1

Großpraktikum Mikrobiologie Teil I, WS 2005/2006 Versuche I-IV

___________________________________ 1. Kultivierung im Großmaßstab, Charakterisierung eines

Stoffwechselweges S. 6 2. Anreicherung eines Enzyms, Charakterisierung seiner katalytischen

Eigenschaften und Regulation S. 18 3. Aktivität, Eisengehalt und UV/VIS-Spektren eines extrem

sauerstoffempfindlichen Schlüsselenzyms S. 29 4. Immunologischer Nachweis eines Schlüsselenzyms und Nachweis

seines Genes durch PCR S. 39

2

Das Praktikum findet in 2 Teilen statt: Teil I. Im Wintersemester werden in 5 Wochen Methoden und Konzepte aus den Bereichen

Physiologie, Biochemie und Molekularbiologie vermittelt. Diese Versuche werden hier

besprochen. In den ersten drei Wochen sind jeweils 6 Teilnehmer (3 Gruppen zu 2

Studenten) mit einem Versuch beschäftigt, die Versuchseinteilung in den letzten zwei

Wochen ist verschieden.

Teil II. Im Sommersemester werden in 12 Nachmittagen (mit einem weiteren Nachmittag nach

Wunsch) Methoden und Konzepte der allgemeinen Biologie der Mikroorganismen

vermittelt. Dieser Teil behandelt die Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von

selbst isolierten Mikroorganismen. Jeweils 2 Studenten zusammen befassen sich mit einer

Gruppe von Mikroorganismen. In einem begleitenden Seminar werden die Erfahrungen

ausgetauscht.

Zu den Praktika sind mitzubringen:

- gebundenes Protokollheft, Schreibzeug

- Labormantel

- Taschenrechner

- Lineal, eventuell Kurvenlineal - Millimeterpapier, einfaches Logarithmenpapier mit 3 Dekaden

- kleines Notizheft, das in die Labormanteltasche passt

3

THEORIE: Anaerober Abbau von aromatischen Verbindungen

durch Thauera aromatica

Einleitung Die Versuche dieses Praktikumsteils gelten einer Substanzklasse und Prozessen, die im Stoffkreislauf der Natur und im Energiestoffwechsel vieler Bakterien eine wichtige Rolle spielen. Es wird gezeigt, wie man vorgeht, wenn man einen Stoffwechselprozess aufklären will.

Aromaten in der Natur. Mit einem Anteil von nahezu einem Viertel des organischen Kohlenwasserstoffes stellen die aromatischen Verbindungen nach den Kohlenhydraten die zweithäufigste Substanzklasse in der Natur dar. Man findet Aromaten häufig im Sekundärstoffwechsel von Pflanzen, so z. B. in der Stützsubstanz Lignin, das aus einem hochvernetzten Phenylpropankörper aufgebaut ist. Die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan stellen einen wichtigen Bestandteil der Proteine dar. Weitere Quellen aromatischer Verbindungen sind fossile Brennstoffe wie Kohle und Erdöl. Die meisten synthetischen Verbindungen enthalten ebenfalls aromatische Ringstrukturen. Im Tierreich findet - von wenigen Beispielen abgesehen - meist kein vollständiger Abbau von Aromaten statt. Dies gilt auch für Pflanzen. Der Mineralisierungsprozeß von aromatischen Verbindungen erfolgt fast ausschließlich durch Mikroorganismen (Bakterien und Pilze), sowohl unter aeroben wie unter anaeroben Bedingungen. Aerober Abbau von aromatischen Verbindungen. Der aerobe Abbau von aromatischen Verbindungen durch Mikroorganismen ist genau untersucht (Stanier und Ornston, 1973, Harwood und Gibson, 1996). Er verläuft bei allen bisher beobachteten Abbauwegen nach demselben Prinzip: die aromatischen Ringstrukturen werden zunächst durch Mono- bzw. Dioxygenasen unter Einbau von Sauerstoff hydroxyliert. Auf diese Weise wird eine Vielzahl von unterschiedlich substituierten aromatischen Ringen in eines von den zentralen Intermediaten überführt, z. B. in Brenzkatechin (1,2-Dihydroxybenzol), Protokatechuat (3,4-Dihydroxybenzoat) und Gentisat (2,5-Dihydroxybenzoat). Die Einführung der Hydroxygruppen in den Benzolring führt zur Destabilisierung des π-Elektronensystems und erleichtert die oxidative Ringspaltung. Entstehende Mono- und Dicarbonsäuren werden über mehrere Reaktionen vor allem zu Acetyl-CoA und Succinat umgewandelt und in zentrale Stoffwechselwege eingeschleust. Anaerober Abbau von aromatischen Verbindungen in fakultativen Anaerobiern. Niedermolekulare aromatische Verbindungen können auch in Abwesenheit von molekularem Sauerstoff vollständig zu CO2 abgebaut werden (Heider und Fuchs, 1997). Da unter anaeroben Bedingungen Sauerstoff als Reaktionspartner für die Oxygenasen nicht zu Verfügung steht, mußten hier alternative, enzymatisch katalysierte Reaktionen entwickelt werden. Prinzipiell wird dabei zwischen dem Abbau in fakultativen und obligaten Anaerobiern unterschieden. Im anoxischen Aromatenabbau von fakultativen Anaerobiern (z.B., denitrifizierende oder photosynthetische Bakterien) werden zunächst chemisch inerte Verbindungen aktiviert, z.B. durch Carboxylierungen, reduktive Abspaltungen von Substituenten oder Coenzym A-Thioester-Bildung. Die Vielfalt der aromatischen Verbindungen wird durch solche und andere Transformationsreaktionen auf wenige Schlüsselintermediate zurückgeführt, vor allem auf Benzoyl-CoA, Resorcin (1,3-Dihydroxybenzol) und Phloroglucin (1,3,5-Trihydroxybenzol). Der überwiegende Anteil der aromatischen Substrate wird über Benzoyl-CoA abgebaut (Abb. 1). Dieses zentrale Intermediat wird durch die Benzoyl-CoA Reduktase in einem Zweielektronen-Schritt zu Cyclohexa-1,5-dien-1-carboxy-CoA reduziert

4

(Boll und Fuchs, 1995). Die Ringreduktion erfordert die Hydrolyse von 2 ATP pro mol Substrat. Die Öffnung des Ringes erfolgt anschließend über eine Hydrolase, die weitere Umwandlung der aliphatischen Verbindungen folgt einer β-Oxidation. Endprodukte des anaeroben Abbaus von Aromaten sind Acetyl-CoA und CO2 (Abb. 2).

CO SCoA

COOH

CO

NH2

SCoA

COOH

NH2

NH2

OH

COOH

OH

COOH

Cl

COCOOH

CH2CO SCoA

CHO

CH2OH

OH

CH3

CHO

OH

Phenol

p-CresolAniline

3-Chlorobenzoate

Benzyl alcohol

Phenylacetate

Benzoate

Phenylglyoxylate

Benzaldehyde

Benzoyl-CoA

4-Hydroxybenzoate

4-Aminobenzoate

CO

OH

SCoA

OHOH

OHOH

COOH

Catechol

Protocatechuate

NO2

COOH

NO2

OCH3OH

COOH

Vanillate

CH2

CH3

COCH3

COCH2

COOH

Ethylbenzene

AcetophenoneCH2

CH2

COOH

COCH2

COSCoA

PhenylpropionateBenzylsuccinate

Toluene

CH3

COOH

HOOC

CH2

CHH2NCOOH

Phenylalanine

CH2COOH

Abb. 1: Benzoyl-CoA als zentrales Zwischenprodukt im anaeroben Abbau verschiedener aromatischer Verbindungen.

Abb. 2: Anaerober Abbau von Benzoyl-CoA zu 3 Acetyl-CoA und 1 CO2.

CO SCoA COO

SCoA

2 [H] H2O

2 [H]2 [H] Acetyl-CoA 2 [H] + CO2

H2O

2

CoASH CoAS

CO SCoA

Benzoyl-CoA

COOH

COHO

SCoACO

COOH

SCoA CO SCoA

2 ATP2 ADP + 2 Pi

2 H2O

Glutaryl-CoA Crotonyl-CoA3-Hydroxy-pimelyl-CoA

Cyclohexa-1,5-dien-1-carboxy-CoA

6-Hydroxy-cyclohex-1-en-1-carboxy-CoA

2-Oxo-cyclohex-1-en-1-carboxy-CoA

COHO

SCoA

5

Anaerober Abbau von aromatischen Verbindungen in obligaten Anaerobiern. Die Fähigkeit zum Abbau von Aromaten wurde in nahezu allen stoffwechselphysiolgischen Klassen von obligat anaeroben Bakterien gefunden (Sulfatreduzierer, Eisenreduzierer, gärende Bakterien in synthropher Assoziation mit einem H2-reduzierendem Bakterium). Während der Abbau von Aromaten in fakultativen Anaerobiern seit mehreren Jahren intensivst untersucht wird, ist über den Stoffwechsel von aromatischen Verbindungen in obligat anaeroben Bakterien fast nichts bekannt. Erst seit kurzem gibt es Hinweise, dass der Aromatenstoffwechsel in strikten Anaerobiern nach einem neuen, bisher unbekannten Weg mit ungewöhnlichen Enzymen verläuft. Thauera aromatica. Das Bakterium T. aromatica wurde unter denitrifizierenden Bedingungen auf Phenol und Nitrat angereichert und isoliert (Tschech und Fuchs, 1987). Das Gram-negative, coccoide Stäbchenbakterium besitzt ein umfangreiches Substratspektrum und wird nach 16S-rRNA-Analyse und aufgrund anderer spezifischer Eigenschaften der β-Gruppe der Proteobakterien zugeordnet (Anders et al., 1995). Es ist in der Lage, eine Vielzahl von aromatischen Substraten wie Benzoat, Phenol, Toluol, 2-Aminobenzoat, Phenylacetat, p-Cresol, Benzaldehyd, Benzylalkohol, 3-Hydroxybenzoat und 4-Hydroxybenzoat unter O2-Ausschluß als Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten. Darüber hinaus kann T. aromatica auch aerob verschiedene aromatische Verbindungen abbauen. Geobacter metallireducens ist ein strikt anaerobes Bodenbakterium mit der besonderen Eigenschaft, eine anaerobe Atmung mit Fe(III) oder anderen Metallionen (Mn(IV), U(VI)) als Elektronenakzeptoren durchzuführen. Diese Eigenschaft spielt in der Natur eine geochemisch wichtige Rolle. Bemerkenswert ist dabei, dass in der Natur Fe(III) hauptsächlich in nichtlöslichen Mineralien vorkommt; ein Problem, welches Eisenreduzierer auf verschiedene Art und weise lösen. Neben der Fähigkeit zur Eisenatmung kann G. metallireducens auch eine Reihe von aromatischen Substanzen verwerten, z.B. Benzoat, Toluol, Benzaldehyd, Phenol, p-Cresol, etc. Letztendlich werden Aromaten vollständig zu CO2 oxidiert, die anfallenden Reduktionsäquivalente werden auf Fe(III) übertragen, welches zu Fe(II) reduziert wird. G. metallireducens gehört zur δ-Gruppe der Proteobakterien und ist mit einigen strikt anaeroben Sulfatreduzierern nahe verwandt. Anmerkungen zum Protokoll Das Praktikumsprotokoll sollte handschriftlich in ein gebundenes Heft (z. B. Schulheft) geschrieben werden. Abgabe spätestens in der Woche nach dem Praktikumsteil! Computerausdrucke werden nicht angenommen. Inhaltsverzeichnis (erste 2 Seiten freilassen!), Datum und Seitenzahlen sollten angegeben werden. Das Protokoll ist soweit möglich chronologisch zu führen. Unter jede Abbildung gehört eine Legende, über jede Tabelle ein Titel. Mehr Angaben zum erwarteten Inhalt des Protokolls finden Sie bei den einzelnen Versuchen.

6

VERSUCH I: Züchtung von einem fakultativ und einem strikt anaeroben Organismus auf Aromaten

ZIELE Der anaerobe Aromatenstoffwechsel wird an zwei typischen Modellorganismen untersucht: Thauera aromatica (fakultative anaerober Denitrifizierer) und Geobacter metallireducens (obligat anaerober Eisenreduzierer). Ziele von Versuch I sind: (1) Die Anzucht von G. metallireducens 50 l-Maßstab auf dem Wachstumssubstrat Benzoat. (2) Die Anzucht von T. aromatica im 2 l-Maßstab mit vier verschiedenen Substraten (Benzoat, Phenylacetat, 4-Hydroxybenzoat, Acetat), an denen später die Induktion von Enzymen der Abbauwege untersucht wird (Versuch II). (3) Herstellen von Zellextrakten ( Benzoat, Phenylacetat, 4-Hydroxybenzoat, Acetat) . Die Hälfte von zwei Zellextrakten (Benzoat-, Acetat-Zellen) dient zum Nachweis von Proteinen mit Antikörpern (Versuch III).(4) Von allen vier Zellextrakten werden durch Ammoniumsulfat- Fällung Proteinfraktionen zur späteren Analyse von Enzymaktivitäten erhalten (Versuch II) . THEORIE Aromatenabbau in Geobacter metallireducens. G. metallireducens kann auf vielen Aromaten und Fe(III) als einzigen Kohlenstoff- und Energiequellen in einem Mineralsalzmedium wachsen. In unserem Fall wird er auf 1.5 mM 4-Hydroxybenzoat und 50 mM Fe(III)-Citrat in einem 200-l-Fermenter gezüchtet (30°C). Aufgrund der hohen Absorption des Fe(III) kann das Wachstum nicht über die optische Dichte bestimmt werden; es erfolgt antstatt dessen über ein Auszählen in Neubauer-Kammern. Parallel dazu wird die Abnahme von 4-Hydroxybenzoat im Medium photometrisch bestimmt. Es wird eine Wachstumskurve erstellt; Wachstumsparameter werden berechnet. Regulation in T. aromatica. Die Stoffwechselwege werden in T. aromatica auf verschiedenen Ebenen reguliert. Die Kontrolle der Transkription und damit die Bildung von Enzymen erfolgt bei Biosynthese- und Abbauwegen verschieden. Bei Biosynthesen „reprimiert“ das Endprodukt, bei Abbauprozessen „induziert“ das Substrat oder ein Folgeprodukt aus dem Substrat. Über die Mechanismen der Transkriptionskontrolle ist damit noch nichts gesagt. Beim Abau von Phenylacetat, 4-Hydroxybenzoat und Benzoat in T. aromatica wird ein gemeinsames Zwischenprodukt, Benzoyl-CoA, gebildet (peripherer Stoffwechsel), das zu Acetyl-CoA abgebaut wird (zentraler Stoffwechsel). Die peripheren Enzyme werden meist nur bei Bedarf gebildet, und der gemeinsame zentrale Stoffwechsel wird in allen drei Fällen benötigt und induziert. Da Acetat ein häufiges und gut verwendbares Substrat ist, werden die Enzyme für den Abbau der weniger geläufigen Substrate wie Aromaten erst in Gegenwart dieser Substrate gemacht. Alle drei aromatischen Substrate werden in einem ersten Schritt durch 3 Enzyme einer Familie, der Coenzym A (CoA) Ligasen, zu ihren CoA-Thioestern umgesetzt. Diese Enzyme sind mehr oder weniger streng spezifisch. Wir prüfen dieses Konzept anhand dieses Beispiels in den folgenden Versuchen. Dazu brauchen wir Zellextrakte. Da die Ligasen aus bisher unbekannten Gründen durch Komponenten des Extraktes völlig gehemmt werden, müssen wir für die Messungen der Aktivitäten die Proteine durch Ammoniumsulfat fällen und damit von löslichen niedermolekularen Verbindungen trennen. Für die späteren Versuche benötigen wir auch den Proteingehalt der Extrakte.

7

Kultur. Das Mineralsalzmedium enthält alle Komponenten in ausreichender Menge, um ca. 5 g Zellen (1g Trockenmasse) pro Liter zu bilden. Geobacter metallireducens (200-l-Kultur): Als Puffersubstanz dient hier Bicarbonat, welches im Überschuß vorhanden ist (pK = ?). Als Elektronendonor dient Benzoat, als Akzeptor Fe(III)-Citrat, welches in hoher Konzentration eingesetzt werden muß (30 Fe[III] werden zu Fe[II] reduziert pro oxidiertem Benzoat ). Fe(III)-Citrat muß zum Lösen aufgekocht werden, danach wird der pH auf 6.0 eingestellt. Thauera aromatica (1-l-Kultur): Hier ist Phosphat im Überschuß vorhanden und dient auch als Puffer. Das Kohlenstoffsubstrat und der Elektronenakzeptor sind in wachstumsbegrenzenden Mengen vorhanden. METHODEN UND KONZEPTE Züchten von 100 ml bis 100 l. Zellernte per Durchlaufzentrifuge, Batch-Kultur, 4-OH-Benzoat-Bestimmung, Trockengewicht, OD, Zellzählung, Wachstumsertrag, Zellaufschluß, Ammoniumsulfatfällung, Proteinbestimmung, Ultrazentrifugation, Medienherstellung, Autoklav, Anaerobes Arbeiten. Anhand dieser Versuche sollen Sie das Wachstumsverhalten eines Bakterienstammes experimentell in den Griff bekommen. Gleichzeitig werden Zellen unter verschiedenen Wachstumsbedienungen für spätere Versuche gezüchtet. Fragen, die experimentell beantwortet werden: Wie unterscheidet sich das Wachstum von Thauera aromatica und Geobacter metallireducens hinsichtlich Wachstumsrate, erreichte optische Dichte ? Auf welchen Substraten wächst Thauera aromatica ? Sind T. aromatica und G. metallireducens als fakultativ und strikt anaerobe Modellorganismen geeignet ? Welcher Wachstumsertrag wird erzielt? Was ist die maximale Wachstumsrate? Wie ist die Stöchiometrie des Substratverbrauchs bei T. aromatica (aromatisches Substrat, Nitrat)? Wieviel % des Substrates werden oxidiert, wieviel % assimiliert ? Was ist die OD/ Trockengewichtsbeziehung ? Decken sich die experimentellen Daten mit den theoretisch erwarteten Umsatzgleichungen und mit dem angenommenen Wachstumsertrag? Wie groß ist die spezifische Rate des Substratverbrauchs bei maximaler Wachstumsrate? Erfüllt die später ermittelte spezifische Enzymaktivität des ersten Enzyms im Abbauweg (Benzoat -CoA Ligase) die Forderung, die spezifische Rate des Substratverbrauchs einer wachsenden Kultur erklären zu können?

8

PROGRAMM UND ZEITPLAN

Zeit Programm Vorbereitung

1.Tag -100 l-Fermenter vorbereiten autoklavieren/kompletieren -1 l-Kulturen vorbereiten -Lösungen herstellen, anaerobisieren, autoklavieren

-Medium ansetzen -Fe(III)-Citrat im Autoklaven lösen -Geobacter-Medium herstellen -CaCl2-Stammlösung -MgSO4-Stammlösung, -Substrat- Stammlösungen (Benzoat, 4- Hydroxybenzoat, Phenylacetat, Acetat) -Nitrat- Stammlösungen -Inokulum wird bereitgestellt

2.Tag -200 l-Fermenter, -1-l-Kulturen komplettieren und beimpfen 1. Probennahme -4-OH-Benzoat-Bestimmung -Substrat für Zufütterung des 200 l- Fermenters -falls möglich: Animpfen 200-l-Kulturen + 1. Probennahme 200 l-Fermenter

-Inokulum wird bereitgestellt - 0.1 M NaOH, Standardlösung 4-OH-Benzoat

3.Tag -Ernte der 1 l-Kulturen -Aufschluß (Frenchpresse, Ultrazentri- fugation) -weitere Probennahmen 200-l-Fermenter, Auszählen der Proben -Trockengewichtsbestimmung -Ammoniumsulfatfällung (falls noch möglich)

-20 mM Tris/HCL Puffer pH 7,8

4.Tag -Ammoniumsulfatfällung -Proteinbestimmung -Probennahme 200-l-Fermenter

-Ammoniumsulfatlösung, gesättigt -Bradford-Reagenz, BSA-Stammlösung

5.Tag -Ernte 200-l-Fermenter -4-OH-Benzoat-Bestimmung -Auswertung

-Durchlaufzentrifuge vorbereiten

9

DURCHFÜHRUNG • Wachstumsmedien und Bestimmungen 1 l-Kulturen. Jede(r) züchtet eine Kultur; die verwendeten Substrate werden abgesprochen. Grundmedium für 1 l wird in 1-l-Flaschen angesetzt. Anschließend wird durch wiederholtes Vakuum anlegen und Begasen mit Stickstoff das Medium sauerstofffrei gemacht (wird gezeigt). Nach dem Autoklavieren und Abkühlen wird das Medium mit den übrigen, getrennt autoklavierten Stammlösungen komplettiert und beimpft. Als Inokulum dienen logarithmisch wachsende Vorkulturen (werden zur Verfügung gestellt). 200-l-Fermenter. Zunächst werden 50 mM Fe(III)-Citrat (auf 50-l-berechnet) in 45-l Wasser suspendiert und autoklaviert. Nach Abkühlen werden das Geobacter-Grundmedium mit 4 M NaOH Lösung auf pH 6 eingestellt (Vorsichtiges Titrieren unter starkem Rühren). Danach werden die anderen Bestandteile des Grundmedium in 2 l H2O suspendiert und zum Fermenter gegeben. Der Fermenter wird erneut autoklaviert. Das Abkühlen des Fermenters auf ca. 30°C erfolgt bei leichtem N2/CO2-Überdruck, somit wird das Medium auch anaerobisiert. Anschließend werden die getrennt anaerobisierten und autoklavierten Stammlösungen komplettiert. Als Inokulum dienen mindestens 2 l einer Vorkultur von Geobacter metallireducens aus der logarithmischen Wachstumsphase (auf 4-OH-Benzoat gewachsen). . • Herstellung der Medien und Stammlösungen 1. G. metallireducens (200-l-Kultur). Es wird ca. 4-l einer 4 M NaOH-Lösung gebraucht, um die Fe(III)-Citrat-Lösung auf pH 6 zu titrieren. Grundmedium pH 7,0: Einwaage Konzentration im Medium Fe(III)-Citrat MG 262

13,15 g/l 50 mM

4 M NaOH Lösung MG 40

Titration der abgekühlten Fe(III)-Citrat Lösung auf pH 6.0

Ca 20 mM

NaHCO3 MG 84

2,5 g/l 30 mM

KH2PO4 x H2O MG 137

0,6 g/l 4.3 mM

NH4Cl MG 53

1,5 g/l 10,0 mM

2. T. aromatica (1-l-Kultur) Grundmedium pH 7,8: Einwaage Konzentration im Medium NaH2PO4 MG 246

0,6 g/l 7,9 mM

K2HPO4 MG 174

5,6 g/l 32,1 mM

NH4Cl MG 53

0,5 g/l 10,0 mM

10

Stammlösungen für G. metallireducens und T. aromatica: Wichtig: Die 4-OH-Benzoesäure ist unlöslich in H2O und wird mit dem zusammen eingewogenen NaOH unter Rühren gelöst (pH-Check hinterher !). Einwaage Konzentration im Medium 0,8 M MgSO4- Stammlösung (0.05 l): MgSO4 x 7H2O MG 246

200 g/l

0,8 mM

0,1 M CaCl2- Stammlösung (0.05 l): CaCl2 x 2 H2O MG 147

15 g/l

0,1 mM

1 M Substrat- Stammlösung (0.075 l): 4-OH-Benzoesäure MG 138 NaOH MG 40

138 g/l 40 g/l

1,5 mM 1,5 mM

Vitaminelösung VL 7 (1000-fach konzentriert) (0.2 l): (wird zur Verfügung gestellt) Cyanocobalamin 100 mg/l Pyridoxin-dihydrochlorid 300 mg/l Thiamindichlorid 200 mg/l Ca-D(+)-Pantothenat 100 mg/l 4-Aminobenzoesäure 80 mg/l D(+)-Biotin 20 mg/l Nicotinsäure 200 mg/l

Spurenelementelösung SL-10 (1000-fach konzentriert) (0.2 l): (wird zur Verfügung gestellt) FeCl2 x 4 H2O 3 g/l MnCl2 x 4 H2O 100 mg/l CoCl2 x 6 H2O 190 mg/l ZnCl2 70 mg/l Na2MoO4 x 6 H2O 36 mg/l NiCl2 x 6 H2O 24 mg/l H3BO3 6 mg/l CuCl2 x 2 H2O 4 mg/l Nitrilotriessigsäure 143,3 g/l NaOH 58 g/l Nur für Geobacter: Selen/Wolframat-Lösung: (1000-fach konzentriert, wird zur Verfügung gestellt) Zusätzlich zu den oben genannnten Stammlösungen (0.8 M MgSO4, 0,1 M CaCl2, 1,5 M Natriumnitrat) benötigen Sie 1 M Substratlösungen von Natriumacetat, Phenylacetat, Benzoat und 4-Hydroxybenzoat für die 1 l-Kulturen (jeweils ca.100 ml). Da die 1l-Kulturen anaerob gezogen werden, benötigen Sie ausserdem eine 1.5 M Stammlösung des Elektronenakzeptors Natriumnitrat. Stammlösungen Einwaage Konzentration im Medium 1 M Natriumacetat-Stammlösung MG 82

8,2 g / 100ml 20 mM

1 M Phenylesssigsäure/ NaOH-Stammlösung MG 136 / MG 40

13,6 g / 100 ml4 g / 100 ml

5 mM

1 M Natriumbenzoat-Stammlösung MG 144

14 g / 100 ml

5 mM

1M 4- Hydroxybenzoat/ NaOH-Stammlösung MG 138 / MG 40

13,8 g / 100 ml4 g / 100 ml

5 mM

1.5 M NaNO3- Stammlösung MG 85

12,7 g/100 ml Die Konzentration im Medium ist abhängig vom Substrat.

11

• Probennahme. Fermenter: Entnehmen Sie aus dem 200 l-Fermenter gleich nach dem Beimpfen und sonst 2-mal täglich eine Probe von ca. 25 ml. Die Auszählung muß unmittelbar erfolgen. Zur Bestimmung von 4-OH-Benzoat werden 1 ml Probe 10 min in der Eppendorfzentrifuge bei vollem Lauf zentrifugiert. Der Überstand wird bei -20°C aufbewahrt. Die täglichen Probennahmen dienen dazu, mittels Auszählung und pH-Wert Kontrolle das Wachstum von G. metallireducens zu verfolgen. 1 l-Kulturen: Bei den 1 l-Kulturen entnehmen Sie 1 ml Proben und verfahren entsprechend. Sie bestimmen das Wachstum über die optische Dichte, Nitrat- und Nitrit- Bestimmung. • Nitrat/Nitrit- Bestimmung. Während des Verlaufs der Züchtung von T. aromatica in 1 l-Kulturen wird bei jeder Probenahme mit Teststäbchen auf Nitrat und Nitrit getestet. Es sollte zu keiner Anhäufung der beiden Stoffe kommen (Nitrit hemmt das Wachstum!). • Bestimmung von 4-OH-Benzoat. 4-OH-Benzoat wird photometrisch nach vorheriger Alkalisierung (pH 12) bestimmt. Entsprechend verdünnte Standards (0,04 ml der 1:500 verdünnten 1 M Stammlösung) und Proben (0,05 ml) werden mit 0.1 M NaOH auf 1 ml aufgefüllt. Erstellen Sie ein UV-Spektrum von 4-OH-Benzoat, bestimmen Sie das Absorptionsmaximum, erstellen Sie bei dieser Wellenlänge eine Eichkurve von 4-OH-Benzoat und bestimmen Sie den Extinktionskoeffizienten bei 277 nm. Wo liegt die Nachweisgrenze? In welchen Grenzen ist die Bestimmung linear? Die Konzentration gleich nach dem Beimpfen und von übrig gebliebenem Substrat am Ende der Fermentation errechnen Sie mittels Lambert-Beer’schem Gesetz aus dem geeignet verdünnten Kulturüberstand. Welche Konzentrationen bestimmen Sie im Fermenter, wieviel Substrat wurde verbraucht? • Wachstumsbestimmung. Das Wachstum wird durch Auszählen in Neubauer-Kammern durchgeführt. Anweisung und Berechnung gemäß dem Kursassistenten. • Trockengewichtsbestimmung. Ein genau bestimmtes Kulturvolumen (100 ml- 1 l, abhängig von der OD; auswiegen!) wird zunächst durch Zentrifugation (10 min, 9000 rpm) und Resuspension in ca. 20 ml verbleibendem Medium ankonzentriert und durch einen zuvor gewogenen Sterilfilter filtriert. Das Feuchtgewicht wird durch erneutes Wiegen bestimmt. Der Filter wird dann über Nacht bei 100°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und dann das Trockengewicht bestimmt. • Kultur im Fermenter und in 1 l-Flaschen Vorgehensweise. Fermenter: Zusammenbau und Funktionsweise der 50 l–Plastikfermenter wird von den Assistenten erklärt. Wir züchten die Zellen anaerob bei 30°C auf 4-OH-Benzoat unf Fe(III)-Citrat. 1 l Kulturen: Die Züchtung von T. aromatica erfolgt anaerob bei 28°C in 1 l Kulturflaschen mit Benzoat (5 mM), Acetat (20 mM), Phenylacetat (5 mM) oder 4-Hydroxybenzoat (5 mM) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle. Das molare Verhältnis der Kohlenstoffquelle zum Elektronenakzeptor Nitrat liegt bei Benzoat oder 4- Hydroxybenzoat als Substrat bei 1:3, bei Phenylacetat bei 1:4 und bei Acetat bei 1:1 im Medium. Jeder züchtet Zellen nur mit einem Substrat. Die Zelldichte (OD578-Wert) in den 2 l-Kulturen wird nur gelegentlich gemessen, um den richtigen Zeitpunkt der Zellernte zu ermitteln (OD 0,4). Das Wachstum wird durch Trübungsmessung bei λ = 578 nm verfolgt. Zellernte. Fermenter: Die Zellen werden mit der Durchlaufzentrifuge abzentrifugiert, was Ihnen gezeigt wird. 1 l Kulturen: Die Zellernte der im 1 l- Maßstab gezüchteten Kultur von T. aromatica erfolgt in der logarithmischen Wachstumsphase. Die Kultur wird zunächst in 500 ml Portionen in 0,5 l- Zentrifugenbechern bei 9.000 rpm und 4°C 15 min abzentrifugiert. (Sorvall RC 5C Zentrifuge, Superlite GS-3-Rotor). Anschließend wird der Niederschlag mit je 10 ml 20 mM Tris / HCl- Puffer pH 7,8 suspendiert und die Zellsuspension in ein vorgewogenes 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Nach erneuter Zentrifugation (bei 9.000 rpm, 4°C, 15 min; Sorvall RC 5C Zentrifuge, SS-34-Rotor) wird der Überstand dekantiert, das Gewicht bestimmt und das Feuchtgewicht errechnet. Danach wird der Niederschlag in 20 mM Tris / HCI- Puffer pH 7.8 resuspendiert, so dass ein Verhältnis von 1: 2 vorliegt (g Feuchtgewicht : ml Puffer). Die so erhaltene Zellsuspension lagern Sie bis zum Aufschluss auf Eis. • Herstellung der Zellextrakte und Ammoniumsulfat-Fällung Extraktherstellung. Zu maximal 3,6 ml der Zellsuspension wird eine kleine Menge (0,1 mg/ml) DNAase I zugegeben. Der Aufschluß erfolgt in einer auf 4°C vorgekühlten Zelle einer French-Presse (kleine Zelle) bei 1.000 bar. Der gewonnene Zellextrakt wird in einen 10 ml Ultrazentrifugenbecher mit Schraubdeckel (Material aus Polycarbonat, Beckmann) geleitet und anschließend bei 100.000 x g (40.000 rpm ) und 4°C für 1 Stunde abzentrifugiert (Beckmann Ultrazentrifuge, 70.1-Ti-Festwinkelrotor). Der Überstand wird in ein vorgewogenes Gefäß dekantiert, das Gewicht

12

erneut bestimmt und daraus das Volumen errechnet. Von diesem Extrakt werden 0.5 ml für Teil II dieses Praktikums mit Ammoniumsulfat gefällt, der Rest wird portioniert und für Teil III dieses Praktikums aufbewahrt (-20°C). Ammoniumsulfat-Fällung. Zellextrakt (0.5 ml) wird mit Ammoniumsulfat bei 55% Sättigung gefällt. Zur Fällung wird eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung pH 7,8 verwendet, die 1 mM EDTA enthält. Die Lösung wird unter leichtem Rühren (Rührfisch!) auf 4°C dem Zellextrakt tropfenweise zugefügt. Die Dauer der Fällung beträgt ca. 30 min., anschließend wird 15 min auf Eis weitergerührt. Nach 10 Minuten Zentrifugation bei vollem Lauf in der Eppendorfzentrifuge wird der Überstand verworfen und der Niederschlag in 0,5 ml Grundpuffer (20 mM Tris/HCl pH 7.8) , der 10% Glycerin enthält, aufgenommen. Portionieren Sie die erhaltene Lösung in zwei Teile. Die benötigten Mengen gesättigter Ammoniumsulfatlösung für die Fällung errechnen sich nach folgender Formel: V x X% + Y x 100% = (V+Y) x Z%. V = Volumen der zu fällenden Proteinfraktion. X = % Sättigung mit Ammoniumsulfat in der zu fällenden Lösung. Y = benötigtes Volumen gesättigter Ammoniumsulfatlösung. Z = gewünschte % Sättigung mit (NH4)2SO4. Daraus ergibt sich: Y = V x ( (Z%-X%): (100%-Z%) ) Ammoniumsulfat-Lösung: 50 ml gesättigtes Ammoniumsulfat pH 7.8 und 1 mM EDTA (Einwaage: 30 g Ammoniumsulfat; 14,6 mg Na4 EDTA, nach praktisch vollständigem Lösen mit 0,5 N NaOH pH 7,8 einstellen). Proteinbestimmung. Für die Versuche II und III benötigen Sie eine Proteinbestimmung von den hergestellten Zellextrakten und den mit Ammoniumsulfat gefällten Extrakten. Die Bradford-Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration beruht darauf, dass Coomaasie-Farbstoff (Brilliant Blue G250) an die Proteine im Sauren bindet aufgrund zweier Eigenschaften: Der Triphenylmethanrest bindet an die unpolaren Bereiche der Proteine und die anionischen Sulfonat-Gruppen interagieren im Sauren mit den kationischen Seitenketten (Arg-/Lys-Reste). Der Farbwechsel, der bei der Bindung des Farbstoffes an Proteine auftritt, ermöglicht eine Bestimmung des Gesamtproteingehalts. Die Methode ist zwei- bis dreimal empfindlicher als die Lowry- oder BCA-Methode. Folgende Verbindungen stören: Detergenzien wie Triton, SDS, Desoxycholat. Zur photometrischen Bestimmung des Proteingehaltes (µg/ml) wird zunächst eine Eichkurve mit einem Proteinstandard erstellt. Wir verwenden dazu Rinderserumalbumin (BSA „bovine serum albumin“, 2 µg/µl). Der Test ist auf Eppendorfhütchen ausgelegt. Die Lösungen werden zur Verfügung gestellt. Von den zu testenden Extraktlösungen werden 1:100-Verdünnungen in Wasser hergestellt . Im Test werden je 5 µl und 20 µl in Doppelansätzen eingesetzt. Die so erhaltenen Extraktlösungen und Proteinstandard-Lösungen (0, 3, 6, 9 µg Protein), (Doppel- bestimmung) werden mit H2O auf 200 µl aufgefüllt. Anschließend wird 1 ml Bradford-Lösung zugegeben und gut gemischt. Die Proben werden anschließend 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die photometrische Messung der Proben erfolgt bei 595 nm. Zur Auswertung werden die Proteinkonzentrationen der verdünnten Extrakte auf der BSA-Eichkurve abgelesen und der Proteingehalt (µg/µl) der Ausgangslösungen unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors berechnet. Bradford-Reagens: 100 mg Coomassie brilliant blue G 250 (0.01 % (w/v)), 50 ml Ethanol (Endkonzentration: 5 % (v/v)), 100 ml konz. Phosphorsäure (Endkonzentration: 8,5 %), auffüllen mit H2O auf 1 l und anschließend filtrieren.

13

AUSWERTUNG UND PROTOKOLL Tabelle 1: Wachstum von G. metallireducens mit 4-OH-Benzoat bei 30°C. V = 200 l, Inokulum = ml/50 l, 4-OH-Benzoat (t0) = .

Probe Zeitpunkt der Probe Bakterien Dichte Substratverbrauch pH No Datum Zeit Dauer

(h) (Zellzahl pro ml) Benzoat

zugeg. (mmol/50 l) pH Sonstiges

14

Tabelle 2: Bilanzierung des Wachstums von G. metallireducens Probe Dauer (h) Zellzahl1 4-OH-

Benzoat(t) aus Inok. 4-OH- Benzoat

Rest 4-OH- Ben.

Gesamt 4-OH- Benzoat

Y (g/mol)

Td (h) µ (1/min) µ/Y = q

Anfang Ende 1OD 1.0 = g TZ / l Abb. 1: Wachstumskurve 1 l-Kultur Abb. 2: Wachstumskurve 200-l-Fermenter Tabelle 4: Zellmengen der verschiedenen 1 l-Kulturen und Proteinkonzentrationen der verschiedenen Extrakte

15

Tabelle 5:

Fermenterprotokoll Lauf Nr.

Datum:

Organismus/Stamm:

Substrat:

1. Inokulum: Volumen (l)

A0

X0 Zellmenge (g Trockengewicht)

2. Substrat vorgelegt:

mM Benzoat

mol Benzoat

3. Ernte: Zeitpunkt:

OD:

Ausbeute: g Feuchtmasse

4. Lagerung: in Flüssig-Stickstoff oder in .............................

Beschriftung:

Rückseite beachten!!

16

Medium: Volumen: 200 l; pH: ; Temperatur: °C

Zusammensetzung: Fe(III)-Citrat: g mit _______ml 4 M NaOH auf pH _____ eingestellt

NaHCO3: g

K2HPO4: g

NH4Cl: g

KCl: g

Nach Autoklavieren zugesetzt:

MgSO4 (Stammlösung 0,8 M): ml

CaCl2 (Stammlösung 0,2 M): ml

VL-7 (1000 x Stammlösung): ml

SL-10 (1000 x Stammlösung): ml

Vorgelegte Substrate: C-Quelle(n): ....................... (Stammlösung ................ M): ml

......................................

Wachstumsbilanz:

Gesamtzeit:

Generationszeit:

C-Quelle: Mol vorgelegt:

- Rest vorhanden:

Mol verbraucht:

Verhältnis C-Quelle: Fe(III)-Citrat =

17

Tabelle 4: Extrakt von Zellen von T. a., die mit Phenylacetat, 4-Hydroxybenzoat, Benzoat undAcetat (jeweils mit Nitrat als Elektronen-Akzeptor) gezogen wurden

Extrakt AS-FällungWachstum auf Zellmenge Volumen Protein ges. Protein/ml Volumen Protein ges. Protein/ml BenzoatPA4OH-BAc

Zeit

Log

Wac

hstu

m (O

D57

8)

Abb 1. Wachstumskurven von T. aromatica in 2 L-Kulturen mit x mM .... und y mM Nitrat, 30 °C

Zeit

Wac

hstu

m (O

D57

8)

Abb 2. Wachstumskurven von G. metallireducens im Fermenter mit 4-Hydroxybenzoat und Fe(III), 30 °C

4-O

H-B

enzo

at

18

VERSUCH II. Bestimmung der Enzymparameter der Benzoat-CoA Ligase aus Thauera aromatica und Anreicherung durch DEAE-Sepharose-Chromatographie

ZIELE Die Ziele dieses Versuchs sind: (1) die Aktivität und die Eigenschaften der Benzoat-CoA Ligase in Thauera aromatica zu bestimmen (Protein-, Zeit- und Substratabhängigkeit etc.), (2) das Enzym über eine Anionenaustausch-Chromatographie anzureichern, (3) die Induktion der Benzoat-CoA Ligase und eventuell zusätzlich vorhandene CoA Ligasen in Zellen zu messen, die auf verschiedenen Substraten gezogen wurden. THEORIE Das Enzym Benzoat-CoA Ligase katalysiert den ersten Schritt des Benzoat-Stoffwechsels:

Benzoat + MgATP + CoASH → Benzoyl-SCoA + MgAMP + PPi Die Aktivität der Benzoat-CoA Ligase (1) wird in einem gekoppelten Enzymtest bei 30 °C verfolgt. Gemessen wird die AMP-Bildung, die über Myokinase (2), Pyruvatkinase (3) (+ Phospoenolpyruvat) und Lactat-Dehydrogenase (4) an die Oxidation von NADH geknüpft ist.

(1) Benzoat + ATP + CoASH → Benzoyl-CoA + AMP + PPi (Mg2+) (2) AMP + ATP ↔ 2 ADP (3) 2 ADP + 2 PEP → 2 Pyruvat + 2 ATP (K+) (4) 2 Pyruvat + 2 NADH + 2H+ → 2 Lactat + 2 NAD+

Der zeitliche Verlauf der Oxidation wird bei 365 nm photometrisch in Plastikküvetten (0,5 ml Testvolumen) verfolgt. Der molare Extinktionskoeffizient für NADH (ε365) beträgt 3,4 x 103 M-1 cm -1. Pro Mol Substrat werden 2 Mol NADH oxidiert. Wichtig: Raten der Hilfsenzyme dürfen niemals limitierend sein. Übersicht über das (komplette) Reinigungsprotokoll für Benzoat-CoA Ligase. Aus Zeitgründen führen wir im Praktikum nur die Anreicherung des Enzyms bis zur Stufe der DEAE-Sepharose durch.

Extrakt-Bereitung aus Zellen von T. aromatica

↓ Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung

↓ Entsalzung durch Dialyse

↓ Chromatographie an DEAE-Sepharose

↓ Chromatographie an Mono-Q (starker Anionentauscher)

↓ Affinitätschromatographie an Reactive Green-Agarose

↓ Gelfiltration an Superdex 200

19

METHODEN UND KONZEPTE Enzymanreicherung, Anreicherungstabelle, Chromatogroaphie DEAE, Leitfähigkeitsmessung, Ammoniumsulfatfällung, & Dialyse, Entwickeln eines Enzymtests, Prinzip des gekoppelten Enzymtests, Stöchiometriebestimmung, Enzymspezifität, Protein- und Zeitabhängigkeit, Substratabhängigkeit in Enzymtests, Enzyminduktion, Coenzyme, Enzymfamilien. FRAGEN, DIE EXPERIMENTELL BEANTWORTET WERDEN Anhand dieser Versuche sollten Sie lernen, wie man mit geeigneten Kontrollen eine bestimmte Enzymreaktion selbst in Gegenwart von tausend anderen Enzymen sicher quantitativ messen kann. -Ist die Reaktionsgeschwindigkeit linear abhängig von der Proteinmenge? -Ist die Produktbildung linear zeitabhängig? -Ist die Reaktion abhängig von allen Substraten? -Entspricht die Stöchiometrie der Erwartung? -Wie wäre es noch möglich die Benzoat-CoA Ligase zu messen (siehe Versuch IV)? -Ist die Enzymaktivitätsmenge abhängig von den Wachstumsbedingungen? -Ist die spezifische Rate der Enzymreaktion ausreichend für das Wachstum der Zellen? -Hat das angereicherte Enzym immer noch die gleichen Eigenschaften? -Liegt der Km-Wert für das aromatische Substrat in einem vernünftigen physiologischen -- Bereich? -Ist die Substratspezifität des Enzyms den Erwartungen entsprechend? -Entspricht die Regulation der Enzymaktivitätsmenge (wie immer der zugrundeliegende - Regulationsmechanismus sein mag) der postulierten Rolle des Enzyms im Stoffwechsel? -Gibt es ähnliche, aber verschiedene Enzyme neben Benzoat-CoA Ligase? Wie werden diese reguliert? Reference: Schühle et al. (2003) Benzoate-Coenzyme A Ligase from Thauera aromatica:

an Enzyme Acting in Anaerobic and Aerobic Pathways. J. Bacteriol. 185: 4920-4929

20

PROGRAMM UND ZEITPLAN:

Zeitplan Programm Vorbereitung 1. Tag

– Extrakt-Herstellung – Enzymfällung - 33 % Ammoniumsulfat - 60 % Ammoniumsulfat – Entsalzung durch Dialyse

– Stammlösungen – Zellen (5 g Feuchtgewicht)/Gruppe – Gesättigte Ammonium-

sulfatlösung – Dialyseschläuche + -puffer

2. Tag

Messen der Benzoat-CoA Ligase – Protein- und Zeitabhängigkeit – Abhängigkeit des Tests von ATP, Mg, CoA – Bestimmung der Stöchiometrie

– Laufpuffer für DEAE-Säule (zunächst ohne DTE) – Gießen der DEAE-Säule

3. oder 4. Tag

– DEAE-Säule (Chromatographie) – Enzymaktivitäten der einzelen Fraktionen bestimmen

– DTE zum DEAE-Laufpuffer hinzufügen

3. oder 4. Tag

– Proteinkonzentrationen – CoA-Ligase-Aktivitäten für andere Substrate: Phenylacetat, 4-Hydroxybenzoat, Acetat

– Bradford-Proteinlösung – versch. Substratlösungen

5. Tag

– Auswertung

21

DURCHFÜHRUNG Enzymanreicherung durch Fällung (1. Tag) •Stammlösungen. Folgende Stammlösungen werden für die ganze Woche angesetzt: Molekulargewicht (g/mol) 100 ml 0,5 M Tris/HCl, pH 8,0 121,1 100 ml 0,25 M MgCl2 203,3 •Grundpuffer (50 ml): Enkonzentration 1ml 0,5 M Tris/HCl, pH 8,0 10 mM Tris/HCl, pH 7,5 0,4 ml 0,25 M MgCl2 2 mM MgCl2

0,015g DTE (fest) 2 mM DTE + 40ml H2O, pH auf 7,5 einstellen, auf 50 ml mit H2O auffüllen. Extraktherstellung. 5 g eingefrorene Thauera aromatica (mit Benzoat gewachsen) Zellen werden in 10 ml Grundpuffer (mit einer kleinen Spatelspitze DNAase I, ungefähr 0,1 mg/ml) gut resuspendiert (Becherglas mit Rührfisch auf Eis). Die Zellen werden durch Passage in der French Presse (vorgekühlte große Zelle, 1260 psi) aufgebrochen. Der erhaltene Extrakt wird in der Ultrazentrifuge bei 4 °C für 1 h bei 100.000 g zentrifugiert, um Zelltrümmer, Membranen und Ribosomen zu entfernen. Der 100.000 g Überstand (Volumen durch Wägung bestimmen !1g ≡ 1ml) wird für die weitere Reinigung eingesetzt. Ammoniumsulfat-Fällung. (siehe Teil I). Der erste Reinigungsschritt besteht aus einer zweistufigen Ammoniumsulfat-Fällung des löslichen Zellextraktes in einem 50 ml Erlenmeyerkolben bei 4° C (0 % bis 33 % und 33 % bis 60 % Sättigung). Alle erhaltenen Fraktionen werden auf Enzymaktivität getestet. Bewahren Sie auch Proben für spätere Proteinbestimmungen auf (gut beschriften) !! Zur Fällung wird eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung pH 7,8 verwendet, die 1 mM EDTA enthält. Die Lösung wird unter leichtem Rühren (kleiner Rührfisch!) der Proteinfraktion tropfenweise zugesetzt. Die Dauer der Fällung beträgt ca. 30 min, danach wird 15 min auf Eis weitergerührt. Dann wird bei 10.000 x g in der Kühlzentrifuge (Corex-Röhrchen; SS-34-Rotor) zentrifugiert (15 Minuten, 4°C), der Überstand nach der 33% Fällung wird weiter verwendet, der Niederschlag wird verworfen (nachdem Sie geprüft haben, ob im gewaschenen Niederschlag wirklich keine Enzymaktivität enthalten ist !). Nach der 60 % Ammoniumsulfat-Fällung wird der Überstand verworfen (sobald feststeht, dass auch hier keine Aktivität enthalten ist !), der Niederschlag wird in einem Volumen Grundpuffer aufgenommen. Y = V x ( (Z%-X%): (100%-Z%) V = Volumen der zu fällenden Proteinfraktion. X = % Sättigung mit Ammoniumsulfat in der zu fällenden Lösung. Y = benötigtes Volumen gesättigter Ammoniumsulfatlösung. Z = gewünschte % Sättigung mit (NH4)2SO4. Vorsicht: Die Benzoat:CoA Ligase ist möglicherweise erst im 60% Niederschlag nachweissbar!

22

Aktivitätsmessung der Benzoat-CoA Ligase (1. Tag) • Stammlösungen ca.0,3 ml 50 mM Phosphoenolpyruvat 206,1 (Kaliumsalz, Pyruvatkinase ist K+-abhängig) ca. 0,3 ml 20 mM NADH 709,4 ca. 0.3 ml 20 mM CoA (wird gestellt) 1.000,0 ca. 0,3 ml 50 mM ATP 605,2 1 ml 100 mM DTE oder DTT 154,3 10 ml 25 mM Natriumbenzoat 144 (ganz genau, wird für Stöchiometrieversuche benützt) Die 1ml Lösungen werden immer auf Eis gelagert und am Ende jedes Versuchstags bei –200C eingefroren. • Testpuffer (auf Eis!) Tris/HCl pH 7,8 100 mM ___ ml 0.5 M Tris/Cl, pH 8,0 MgCl2 5 mM ___ ml 0.25 M MgCl2 ATP 1 mM ___ ml 50 mM ATP CoA 0,4 mM ___ ml 20 mM CoA NADH 0,5 mM ___ ml 20 mM NADH Phosphoenolpyruvat 1 mM ___ ml 50 mM PEP Myokinase 2 U / 5 ml Lactat-Dehydrogenase 2 U / 5 ml Pyruvatkinase 2 U / 5 ml DTE oder DTT 2 mM ___ ml 100 mM DTE/DTT mit H2O auf 5 ml Endvolumen auffüllen Setzen Sie unter Verwendung Ihrer Stammlösungen 5 ml dieses Ansatzes für 10 Tests an (es sollte nicht nötig sein den pH nochmals einzustellen). •Testansatz (300C): 490 – x µl Testpuffer

x µl Enzymprobe → Bestimmung des Leerwertes

Zum Start der Reaktion: 10 µl 25 mM Benzoat (Endkonzentration 0,5 mM) ──────── → Bestimmung des Messwertes 500 µl Testvolumen Testansatz und Enzymprobe werden in eine Küvette gegeben und die NADH-Oxidation wird im Photometer bei 365 nm verfolgt (Leerwert). Sobald die gemessene Rate linear ist, wird die Reaktion durch Zugabe von Benzoat gestartet und weiter die Absorptionsabnahme bei 365 nm verfolgt (Messwert). Der Leerwert wird vom Messwert abgezogen. Entsalzung der Probe durch Dialyse. Die gefällte und in Grundpuffer aufgenommene (aktive!) Proteinfraktion nach der 60 % Ammoniumsulfatfällung wird in vorbereitete Dialyseschläuche (Ausschlussvolumen 12-14 kDa, autoklaviert in 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0!) gefüllt (die Schläuche nicht ganz voll machen, möglichst wenig Luft einschließen und gut verknoten !). Der Schlauch wird über Nacht bei 4 °C gegen 1 l Dialysepuffer dialysiert, am nächsten Morgen wird der Dialysepuffer mit 1l frischem Dialysepuffer ersetzt und nochmals über Nacht bei 4°C dialysiert.

•Dialysepuffer (2 × 1l) wird unter Verwendung der Stammlösungen angesetzt; Endkonzentration: 10 mM Tris-HCl pH 7,5; 2 mM MgCl2

23

Eigenschaften des Enzyms (2. Tag) Am Anfang jeder Enzymcharakterisierung steht die Austestung einiger wichtiger Parameter des Enzyms und des verwendeten Testsystems. (1) Eine typische Enzymreaktion (1. Ordnung) ist innerhalb gewisser Grenzen linear abhängig von der Proteinmenge (nur in diesem Bereich können Raten genau bestimmt werden!), und die Anfangsgeschwindigkeit sollte eine lineare Zeitabhängigkeit zeigen. (2) Besonders wichtig ist es, bereits früh durch geeignete Kontrollen (Supplementation des Tests) die Abhängigkeit des Enzyms von Substraten, Cosubstraten und Cofaktoren zu bestimmen. (3) Die Reaktionsstöchiometrie wird bestimmt. In unserem Fall wird die umgesetzte Menge von NADH bei Einsatz von genau bekannter limitierender Substratmenge bestimmt (nur möglich bei irreversiblen Reaktionen). Daraus kann geschlossen werden, ob die Benzoat-CoA Ligase ATP zu ADP oder AMP spaltet. (4) Die Analyse der gebildeten Produkte (siehe Teil IV) gibt die Sicherheit, die vermutete Reaktion gemessen zu haben. •Verwendetes Enzym. Ungefähr 1/10 der dialysierten Probe vom Vortag wird für die Messung der Enzymeigenschaften abgenommen und gleichzeitig der Dialysepuffer ersetzt. •Testlösung (wie am 1. Tag) für 20 Enzymtests, aber ohne Mg2+, ATP, CoA und Substrat ! 2 ml 0,5 M Tris/Cl, pH 8,0 0,25 ml 20 mM NADH (Endkonzentration: 0,5 mM) 0,2 ml 50 mM PEP 14 µl Myokinase, 5 µl Lactat-Dehydrogenase, 7,6 µl Pyruvatkinase 0,2 ml 100 mM DTE + 6,4 ml H2O •Testansatz. Zu je 450 µl Testlösung: CoA (µl) ATP (µl) MgCl2 (µl) Protein (µl) Starten mit

Versuch 1 10 10 10 10 (1:2) 10 µl Benzoat

Versuch 2 10 10 10 10 (1:10) 10µl Benzoat

Versuch 3 10 10 10 10 (1:20) 10µl Benzoat

Versuch 4 10 10 10 10 (1:10) 10 µl 1:10 verd. Benzoat

(Endkonz. 0,05 mM)

Versuch 5 10 10 10 10 (1:10) 10 µl 1:5 verd. Benzoat

(Endkonz. 0,1 mM)

Versuch 6 -- 10 10 10 (1:10) 10 µl Benzoat, dann mit 10 µl CoA

Versuch 7 10 -- 10 10 (1.10) 10 µl Benzoat, dann mit 10 µl ATP

Versuch 8 10 10 -- 10 (1:10) 10 µl Benzoat, dann mit 10 µl MgCl2

Versuch 9 10 10 10 10 (1:10) 10 µl 4OH-Benzoat, dann mit 10 µl Benzoat

In den Versuchen 1 bis 3 wird die Proteinabhängigkeit der Reaktion gezeigt; in den Versuchen 6 bis 8 wird die Abhängigkeit von den anderen Substraten gezeigt. In den Versuchen 4 und 5 wird die Reaktionstöchiometrie bei begrenzender Benzoatmenge bestimmt (Reaktion auslaufen lassen). Außerdem kann in diesem Versuch der Km-Wert für Benzoat abgeschätzt werden. Im Versuch 9 wird die Spezifität der CoA Ligase für das Substrat Benzoat getestet.

24

Enzymanreicherung: Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose (Pharmacia) (3. Tag) •DEAE-Puffer A (400 ml) wird unter Verwendung der Stammlösungen angesetzt (KCl fest einwiegen, DTE frisch dazugeben!)

Enkonzentration: 10 mM Tris/Cl, pH 7,5; 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM DTE •DEAE-Puffer B (200 ml) wird unter Verwendung der Stammlösungen angesetzt (KCl fest einwiegen, DTE frisch dazugeben!)

Enkonzentration: 10 mM Tris/Cl, pH 7,5; 500 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM DTE Eine Säule mit folgenden Parametern wird verwendet: Innendurchmesser 1,6 cm, Volumen 5 ml, Flussrate 60 ml/h. (Vorgeschlagene Lampeneinstellung: 0,5 – Schreiber: 50 mV; 1 mm/min Vorschub). Die Proteinfraktion nach Dialyse (Volumen durch Wiegen bestimmen; Enzymaktivität und Proteinmenge bestimmen) wird auf die mit 40 ml DEAE-Puffer A äquilibrierte Säule aufgetragen und anschließend mit Puffer A gewaschen. Der Proteingehalt des Vorlaufs wird mit einem UV-Monitor kontrolliert. Wenn die UV-Absorption wieder fast auf den Ausgangspunkt gesunken ist (ungefähr 30 ml), wird mit einem Gradientenmischer ein linearer Gradient über 20 Säulenvolumina (100 ml) von 50 - 500 mM KCl angelegt. Fraktionen von je 2 ml werden aufgefangen (im Schreiberausdruck markieren!) und auf ihre Ligase-Aktivität getestet. Die erhaltenen Gesamtaktivitäten der einzelnen Fraktionen werden als Blockdiagramm in das UV-Absorptionsprofil des Laufs eingetragen. Von den (nicht aktiven) Fraktionen wird die Leitfähigkeit bestimmt. Eine Eichkurve für die Leitfähigkeit wird mit Hilfe von Puffer A und B erstellt. Durch Vergleich des erhaltenen Wertes mit den Leitfähigkeitsmessungen der verschiedenen Lösungen wird der KCl Gehalt der einzelnen Fraktionen bestimmt und in die Abbildung zum Säulenlauf eingetragen. Die Benzoat-CoA Ligase sollte bei einer KCl-Konzentration von 80 mM im Puffer zu wandern anfangen, das Maximum der Elution des Proteins sollte bei einem KCl-Gehalt von 130 mM liegen. Fraktionen, die Enzymaktivität zeigen, werden vereinigt. Das Volumen der vereinigten Fraktionen (wiegen), die Enzymaktivität und Proteinkonzentration werden bestimmt. Aus diesen Werten wird eine Anreicherungstabelle erstellt.

Laufpuffer

Pumpe

Säule

UV-Monitor Fraktionssammler

Schreiber

Versuchsaufbau für die Säulenchromatographie

25

PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD (4. Tag) Die Proteinbestimmung in den verschiedenen Proteinfraktionen erfolgt nach der Methode von Bradford (siehe Fermenter-TeilI). Der Proteingehalt folgender Proben wird bestimmt: Schätzung (mg/ml) Zellextrakt von Thauera aromatica 100.000 g Überstand dialysiert z.B. 20 - 40 33 % Überstand Ammoniumsulfatfällung 33 % Niederschlag Ammoniumsulfatfällung 60 % Überstand Ammoniumsulfatfällung 60 % Niederschlag Ammoniumsulfatfällung, nicht dialysiert (Tag 1) 60 % Niederschlag Ammoniumsulfatfällung, dialysiert (Tag 2) 60 % Niederschlag Ammoniumsulfatfällung, DEAE-Auftrag (Tag 3) z.B. 2 - 5 DEAE vereinigte Fraktionen (Tag 3) 55 % Niederschlag Ammoniumsulfatfällung Benzoat Zellen (Teil I) z.B. 15 -30 55 % Niederschlag Ammoniumsulfatfällung Acetat Zellen (Teil I) 55 % Niederschlag Ammoniumsulfatfällung 4-Hydroxybenzoat Zellen (Teil I) 55 % Niederschlag Ammoniumsulfatfällung Phenylacetat Zellen (Teil I) Aktivitäten von CoA Ligase-Isoenzymen (4. Tag) •Substratlösungen. 10 ml 25 mM Phenylacetat (neutralisieren!) 10 ml 25mM 4-Hydroxybenzoat (neutralisieren!) 10 ml 25 mM Natriumacetat Die Anwesenheit von verschiedenen CoA-Ligasen in unterschiedlich angezogenen Zellen wird mit den Ammoniumsulfat-gefällten Zellextrakten aus Teil I untersucht. Die vier Proteinfraktionen werden auf Aktivitäten für Benzoat, Phenylacetat, 4-Hydroxybenzoat und Acetat untersucht. Es werden 10 ml des Testansatzes des 1. Tages (bis 20 Messungen) angesetzt. Die 50-fach konzentrierten Stammlösungen der jeweiligen Substrate werden verwendet, um die Reaktion zu starten. Folgende Test-Ansätze sind anzusetzen:

Extrakt (je 10 µl) Starten mit (je 10 µl) Versuch 1 Benzoat Versuch 2 Acetat Versuch 3 Phenylacetat Versuch 4

Benzoat-Zellen 4-Hydroxybenzoat

Versuch 5 Benzoat Versuch 6 Acetat Versuch 7 Phenylacetat Versuch 8

Phenylacetat-Zellen 4-Hydroxybenzoat

Versuch 9 Benzoat Versuch 10 Acetat Versuch 11 4-Hydroxybenzoat Versuch 12

4-Hydroxybenzoat-Z. Phenylacetat

Versuch 13 Benzoat Versuch 14 4-Hydroxybenzoat Versuch 15 Phenylacetat Versuch 16

Acetat-Zellen Acetat

26

AUSWERTUNG UND PROTOKOLL (5. Tag) Tabelle 1: Ammoniumsulfatfällung

Probe

Proben - volumen im

Test (µl)

Proben-volumen

gesamt (ml)

Leerwert (∆A/min)

Messwert (∆A/min)

∆ (Messwert - Leerwert) (∆A/min)

Gesamt- aktivität∗

(∆A/min)

Ausbeute (%)

Zellextrakt 33 % ÜS

z.B. 1µl

33 % Nd 60 % ÜS 60 % Nd ∗ Die Gesamtaktivität bezieht sich auf die Aktivität in der gesamten Probe Tabelle 2: Proteinabhängigkeit der Benzoat CoA Ligase

60 % Nd (dialysiert)

(µl)

Leerwert (∆A/min)

Messwert (∆A/min)

∆ (Messwert - Leerwert) (∆A/min)

Volumenaktivität∗ (µmol min-1 ml-1 )

Protein (mg/ml)

Spezifische Aktivität∗

(µmol min-1 mg-1) 5µl 1: 10 10µl 1:20 10µl

∗ Die Volumenaktivität bezieht sich auf die Aktivität in einem ml der Probe ∗ Die spezifische Aktivität bezieht sich auf die Aktivität pro einem mg des Proteins der Probe

Abb. 1: Zeitabhängigkeit (repräsentativer Schreiberausdruck)

Abb. 2: Proteinabhängigkeit der Reaktion

Abb. 3: Start mit S, ATP, Mg und CoA; Substratabhängigkeit der Reaktion (Schreiberausdrucke)

Zeit (min) Zeit (min) Extraktmenge (µl/Test)

A36

5

A36

5

Akt

ivitä

t (µm

ol/m

in)

27

Tabelle 3: Substratabhängigkeit der Benzoat CoA Ligase

Parameter Leerwert (∆A/min)

1.Messwert (+ Benzoat) (∆A/min)

2.Messwert (+ z.B. ATP)

(∆A/min)

∆ (1. Messwert ─ Leerwert)

(∆A/min)

∆ (2. Messwert ─ 1.Messwert)

(∆A/min) − ATP

− Mg2+ − CoA 4-OH Benzoat ─── Tabelle 4: Stöchiometrie der CoA-Ligase Eingesetzte Mengen Benzoat (nmol)

∆A365 NADH oxidiert (nmol)

Stöchiometrie

Tabelle 5: Spezifische Aktivität von CoA Ligasen in Zellen nach anaerobem Wachstum mit verschiedenen Substraten. Getestetes Substrat Wachstums- substrat

Benzoat 4-Hydroxy- benzoat

Phenyl- acetat

Acetat

spezifische Aktivität (µmol min-1 mg-1) Benzoat

4-Hydroxybenzoat Phenylacetat Acetat

Abb. 4. Reaktionsverlauf (mit 0.05 mM Benzoat gestartet) (Schreiberausdruck mit Auswertung)

Zeit (min)

A36

5

28

Tabelle 6: Reinigung der Benzoat-CoA Ligase

Reinigungsschritt Volumen Protein Prot. Gesamt Volumenaktivität Gesamtaktivität Spez. Aktivität Ausbeute Anreicherung(ml) (mg/ml) (mg) (µmol/min ml) (µmol/min) (µmol/min mg) (%) (-fach)

100000 g ÜS − − −

AS-Fällung

30 % ÜS

60 % Nd (100%) (1x)

Dialyse

DEAE

Abb. 6. DEAE-Säulenchromatographie zur Anreicherung der Benzoat-CoA Ligase ausThauera aromatica

A28

0

KC

l (m

M)

Vol

u men

akt iv

ität (

µmo l

/min

/ml)

Zeit

29

VERSUCH III.

Aktivität, Eisengehalt und UV/VIS-Spektren des Schlüsselenzyms des anaeroben Aromatenstoffwechsels von Thauera aromatica

ZIELE 1. Nachweis der Benzoyl-CoA Reduktase-Aktivität und Identifizierung von Produkten enzymatischer Folgereaktionen in Extrakten von T. aromatica nach Wachstum auf verschiedenen Substraten (Benzoat, Acetat) und mit gereinigter Benzoyl-CoA Reduktase 2. Charakterisierung der spektrale Eigenschaften und Bestimmung des Eisengehalt eines Eisen-Schwefel Proteins (Benzoyl-CoA Reduktase) und eines Häm-Proteins (Myoglobin) THEORIE Eigenschaften und Funktion der Benzoyl-CoA Reduktase. Die Benzoyl-CoA Reduktase (BCR) ist ein Schlüsselenzym des anaeroben Aromatenstoffwechsels und katalysiert die reduktive Dearomatisierung von Benzoyl-CoA (BCoA) zu einem nicht-aromatischen zyklischen Dien (siehe Abb.1). Dieser Prozeß ist analog zur Nitrogenase-Reaktion, da in beiden Fällen die Reduktion eines stabilen Substrates (resonanzstabilisierter aromatischer Ring, bzw. Dreifachbindung des molekularen Stickstoffs) an eine stöchiometrische ATP-Hydrolyse gekoppelt ist. Das Enzym ist beim denitrifizierenden Bakterium Thauera aromatica bei anaerobem Wachstum auf aromatischen Substanzen induziert. BCR ist ein sauerstoffempfindliches Eisen-Schwefel-Protein, welches aus 4 unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Aktivitätsmessung. Die Aktivitätsmessung der Benzoyl-CoA Reduktase basiert auf einem radioaktiven Test mit ringmarkierter 14C-Benzoesäure. Diese wird in Extrakten von Thauera aromatica durch die Benzoat-CoA Ligase (siehe Versuch II) zunächst zu 14C-Benzoyl-CoA umgesetzt, dem eigentlichen Substrat der BCR. 14C-Benzoyl-CoA wird anschließend durch die BCR in Anwesenheit eines Elektronenlieferanten (z.B. Na-Dithionit), ATP und Mg2+-Ionen reduziert, das Produkt der Reaktion ist Cyclohexa-1,5-dien-1-carbonyl-CoA. Na-Dithionit ist ein Ein-Elektronen-Reduktionsmittel mir einem sehr negativem Redox-Potential (-550 mV) und dient als künstlicher Elektronendonor für BCR.

Abb. 1 Benzoyl-CoA Reduktase Reaktion mit Dithionit als künstlichem Elektronendonor

SO OH

O2S S

OO

OO

+ 2 H2O

2 e-

+ 2 H+

O SCoA O SCoA

2 ATP 2 ADP+ 2 H2O 2 Pi

30

Ein Molekül Dithionit disproportioniert in zwei Sulfoxidradikalanionen (SO2*-), welche unter Abgabe je eines Elektrons zu Bisulfit (HSO3

-) oxidiert werden. Die beiden frei werdenden Elektronen werden durch Katalyse von BCR in einer ATP-abhängigen Reaktion auf den aromatischen Ring übertragen. Im folgenden ist die Theorie der angewandten zwei unterschiedlichen Methoden (DC/Phospho-Imaging und HPLC) zum qualitativen und quantitativen Nachweis der Reaktion kurz beschrieben. Dünnschichtchromatographie (DC). Zunächst werden 14C-BCoA und die CoA-Ester-Reaktionsprodukte durch alkalische Hydrolyse in die freien Carbonsäuren überführt. Diese werden dann über DC in einem geeigneten Laufmittel aufgetrennt. Der Nachweis der gebildeten radioaktiven Produkte auf der DC-Platte erfolgt schließlich mit einem Phospho-Imager. Dieser Test dient zur qualitativen Aktivitätsbestimmung und wird mit Extrakten von Benzoat- und Acetat- Zellen sowie mit teilgereinigter BCR durchgeführt. Die Dünnschichtchromatographie wird mit bereits fertig gegossenen Kieselgel-Platten als stationärer Phase und einem Diisopropylether/Butanol-Gemisch (70:30 Vol %) als mobiler Phase durchgeführt. Es werden jeweils 5 µl mit einer Kapillare auf die Platte aufgetragen. Phosphor-Imager. Die fertige DC wird mit einem ‚Phospho-Imager‘ entwickelt. Das Prinzip ist analog zur Schwärzung eines Filmes mit radioaktiver Strahlung oder Licht. Die benutzten Imaging Platten bestehen aus einer komplexen Matrix aus BaFBr-Kristallen, welche über ionisierende β-Strahlen angeregt werden können. Die DC wird auf eine Imaging-Platte für zwei Tage aufgelegt. Dort wo sich radioaktive Banden befinden werden die Kristalle angeregt. Danach wird die Imaging-Platte auf angeregte Bereiche gescannt, wodurch ein digitales ‚Bild‘ der DC entsteht. Dieses kann beispielsweise auf einem Computer abgespeichert werden. Leider sind Einzelheiten des Prinzips Firmengeheimnisse. HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Im Gegensatz zum ersten Test erfolgt Nachweis der BCR-Aktivität hierbei ohne alkalische Hydrolyse, d.h. es werden die Reaktionensedukte und –produkte als CoA-Ester nachgewiesen. Nach Auftrennung über HPLC werden BCoA und die daraus entstandenen Produkte über einen Radioaktivitätsmonitor detektiert. Dieser Test dient zur qualitativen und quantitativen Aktivitätsbestimmung und wird mit Benzoat-Zellen und teilgereinigter BCR durchgeführt. Eine detaillierte Einführung in die HPLC wird am 3. Versuchstag gegeben. Als stationäre Phase dient in unserem Versuch ein hydrophobes Material aus C-18-Einheiten, welche an eine sphärische Kieselgelmatrix gebunden ist. Dieses Material ermöglicht die Bindung von hydrophoben Substanzen wie z.B. Aromaten. Die zu untersuchenden Substanzen werden schließlich mit einem Gradienten bestehend aus einem Puffer und einem organischen Lösungsmittel (z.B. Acetonitril oder Methanol) eluiert. Diese Technik wird C-18-RP-HPLC genannt (RP steht für reversed-phase). Nach Elution von der Säule werden die radioaktiv markierten CoA-Ester mit einem ‚radioactivity-monitoring-analyzer‘ nachgewiesen. Dieser besitzt eine Durchflußzelle mit einem Feststoffszintillator (z.B. aus Y-Silikat, oder CaF2). Die Radioaktivität wird schließlich analog zur Flüssigszintillation in ein Signal umgewandelt, welches proportional zur Menge der radioaktiv markierten Substanz ist. Die Fläche unter dem Signal kann integriert werden, somit eignet sich HPLC hervorragend zur Quantifizierung von zuvor aufgetrennten Substanzen.

31

Abb. 2. Schematischer Aufbau eines HPLC-Systems HPLC zeichnet sich durch eine sehr hohe Auflösung bei der Trennung von Substanzen aus. Diese wird durch ein äußerst homogenes Material mit einem sehr geringen Partikeldurchmesser (5 µM) erreicht. Dadurch wird die Anzahl der Trennböden um ein Vielfaches gesteigert gegenüber herkömmlicher Flüssigchromatogrpahie. Allerdings erfordern die damit verbundenen hohen Drücke (bis 200 bar) bei der HPLC besondere (teure!) Materialien (z.B. Edelstahlsäulen, Edelstahlkapillaren, Hochleistungspumpen).

Regulation der BCR. In Zellextrakten können auch einige der nachfolgenden Stoffwechselschritte nachgewiesen werden. Letztendlich kommt es zur Ringöffnung und zur Bildung von 3-Hydroxy-Pimelyl-CoA, welches in einer β-Oxidation zu Acetyl-CoA-Einheiten und Kohlendioxid umgesetzt wird (siehe Einleitung). BCR sollte nur dann in größerer Menge von T. aromatica synthetisiert werden, wenn Aromaten als Wachstumssubstrate dienen. Als Kontrolle dienen auf Zellen, die auf Acetat anstatt Benzoat gewachsen sind (siehe auch Western-blotting in Versuchsteil IV). Spektrale Eigenschaften von Eisen-Schwefel-Proteinen. In einem weiteren Versuchsteil soll vergleichend das UV/VIS Spektrum und der Eisengehalt von BCR und Myoglobin bestimmt werden. Eisen ist ein sehr häufig vorkommendes Metall in Enzymen/Proteinen. Man unterscheidet dabei zwischen 3 Klassen:

- 1.Hämproteine mit Eisenporphyrin-Komplexen: z.B. Cytochrome, Myoglobin, Peroxidasen, Sulfit-, Nitritreduktase

- 2.Nichthäm-Eisenproteine ohne Schwefel als Ligand (Liganden können Aminosäurereste, H2O, HO-, O2- oder Oxoanionen (O= sein): z.B. aerobe Ribonukleotid-Reduktase, Monooxygenasen (Phenyalanin-Monooxygenase, Methan-Monooxygenase) und Dioxygenasen (Catechol-1,2-Dioxygenase).

- 3.Eisen-Schwefel-Proteine: Mit einem Fe-Atom: z.B. Rubredoxin Mit 2Fe-2S-Cluster: z.B. Spinat-Ferredoxin, Rieske-Zentrum (bc1-Komplex), NADH-

Oxidoreduktase (Komplex 1) Mit 3Fe-4S-Cluster: z.B. Ferredoxine, Hydrogenasen Mit 4Fe-4S-Cluster: z.B. 4Fe-4S oder 2[4Fe-4S] Cluster, Fe-Protein der Nitrogenase, Hydrogenasen, CO-Dehydrogenase, Benzoyl-CoA Reduktase Komplexe Cluster: z.B. Mo-Protein der Nitrogenase

Abfall

32

Die BCR gehört zur 3. Klasse, sie besitzt mehrere Fe-S Cluster mit sehr negativen Redoxpotentialen. Eisenhaltige Proteine besitzen typische spektroskopische Eigenschaften. In diesem Versuchsteil sollen die charakteristischen UV/VIS-spektroskopischen Eigenschaften der BCR (Fe-S-Protein) mit denen von Myoglobin, (Häm-Protein) verglichen werden. Prinzipiell gibt es dabei folgende Unterschiede:

[4Fe-4S]-Protein Häm-Protein

Charakteristika des oxidierten UV/VIS-Spektrums

-Breite Schulter von

350-800 nm

-Intensiver peak bei 405 nm (Soret-Bande) -Kleinere Peaks bei 500-700 nm (β−, γ− Bande)

Effekt der Reduktion des Enzyms -Ausbleichen der

Schulter

-bathochromer shift der Soret- Bande (ins Längerwellige) -Intensivierung der charakterischen Banden bei 500-600 nm

UV/VIS Spektrum von BCR und Myoglobin. Im Anaerobenzelt werden vom Assistenten 2 anaerob oxidierte BCR- und Myoglobin-Proben in 150 mM Mops-Puffer, pH 7.3 vorbereitet. Diese werden im Zelt in 2 Quartzküvetten überführt und mit einem Stopfen versehen und ausgeschleust. Parallel wurde eine 1 mM anaerobe Na-Dithionit-Lösung vorbereitet. Mit einem UV/VIS-Spektrometer sollen nun zunächst die beiden UV/VIS-Spektren der oxidierten Proteine aufgenommen werden. Mit einer anaeroben Glasspritze soll nun schrittweise Na-Dithionit hinzugefügt werden, bis sich das UV/VIS-Spektrum nicht mehr ändert. Es soll das Differenzspektrum zwischen der oxidierten und reduzierten Form gebildet werden. Mit dem später bestimmten Proteingehalt sollen darüber hinaus die Extinktionskoeffizienten für die Maxima und für das Differenzmaximum erstellt werden. Eisenbestimmung von BCR und Myoglobin. Der Gehalt an Eisen wird mit der Phenanthrolin-Methode bestimmt. Hierzu wird das Eisen durch Säurebehandlung zunächst aus dem Protein herausgelöst, anschließend wird das freie Fe3+ mit Hydroxylamin zu Fe2+ reduziert. Fe2+ geht nun einen stabilen Komplex mit Phenanthrolin ein, welcher photometrisch bei λ = 546 nm verfolgt wird (siehe Abbildung 4). Es können 0-20 nmol Fe2+ bestimmt werden. Eine Eichgerade von 0-20 nmol Fe(NH4)2(SO4)2 wird zur quantitativen Bestimmung erstellt. Abb. 4: ortho- Phenanthrolin-Eisen-Komplex

N N

Fe2+

33

METHODEN UND KONZEPTE Anaerobes Arbeiten, Radioaktives Arbeiten, Flüssigszintillationszählung, qualitativer und quantitativer Enzymtest, Analyse von Stoffwechselwegen, enzymatische Redoxreaktionen, Enzyminduktion, Dünnschichtchromatographie, HPLC, Phospho-Imaging, UV/VIS-Spektroskopie, Fe-Bestimmung, Protein-Bestimmung, Eigenschaften von Fe-S-Proteinen. PROGRAMM UND ZEITPLAN: Zeitplan Programm Vorbereitung

1. Tag

– Herstellung der allgemeinen Lösungen und Puffer

– Herstellung der Lösungen und Puffer für Versuchsteil 1

2. Tag

– Enzymatische Ringreduktion mit Extrakten und BCR – Hydrolyse der Proben/DC-Lauf /Phospho-Imaging

3. Tag

– HPLC-Analyse der am 2. Tag genommenen Proben

– Herstellung von Lösungen und Puffer für Versuchsteil 2

4. Tag

– UV/VIS-Spektrum, Eisen- und Proteingehalt einer BCR Probe

5. Tag

– Phospho-Imager-Auswertung – HPLC-Auswertung – Abschlußbesprechung und Protokoll

DURCHFÜHRUNG Vorbereitungen für den radioaktiven Enzymtest (1. Tag) Herstellung der Grundlösungen/Puffer. 20 ml 4M KOH, 10 ml 50 % H2SO4 (Säure in Wasser!!!), 10 ml 10 % Ameisensäure. Anaerober Reaktionspuffer: 40 ml 100 mM Mops (Morpholinopropansulfonsäure) + 20 mM MgCl2 x 6H2O. Diesen mit 4 M KOH auf pH 7.3 einstellen, mit Stopfen verschliessen und zum Anaerobisieren 20 Minuten mit N2 begasen. Reaktionsansätze vorbereiten/einwiegen. Es werden 3 Reaktionsansätze mit 0.65 ml benötigt. Die Reaktion wird durch Zugabe von Benzoat-Zellextrakt, Acetat-Zellextrakt, oder teilgereinigter BCR gestartet.

34

Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes: Form Volumen Endkonzentration Grundlösung: Mops pH 7.3 mit MgCl2x6H2O ATP, Di-Na-Salz Coenzym A

Stammlösungen: Natrium Dithionit* 100 µl Zellextrakt oder BCR** 4 µCi 14C-Benzoat 12C-Benzoat Benzoat-CoA Ligase (vom Kurs teilgereinigt, siehe Versuch 2)

Puffer Fest Fest Fest 50 mM Stammlösung* ~50 mg Protein /ml flüssige Stammlösung 10 µl aus 10 mM Stammlösung aerobe DEAE-Fraktion

0.365 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.025 ml 0.01 0.05 ml

~ 50 mM ~ 10 mM 10 mM 0.4 mM ~8 mM ~8 mg Protein/ml 4 µCi/Ansatz_______***

0.65 ml *Das Dithionit wird als Pulver eingewogen und erst unmittelbar vor der Reaktion (am 2. Tag !) in 1 ml Mops-Puffer im Anaerobenzelt gelöst. **Die Konzentration der BCR-Lösung wird vom Kursassistenten angegeben ***Die spezifische Aktivität von 14C-Benzoat beträgt 130 µCi/µmol. Man berechne die Endkonzentration an Gesamt-Benzoat (12C + 14C-Benzoat). Übersicht über die jeweiligen Ansätze:

Ansatz 1 Acetat-Extrakt

50 µl Probe mit Hydrolyse: Analyse

freier Säuren über DC

100 µl anaerobe Probenentnahme nach 0,1; 1; 2; 5; 15 Minuten

Ansatz 2 Benzoat-Extrakt

Ansatz 3 BCR

50 µl Probe ohne Hydrolyse: Analyse von CoA-Ester-

Analyse über HPLC

35

Einwaagen. Grundlösung: für 3,5 Ansätze zusammen (___mg) CoA, (____mg) ATP in einen Reaktionstopf einwiegen, Benzoat für 1 ml 10 mM Stammlösung (_____ mg) in einen weiteren Reaktionstopf einwiegen. Dithionit einwiegen. Beschriftung. Eppendorfreaktionsgefäße beschriften (insgesamt 25): zu 15 je 5 µl 4 M KOH geben für DC-Proben mit Hydrolyse mit Ansätze; in die anderen 10 je 5 µl 10 % Amseisensäure geben für HPLC-Proben ohne Hydrolyse mit Benzoat-Extrakt und BCR (siehe Übersicht vorherige Seite). Eppendorfgefäße verschliessen und bei 4°C aufbewahren.

DC vorbereiten. Platten: Macherey-Nagel DC-Platten DC-Tank mit 100 ml Diisopropylether/Butanol (3:1, v/v) befüllen, Filterpapier am Rand einlegen. Darauf achten, dass DC-Tank fest verschlossen ist (Schliffett benutzen). Einweisung in das radioaktive Arbeiten. Einweisung in das anaerobe Arbeiten.

Enzymatische Reduktion des aromatischen Ringes und DC-Analysen (2. Tag, Dauer bis ca. 19.00 Uhr !) Das Wasserbad vorheizen auf 30°C (Enzymreaktion), Thermoblock auf 80°C (Hydrolyse

der CoA-Ester) einstellen. Die Grundlösungen, die 12C-Benzoat- und Na-Dithionit-Stammlösungen, 3 Reaktionstöpfe

sowie den anaeroben Mops/Puffer ins Anaerobenzelt einschleusen: nur mit Hilfe eines Assistenten !

Grundlösungen herstellen: CoA und ATP in einem Reaktionstopf in 1,28 ml Mops lösen. Je 0,365 ml Grundlösung davon in die Reaktionstöpfe pipettieren Na-Benzoat und Na-Dithionit in je 1 ml Mops-Puffer lösen je 10 µl Na-Benzoat- und 100 µl Na-Dithionit Stammlösung zu den Reaktionsgefäßen

pipettieren. jedes Reaktionsgefäß fest mit einem Gummistopfen verschließen

(sie befinden sich im Anaerobenzelt); Reaktionsgefäße + Mops-Puffer ausschleusen 14C-Benzoat-Stammlösungen (in Eppendorf-Reaktionsgefäßen) auftauen: 12 µCi in 80 µl 25 µl der 14C-Benzoat-Stammlösung in die Ansätze pipettieren. 50 µl der teilgereinigten Benzoat-CoA Ligase-Fraktion mit Hamilton-Spritzen

hinzupipettieren Alle Ansätze für 15 Minuten ins 30°C-Wasserbad stellen. (Warum ?)

Start der Reaktion durch Zugabe von 100 µl Extrakt/BCR, durchmischen und sofort wieder mit gleicher Spritze 100 µl entnehmen. Davon 50 µl in für in ein Eppendorf-Gefäße für die Hydrolyse-Proben (Ansätze 1-3) und 50 µl in die Eppendorfgefäße ohne Hydrolyse (Im Ansatz 1 kommen diese 50 µl in den Radioaktivitätsabfall). Nach 1,2, 5, 15 Minuten erneut eine Probe entnehmen und wie beschrieben verfahren.

36

Hydrolyse der DC-Proben. Eppendorf-Gefäße mit 4 M KOH für 20 min in 80°C-Thermoblock stellen, 10 min abkühlen lassen. Danach 2 µl 50 % H2SO4 (saure Proteinfällung) hinzupipettieren. Das gefällten Proteins wird abzentrifugiert (15 min, maximale Geschwindigkeit). Die nicht hydrolysierten Proben zur HPLC-Analyse werden eingefroren. DC. Auf je 2 DC-Platten mit weichem Bleistift und Lineal 2 cm vom Rand entfernt eine Auftragslinie ziehen. Je 2 cm vom linken und rechten Rand die Linie markieren (da die DC am Rand nicht gleichmäßig läuft, ist der 2-cm-Abstand vom Rand notwendig) und dann in 1-cm-Abständen die Linie in Auftragebereiche unterteilen. Je 5 µl jeder Probe werden mit einer Kapillare in einem Bereich von 1 cm auf der Linie aufgetragen, der Abstand zum nächsten Auftragbereich beträgt ebenfalls 1 cm; somit können 8 Proben auf eine DC-Platte aufgetragen werden. Die DC in den Tank stellen und darauf achten, daß der Deckel gut verschlossen ist (Schliffett !). Die DC so lange laufen lassen, bis das Lösungsmittel bis auf ca. 2 cm der Oberkante der Platte angekommen ist (Dauer ca. 2-3 h). Phospho-Imaging. Mit Fön (kalt) unter dem Abzug trocknen, mit Folie abkleben und auf Phospho-Imager-Platte auflegen (2 Tage Exponierzeit). HPLC-Analysen (3. Tag) HPLC-Puffer anfertigen. 2 l 50 mM K-Phosphatpuffer pH 6,8 mit 0,2 µM-Poren-Filter filtrieren.

Ausführliche Einweisung in die HPLC durch Kursassistenten. Dabei Äquilibrierung der HPLC-Säule mit dem hergestellten Laufmittel. HPLC-Analyse der Proben. 14C-Benzoat, 14C-Benzoyl-CoA. Wichtig: um ein gutes Signal/Rauschverhältnis zu erhalten sollte in einem Peak mindestens 8000 cpm sein. Die nach 0,1 min gezogene Probe sollte zur Kontrolle der vorhandenen Radioaktivitätsmenge aufgespritzt werden. Ist das Signal/Rauschverhältnis zufriedenstellend (mit Kursassistenten besprechen) werden die restlichen Proben entsprechend verdünnt. Zusammen mit den Kursassistenten wird ein die Computer-gesteuerte HPLC-Anlage programmiert. Danach werden die Proben mit dem Autosampler (automatischer Probengeber) auf die Säule injiziert. UV/VIS-Spektren und Eisengehalte von BCR und Myoglobin (4. Tag) Herstellung der Grundlösungen. 0,2 % o-Phenanthrolin (20 mg/10 ml), 10 % Hydroxylamin/HCl (1g/10 ml), 10 ml 25 % HCl. Als Eisenstandard wird 500 µM Fe(NH4)(SO4)2 (500 ml) eingesetzt. Aufnahme der UV/VIS-Spektren von BCR und Myoglobin. Die anaeroben, oxidierten BCR- und Myoglobin Proben werden vom Assistenten ausgeteilt, davon werden 500 µl im Anaerobenzelt in 0,7-ml-Quarz-Küvetten pipettiert mit einem Stopfen versehen. Zur Herstellung einer anaeroben 0,5 mM Na-Dithionit-Lösung werden 0,5 mg in ein 5-ml-Glasgefäß eingewogen. Dieses wird zusammen mit den Protein-Proben ins Zelt eingeschleust und mit dem am 1. Kurstag hergestellten anaeroben Mops/KOH-Puffer auf 5 ml aufgefüllt, mit Stopfen versehen und ausgeschleust. Die Aufnahme der Spektren erfolgt mit einem

37

UV/VIS-Spektrophotometer, Spektren werden von 220-800 nm aufgenommen (Scan-Speed 480 nm/min), es erfolgt eine ausführliche Einweisung durch die Assistenten. Zur Redoxtitration werden in 2-4-µl-Schritten die 0.5 mM Na-Dithionit-Lösung in die Küvette pipettiert. Dabei werden die Proteine schrittweise reduziert, es wird jeweils ein Spektrum aufgenommen. Der Endpunkt der Redoxtitration ist erreicht wenn sich das Spektrum nicht mehr ändert. Was sind die spektralen Eigenschaften von BCR und Myoglobin ? Unterschiede ? Was ändert sich während der Redoxtitration ? Bestimmen Sie die Extinktionskoeffizienten bei den charakteristischen Peaks. Proteinbestimmung der BCR- und Myoglobin-Proben. Die Proteinbestimmung erfolgt nach Bradford (siehe vorherige Versuchs). Es soll die Proteinkonzentration in nmol/ml bestimmt werden. Die Molekülmassen sind BCR: 170 kDa, Myoglobin 19 kDa. Eisenbestimmung der BCR- und Myoglobin-Probe. Die Eisenbestimmung erfolgt nach folgendem Schema. Als Standard dient eine Fe(NH4)(SO4)2 –Lösung folgender Konzentration: 0, 4, 8, 12, 16, 20 nmol in 500 µl H2O. Die Absorption wird bei 546 nm gemessen. Doppelbestimmungen ! Wie hoch liegt der Eisengehalt der BCR/Myoglobin ? In welchem Zusammenhang stehen Eisengehalt und Absorptionsspektren? Wieviel [4Fe-4S]-Cluster besitzt BCR ? Wieviele wurden mit Dithionit reduziert ? Auswertung der Phospho-Imager und HPLC-Daten und von Versuch A. Kommentieren Sie das Produktmuster. Schätzen sie die spezifische Aktivität in den Rohextrakten und der gereinigten BCR ab. Vergleichen Sie diese Aktivität mit der Wachstumsrate !

100 µl Proteinprobe

+15 µl 25 % HCl+385 µl H2O

10 min 80°C

+ 0,1 ml 10 % Hydroxylamin+ 0.5 ml 0.2 % Phenanthrolin

30 min 20°C

A bei λ=546 nm

10 min 10.000 x g

38

AUSWERTUNG UND PROTOKOLL (5. Tag) Abb. 1: Nachweis der enzymatischen Reduktion von 14C-Benzoyl-CoA über Dünnschichtchromatographie. Proben (50 µl) wurden den anaeroben Ansätzen (0,7 ml) nach 0,1-15 min entnommen; anschließend wurden die CoA-Thioester alkalisch hydrolysiert und über DC aufgetrennt. Die radioaktiven Substanzen wurden über Phospho-Imaging sichtbar gemacht. Alle Ansätze enthielten 5 mM ATP, 20 mM MgCl2, 8 mM Na-Dithionit, 0.4 mM CoA und 4 µCi Benzoat (A ,B), bzw. 4 µCi 14C-Benzoyl-CoA (B). A. Ansatz mit Extrakt von T. aromatica, gewachsen auf Benzoat, B. gewachsen auf Acetat, C. Teilgereingte BCR. Abb. 2 Nachweis der enzymatischen Bildung radioaktiver Produkte aus 14C-Benzoat/14C-Benzoyl-CoA über HPLC. (A) Ansatz mit Extrakt aus T. aromatica Zellen, gewachsen auf Benzoat; (B) Ansatz mit teilgereinigter BCR. Die Detektion erfolgte über einen Radioaktivitätsmonitor mit einer Durchflußzelle. B=Benzoat, BC=Benzoyl-CoA, X;Y;Z = Produkte der BCR-Reaktion und den enzymatischen Folgereaktionen. Abb. 3. Zeitabhängige Bildung von Produkten aus 14C-Benzoat und 14-C-Benzoyl-CoA katalysiert durch (A) Extrakt von T. aromatica, gewachsen auf Benzoat, (B) teilgereinigte BCR. Bei den Abbildungen handelt es ich um die quantitative Auswertung der unter Abb. 2 gezeigten HPLC-Diagramme. ○ Benzoat ● Benzoyl-CoA, ■ X □ Y, usw. Abb. 4 UV-VIS Spektren von (A) BCR (Konzentration mg/ml) und (B) Myoglobin (Konzentration mg/ml). ⎯⎯ oxidierte Form, ----- nach Zugabe von x µM , …… nach Zugabe von y µM Na-Dithionit usw. Abb. 5 Eisengehaltbestimmung der BCR und Myoglobin mit Phenanthrolin. Die Eichreihe wurde mit 0-20 nmol Fe(NH4)2(SO4)2 erstellt. ⎯⎯ Durchschnittswert der gemessenen Extinktionen der BCR-Probe, ------ der Myoglobin-Probe. Nach Einbeziehung des Proteingehaltes ergab sich dabei für BCR ein Eisengehalt von (x mol/mol Protein) und für Myoglobin von (y mol/mol Protein).

0,1 1 2 5 15 0,1 1 2 min

A B

5 15 0,1 1 2 5 15 min

C

39

VERSUCH IV 1. Immunologischer Nachweis der Benzoyl-CoA-Reduktase von Thauera aromatica K172 nach Wachstum auf verschiedenen Substraten 2. Nachweis der Benzoyl-CoA-Reduktasegene durch PCR ZIELE Die Ziele dieses Versuchs sind: (A) Die Untersuchung der Synthese der Benzoyl-CoA-Reduktase in Zellen, die auf verschiedenen aromatischen Substraten unter denitrifizierenden Bedingungen gewachsen sind. Wir verwenden dazu einen immunologischen Nachweis. (B) Der Nachweis der Gene für die Benzoyl-CoA-Reduktase durch PCR. THEORIE Das Enzym Benzoyl-CoA-Reduktase katalysiert folgende Reaktion:

COSCoA COSCoA

2 ATP + 2 H2O 2 ADP + 2 Pi

2 e- + 2 H+

Es ist die zentrale Reaktion im anaeroben Stoffwechsel vieler Aromaten. Das Enzym wird nur gebildet, wenn das Bakterium unter anoxischen Bedingungen mit Aromaten wächst, die über Benzoyl-CoA abgebaut werden. Die Gene für die vier Untereinheiten des Enzyms (32 kDa, 38 kDa, 45 kDa, 48 kDa) liegen zusammen mit dem Gen für den Elektronendonor Ferredoxin in einem gemeinsamen Cluster. Dieser Cluster, vermutlich ein Operon, codiert für alle Enzyme des Stoffwechsels von Benzoyl-CoA bis zur Bildung von 3-Hydroxypimelyl-CoA. Die Umsetzung von 3-Hydroxypimelyl-CoA zu Acetyl-CoA ist nicht spezifisch für den Stoffwechsel von Aromaten. Dieser Teil des Stoffwechsels wird anders reguliert, und die Gene dafür sind derzeit noch nicht bekannt.

2 Ferredoxin red.

40

5'→3' Abb. 1:Anordnung der Gene, die für die Proteine des Benzoyl-CoA-Stoffwechsels codieren METHODEN UND KONZEPTE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blot, Immundetektion mittels Chemolumineszenz, DNA-Präparation, Agarose-Gel-Elektrophorese, PCR, Primer ableiten, DNA-Bestimmung, Reinigung eines PCR-Fragments, Gelelution, Datenbankrecherche. PROGRAMM UND ZEITPLAN Zeitplan Programm Vorbereitung 1. Tag

– SDS-Gelherstellung und Elektrophorese – Gelfärbung und Entfärbung – Western-Blot – Färbung der Membran

– SDS-Gele gießen – Probenvorbereitung

2.Tag

– Blockieren der Membran – Inkubation mit Antikörpern – Chemolumineszenz-Nachweis

– Ansetzen der Blockierungslösung – Ansetzen der Antikörperverdünnung

3.Tag

– DNA-Isolierung – Agarose-Gel-Elektrophorese – PCR-Reaktion

– Agarose-Gele gießen – Ansetzen der PCR-Reaktion

4.Tag

– Isolierung von PCR-Amplifikaten via Gelelektrophorese und Glasstaubelution

– Agarose-Gele gießen

5.Tag

– Auswertung – Protokoll – Datenbankanalyse

Benzoyl-CoA-Reduktase Untereinheit C Untereinheit B Untereinheit A Untereinheit D (38 kDa) (45 kDa) (48 kDa) (32 kDa)

Weitere Enzyme des Benzoyl-CoA- Stoffwechsels

Ferredoxin (9.1 kDa)

41

DURCHFÜHRUNG 1. Immunologischer Nachweis der Benzoyl-CoA-Reduktase von Thauera aromatica nach Wachstum auf verschiedenen Substraten (1. und 2. Tag) Zellextrakte. Die Extrakte von Thauera aromatica-Zellen, die auf Acetat und Benzoat angezogen wurden, wurden bereits im Teil I hergestellt und die Proteinkonzentrationen bestimmt. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die SDS-Gelelektrophorese (SDS = Natrium-Dodecylsulfat) wird zweifach durchgeführt. Ein Gel dient zum Blotten der Proteine und für deren immunologischen Nachweis. Das andere SDS-Gel wird mit Coomassie angefärbt und dient als Kontrolle für die gelungene Elektrophorese. Außerdem kann man bereits unterschiedlich induzierte Proteine mit dem bloßen Auge erkennen. Für die diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese (nach Laemmli, 1970) werden 10 %ige Trenn- und 4 %ige Sammelgele verwendet. Frisch ansetzen: Ammoniumpersulfatlösung (APS; 1 ml-Ansatz):

100 mg/ml

Weitere Stammlösungen (werden zur Verfügung gestellt): Acrylamid-Stammlösung: 30 % (w/v) Acrylamid 0,8 % (w/v) Methylenbisacrylamid Trenngelpuffer (1 l-Ansatz): 1,5 M Tris/HCl pH 8,8 Sammelgelpuffer (1 l-Ansatz): 1,0 M Tris/HCl pH 6,8 SDS-Stammlösung (80 ml Ansatz): 10 % (w/v) SDS TEMED fertige Lösung Probenpuffer (2-fach konzentriert) (10 ml Ansatz)

3,2 ml 1 M Tris/HCl pH 6,8 1,5 g SDS

3,5 ml Glycerin 2,5 ml Mercaptoethanol 3 mg Bromphenolblau Elektrodenpuffer (10-fach Puffer, 1 l Ansatz)

30 g Tris/HCl pH 8,8 144 g Glycin

10 g SDS Agarose zum Abdichten 1.5 % (w/v) Agarose Isopropanol zum Überschichten

42

Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgele (Ansatz für ein kleines Gel): 10 %iges Trenngel: • 3 ml Acrylamid-Stammlösung • 2,25 ml Trenngelpuffer • 90 µl SDS-Stammlösung • 3,66 ml H2O • 9 µl TEMED (N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin) • 45 µl APS (Ammoniumperoxodisulfat) 4 %iges Sammelgel: • 0,825 ml Acrylamid-Stammlösung • 0.75 ml Sammelgelpuffer • 60 µl SDS-Stammlösung • 4,35 ml H2O • 7,5 µl TEMED • 30 µl APS Gelherstellung. Die Elektrophoreseapparaturen werden nach Anleitung zusammengebaut. Die Lösungen für die 4 %igen und 10 %igen Gele werden nach den obigen Angaben ohne TEMED und APS in kleinen Bechergläsern zusammenpipettiert. TEMED und APS werden zur 10 %ige Gellösung hinzugegeben. Gleich darauf wird das 10 %ige Trenngel zwischen zwei gereinigte und entfettete Glasscheiben gefüllt und dann mit Isopropanol überschichtet. Nach ∼30 min ist das Gel vollständig auspolymerisiert. Das überstehende Isopropanol wird mit H2O bidest. entfernt, anschließend wird das Wasser mit einem Zelltuch abgesaugt. TEMED und APS werden zur Sammelgellösung gegeben. Die fertige Sammelgellösung (s. o.) wird eingefüllt und der Taschenformer eingesetzt. Nach erfolgter Polymerisation (∼ 30 min) wird der Taschenformer wieder entfernt. Die Gele werden in die Elektrophoreseapparaturen eingesetzt, und die Kammern mit 1 x Elektrophoresepuffer befüllt. Probenvorbereitung. Der Gehalt an Benzoyl-CoA-Reduktase in Extrakten von Thauera aromatica-Zellen, die auf den Substraten Benzoat bzw. Acetat angezogen wurden, soll bestimmt werden. Dazu werden von den Extrakten je zwei verschiedene Proteinmengen (5 µg und 20 µg Gesamtprotein) auf das Gel aufgetragen. Zur Kontrolle und als “Standard” werden zusätzlich zwei verschiedene Proteinmengen von angereinigtem Enzym Benzoyl-CoA-Reduktase (2 µg/µl) aufgetragen. Als Negativkontrolle werden 125 µg E. coli-Zellen (125 µl einer Kultur mit OD 1) in 20 µl 1,0 M Tris/HCl-Puffer pH 6,8 aufgenommen, zum Aufschluß der Zellen mit 20 µl 2-fach konzentriertem Probenpuffer versetzt und 5 min im Wasserbad bei 95°C erhitzt. Alle anderen Proben werden in einem Eppendorfgefäß mit 1,0 M Tris/HCl-Puffer pH 6,8 auf den gewünschten Proteingehalt verdünnt (Gesamtvolumen: 10 µl), mit 10 µl Probenpuffer (2-fach konzentriert) versetzt und zur vollständigen Denaturierung 5 min im Wasserbad bei 95°C erhitzt. Pro Tasche werden 20 µl Probe mit einer Hamiltonspritze aufgetragen, vom E. coli-Extrakt werden 10 µl aufgetragen. Zur Bestimmung der Molekülmasse wird in eine Tasche 10 µl einer Lösung folgender Molekülmassenstandards (5 mg Protein/ml) aufgetragen: Phosphorylase B (94 kDa), Rinderserumalbumin (67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Carboanhydrase (29 kDa), Lysozym (14 kDa). Der Auftrag sollte in folgender Reihenfolge erfolgen:

43

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 E.coli Marker BCR BCR Benzoat Benzoat Acetat Acetat 2 µg 8 µg 5 µg 20 µg 5 µg 20 µg 10µl 10 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl

Elektrophoresebedingungen. Die Elektrophorese erfolgt bei Raumtemperatur und konstant gehaltener Spannung. Beim Einwandern der Probe ins Sammelgel werden 100 V vorgewählt. Sobald die Lauffront ins Trenngel eingewandert ist, wird auf 150 V umgestellt. Die Elektrophorese wird gestoppt, wenn sich die Farbfront ca. 2 mm vor Gelende befindet. Gel A: Coomassie-Färbung. Die Coomassie-Färbung zum Nachweis von Proteinen wird bei Raumtemperatur auf einem Schüttler unter leichtem Schwenken durchgeführt. Lösungen zur Färbung des Polyacrylamidgels : Fixier- und Färbelösung (wird bereitgestelt): 30 % (v/v) Methanol

20 % (v/v) Essigsäure 0,25 % (w/v) Coomassie-Blau R-250

Entfärbelösung I (500 ml-Ansatz): 30 % (v/v) Methanol 20 % (v/v) Essigsäure Entfärbelösung II (500 ml-Ansatz): 8 % (v/v) Essigsäure Das Gel wird nach Entfernen der Glasplatten für 90 min in die Fixier- und Färbelösung gelegt. Anschließend wird das Gel in die Entfärberlösung I gelegt und solange inkubiert, bis die Proteinbanden sichtbar sind. Zur Aufhellung des Hintergrundes wird das Gel für weitere 30 min in der Entfärberlösung II geschwenkt. Gel B: Proteintransfer auf Nitrocellulose. Die aufgetrennten Proteine nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden auf Nitrocellulose-Membran (Typ 885, Schleicher und Schuell) überführt. Dazu wird das Semi-Dry-Verfahren mit dem Multiphor-System II (Pharmacia) benutzt. Für den Proteintransfer wurden 6 Filterpapierbögen und 1 Nitrocellulosestreifen auf die Maße des SDS-Geles (8 x 8 cm) zugeschnitten. Anoden- und Kathodenpuffer (werden zur Verfügung gestell): A Anodenpuffer I, pH 10,4: 18,15 g Tris 100 ml Methanol → Auffüllen auf 500 ml mit H2O bidest. B Anodenpuffer II, pH 10,4: 1,52 g Tris 100 ml Methanol → Auffüllen auf 500 ml mit H2O bidest. C Kathodenpuffer, pH 7,3: 2,6 g 6-Aminocapronsäure 100 ml Methanol → Auffüllen auf 500 ml mit H2O bidest. Auf die mit dest. H2O benetzte Anode werden 2 mit Anodenpuffer I getränkte Filter gestapelt. Darauf kommten ein mit Anodenpuffer II angefeuchtetes Filterpapier. Auf diese Papierlagen werden zuerst die angefeuchtete Nitrocellulosemembran und dann das Polyacrylamidgel

44

gelegt. Zwischen das SDS-Gel und die Kathode kommen weitere 3 Filterpapierstreifen mit Kathodenpuffer. Die Anordnung der Filterpapierlagen ist in Abbildung 2 gezeigt.

- - - - - - - - - - - - - - - - -

+ + + + + + + + + + + +

Kathode

3 Filterpapiere (C)Polyacrylamid-GelNitrocellulosemembran (B)1 Filterpapier (B)2 Filterpapiere (A)

Anode

Abb. 2: Schematischer Aufbau des "Semi-Dry-Blot". Die Filterpapierlagen und die Nitrocellulosemembran wurden in folgenden Lösungen getränkt: Lösung A (Anodenpuffer I), Lösung B (Anodenpuffer II) und Lösung C (Kathodenpuffer). Der Proteintransfer wird bei einer konstanten Stromstärke von 1,5 mA/cm2 Blotfläche durchgeführt. Nach 60 min ist das Enzym vollständig auf die Nitrocellulosemembran überführt. Zur Kontrolle wird das SDS-Gel mit Coomassie angefärbt. Färbung elektrotransferierter Proteine auf Nitrocellulose. Die auf Nitrocellulose übertragenen Proteine werden zur schnellen Übersicht mit Ponceau S angefärbt. Die Färbung wird bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (30-60 U/min) durchgeführt. Die Lösungen werden mit demineralisiertem Wasser hergestellt.

Ponceau S-Färbelösung (wird bereitgestellt): 99,5 % (v/v) einer 0,1 %igen (w/v) Ponceau S-Lösung 0,5 % (v/v) Eisessig Die geblottete Nitrocellulosemembran wird für 2 min in ca. 100 ml Färbelösung getaucht und anschließend zur Entfärbung der proteinfreien Bereiche ~10 Minuten mit demineralisiertem H2O gewaschen.

45

Immunologischer Nachweis der Benzoyl-CoA Reduktase. Mit Hilfe von polyklonalen Kaninchenantikörpern gegen Benzoyl-CoA Reduktase soll die Anwesenheit dieses Schlüsselenzyms in verschieden angezogenen Zellen nachgewiesen werden. Abbildung 3 skizziert das Prinzip des Western-Blotting-Nachweises. Sämtliche Schritte des Western-Blotting-Nachweises werden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (30-60 U/min) durchgeführt. Die Lösungen für den "Western-Immunoblot" werden mit demineralisiertem Wasser hergestellt (Angaben pro Gruppe). Phosphat-Tween-Puffer pH 7,5 (500 ml-Ansatz), wird zur Verfügung gestellt:

80 mM Na2HPO4 20 mM NaH2PO4 100 mM NaCl 3 % (v/v) Tween 20 Blockierungslösung pH 7,5 (100 ml-Ansatz):

5 % (w/v) Trockenmilchpulver in Phosphat-Tween-Puffer Immunodetektionsreagenz (RP 2109, Amersham):

: 2 ml Reagenzlösung I 2 ml Reagenzlösung II

Die Mischung der Reagenzien erfolgt unmittelbar vor Gebrauch.

Enzymatische Oxidation des Luminols in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid (H2O2):

N2 + LichtPeroxidase

H2O2 O-

O-

NH2

O

O

NH

NH

NH2

O

O

Die mit Protein beladene und eventuell angefärbte Nitrocellulosemembran wird zunächst für eine Stunde in 50 ml Blockierungslösung gelegt, um unspezifische Bindungen des Antikörpers an die Membranoberfläche zu vermeiden. Danach wird die Membran durch zweimaliges Schwenken in 50 ml Phosphat-Tween-Puffer gespült und 15 min im Pufferbad gewaschen. In zwei weiteren Waschschritten wird jeweils 5 min in Phosphat-Tween-Puffer geschwenkt. Während des letzten Waschschrittes wird eine Antiserumverdünnung (50 ml) von 1: 2 000 000 in Phosphat-Tween-Puffer hergestellt. Anschließend wird die Nitrocellulosemembran 60 min mit der verdünnten Serum-Lösung behandelt und wiederum viermal in 50 ml Phosphat-Tween-Puffer gewaschen. Dann werden in einem letzten Inkubationsschritt Peroxidase-gekoppelte Anti-Antikörper (1:5 000 in Phosphat-Tween-Puffer verdünnt; RP 2108, Amersham; 50 ml-Ansatz) für 60 min an die Reduktase-Antikörper gebunden. Überschüssige Anti-Antikörper werden durch die oben beschriebenen Waschschritte in Phosphat-Tween-Puffer entfernt. Zur Detektion wird die Oberseite der Membran mit der Lumineszenzreagenslösung (~0,1 ml/cm2) beträufelt, der Filter nach 1 min Inkubationszeit zwischen zwei Frischhaltefolien gespannt und im Dunkeln (Dunkelkammer) ein Röntgenfilm (Hyperfilm, Amersham) aufgelegt. Die Entwicklung des Röntgenfilms erfolgt nach einer Belichtungszeit von 0,5 - 10 min.

+

46

Sekundärer Antikörper mit gebundener Peroxidase Protein Persäure Primärer Antikörper O2

2- + 2 H2O Nitrocellulosemembran oxidiertes Produkt

O22-

+ Licht

Luminol Abb. 3: Schematischer Aufbau der "Western-Blot"-Hybridisierung und Prinzip der Enzym-Chemoluminiszenz. Die an Benzoyl-CoA Reduktase gebundenen Antikörper können durch die enzymatische Oxidation von Luminol detektiert werden. Bei der Peroxidase-katalysierten Reaktion kommt es an der Stelle des Proteins zu einer Lichtemission, die durch Auflegen der Nitrocellulosemembran auf Röntgenfilm nachgewiesen wird.

Röntgenfilm

47

DURCHFÜHRUNG 2. Nachweis der Benzoyl-CoA Reduktasegene durch PCR (3. und 4. Tag) Die Benzoyl-CoA Reduktase wurde in unserem Labor aus dem Bakterium Thauera aromatica gereinigt. Die 4 Untereinheiten (UE) des Enzyms wurden N-terminal ansequenziert, d.h. es wurden die Aminosäuresequenzen der N-terminalen Bereiche der Untereinheiten bestimmt. Anhand dieser Aminosäure-Sequenzinformation ist es nun möglich, im Chromosom von T. aromatica den DNA-Bereich zu finden, der für das Protein codiert (das Gen/ die Gene). Übersicht:

Isolierung chromosomaler DNA

aus T. aromatica

Amplifizierung der Gene durch PCR

Nachweis der amplifizierten DNA

Isolierung der amplifizierten DNA aus dem Agarose-Gel

Isolierung chromosomaler DNA aus T. aromatica ( Current Protocols, 2.4.1). Die chromosomale DNA dient im weiteren als Matrize für die PCR. Sie wird aus tiefgefrorenen Zellen (Feuchtzellmasse) isoliert. Angaben jeweils pro 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß. – Einwiegen von 10 mg Zellen.

– Resuspension der Zellen in 570 µl TE-Puffer. – Zugabe von 30 µl 10% SDS-Lösung und 3 µl Proteinase K-Lösung (20 mg/ml);

mischen und 1 h bei 52°C inkubieren. Das SDS löst die Zellmembran, die Proteinase K zerstört Proteine, die noch an die DNA binden.

–Zugabe von 100 µl 5 M NaCl-Lösung. Zur Erhöhung der Salzkonzentration, da sich bei Salzkonzentrationen < 0.5 M bei Raumtemperatur sich im nächsten Schritt ein CTAB- Nukleinsäure-Niederschlag bilden würde. – Zugabe von 80 µl CTAB/NaCl-Lösung; mischen und 10 min bei 65°C inkubieren. Das CTAB fällt die Zellwand, denaturiertes Protein und Polysaccharide durch Komplexierung. – Extraktion mit 780 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1)-Mischung. Die CTAB- Komplexe emulgieren sich in der organischen Phase. – Zentrifugation: 5 min bei höchster Geschwindigkeit. Zur besseren Auftrennung der beiden Phasen. Die ausgefällten Komplexe lagern sich als weiße Zwischenschicht

48

zwischen wässrige und organische Phase. – Überführung der oberen, wässrigen Phase in ein neues Eppi. – Wiederholung der Extraktion und Zentrifugation. – Die obere, wässrige Phase wieder in ein neues Eppi. – Vorsichtiges (!) Überschichten mit 400 µl Isopropanol. Zur Fällung der DNA. –Nach vorsichtigem Schnippen mit dem Fingernagel wird an der Grenzschicht der Lösungen ein Knäuel von chromosomaler DNA sichtbar, der mit einer zu einem Haken ausgezogenen Pasteurpipette in ein Eppi mit 200 µl 70%(v/v) Ethanol überführt wird. 70% (v/v) Ethanol dient zum Waschen der DNA, d.h. zum Entfernen überschüssigen Salzes. – Zentrifugation: 5 min bei höchster Geschwindigkeit. – Abziehen der Flüssigkeit mit einer ausgezogenen Pasteurpipette. –Vakuum-Zentrifugation; 5-10 min bei Raumtemperatur bis der Niederschlag getrocknet ist. –Lösen des Niederschlag in 100 µl TE-Puffer. DNA löst sich leichter und ist stabiler unter schwach alkalischen Bedingungen (DNA ist eine Säure).

Stammlösungen:

70 % EtOH 70 ml EtOH plus 30 ml H2O 5 M NaCl 29 g pro 100 ml H2O 10 % SDS 10 g SDS in 100 ml H2O Proteinase K 20 mg Proteinase Kin 1 ml H2O CTAB/NaCl-Lösung: 10 % (w/v) CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) 0.7 M NaCl. TE-Puffer: 10 mM Tris/HCl pH 8.0 1 mM NaEDTA CHCl3/Isoamylalkohol 24:1 (v/v), 100 ml

Die PCR (Polymerase chain reaction). Die PCR ist eine Methode zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren: Spezifische Nukleinsäuren können in vitro in einem einzigen Reaktionszyklus mit hoher Ausbeute amplifiziert werden. Das Reaktionsprinzip der PCR entspricht der Replikation (Verdopplung) der DNA in der Zelle: Eine DNA-Polymerase synthetisiert neue DNA an einer vorhandenen Nukleinsäure-Matrize. In der Zelle braucht das Enzym dazu einen (RNA)-Primer, ein Nukleinsäuremolekül, das mit dem Matrizenstrang hybridisiert und von der Polymerase als Starter benutzt wird. Im Reagenzglas werden künstlich synthetisierte Oligonucleotidprimer verwendet. Diese Startmoleküle sind aus den flankierenden Bereichen der Matrize abgeleitet, weshalb das zu amplifizierende Fragment zwischen ihnen liegt. Für die Reaktion werden also eine Matrize, eine DNA-Polymerase, Desoxynukleotide, zwei Oligonukleotide als Primer und ein geeignetes Puffersystem benötigt. Die gesamte Reaktion basiert auf drei Teilschritten die ca. 30 mal wiederholt werden. Denaturierung. Durch Erhitzung auf ca. 90°C wird die DNA in Einzelstränge aufgeschmolzen. Primer-Bindung an die DNA-Matritze (‘Annealing’). Beim Herabkühlen auf ca 50°C hybridisieren die Oligonukleotid-Primer mit den beiden DNA-Matrizensträngen (die ‘Annealing’-Temperatur ist abhängig von der Summe des (G/C- und A/T-Gehaltes der Primer). Polymerisation. Die hitzestabile DNA-Polymerase beginnt an diesem kurzen Stück doppelsträngiger DNA mit der Polymerisation des Gegenstranges ( bei ca. 70°C).

49

Die Polymerase-Kettenreaktion:

Denaturierung 95°C

5’3’ 5’

3’

3’ 5’

5’ 3’

Primer Annealing 40°C5’

5’

3’ 5’5’

5’ 3’5’

dTTPAmplifizieren durchTaq-Polymerase (72°C)dGTPdATP

dCTP

3’ 5’5’ 3’

3’

5’5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’5’5’3’

Doppelsträngige DNA

Einzelsträngige DNA

Amplifizierung der Gene durch PCR. Grundvoraussetzung für die Anwendung der PCR ist eine partielle Sequenzinformation entweder über die Sequenz der gesuchten DNA oder, im Falle eines Proteins, über dessen Proteinsequenz (= reverse Genetik).

Die Benzoyl-CoA Reduktase besteht aus vier Untereinheiten (UE), deren N-terminalen Enden sequenziert worden sind. Von diesen bekannten Proteinsequenzen lassen sich Oligonukleotide ableiten, mit deren Hilfe die Gene für die einzelnen UE amplifiziert werden sollen. Die Aminosäure Methionin (M) wird z.B. durch das Triplett ATG codiert. Aufgrund der Degeneriertheit des Codes werden die meisten Aminosäuren von mehreren, sich an der dritten Base unterscheidenden Tripletts codiert, wie z.B. Leucin (L) durch CTA, CTC, CTG oder CTT. Wird eine Aminosäure durch zwei unterschiedliche Tripletts codiert, wie z.B. Phenylalanin (F) durch TTT oder TTC, so kann an die entsprechende Stelle innerhalb des Oligonukleotides entweder ein Thymin oder ein Cytosin synthetisiert werden. Man arbeitet also mit einem Oligonukleotid-Gemisch.

Eine weitere Informationsquelle stellen andere, bereits bekannte Gene des gleichen Organismus dar. An der Häufigkeit der Benutzung eines bestimmten Tripletts von mehreren möglichen für eine Aminosäure (codon usage) kann eine Vorauswahl für die Tripletts im abgeleiteten Oligonukleotid erfolgen.

50

Beispiel: Relative Häufigkeit der Tripletts für die Aminosäuren Phenylalanin (F) und Glycin (G) in den bereits sequenzierten Genen für die 4-Hydroxybenzoyl-CoA Reduktase aus Thauera aromatica:

Phenylalanin: : Glycin: Triplett rel. Häufigkeit Triplett rel. Häufigkeit TTC 90,9% GGC 74,4% TTT 9,1% GGG 10% GGT 11,7% GGA 3,8%

Bsp.: N-Terminus der 38 kDa-UE: M E C F V G I D L G S T TTCGTGGGGATCGATCTGGG C C C C In diesem Beispiel wird mit einem Gemisch aus 16 Oligonukleotiden gearbeitet (entspricht der Kombinationsmöglichkeit von 2 verschiedenen Basen an 4 verschiedenen Positionen des Oligonukleotids). Dieser Strategie folgend wird auch für den Gegenstrang ein Oligonukleotid-Gemisch abgeleitet, das in der PCR als Primer verwendet werden kann. Von jeder der 4 UE und einer internen Sequenz der 38-kD-UE werden somit 2 Oligonucleotid-Gemische abgeleitet. Die relative Lage der Gene der Benzoyl-Reduktase in Thauerea aromaticaist bekannt: C B A D 38kD 45kD 48kD 32kD 5'→3' CR CI-R BR DR CL CI-L BL AL

Entsprechend dieser Information wird in der PCR jeweils das Hin-Oligo aus dem N-Terminus einer UE mit dem Rück-Oligo des N-Terminus der folgenden UE kombiniert.

51

"Hin"-Oligo "Rück"-Oligo C-UE, 38kD, ca. 1040 bp CR CL B-UE, 45kD, ca. 1230 bp BR BL A-UE, 48kD, ca. 1310 bp AR AL D-UE, 32kD, ca. 870 bp DR DL interne Sequenz der C-UE CIR CIL Pipettierschema für einen Standard-PCR-Ansatz: dNTP: desoxyNukleosidtriphosphat; U= 1 Enzymeinheit; Konzentration Einsatz pro Reaktion chromosomale DNA

ca. 0.1-0.5 µg/µl

1 µl

10x Puffer

100 mM Tris-Cl, pH 8.8, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, 1% (v/v) Triton X-100

10 µl

dNTP-mix (dATP,dCTP, dGTP, dTTP)

2 nmol/µl

10 µl

oligo: hin primer oligo: rück primer

2 pmol/µl 2 pmol/µl

10 µl 10 µl

Taq Polymerase

2 U/µl

1 µl

H2O

58 µl

Summe

100 µl

Ansatz von 9 PCR-Reaktionen, jeweils in ein 0.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß: 1 2 3 4 5 6 Hin-Oligo CR CR BR CR CIR CR Rück-Oligo BL AL AL CIL BL BL Chr. DNA ja Ja ja ja ja nein Der Ansatz wird in den Thermo-Cycler gestellt und das Programm 1 (siehe unten) gestartet. Programm: Start: 1. Drücken des Start-Knopfes 2. Eingabe des Blockes 3. Eingabe des gewünschten Programmes:1 4. Bestätigung durch Drücken des "Start"-Knopfes

52

95°C 2min

95°C 30sec

40°C 30 sec

72°C 1 min

40°C 30 sec

72°C 5 min

6°C halten (Dauer der PCR-Reaktion: 1,55 Std.) Nachweis der amplifizierten DNA. Zum Nachweis der amplifizierten DNA wird 1/10 (10 µl) jeder PCR-Reaktion mit 5 µl Farbstofflösung (enthält Bromphenolblau und Glycerin zum Beschweren der Proben) versetzt und in einer Agarose-Gelelektrophorese eingesetzt. Vorsicht! Beim Arbeiten mit Ethidiumbromid (EtBr)-gefärbten Gelen stets Handschuhe tragen und den direkten Kontakt mit dem Gel vermeiden.

– Gießen des Agarosegeles 0,8% (w/v): Agarose in 1x TAE-Puffer + 1 µl/10 ml 1% EtBr-Lösung. Das Ethidiumbromid lagert sich zwischen die Doppelstrang-DNA und macht diese indirekt durch seine Fluoreszenz im UV-Licht "sichtbar". – Überschichten des Geles mit Laufpuffer 1x TAE. – Auftragen der mit Farbstofflösung versetzten Proben + 2 Spuren Standard. – Gelelektrophorese bei 100 Volt, bis die blaue Farbstoffbande Bromphenolblau (BPB) etwa 2/3 des Geles durchwandert hat (ca. 1 h). – Photographie des Geles unter UV-Licht (302 nm). Vorsicht! Sonnenbrandgefahr

Stammlösungen:

1x TAE: 40 mM Tris-Acetat pH 8.0 1 mM EDTA Ethidiumbromid 1 % Stammlösung Farbstofflösung: 0.07% (w/v) Bromphenolblau 50% (w/v) Glycerin in 1x TAE

30x

53

Isolierung der amplifizierten DNA aus dem Agarose-Gel. Die Elution der gewünschten DNA-Fragmente geschieht nach der "Glasstaub"-Methode (Vogelstein, B. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619).

– Mit einem Skalpell werden die gewünschten DNA-Fragmente unter UV-Licht ausgeschnitten und in ein Eppi (1.5ml) überführt. – Wiegen des Fragmentes zwecks Volumenermittlung. – Zugabe von 2.5-3 Volumen gesättigter NaI-Lösung. – Inkubation bei Raumtemperatur (gelegentliches Umdrehen), bis sich das Gelstück aufgelöst hat. Durch die Eigenschaft chaotroper Salze, nicht-kovalente Bindungen aufzubrechen, löst sich das Agarose-Gelstück. – Zugabe von 5 µl Glasstaublösung (Glasmilch), mehrmaliges Umdrehen und Inkubation auf Eis, mindestens 10 min. In Gegenwart chaotroper Salze bindet DNA spezifisch an Silikatoberflächen. – Zentrifugation: 2 min, höchste Geschwindigkeit. – Den Überstand mit ausgezogener Pasteurpipette abziehen und verwerfen. – Das Pellet wird 3x mit eiskaltem TES-Puffer gewaschen:

Zugabe von 200µl TES-Puffer; das Eppi wird um 180° gedreht in die Zentrifuge gestellt, so daß das Pellet nun statt an der Aussen- an der Innenwand des Eppis liegt. Zentrifugation: 1 min , höchste Geschwindigkeit. Das Pellet ist nun wieder aussen. Abziehen des Überstandes wie oben. Erneute Zugabe von 200µl TES-Puffer, etc.

– Zur Desorption der DNA wird das Pellet in 30 µl H2O gelöst und mind. 10 min bei 48°C inkubiert. – Zentrifugation: 2 min, höchste Geschwindigkeit. – Überführung der 30 µl wässrigen Lösung in ein neues Eppi. – 10 µl davon werden mit 5 µl Farbstofflösung versetzt und in einer erneuten Agarose- Gelelektrophorese zwecks Kontrolle des DNA-Gehalts eingesetzt.

Stammlösungen:

TES-Puffer: 10 mM Tris-HCl; pH 8 1 mM NaEDTA 100 mM NaCl 50% (v/v) Ethanol

54

N-terminale Aminosäuresequenzen der Untereinheiten A-D der Benzoyl-CoA Reduktase aus Thauera aromatica nach Edman-Abbau Untereinheit N-terminus Interne Fragmente nach Bromcyan-Spaltung: BcrA MECFVGIDLGSTXXKAV

BcrB SAKTNPEVIKESXMV

BcrC STADIIARCEALYEDLD

1. LKDYLAAAVKVEQKRDNXRVIINNGFF 2. FPGKYVRYFDVPNYRDDDGDNNYT

BcrD TITAGIDIGTGAVITVLSR

1. TITAGIDIGTGAVKTVLFRVEGXDTE

Teilsequenz der BcrC-Untereinheit: atcatcgcgcgctgtgaagcgctttacgaggaccttgatttcactgccgccaggcaatggaaggaggccgatccctctcgcaaggttatcgcctacatgccggtatatgtgccgcgcgagatcattcatgcggctggcatgctgcccctgggcatcatgggcggcggcgacggcctggaggtgatccacggcgacgccttctaccagagctacatctgccgcatcccacgctcgaccatcgaacttggcctgtcgaagcgcatggatttcgtcgatggcatgctgttccccagcatctgtgacgtcatccgcaacctgtcgggcatgtggaagctgatgttcccgggcaagtacgtgcgttacttcgatgttccccagaactaccgcgacgacgtcggcggcaactactacaccgccgaactgaacgaactgcgcgaaggcctggagcacctgtcgggccgcaagatcaccgacgacgccctgcgcgcttcgatcaaggtctacaacgaaaaccgcaagctcgtccaggatgtctatggcctgcgttcgcgcgagccctggaaggtgccgtcggccgacgtctatctgctgatgcgcgccggcctggtgctgccggtcgaagagcacaaccagatgctgaaggactacctggccgccgcggtcaaggtcgaggcgcaaaagcgcgacaactgtcgcgtgatcatcaacggctcgttctgcgaacagccgccgctcaacctgatcaagtcgatcgagctctcgggctgct

Codon usage of Thauera aromatica tta ( ) 0 --- Cys(C) 109 ctt Leu(L) 23 --- Ser(S) 305 --- ( ) 0 caa Gln(Q) 20 ttg Leu(L) 21 taa Ter(.) 4 gca Ala(A) 50 cag Gln(Q) 150 --- Leu(L) 541 tag Ter(.) 3 gcc Ala(A) 367 --- Gln(Q) 170 aaa Lys(K) 29 tga Ter(.) 11 gcg Ala(A) 232 gaa Glu(E) 179 aag Lys(K) 225 --- Ter(.) 18 gct Ala(A) 35 gag Glu(E) 208 --- Lys(K) 254 aca Thr(T) 6 --- Ala(A) 684 --- Glu(E) 387 atg Met(M) 182 acc Thr(T) 223 aga Arg(R) 7 gga Gly(G) 20 --- Met(M) 182 acg Thr(T) 65 agg Arg(R) 8 ggc Gly(G) 393 ttc Phe(F) 169 act Thr(T) 14 cga Arg(R) 26 ggg Gly(G) 53 ttt Phe(F) 17 --- Thr(T) 308 cgc Arg(R) 263 ggt Gly(G) 62 --- Phe(F) 186 tgg Trp(W) 59 cgg Arg(R) 63 --- Gly(G) 528 cca Pro(P) 13 --- Trp(W) 59 cgt Arg(R) 71 cac His(H) 98 ccc Pro(P) 89 tac Tyr(Y) 129 --- Arg(R) 438 cat His(H) 40 ccg Pro(P) 198 tat Tyr(Y) 30 aac Asn(N) 165 --- His(H) 138 cct Pro(P) 12 --- Tyr(Y) 159 aat Asn(N) 18 ata Ile(I) 2 --- Pro(P) 312 gta Val(V) 7 --- Asn(N) 183 atc Ile(I) 288 agc Ser(S) 94 gtc Val(V) 211 gac Asp(D) 257 att Ile(I) 17 agt Ser(S) 11 gtg Val(V) 214 gat Asp(D) 100 --- Ile(I) 307 tca Ser(S) 6 gtt Val(V) 19 --- Asp(D) 357 cta Leu(L) 3 tcc Ser(S) 56 --- Val(V) 451 tgc Cys(C) 82 ctc Leu(L) 170 tcg Ser(S) 131 nnn ???(X) 30 tgt Cys(C) 27 ctg Leu(L) 324 tct Ser(S) 7 TOTAL 6106

55

Ergebnis einer Datenbankrecherche mit obiger Teilsequenz der BcrC-Untereinheit: Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi|2190579 (U75363) benzoyl-CoA reductase subunit [Rhodopseudom... 523 e-148 gi|123113|sp|P11570|HGDB_ACIFE (R)-2-HYDROXYGLUTARYL-COA DEHYDR... 128 6e-29 gi|1781027|gnl|PID|e291022 (X98916) orf7 [Methanopyrus kandleri] 99 4e-20 gi|2495735|sp|Q60318|Y007_METJA HYPOTHETICAL PROTEIN MJ0007 >gi... 73 2e-12 gi|2648585 (AE000968) 2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase, subuni... 73 3e-12 gi|732092|sp|P39384|YJIM_ECOLI HYPOTHETICAL 43.6 KD PROTEIN IN ... 55 5e-07 gi|2896764|gnl|PID|e1252006 (AL021899) putative membrane protei... 34 1.4 gi|1839374|bbs|173193 (S80118) nude [rats, C57BL/6J, Peptide, 6... 34 1.8 gi|1839376|bbs|173208 (S80120) nude rnu [rats, C576J-nu/nu, Pep... 34 1.8 gi|115188|sp|P19321|BXD_CLOBO BOTULINUM NEUROTOXIN TYPE D PRECU... 31 9.2 gi|260239|bbs|118641 (S49407) type D neurotoxin [bacteriophage ... 31 9.2 gi|2190579 (U75363) benzoyl-CoA reductase subunit [Rhodopseudomonas palustris] Length = 394 Local hits (HSPs): __________________________________________________ __________________________________________________ Database sequence: | | | | 394 0 150 300 Score = 523 bits (1332), Expect = e-148 Identities = 250/385 (64%), Positives = 301/385 (77%) Query: 2 STADIIARCEALYEDLDFTAARQWKEADPSRKVIAYMPVYVPREIIHAAGMLPLGIMGGG 61 +TADIIARCEAL+ DL FTAAR+WK A+P R V+ ++P Y PRE++HAAG LPLGI GGG Sbjct: 8 TTADIIARCEALFSDLSFTAAREWKAAEPGRIVVGFLPYYAPRELVHAAGGLPLGIFGGG 67 Query: 62 DGLEVIHGDAFYQSYICRIPRSTIELGLSKRMDFVDGMLFPSICDVIRNLSGMWKLMFPG 121 D LEVIHGDA+YQSYICRIPRSTIELG+S R+DFVDGM+FPSICDVIRNLSGMWKLMFP Sbjct: 68 DQLEVIHGDAYYQSYICRIPRSTIELGVSGRLDFVDGMMFPSICDVIRNLSGMWKLMFPS 127 Query: 122 KYVRYFDVPQNYRDDVGGNYYTAELNELREGLEHLSGRKITDDALRASIKVYNENRKLVQ 181 K RY D+P N+ DD+GG +Y +EL E E L L+G+ IT DA+RASI V+N+NR+L++ Sbjct: 128 KGARYIDLPHNFDDDLGGEFYVSELRETCEWLSTLTGKPITSDAIRASIAVFNDNRRLIR 187 Query: 182 DVYGLRSREPWKVPSADVYLLMRAGLVLPVEEHNQMLKDYLAAAVKVEAQKRDNCRVIIN 241 +Y LR+ EPW VPS+++YLL+RAG+V+PVEEHNQML DYLAA + +DN RV+I Sbjct: 188 ALYQLRADEPWNVPSSELYLLLRAGMVIPVEEHNQMLADYLAAVRLQQRPIKDNSRVVIC 247 Query: 242 GSFCEQPPLNLIKSIELSGCYIVDDDYMIVHRFLRNEVSTAGDPMQNLSLAFLHESISTA 301 G FCEQPPLNLIKSIELSGCYIVDDD+++V R+ ++V+ GDP+ NL+ A+LH+S ST Sbjct: 248 GMFCEQPPLNLIKSIELSGCYIVDDDFILVTRWENSDVALDGDPLSNLASAYLHDSKSTP 307 Query: 302 AXXXXXXXXXXXXXXXQVRTNAAEGVIFAAPSFCDPALLERPMLADRCSENKVPYISFKY 361 VR N AEGVIFA SFCDP LLERPML + +P I+FKY Sbjct: 308 PKYEPDEAKKGLYLVDSVRKNRAEGVIFAMTSFCDPGLLERPMLQPVLKSHGIPQIAFKY 367 Query: 362 AENSGQMQPIREQAGTFADSIKLWS 386 AENSGQMQPIREQAGTF DSIKLWS Sbjct: 368 AENSGQMQPIREQAGTFPDSIKLWS 392 gi|123113|sp|P11570|HGDB_ACIFE (R)-2-HYDROXYGLUTARYL-COA DEHYDRATASE BETA-SUBUNIT >gi|68341|pir||DWDXBF 2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase (EC 4.2.1.-) beta chain - Acidaminococcus fermentans >gi|38802 (X14252) hgdB protein precursor [Acidaminococcus fermentans] Length = 379 Local hits (HSPs): _______________________________________________ __________________________________________________ Database sequence: | | | | 379 0 150 300 Score = 128 bits (318), Expect = 6e-29 Identities = 89/357 (24%), Positives = 170/357 (46%), Gaps = 12/357 (3%) Query: 32 RKVIAYMPVYVPREIIHAAGMLPLGIMGGGDGLEVIHGDAFYQSYICRIPRSTIELGLSK 91 +K I +P YVP E+++AAGM+P+G+ G +G + + + S+ C I + ++E+ L Sbjct: 29 KKAIGCLPYYVPEELVYAAGMVPMGVWGC-NGKQEVRSKEYCASFYCTIAQQSLEMLLDG 87 Query: 92 RMDFVDGMLFPSICDVIRNLSGMWKLMFPGKYVRYFDVPQNYRDDVGGNYYTAEL-NELR 150 +D +DG++ P +CD +R +S +K+ K F R + G +T + +E++ Sbjct: 88 TLDGLDGIITPVLCDTLRPMSQNFKVAMKDKMPVIFLAHPQVRQNAAGKQFTYDAYSEVK 147

56

Query: 151 EGLEHLSGRKITDDALRASIKVYNENRKLVQDVYGLRSREPWKVPSADVYLLMRAGLVLP 210 LE + G +IT+DA+ +IKVYN++R ++ L + P +P++ ++RA + Sbjct: 148 GHLEEICGHEITNDAILDAIKVYNKSRAARREFCKLANEHPDLIPASVRATVLRAAYFML 207 Query: 211 VEEHNQMLKDYLAAAVKVEAQKRDNCRVIINGSFCEQPPLNLIKSIELSGCYIVDDDYMI 270 +E+ + L++ A K D +V+++G P ++K+++ + I DD Sbjct: 208 KDEYTEKLEELNKELAAAPAGKFDGHKVVVSGIIYNTP--GILKAMDDNKLAIAADDCAY 265 Query: 271 VHR-FLRNEVSTAGDPMQNLSLAFLHESISTAAXXXXXXXXXXXXXXXQ-VRTNAAEGVI 328 R F + + + L++ F + V+ + AEG+I Sbjct: 266 ESRSFAVDAPEDLDNGLHALAVQFSKQKNDVLLYDPEFAKNTRSEHVGNLVKESGAEGLI 325 Query: 329 FAAPSFCDPALLERPMLADRCSENKVPYISF---KYAENSGQMQPIREQAGTFADSI 382 FCDP +E P L + +P++ + + GQ Q E FA+S+ Sbjct: 326 VFMMQFCDPEEMEYPDLKKALDAHHIPHVKIGVDQMTRDFGQAQTALE---AFAESL 379 Primer-Sequenzen für die Untereinheiten des bcr-operons: BCR A-R:5' TTC GT(G/C) GG(G/C) ATC GA(T/C) CT(G/C) GG 3' BCR A-L 5' CC(G/C) AG(A/G) TCG AT(G/C) CC(G/C) ACG AA 3' BCR B-R 5' AAG AC(G/C) AAC CC(G/C) GA(G/A) GT(G/C) ATC AAG GA 3' BCR B-L 5' TTC TTG AT(G/C) AC(C/T) TC(G/C) GGG TT(G/C) GT 3' BCR C-R 5' AC(G/C) GC(G/C) GA(T/C) ATC ATC GC(G/C) GC(C/G) TGC GA 3' BCR C-L 5' AAG TC(G/C) AGG TC(C/T)TCG TA(G/C) AG(G/C) GC(T/C) TCG CA 3' BCR D-R 5' AC(G/C) ATC AC(G/C) GC(G/C) GG(G/C) ATC GAC ATC GG 3' BCR D-L 5' CC(T/C) TC(G/C) AC(G/C) CGG AA(G/C) AG(G/C) AC(G/C) GTC TT 3'

57

AUSWERTUNG UND PROTOKOLL (5. Tag) Abb. 1: SDS-Gel-Elektrophorese von Extrakten von T. aromatica Abb. 2A: Western Blot von Extrakten von T. aromatica. Die Untereinheiten des Enzyms Benzoyl-CoA Reductase wurden durch polyklonale Antikörper anhand des Chemolumineszenzverfahrens nachgewiesen. (Beschriftung der Spuren analog SDS-Gel in Abb.1). Abb. 2B: Proteinfärbung der Western-Blot-Membran mittels Ponceau-S (Beschriftung der Spuren analog SDS-Gel in Abb.1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Spur 1: leer Spur 2: E.coli Extrakt Spur 3: Marker Protein Spur 4: gereinigte Benzoyl-CoA-Reductase (Proteinmenge 1) Spur 5: gereinigte Benzoyl-CoA-Reductase (Proteinmenge 2) Spur 6: T.aromatica Benzoat (Proteinmenge 1) Spur 7: T.aromatica Benzoat (Proteinmenge 2) Spur 8: T.aromatica Acetat (Proteinmenge 1) Spur 9: T.aromatica Acetat (Proteinmenge 2) Spur 10: leer

58

III.2: Abb. 3: Agarose-Gelelektrophorese von chromosomaler DNA von T aromatica Abb. 4: Ableitung von Oligonucleotidsequenzen für die PCR-Primer aus der N-terminalen Aminosäuresequenz einer Clustereinheit der Benzoyl-CoA-Reduktase aus T. aromatica Abb. 5: Agarose-Gel-Elektrophorese der PCR-Reaktion. Analyse der PCR-amplifizierten DNA-Fragmente. Abb. 6: Agarose-Gel-Elektrophorese der PCR-amplifizierten DNA-Fragmente, die aus dem ersten Agarose-Gel isoliert worden sind.

1 2 3 4

Spur 1: Standard-Marker-DNA Spur 2: isolierte genomische DNA, Menge 1 Spur 3: isolierte genomische DNA, Menge 2 Spur 4: genomische DNA, Kontrolle

1 2 3 4 5 6 7

Spur 1: DNA-Molekularmassen-Standard Spur 2: PCR (1) Spur 3: PCR (2) Spur 4: PCR (3) Spur 5: PCR (4) Spur 6: PCR (5) Spur 7: PCR (6)

1 2 3 4

Spur 1: DNA-Molekularmassen-Standard Spur 2: isoliertes PCR-Produkt (1) Spur 3: isoliertes PCR-Produkt (2) Spur 4: isoliertes PCR-Produkt (3)

59

Abb. 7: Organisation der DNA-Fragmente der Gene für die Untereinheiten der Benzoyl-CoA-Reduktase.