, dando como producto un dipirrilfenil- metano sustituido,incoloro. Esta reacción II es reversible.

Finalmente, como puede verse en la ecuación III, el complejo incoloro puede perder

dimetilanilina, transformándose, a su vez, en un dipirrilmeteno, cuyo espectro de absorción se ha corrido alongitudes de onda más cortas.

El color rojo que se desarrolla en la reacción I aumenta muy rápidamente en intensidad,dependiendo de las condiciones experimentales; alcanza un máximo y disminuye luego, muylentamente.


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TRABAJO PRÁCTICO VPURIFICACIÓN ENZIMÁTICA

Purificación parcial de la enzima δδδδ-aminolevulínico dehidrasa(Parte 2: Filtración molecular)

Objetivos

- Aprender cómo utilizar el tamaño (o, más precisamente, el radio hidrodinámico) de una molécula para separarla de otros componentes de una mezcla.

Materiales

• Dextran-Blue (Azul Dextrano) Solución de CoCl2 • Solución de BaCl2 • Reactivo de Bradford

•

Buffer fosfato de sodio 50 mM.

Metodología

1) Determinación del Volumen Excluido (V0) y del Volumen Total (Vt) de la columna a utilizar.

Esta primera etapa constituye la calibración de la columna. Deberán utilizarse dos compuestos, unode alto peso molecular cuyo Volumen de Elución (Ve) determinará el V0 de la columna y otro de muy bajo peso molecular y cuyo Ve determinará el Vt. El primero será Dextran-Blue y, el segundo, cloruro decobalto.

Se deberá recordar lavar con agua destilada (líquido con el que se equilibró la columna) la matrizantes de utilizarla y nunca dejarla secar. A su vez, el volumen de muestra a sembrar deberá ser entre un 5y un 10% del Vt de dicha columna (10 mL aprox.). Previo a la siembra se agregará sacarosa a la muestra para reducir fenómenos difusivos que puedan ocurrir durante la misma.

El eluido se deberá colectar en fracciones de a 0,5 mL a la vez que se agrega continuamente aguadestilada a la columna (¡OJO! El tiempo de goteo debe ser entre 12 y 15 seg.). La elución concluirácuando se haya colectado todo el cloruro de cobalto que se había sembrado en la columna.

Una vez colectadas las fracciones, se asignarán unidades arbitrarias de intensidad decoloración (azul para el Dextran-Blue y roja para el cloruro de cobalto) a cada fracción colectada.La representación de la intensidad de color en función del volumen al que fue eluida cada fracción(Ve) será el cromatograma o perfil de elución a partir del cual podrá leerse el V0 y Vt de lacolumna utilizada.


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2) Desalado de una muestra proteica

Utilizando la columna calibrada en 1), se desalará la fracción proteica P obtenida en la Parte I de purificación del ALA-D, luego de la precipitación con sales.

La metodología a seguir será la misma que la empleada al calibrar la columna. La elución finalizará

una vez que haya salido de la columna un volumen igual al Vt determinado en 1) + 2 mL.

Sobre 2 alícuotas de cada fracción recolectada se procederá a detectar, en la primera, presencia proteica por la técnica de Bradford (a 50 L de eluido se le agregan 500ul del reactivo de Bradford) y, en lasegunda, presencia de sales. Para esto último se deberá agregar cloruro de bario (BaCl 2) 1:1 a una alícuota de 50L de cada fracción proteica colectada. El BaCl2 forma un precipitado blanco en presencia de iones sulfato (porla formación de sulfato de bario, insoluble).

Finalmente se asignarán unidades arbitrarias de cantidad de proteínas y de sales a cada fracción y seconfeccionará el cromatograma correspondiente para evaluar la eficiencia del desalado, el cual también deberáanalizarse en función del obtenido en 1).

Se reservará el tubo con máxima cantidad de proteínas y mínima de sales para sembrar en un gel deSDS-PAGE, en el Trabajo Práctico VIII.

Bibliografía

P.Andrews, Biochem. J. (1964) 91: 222.

P. Flodin, J. Chromat. (1961) 5: 103.

M. Paget and P. Coustenoble, Ann. Biol. Clin. (1966), 24: 181.


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TRABAJO PRÁCTICO VIPURIFICACIÓN ENZIMÁTICA

Intercambio iónico

Objetivos

- Conocer cómo una propiedad específica de una molécula tal como su carga neta puedeaprovecharse para aislarla de otras que presenten una carga diferente.- Aprender a elegir la combinación de medios (resinas y buffers de siembra y elución) necesaria paraoptimizar la separación requerida.

Materiales

• Resina de intercambio iónico DEAE-celulosa equilibrada en buffer fosfato de sodio 25mM pH 6,8.• Buffer de siembra: Buffer fosfato de sodio 25 mM pH 6,8.

• Buffer de elución: Buffer fosfato de sodio 25 mM pH 6,8 + NaCl 0,65 M.

•

Solución de albúmina sérica bovina (5 mg/mL).• Solución de lisozima (5 mg/mL).• Reactivo de Bradford.

Metodología

Cada grupo recibirá 5mL de una suspensión de DEAE-celulosa en buffer fosfato de sodio 25mM pH 6,8 , a la que se deberá agregar la mezcla proteica a separar (lisozima:BSA, 1:1).

Comenzará, entonces, la incubación en batch que permitirá la interacción de las proteínas conla resina. Para una óptima homogeneización se deberá agitar lenta y continuamente la suspensión, atemperatura ambiente, durante el tiempo de incubación (5min. aproximadamente).

Finalizada la incubación se deberá volcar la suspensión sobre una columna colocada en sucorrespondiente soporte (puede resultar útil, en este paso, agregar 2 mL más de buffer de siembra ala suspensión para facilitar el pasaje de la misma a la columna). Una vez hecho esto ya se podrásembrar la muestra y comenzar a pasar buffer de siembra por la columna para, así, obtener el“percolado” de la misma.

Posteriormente debe procederse a la elución de la columna con el buffer correspondiente.

Es importante destacar que las fracciones colectadas de la columna no deben exceder 1m devolumen.

Por último, deberá determinarse la presencia proteica en cada fracción mediante la coloración

de Bradford.Los resultados obtenidos podrán graficarse mediante un cromatograma o perfil de elución, a

partir del cual se logrará inferir el punto isoeléctrico de cada una de las proteínas de la mezcla.


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Según la tabla que se muestra a continuación, una concentración ácido levulínico 0,6 mM produceuna inhibición de alrededor el 50%, mientras que la pérdida de actividad es casi total con concentracionesmayores de 4 mM.

Ácido levulínico(mM)

Actividad específicaporcentual (%)

0 1000,2 830,4 590,6 481 352 194 86 4

Efecto del ácido levulínico sobre la

actividad del ALA-D de hígado de cerdo.

Para caracterizar el tipo de inhibición por ácido levulínico se mide la actividad de ALA-D en presencia de distintasconcentraciones de ALA para dos concentraciones diferentes de inhibidor. Se emplea como extractoenzimático el sobrenadante S (0,1 mL) y las condiciones estándar de incubación (1 mL de volumen deincubación y [β-Me] = 20 mM). La reacción se detiene y el producto se cuantifica de la manera habitual,luego de 30 minutos de incubación.

El protocolo a seguir para el punto 2) y 3) se adjunta a continuación en la tabla 2:

Tabla 2:tubos ALA

(mM)ALA

10 mMác. lev.(mM)

ác. lev. 5 mM(mL)

β-Me 200 mM(mL)

enzima buffer(mL)

A555

Benzima ----- 0 0,1

1 0,05 0 0,12 0,10 0 0,13 0,25 0 0,14 0,50 0 0,1


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5 0,75 0 0,16 1,00 0 0,17 3,00 0 0,18 0,05 0,25 0,19 0,10 0,25 0,110 0,25 0,25 0,111 0,50 0,25 0,112 0,75 0,25 0,113 1,00 0,25 0,114 3,00 0,25 0,115 0,05 0,50 0,116 0,10 0,50 0,117 0,25 0,50 0,118 0,50 0,50 0,119 0,75 0,50 0,120 1,00 0,50 0,121 3,00 0,50 0,1

Actividades:

* Para cada concentración de inhibidor, determinar vi en nmoles de PBG formado/ hora al variar la

concentración de sustrato.

* Caracterizar mediante gráfico de inversas el tipo de inhibición. Estimar Ki.


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TRABAJO PRÁCTICO VIIIELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES

DESNATURALIZANTES

Introducción

Un método muy común para la separación de proteínas es la electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) descripto por Laemmli ycolaboradores (1970). La separación de proteínas por SDS-PAGE es utilizada con distintos finestales como la estimación del peso molecular de las mismas, la determinación de la abundanciarelativa de las principales proteínas en una muestra, para evaluar la pureza de una muestra proteicao el progreso de un proceso de fraccionamiento o purificación.

Generalmente se utiliza un sistema discontinuo de geles como medio soporte lo que permite,en general, una mejor resolución de las proteínas deseadas. Dicho sistema consta de un gelseparador y otro, que se encuentra por encima de éste, llamado gel concentrador el cual posee los pocillos de carga de la muestra. En este sistema, los geles son generados a partir de dos buffers de

pH diferentes: 8.8 para el gel separador y 6.8 para el concentrador. Además, a diferencia de unaelectroforesis nativa, en este sistema se utiliza un detergente aniónico llamado dodecil sulfatosódico (SDS) que desnaturaliza proteínas y les imprime una densidad de carga (carga/masa)negativa y uniforme entre todas ellas. Por su parte, el poro presente en el gel dependerá del porcentaje de acrilamida (%T) y del porcentaje del entrecruzador, la bisacrilamida (%C). Una vez polimerizada, la poliacrilamida tiene la particularidad de frenar selectivamente el pasaje demoléculas más voluminosas por sobre el de las más pequeñas. Luego de finalizada la corridaelectroforética, la tinción del gel con un colorante para proteínas permite la visualización de las bandas proteicas obtenidas.

Debido a que la relación carga/masa es uniforme entre todos los complejos polipéptido

desnaturalizado-SDS, la velocidad de migración de las proteínas depende casi exclusivamente dela masa molecular relativa (PM) de las mismas. En un gel de densidad uniforme, la distancia demigración relativa de la proteína (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo de su PM. Si serealiza una corrida electroforética de proteínas de PM conocido junto con muestras incógnita, unavez determinados todos los Rf se puede calibrar el sistema graficando el logaritmo del PM vs. Rfde las muestras conocidas y estimar así el PM de las proteínas incógnita por interpolación.

Objetivos

- Aprender a utilizar un método electroforético para separar los componentes de una mezcla enfunción de su peso molecular.

- Determinar el peso molecular de una proteína incógnita.

- Utilizar la técnica de electroforesis como una herramienta para seguir el avance de un proceso de purificación proteico.

- Comprender las diferencias entre técnicas electroforéticas en condiciones nativas y desnaturalizantes.

Materiales


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SE DEBERÁ CONOCER LA PELIGROSIDAD DE LAS SUSTANCIAS A UTILIZAR.

• Acrilamida / bis (30% T, 2.67 % C)Acrilamida 29.2 gBis-acrilamida 0.8 gVolumen total 100 mL

•

Buffer de corrida: Tris 25 mM - glicina 192mM - SDS 0.1%. pH: 8,3 (5X)

Para 1 L de buffer:

Tris Base………. ...............................15 gGlicina ............................................. 72 gSDS ................................................ 5 gPara usar diluir 1:5 con agua destilada.

• Buffer Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 (1X): 90.75 g de Tris y ajustar el pH a 8.8 con HCl 4 N.Llevar el volumen a 500 mL con agua destilada.

• Buffer Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 (1X): 15.13 g de Tris y ajustar el pH a 6.8 con HCl 4 N.Llevar el volumen a 250 mL con agua destilada.

• Buffer de siembra:

Agua destilada 4.8 mLTris-ClH 0.5 M pH:6.8 1.2 mLGlicerol 1.0 mLSDS 10% (p/v) 2.0 mLAzul de Bromofenol 0.1% (p/v) 0.5 mL

β-mercaptoetanol 0.5 mLVolumen total 10.0 mL

• Solución fijadora:

Solución de Ácido tricloroacético al 12.5 %

• Reactivos para tinción con Coomassie Brilliant Blue:

a)

Coomassie Brilliant Blue R-250 0.15% en solución de Metanol (30%): Ácidoacético (10%).

b)

Solución para desteñir: Ácido acético 7%: metanol 5%.

• Standards de peso molecular (1ug/ ul):

Proteína PMFosforilasa b 97.400Seroalbúmina bovina 66.000Ovoalbúmina 45.000Anhidrasa carbónica 30.000Inhibidor de tripsina 20.100


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Lactalbúmina 14.400

Metodología

1.

Preparación de las placas de vidrio:

Limpiar bien las placas de vidrio con alcohol y una vez secas colocarlas en los armadoresinterponiendo los separadores correspondientes entre ambas. La placa de vidrio más grande es la posterior.Mover las llaves laterales del armador y asegurarse que queden firmemente sujetos al soporte.

2. Preparación de los geles.

Se correrán geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 15% y 10% de T con SDS según la técnicade Laemmli.

Gel separador:

Gel separador 15%T Gel separador 10%TAcrilamida/bis (stock 4,05 mL 2,7 mL30%T/2,67%C)Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 2 mL 2,0 mLSDS 10% p/v 80 L 80 LH2O destilada 1.82 mL 3,17 mLAPS 10% 40 L 40 LTEMED 6 L 6 LVolumen total 8 mL 8 mL

Cargar los geles con aproximadamente 4 mL de la solución de gel separador y luego adicionarsuavemente H2O destilada en la parte superior con una piseta, para evitar el contacto con el oxígeno del aire.

No moverlos hasta que gelifiquen, lo cual se verá por la formación de una interfase. Mientras esto ocurre prepare la solución correspondiente al gel concentrador. Una vez polimerizado vuelque el H2O destilada.

Gel concentrador 4%:

Acrilamida/bis (stock 30%T/2,67%C) 0.53 mLTris-HCl 0.5 M pH: 6.8 1 mLSDS 10%w/v 40 LH2O destilada 2.41 mL

APS (persulfato de amonio) 10% 20 LTEMED 4 LVolumen total 4 mL

Llenar la parte superior con la solución de gel concentrador. Colocar inmediatamente los peines enla parte superior evitando la formación de burbujas y cuidando que queden derechos.

Tener en cuenta en los pasos previos que una vez agregado el persulfato de amonio (APS) y elTEMED comenzará la reacción de polimerización.


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3. Armado de las cubas.

Retirar el peine y colocar la placa en la cuba de electroforesis colocando el vidrio delantero hacia la parte interna de la cuba.

Llenar la cuba con el buffer de corrida y proceder al sembrado de las muestras.

4. Preparación y siembra de las muestras.

Se seleccionan muestras correspondientes a las diferentes etapas del esquema de purificaciónde la enzima ALA-D. Se siembran en distintos carriles cuidando de sembrar la misma cantidad de proteínaen todos ellos. También se sembrarán standards de peso molecular (5-10 g de cada uno).

Por otro lado, se sembrará una proteína homogénea (5-10 g) cuyo peso molecular deberádeterminarse a partir de la calibración realizada con los standards (de ser posible, sembrados encarriles adyacentes).

Se tratan las muestras y los estándares de peso molecular con igual volumen del buffer de siembra.Calentar 5 minutos a 100°C, enfriar y sembrar 20 l como máximo (es decir, 10 L de muestra con 10L de buffer de siembra). La muestras deben tener una concentración de proteínas entre 20-30 g/ 10

L.

5. Corrida electroforética.

Se conecta la cuba a la fuente de poder y se corren a 80 V-1/2 hora y 130 Vaproximadamente 1 hora, hasta que el colorante llegue a la parte inferior del gel.

6. Fijación y tinción con Coomassie Blue.

Se desarma la cuba, se retira el gel de las placas de vidrio y se mide la distancia recorrida por elcolorante. Se procede a la fijación y tinción de las bandas proteicas.

Se agrega la solución del colorante Coomassie Blue (tinción rápida), se deja al menos 30 minutos y

se destiñe con solución lavadora hasta que las bandas proteicas sean visibles. Si los geles no se van ateñir luego de la corrida fijarlo con TCA 12.5 % durante 1 hora o más.

Una vez finalizada la coloración correspondiente, se evaluará el avance del proceso de purificaciónlogrado y se determinarán los Rf de los standards y de la proteína incógnita.

Bibliografía

- Neville, D.M. J.Biol Chem. (1971) 246: 6328-6334.

- Laemmli, U.K. Nature (1970) 227: 680- 685.

- Merril, C.R., Harrington, M., Alley, V. Electrophoresis (1984) 5: 289-297.

- Blum, H., Beier, H., Gross, H.J. Electrophoresis (1978) 8: 93-99.


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TRABAJO PRÁCTICO IX ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN LIGANDO-PROTEÍNA

Introducción

El método de Bradford puede ser utilizado, no solamente para determinar la concentración de proteína en una solución, sino también para determinar el número total de sitios de interacción de la proteína con el

colorante y, a partir de este dato, hacer predicciones acerca de la estructura primaria de una proteína.

Objetivos

- Utilizar un colorante para el estudio de la interacción proteica con su ligando.

- Determinar el número de sitios de unión para el colorante presentes en una molécula proteica.

Materiales

• Coomassie Brilliant Blue G-250 0,7 x 10-4 M.

•

Albúmina sérica bovina.

Metodología

Utilizando el método para la determinación de proteínas con el colorante Coomassie Blue se deberádeterminar el número total de sitios de unión para el colorante (n) en la molécula proteica. El número de sitios secorrelaciona con el número total de argininas y lisinas en una determinada proteína.

Experimento 1: Determinación de εεεεlibre para el colorante

La absortividad para el colorante libre puede obtenerse por la Ley de Beer en las condiciones deensayo, utilizando cantidades variables de colorante, llevando a un volumen de 2,0 mL con el

solvente del reactivo. Luego completar a 3,0 mL con agua desionizada y determinar la absorbancia.Protocolo de trabajo:

tubo colorante (mL) solvente de reactivo (mL) agua (mL) A620 B 0 2.00 11 0.50 1.50 12 1.00 1.00 13 1.50 0.50 14 1.75 0.25 15 2.00 0 1

Experimento 2: Determinación de εεεεunido para el colorante

La absortividad molar del complejo proteína-colorante puede calcularse agregando a una dadasolución del colorante, cantidades variables de proteína. Se partirá de una solución madre de proteína de 10 mg

proteína/mL, de la que se tomarán volúmenes crecientes y se completará hasta 1,0 mL con agua desionizadacuando fuese necesario. Luego se agregará 0,4 mL de colorante 10-4 M. Finalmente se agregará 1,6 mL desolvente de reactivo para completar el volumen total a 3 mL. Deben esperarse 15 minutos antes de sulectura en el espectrofotómetro.

La absortividad del colorante unido puede obtenerse de la siguiente manera: se realiza un gráfico de(1/A) versus (1/cantidad de proteína) a una concentración fija de colorante. La extrapolación a cero(concentración infinita de proteína) permite determinar el máximo de absorbancia (Amáx.) para el coloranteunido, porque todas las moléculas del colorante estarán unidas a la proteína en estas condiciones. El cociente


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Amáx./CTotal dará la absortividad molar requerida ( εunido).

Protocolo de trabajotubo proteína (10 mg/mL)

(mL)agua(mL)

colorante(mL)

solvente de reactivo(mL)

A620

B 0 1.0 0.4 1.6

1 0.05 0.95 0.4 1.6

2 0.075 0.925 0.4 1.6

3 0.1 0.9 0.4 1.6

4 0.2 0.8 0.4 1.6

5 0.3 0.7 0.4 1.6

Experimento 3: Curva de calibración para proteína

El análisis estándar se lleva a cabo utilizando 2,0 mL del reactivo y cantidades variables de proteína,a partir de una solución acuosa de 0,5 mg proteína/mL, ajustando el volumen total a 3,0 mL con aguadesionizada. La cantidad de proteína puede variarse entre 0 y 50 g. Todas las mediciones deabsorbancia se realizarán contra agua destilada, luego de mezclar bien y dejando incubar la mezcla por 15minutos, por lo menos.

Para cada muestra, se calculará el A sustrayendo la absorbancia del “blanco” conteniendo colorante pero no proteína, del valor obtenido para la muestra conteniendo proteína. Se construirá la curva decalibración correspondiente.

Nota: ¿Por qué si Ud. ya realizó una curva de proteínas por el método de Bradford, debe ahora realizaruna nueva curva?

Protocolo de trabajo

tubo proteína (0,5 g/mL)(mL) agua(mL) colorante(mL) A620

B 0 1 2

1 0.02 0.98 2

2 0.04 0.96 2

3 0.06 0.94 2

4 0.08 0.92 2

5 0.1 0.90 2

Determinación de n

Se utilizarán los datos obtenidos en los tres experimentos anteriores para calcular este parámetro.Las deducciones matemáticas desarrolladas en el apéndice muestran que:

)( libreunidomedio

P

A

ε ε

ν

−

∆=

En los experimentos 1 y 2 fueron calculados εlibre y εunido respectivamente. La pendiente dela curva de calibración del experimento 3 corresponde al valor de ∆A/P. ¿Cuáles deben ser las unidades


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de P? ¿Qué operaciones permiten expresar P en las unidades correctas?

Para completar el informe los alumnos deberán obtener el número de residuos Lisina + Arginina de laseroalbúmina bovina. Para ello, deberán:

- Ingresar en el sitio: http://au.expasy.org

- Elegir en “Tools and software packages”: Primary structure analysis y, una vez dentro de esta

parte, elegir “ProtParam”.

- Dentro de esta herramienta, en la ventana que indica “Search” Swiss-Prot/TrEMBL escribir en “for” bovine albumin y presionar “Go”.

- Al aparecer el resultado de la búsqueda, elegir “ALBU BOVIN (P02769)” -

Una vez dentro de la pantalla de resultado, elegir [Sequence]

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Finalmente comparar los resultados teóricos con los experimentales.

Apéndice — Deducciones matemáticas

La ecuación que permite describir la unión del colorante puede ser alcanzada mediante unaaproximación basada en la ley de Beer. Para la absorbancia inicial (Ao), antes del agregado de proteína, podemos escribir:

Ao= εlibreCtotal

donde libre es la absortividad molar del colorante libre y Ctotal es la concentración total del colorante. Seconsidera que el paso de la luz es de 1 cm.

Luego del agregado de la proteína, la absorbancia final (Af ) es igual a la suma de lascontribuciones de ambos: el complejo colorante-proteína y el colorante libre residual, como sigue:

Af = Alibre + Aunido Af = εlibreClibre + εunidoCunido

donde Clibre es la concentración del colorante residual libre y Cunido es la concentración del colorante unido ala proteína.


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Una suposición que se hace en este momento es que la absortividad molar del colorante unidoes la misma para todas las clases de sitios de unión. Si las cadenas laterales de ambos, arginina ylisina, unen al colorante, esta suposición puede no ser cierta.

El “principio de conservación del colorante” requiere que:

Ctotal = Clibre + Cunido

El cambio en absorbancia, a la longitud de onda medida, está dado por la diferencia Af – Ao demanera que:

∆A = Af – Ao∆A = εlibreClibre + εunidoCunido – εlibreCtotal

∆A = εlibreClibre + εunidoCunido – εlibre (Clibre + Cunido)∆A = εlibreClibre + εunidoCunido – εlibreClibre – εlibreCunido

∆A = εunidoCunido – εlibreCunido∆A = Cunido (εunido – εlibre)

Cunido = ∆A(εunido – εlibre)

Esta ecuación puede ser expresada en términos de medio, definido como el número de moléculasunidas de colorante por molécula de proteína. Este parámetro puede, por lo tanto, escribirse como:

P

C unidomedio =ν

donde P es la concentración molar de proteína. Las unidades de concentración de C y P deben ser lasmismas para que el número de sitios sea adimensional.

Sustituyendo, podemos escribir:υmedio = ∆A

P(εunido – εlibre)

Podemos observar que, disponiendo de los parámetros εlibre y εunido y, determinando el A para unaconcentración proteica en particular (P), el número medio de moléculas de colorante, unidas por moléculade proteína, puede ser encontrado. Si las condiciones son tales que la proteína se encuentra saturada conel colorante, todos los sitios de unión estarán ocupados y este número será igual a n, el número total desitios de unión.


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TRABAJO PRÁCTICO XREGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE NITRATO REDUCTASA

Introducción

El nitrógeno juega un papel clave en la producción agrícola. Todas las plantas se nutren de las

diferentes formas de nitrógeno existentes en el suelo, pero hay dos de ellas que representan el mayor porcentaje; el amonio y el nitrato. El mejoramiento de los suelos agrícolas deficientes en nitrógeno selogra mediante las diferentes técnicas de fertilización nitrogenada, con la utilización de urea, nitratos y salesamoniacales o amoniaco gaseoso, manufacturadas con un alto costo.

El nitrógeno que es tomado bajo la forma de nitrato, es reducido a amonio antes de entrar en elcamino biosintético de los aminoácidos; las enzimas responsables de este proceso son la nitrato reductasa(NR) y la nitrito reductasa (NiR), catalizando la siguientes transformaciones:

NR NiRNO-3 →→→→ NO

-2 →→→→ NH

+4 →→→→ →→→→ →→→→ Aminoácidos

En los tejidos verdes la asimilación del nitrato esta íntimamente asociada a la fotosíntesis, nosolo por el suplemento de factores de reducción, sino también por proporcionar los compuestos carbonadosrequeridos para la síntesis de aminoácidos.

La reducción del nitrato es un paso limitante por el hecho de que el mismo se puede acumularen los tejidos de la planta sin causar ningún efecto deletéreo, y el nitrito y el amonio no se pueden almacenar.Por lo tanto la incorporación de nitrógeno proveniente de la reducción del nitrato para la síntesis deaminoácidos es controlada por la actividad regulatoria de la NR por ser:

1) La primer enzima del camino biosintético.2)

Inducible por el sustrato.3) Ser relativamente inestable tanto in vivo como in vitro cuando la planta está sometida a stress hídrico o

de temperatura.4) Su actividad relativa con respecto a las otras enzimas del camino biosintético es baja y su K m

para nitrato es alta.

Existe una correlación positiva entre la actividad NR y el crecimiento de la planta y con el contenidode proteína en los granos.

El suplemento de nitrato induce la actividad de la NR y al desarrollo de peroxisomas y por lotanto se acepta que el número de estos últimos esta relacionado con la actividad de la NR.

EL PAPEL DE LA LUZ EN LA ACTIVIDAD DE LA NR

Un gran número de organismos heterotróficos como, por ej., los hongos, asimilan el nitrato en

oscuridad haciendo uso del poder reductor generado por la oxidación de la glucosa. Similarmenteen las plantas superiores, en los tejidos no fotosintéticos como las raíces, se produce la asimilación delnitrato en oscuridad utilizando los fotosintatos provenientes de los tejidos verdes. Sobre esta base

podríamos pensar que la luz no juega un rol directo, sin embargo se sabe que la reducción del nitrato seacelera considerablemente en presencia de luz.

De trabajos de investigación realizados por distintos autores se sabe que:

1) La luz aumenta la actividad de NR.2) La luz estimula el transporte de nitratos desde el lugar de almacenaje hasta el pool

metabólico, en las células vivas (hojas).


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3)

La luz es necesaria para la inducción de la síntesis de la NR.4)

La luz activa la NR inactivada preexistente.5) La fotosíntesis provee el poder reductor para la reducción del nitrato.

Características de la NR

La NR presenta niveles diferentes de actividad y cantidad de enzima según la especies y órganos

en los cual se ha determinado, sin embargo, por la misma razón, la cantidad de enzima extraída varia. Lasmás altas actividades se han obtenido en los tejidos clorofílicos.Para estudiar la NR es fundamental considerar:

1 )

L a e s p e c i e2 )

La variedad dentro de la especie3 ) La edad de las plantas4 ) Las técnicas de cul t ivo

Como la enzima es inducible por el sustrato y exhibe una variación diurna, las más altasactividades se obtienen cuando las plantas están creciendo con altos contenidos de nitrato y expuestasa un fotoperíodo adecuado. La menor actividad se ha registrado al final del periodo de oscuridad.

La edad de los tejidos tiene un efecto marcado sobre la actividad en algunas especies, pero no enotras, dependiendo de la especie, ya que el mismo tejido de distintas especies puede mostrar el máximode actividad a edades diferentes. La enzima es capaz de utilizar NADH o NADPH como donante deelectrones y esto depende de la especie sin embargo en ciertas especies coexisten ambas formas.

- Peso molecular:El peso molecular es muy variable oscila entre 25.000 (en hojas de Perilla) a 600.000 (en hojas de Trigo).- Afinidad por el sustrato:La K m para Nitrato es del orden de 0,2 mM

- Especificidad por el cofactorLos valores de K m para NADH son del orden de 2,5 M

- Requerimientos de flavinasEl FAD es constituyente de la enzima en algunas especies, incrementando la actividad de la enzima en un50% a concentraciones de 0,1 M de FAD o 3,7 M de FMN según el caso, cuando los piridínnucleótidos son los dadores de electrones.- MetalesLa NR de plantas contiene molibdeno. Su función radica en la participación del transporte de electrones.En algunas especies la enzima posee como grupo proteico al citocromo b557.- FosfatosCiertas especies requieren ortofosfato que facilitaría la reducción de molibdeno formando un complejocon él.- InhibidoresSe inhibe ante la adición de pCMB en concentraciones de 1 mM a 1 M en sistemas en los cuales el donante

de electrones es un piridín nucleótido. La cisteína y el glutatión del orden de 5 a 100 veces protegen a laenzima contra la inhibición. La enzima es sensible a reactivos que reaccionan con metales; el cianuro yla azida son efectivos mientras que los agentes orgánicos quelantes dan diferentes grados de inhibición.Atabrina inhibe la enzima a concentraciones de 5 mM. No es inhibida por el monóxido de carbono ni

por los fluoruros.- Localización celular


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Es una enzima citoplasmática, aunque algunos investigadores opinan que también la han hallado encloroplastos.

- InducciónEs inducida por nitratos en plantas enteras y tejidos y por molibdeno en tejidos provenientes de plantasque crecen con deficiencia en molibdeno.- EstabilidadLa enzima es relativamente estable tanto in vivo como in vitro; posee una vida media que varia segúnla especie y condiciones, entre 4 y 15 horas. Sin embargo parcialmente purificada y a -20°C puedeconservar su actividad hasta 3 meses.

Objetivos

- Comprender el papel regulatorio de los factores ambientales sobre la actividad de un sistemaenzimático vegetal.

- Estudiar el efecto que un cofactor ejerce sobre la actividad de la enzima que lo utiliza.

- Abordar el estudio de la regulación enzimática desde dos modelos experimentales diferentes: invivo

ein vitro

.

Materiales

• Solución de Hewitt.• NO2 Na 100 M.• Sulfanilamida (1% en HCl 1,5 N (p/v)).• Naftil-etilendiamina (0,02%; p/v)• Buffer fosfato pH 7,5 50 mM• NO3K 200 mM

•

Tritón X-100 0,1%• GSH 5 mM

• EDTA 5 mM• Caseína 1,5%• Polivinilpirrolidona 1,5%

Metodología

1)Curva de calibración de nitrito

Se efectuará una curva utilizando el nitrito de sodio en concentraciones de 2,5-30 nmol.

Reactivos nmoles de KNO2 2,5 5 10 20 30 B

KNO2 100 M (mL) -----

Agua 1,5

Sulfanilamida (1% en HCl 1,5 N; p/v) 1 1 1 1 1 1

Naftil-etilendiamina (0,02%; p/v) 1 1 1 1 1 1

Esperar 15 minutos

A540nm

A’540nm


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2) Determinación de actividad enzimática de NR

Se harán crecer plantas de trigo en arena, previamente lavada, con una solución nutritiva adecuada(de Hewitt), con KNO3, y un control sin fuente de nitrógeno, durante 15 días (hasta quelas plantas alcancen 10 a 15 cm de altura). Se emplearán 2 plantas para cada tratamiento.Dos días antes, una de las macetas se pondrá en condiciones de oscuridad.

Determinación in vitro

Se pesarán 1,5 g de hojas de trigo de plantas crecidas a la luz en presencia y ausencia de nitrato, secortarán en trozos pequeños y se romperán suavemente en un mortero previamente enfriado en hielo con 8mL de buffer de extracción. Se filtrará a través de un trozo de tela de algodón, y ese homogenato seráutilizado para la determinación de actividad. La experiencia se realiza según el protocolo que se indica,empleando dos concentraciones de sustrato diferentes.

Buffer de extracción:

Buffer fosfato de K pH 7,5 50 mM

GSH 5 mMEDTA 5 mMCaseína 1,5%Polivinilpirrolidona 1,5%

Hojas BkControl

(mL)Nitrato(mL) (mL)

+NADH -NADH +NADH -NADHBuffer PO4(K) 0,2 M pH7,5

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

KNO3

0,1 M 0,1/0,2 0,1/0,2 0,1/0,2 0,1/0,2 0,2NADH 1 mM 0,4 ------ 0,4 ------ ------Enzima 0,9 0,9 0,9 0,9 ------H2O ------ 0,4 ------ 0,4 1,3

Incubación: 60 minutos a 30°C.Acetato de Zinc 1 M 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Centrifugar 20 minutos a 5000 r.p.m. Tomar sobrenadante con pipeta Pasteur.Sobrenadante 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5Sulfanilamida 1 1 1 1 1

-Naftil-etilendiamina 1 1 1 1 115 minutos a tº ambiente

A 540nm A’540nm moles / 60 minutosUE / gr. tejido


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Determinación in vivo

El tejido de las plantas conteniendo o suplementado con carbohidratos cuando es inmerso en unasolución que contiene nitratos y en condiciones de oscuridad, es capaz de acumular y liberar nitritos alentorno.

Se tomarán 0,5 gr de hojas de trigo cortadas en trozos pequeños y se colocarán en unErlenmeyer de 50 mL con 5 mL de buffer de infiltración. Tapar con tapón de goma y hacer vacío.

Buffer de infiltración:

Buffer fosfato pH 7,5 1 mMKNO3 200 mMTritón X-100 0,1%

Las incubaciones se harán en oscuridad (se forrará el Erlenmeyer con papel metálico) y se incubará a 30°Cdurante 1 hora con una agitación suave. Sobre distintas alícuotas del incubado se determinará concentración denitrito.

a) NR en plantas crecidas en distintas condiciones

Control(mL)

Nitrato(mL)

Luz Oscuridad Luz OscuridadAlícuota 0 2 0 4 0 2 0 4 0 1 0 2 0 1 0 2A uaSulfanilamida 1 1 1 1 1 1 1 1-Naftil-etilendiamina 1 1 1 1 1 1 1 1

A540nm moles / 60 minutos

UE / r. te ido

b) Actividad de NR en función del tiempo de incubaciónEn las plantas crecidas a la luz y en presencia de nitrato se efectuarán ensayos in vivo empleando

tiempos de incubación diferentes y concentración de NO3K en el medio de infiltración:200 mM. Se retirarán alícuotas de los tubos de ensayo a 30, 60, 90 y 120 minutos de incubacióndeterminándose en ellas la concentración de nitrito.

Nitrato 200 mM30 60 90 120

Alícuota 0 1 0 1 0 1 0 1A ua 1 4 1 4 1 4 1 4Sulfanilamida 1 1 1 1Naftil-etilendiamina 1 1 1 1A540nm

moles / 30 minutosUE / gr. tejido

- Realizar un gráfico de nmoles de producto vs. tiempo de incubación.

Bibliografía1) Methods in Enzymology Vol. XXIII (1971) pag 1491 y Vol. LXIX (1980) pag 272.2) H. J. Evans y A. A. Nason. Plant Physiol. 28 (1953) 233.3) L. Veevers y col. Biochim. Biophys. Acta 89 (1964) 453.4) E. J. Hewitt y D. J. D. Nicholas enModern Methods in Plant Analysis. Springer. Berlin 19644)

L. E. Schrader y col. Plant Physiol. 43 (1968) 930.5) J. Imsande y B. Touraine Plant Physiol. 105 (1994) 3


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