Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Grün fluoreszierendes Protein (GFP) –Entwicklungen bei den Fluoreszenzmarkern
Folien im Internet auf der Homepage der Physikalischen Chemie III
http://www.uni-bielefeld.de/chemie/arbeitsbereiche/pc3-hellweg/teaching
Tilman Kottke
Physikalische und Biophysikalische Chemie
Universität Bielefeld
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Grundlagen zur Fluoreszenz
Neuere Entwicklungen
Grün Fluoreszierendes Protein (GFP)
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Kernabstand
Ene
rgie
rGG
Jablonski-Termschema
elektronischer Grundzustand
elektronisch angeregter Zustand
Schwingungsenergieniveaus
Schwingungsenergieniveaus
nach Atkins (1990) Physikalische Chemie
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Kernabstand
Ene
rgie
Jablonski-Termschema
Eigenschaften der Fluoreszenz von Molekülen:
- niedriger in Energie als Absorption (Stokes-Shift)- verzögert gegenüber Absorption - Schwingungsstruktur des elektronischenGrundzustands
- erfolgt spontan
Intensität der Fluoreszenz hängt ab von:
- eingestrahlte Anzahl an Photonen- Franck-Condon-Faktor der Anregung→ Extinktionskoeffizient
- Geschwindigkeit von Konkurrenzprozessen
rGG
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Konkurrenzprozess: Quenchen durch Stöße
Fluoreszenz-Quantenausbeute von NO2in Abhängigkeit vom Druck
Moore und Hummel (1983) Physikalische Chemie
Löschung: M* + Q M + Q + kinetische Energie
M*: angeregtes NO2 Q: Quencher, NO2 im Grundzustand
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Fluoreszenz-Quantenausbeute ΦF
Löschung: M* + Q M + Q + kinetische Energiek2
Fluoreszenz: M* k1: natürliche GeschwindigkeitskonstanteM + hνk1
Geschwindigkeitsgesetz: ]*][[*][*][21 QMkMk
dtMd
−−=
][]*][[*][*][
21
1
21
1
Qkkk
QMkMkMk
F +=
−−−
=φ
→ ΦF hängt vom Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten ab
→ alle Moleküle fluoreszieren, typische Lebensdauer τF = 1/kF ~ 10-8 s
→ schnelle Konkurrenzprozesse verringern ΦF und τF
beobachtete Geschwindigkeitskonstante ][21 QkkkF +=
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Konkurrenz-Prozesse
Fluoreszenz in Konkurrenz zu vielen anderen Prozessen: begünstigt durch:
flexible Moleküle
Schweratome überstarke Spin-Bahn-Kopplung
hohen Druck
großes Dipolmoment des Solvens
reaktive externe Gruppenschnelle Diffusionhohe Konzentration
- strahlungslose Deaktivierung in den Grundzustand(interne Konversion IC)
→ Umwandlung in interne Schwingungsfreiheitsgrade
- Übergang in Triplettzustand (intersystem crossing ISC)→ Änderung des Spinzustands
- Stoßdeaktivierung in der Gasphase→ Umwandlung in externe Freiheitsgrade der Translation
- Schwingungsrelaxation in Lösung→ Umwandlung in externe Schwingungsfreiheitsgrade
- Photoreaktion (z. B. Elektronentransfer)
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Kernabstand
Ene
rgie
Stokes-Shift Beitrag 1
Energieunterschied von absorbierter und emittierter Strahlung aufgrund
1) vertikaler Übergang der Absorption und Emission(Franck-Condon-Prinzip)
2) Änderung der Molekülgeometrie im angeregten Zustand
3) strahlungsloser Zerfall im angeregten Zustandviel schneller als Fluoreszenz
rGG
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Stokes-Shift Beitrag 2
Im angeregten Zustand andere Geometrie des Moleküls → Dipolmoment ändert sich
Polares Lösungsmittel muss auf Änderung reagieren → Solvensrelaxation
Pfeile zeigen Dipolmomente von Molekül (Kasten)und Solvens (Ecken)
Fluoreszenz
Stokes-Shift bis zuΔλ = 20 – 50 nm
Winter / Noll (1998) Methoden der Biophysikalischen Chemie
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Probe
Detektion der Fluoreszenz
→ Abtrennung der Fluoreszenz vom gestreutenAnregungslicht durch spektrale Verschiebung
(Stokes-Shift)
Walla (2009) Modern Biophysical Chemistry
PM
M
MonochromatischeLichtquelle
Aufbau:
Linse
Dispersives Elementoder Filter
Detektor
Problem: Streulicht zeigt ähnliche Ausbreitungwie Fluoreszenz in alle Raumrichtungenund muss abgetrennt werden
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Grün Fluoreszierendes Protein (GFP)
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Grün Fluoreszierendes Protein (GFP)
Zyklisierung, Dehydratisierung,Oxidation
- 228 Aminosäuren, bilden 11 Faltblätter- Fluorophor gebildet durch intramolekulare Reaktion:
→ Emission im sichtbaren Spektralbereich
- lässt sich in alle Organismen über DNA/RNA-Manipulation einbringen→ Markierung von Proteinen oder Strukurelementen in lebenden Zellen
Tyrosin
Glycin
Serin
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Grün Fluoreszierendes Protein (GFP)
Barondeau et al. (2005) Biochemistry 44, 1960
11 Faltblätter umgeben den Fluorophor
Schema der Nervenzellen, die Mechanosensoren enthalten
→ Ortsinformation über das Protein MEC-17-GFP→ Funktionelle Information
GFP-Fluoreszenz-Mikroskopiebild eines lebenden WurmsM. Chalfie (2008) Nobel Lecture
Suzuki et al. (2003) Neuron 39, 1005
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
M. Chalfie (2008) Nobel Lecture Chalfie et al. (1994) Science 263, 802
Nobelpreis für Chemie 2008
Osamu ShimomuraMartin ChalfieRoger Y. Tsien
Foto: dpa
“for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP”
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Erklärung der günstigen Eigenschaften des GFP
- hohe Quantenausbeute (79 %)
Hypothesen zur Erklärung
- Energie-Abstand der Zuständevariierbar durch Umgebung und Konjugation
Unterdrückung von konkurrierenden Prozessen:- IC → rigider Fluorophor - ISC → Schweratome fehlen im Fluorophor- Schwingungsrelaxation → zwar polare aber auch starre
Umgebung durch Protein
- polare Umgebung und hohes Übergangsdipolmoment (7 D)- aber: mässig flexible Umgebung
Eigenschaft
- mässiger Stokes-Shift von(~38 nm, deprotoniert)
- Emissionswellenlänge durch Mutanten und Varianten veränderbar
→ Grundlage für Weiterentwicklungen
R. Tsien (2008) Nobel Lecture
- Photostabilität - Photochemie → Hülle verhindert Diffusion zum Fluorophor→ keine schnellen Reaktionen innerhalb des Proteins wie Isomerisierung und e--Transfer
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Neuere Entwicklungen
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Verbesserungen beim GFP: rsEGFPSchaltbares EGFP durch Mutation weiteroptimiert: “reversible switcheable enhanced GFP” rsGFP
Zwei langlebige Zustände,durch Licht hin- und herschaltbar,nur einer fluoresziert:
Belichtung mit 488 nm
Grotjohann et al. (2011) Science 478, 204
Vorteile: Sehr hohe PhotostabilitätSchnelle Schaltbarkeit→ 1200 Zyklen bis 50 % gebleicht
Vergleich der Schaltbarkeit mit bestem bisherigen System (Dronpa)
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Anwendung des rsEGFP
Vielfach wiederbeschreibbarer Datenspeicher durch Proteinschicht fixiert in Polyacrylamid
25 Grimms Märchen als ASCII-Binärcode, optisch geschrieben undausgelesen durch Konfokalmikroskopie (1.8 MB mit DVD-Schreibdichte)
Grotjohann et al. (2011) Science 478, 204
→ großes Potenzial für Entwicklung des GFP, allerdings weitgehend durch Screening
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Konkurrenz zu GFP durch andere ProteineZiel: möglichst langwellige Emission
- weniger Streuung → dringt tiefer in Gewebe ein- weniger Autofluoreszenz → höherer Kontrast
Rockwell et al. (2006) Annu. Rev. Plant Biol. 57, 837
Fluorophor BiliverdinProdukt aus dem Abbau von Häm
Optimierung: Mutante einer Chromophor-Bindedomäne des Bacteriophytochroms
708 nm
Anregungs- und Emissionspektrendes mutierten Bacteriophytochrom
Shu et al. (2009) Science 324, 804
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Shu et al. (2009) Science 324, 804
Fluoreszenz-Tomographie-Aufnahme einer Mäuselebermittels Bacteriophytochrom
Konkurrenz zu GFP durch andere Proteine
→ GFP-basierte Emitter im Fernroten nicht verfügbar, Chance für alternative Proteine
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Kleine Moleküle als Floureszenzmarker
→ kleine Moleküle bieten maßgeschneiderte Eigenschaften
Koide et al. (2011) JACS 133, 5680
Selektivität: Si-Rhodamin-Spiroverbindung reagiert auf HOCl, nicht auf andere reaktive Sauerstoffspezies
farblos, nicht fluoreszierend farbig, stark fluoreszierend
Rationales Design: - Si statt O für Rotshift der Emission- R als wasserlösliche Gruppe- Spiroverbindung für Selektivität- hoher Kontrast durch entstehende Konjugation
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Lifetime Gating über Metall-Fluoreszenz
Alternative: Gold-Nanopartikel
→ bisheriges, rationales Design: lange natürliche Lebendauervon Lanthanoid-Komplexen
→ einfacher Zugang zu deutlichlängeren Lebensdauernals organische Farbstoffe
Fluoreszenz-Abnahme in Lösung und in der Zelle
Ziel: lange Lebensdauer: Konkurrenz-Beiträge wie Autofluoreszenz lassen sich durch Schalten (Gating) des Detektors entfernen
Shang et al. (2011) Small 7, 2614
→ Eigener Anwendungsbereich, da Lebensdauer von GFP-Emission nicht so variabel
Dr. Tilman Kottke, Universität Bielefeld, 2011
Weiterführende Literatur
M. Chalfie (2008) Nobel lecture, www.nobelprize.org
R. Tsien (2008) Nobel lecture, www.nobelprize.org
Shaner et al. (2007) „Advances in fluorescent protein technology”, J. Cell. Sci. 120, 4247
Lakowicz (2006) „Principles of fluorescence spectroscopy“
Lehrbücher der Physikalischen Chemie