GRANULOCITE-MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR

Elisa Gerbaudo

a.a. 2006/2007

GRANULOCITE-MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR

GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) è una glicoproteina di 22 kDa, codificata da un gene localizzato nel cromosoma umano 5, che contiene 4 esoni e 3 introni.

E’ posizionato in tandem col gene per l’ IL-3 e in prossimità dei geni per IL-4, IL-5, IL-9 ed M-CSFR.

Il precursore è una proteina di 144 aa: -2 ponti disolfuro : Cys 54-96(importante per l’ attività biologica) e Cys 88-121 -2 potenziali siti di glicosilazione: Asn 27 e Asn 37( la forma non glicosilata ha attività maggiore)

Il clivaggio del peptide segnale genera una proteina matura di 127 aa.

STRUTTURA GM-CSF

Struttura della forma non-glicosilata:

4α eliche in conformazione up-up-down-down antiparallele;

Il dominio di legame di Rα comprende il primo e terzo loop antiparalleli;

Il dominio di legame di βc contiene un residuo di glutammato (21) nella prima α elica.

Martinez-Moczygemba M. et al. Biology of common β receptor-signaling cytokines: IL-3, IL-5, e GM-CSF, J Allergy Clin Immunol, 112:653, 2003

GM-CSF è prodotto da:

Macrofagi Linfociti T

Linfociti B Eosinofili

Mast cells Neutrofili

Fibroblasti Cellule endoteliali

Cellule placentali Astrociti

Cellule stromali Cheratinociti

Cellule mesoteliali Osteoblasti

GM-CSF viene secreto in risposta a vari stimoli: IL-1, TNF-α, LPS.

Nelle cellule T la sinergia tra TCR e CD28 porta a produzione di GM-CSF

Concentrazione nel siero: 20-100 pg/ml

Regolazione sia a livello della trascrizione che post-trascrizionale

Il gene di GM-CSF comprende 2 regioni di controllo trascrizionale distinte:

-la regione del promotore, che si estende per 120 bp a partire dal sito di inizio della trascrizione;

-una regione enhancer 3 kb upstream.

Il promotore risponde a diversi segnali: Ca2+, TNF, IL-1E lega fattori quali NF-kB, NF-AT, AP.1

Oltre all’ aumentata trascrizione, è importante la degradazione dell’mRNA (presenza di 8 motivi 5’-AUUUA-3’ nella regione 3’ UTR)

IL RECETTORE DEL GM-CSF

Catena α

Si associa al GM-CSF con bassa affinità (1-10 nM)

Catena β

Necessaria per la trasduzione del segnale, media il legame ad alta affinità del GM-CSF assieme al recettore α

Appartiene alla famiglia di gp140, del gruppo di recettori per le citochine di tipo I:

Contiene domini extracellulari conservati (CRMs), ognuno costituito da 2 domini fibronectin III-like.

4 cisteine conservate Motivo WSXWS (folding)

Lyne PD et al., Molecular modeling of the GM-CSF amd IL-3 receptor complexes, Protein Sci., 4:2223, 1995.

E’ espresso da:

Macrofagi cellule CD34+

Neutrofili precursori di eritrociti e megacariociti

Eosinofili linfociti T e B fetali

Basofili DC

cellule vascolari endoteliali fibroblasti

Cellule tumorali di vario tipo

Scott CL et al.,The beta common chain of the Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor , IL-3 and IL-5 receptors, The International Journal of Biochemestry & Cell Biology,31:1011, 1999.

CATENA α (CD116)

Gene localizzato nella regione pseudoautosomale (PAR) dei cromosomi X e Y, copre un’ area di 45 kb, ha 13 esoni

Motivi di legame per PU.1, AP-1, GATA, C/EBP,NFkB.

Singolo passo transmembrana di 400 aa; la forma full-length di 80 kDa è predominante (almeno 8 isoforme).

Dominio extracellulare: 1 regione N-terminale di 100 aa (omologia con IL-3Rα e IL-5Rα), 2 domini fibronectin-III like contenenti 4 residui di Cys conservati e un motivo WSXWS .

11 potenziali siti di glicosilazione.

Dominio citoplasmatico: 1 corto motivo proline-rich, privo di attività intrinseca.


CATENA β (CD 131)

E’ condivisa coi recettori per l’ IL-3 e IL-5, ha 2 funzioni:-aumentare l’ affinità di legame;-trasdurre il segnale.

Singolo gene sul cromosoma 22;siti di legame per i membri della famiglia Ets (PU.1), GATA, C/EBP, Myb, AP-1, STATs, NFkB;

upregolata in risposta a IFNγ, eritropoietina, stem cell factor, IL-3 e TNFα

Polipeptide di 95 kDa e 880 aa con 3 potenziali siti di N-glicosilazione

Dominio extracellulare: 2 domini di omologia (4 motivi fibronectin-III), con residui conservati: 4 Cys, una coppia Pro-Pro e il motivo WSXWS.

Dominio citoplasmatico: è più lungo, ha siti di legame per Jak (Box1 e2).

2 isoforme: full-length e una forma alternativa (βIT), tronca, che agisce come inibitore di βc.


Modello di attivazione del recettore

Guthridge MA et al., Mechanism of activation of the GM-CSF, IL-3 and IL-5 family of receptors, Stem Cells, 16:301, 1998

1. JAK / STAT proliferazione e differenziamento2. RAS / MAPK proliferazione, crescita e sopravvivenza3. PI 3 K proliferazione,dimensioni cellulari, apoptosi e riarrangiamenti del citoscheletro


Guthridge MA et al., Mechanism of activation of the GM-CSF, IL-3 and IL-5 family of receptors, Stem Cells, 16:301, 1998

Terminazione del segnale

-attivazione di fosfatasi (SHP1 è coinvolta nella downregolazione dell’ attivazione di βc);

-induzione di soppressori del signaling delle citochine (SOCS): famiglia di small protein contenenti SH2.Meccanismi: inattivazione delle JAKs ; blocco dell’ accesso delle STATs ai siti di legame del recettore; ubiquitinazione delle proteine segnale e targeting al proteosoma.

-PIAS: inibitori delle STAT, bloccano il loro legame al DNA

-endocitosi e degradazione del recettore;

-sintesi e rilascio di recettori solubili per GM-CSF :(sGM-CSFR-α, manca del dominio TM e IC), espressi in BM, monociti/macrofagi; cells di corio-carcinoma, T cells del tessuto sinoviale reumatoide.

Attività biologica in vitro

Stimolazione di proliferazione, differenziamento, funzione e sopravvivenza delle cellule ematopoietiche (attività sovrapposta a quella di altre citochine, come M-CSF, G-CSF, IL-3, IL-6, SCF):

Monfardini C et al., Structure-based design of mimetics for Granulocyte- macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), Current Pharmaceutical Design, 8:2185, 2002

GM-CSF

Progenitori ematopoietici:

stimola la crescita di CFU-G, CFU-M, CFU-GM, CFU-DC, CFU-Eo.

Monociti / macrofagi:

aumenta la fagocitosi (azione sinergica con TNF-α);

potenzia l’ uccisione di microbi attraverso specie reattive di O e N;

aumenta la loro funzione di APC attraverso un’ overespressione di MHC-II e molecole co-stimolatorie;

stimola la produzione di citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-1α e β, IL-6, IL-8, IL-12, M-CSF, IL-1Ra);

promuove la migrazione verso i loci infiammatori (aumento espressione di molecole di adesione, quali CD11b e ICAM)

Neutrofili: ne stimola l’ attività antimicrobica attraverso aumentata fagocitosi e killing intracellulare;

Cellule dendritiche: DCs sono specializzate nella cattura dell’ Ag, nella migrazione e nella stimolazione delle cell T e sono una popolazione piuttosto rara.GM-CSF ( da solo o con IL-4 o TNF-α) promuove lo sviluppo delle DCs.

Altre cellule:

eosinofili: ne promuove la sopravvivenza, la citotossicità, la produzione di leucotrieni e l’ adesione;

granulociti basofili: induce il rilascio di istamina;

T cells: aumenta la capacità dell’ IL-2 di stimolarle;

NK: aiuta i precursori delle NK a differenziare;

cells non-ematopoietiche, tra cui fibroblasti, cells endoteliali e cells della muscolatura liscia.

Attività biologica in vivo

Topi transgenici per il GM-CSF:

-L’ overespressione porta ad accumulo di macrofagi in diversi tessuti, cecità e danni tissutali letali;

-Topi trapiantati con BM cells infettate con retrovirus esprimente GM-CSF sviluppano sindrome mieloproliferativa (infiltrati di neutrofili, eosinofili e macrofagi in polmoni, fegato, milza, cuore e muscoli morte).

-Trasferimento genico mediato da adenovirus nei polmoni induce eosinofilia, espansione dei macrofagi, neutrofili e DCs (sensibilizzazione agli aeroallergeni).

-Polimorfismi di GM-CSF sono determinanti dell’ asma.

-L’ espressione nello stomaco porta a gastrite autoimmune.

Topi GM-CSF deficienti:

-non hanno alterata produzione di cells ematopoietiche

-sviluppano anomalie polmonari simili alla proteinosi polmonare alveolare (PAP), caratterizzata da progressivo accumulo di proteine surfattanti e lipidi negli alveoli

-mostrano risposte compromesse alle cell T citotossiche, produzione di IFNγ e funzioni fagocitarie alterate, quindi aumentata suscettibilità a infezioni con L. monocytogenes, Streptococcus e P.carinii

Topi GM-CSF Rβc deficienti:

Sviluppano PAP e hanno un numero ridotto di eosinofili

Patologie:

Infezioni:Migliora la host response a diversi tipi di batteri e funghi (C. albicans, Pneumococcus, P.carinii)

Guarigione delle ferite:Accelera il riparo tissutale

Tumori:GM-CSF induce lo sviluppo di DCs in vitro.Le DCs sono specializzate nel dare inizio all’ immunità, a causa della loro capacità di processare efficientemente gli Ag in pathways di MHC di classe I e II.La vaccinazione con cells tumorali irradiate, ingegnerizzate per secernere GM-CSF stimolano l’ espansione e la maturazione delle DCs provocano un’ immunità anti-tumorale potente, specifica e duratura (in topi).

Infiammazione:Come molecola pro-infiammatoria-Aumentati livelli di GM-CSF in biopsie di pelle da pazienti allergici con reazioni cutanee;-Presente in elevata quantità nelle giunture di pazienti affetti da artrite reumatoide.-Elevati livelli in pazienti affetti da asma

Come molecola anti-infiammatoria-Previene la progressione dell’ aterosclerosi

Differenze a seconda della dose, di stimoli addizionali, di infezioni concomitanti

Hamilton JA, GM-CSF in inflammation and autoimmunity,TRENDS in Immunology, 23:403, 2002

Artrite reumatoide:GM-CSF è coinvolto nella patogenesi dell’ RA, sia nelle prime fasi di presentazione dell’ Ag alle cellule T, sia nelle fasi successive di attivazione dei macrofagi e rilascio di enzimi di degradazione.

GM-CSF

GM-CSF

Monfardini C et al., Structure-based design of mimetics for Granulocyte- macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), Current Pharmaceutical Design, 8:2185, 2002

Asma

Stacey AR et al., On the generation of allergic desease: from GM-CSF to Kyoto, TRENDS in Immunology, 23:396, 2002

APPLICAZIONI CLINICHE

NEUTROPENIA E TROMBOCITOPENIA DOPO CHEMIOTERAPIA O BMT:Riduce il periodo di neutropenia e trombocitopenia inducendo la proliferazione e la mobilizzazione di neutrofili, eosinofili, monociti e piastrine derivati da BM

BMT su topi con 3 diverse popolazioni cellulari:

I topi trapiantati sono stati trattati con cells producenti GM-CSF

Aumento di 4 volte della ricostituzione delle T-cells e delle DCs

MOBILIZZAZIONE DELLE PBSC :Mobilizza le PBSC dopo chemioterapia o in combinazione con G-CSF.

Il miocardio infartuato recluta cells staminali e progenitrici circolanti verso il sito del danno

usato GM-CSF per mobilizzare BMSCs in pazienti con AMI

Cells 34+ i pazienti trattati con GM-CSF aumentano e hanno un picco a 7 gg

HIV:Sopprime la replicazione di HIV; aumenta l’ attività antiretrovirale di zidovudina e stavudina

Infezioni da lentivirus, come HIV, causano neutropenia e difetti nei neutrofili e aumentano la suscettibilità a infezioni da parte di batteri Gram+, Gram- e funghi

Animali infettati con FIV trattati per 6 gg con GM-CSF

Piccole quantità di LPS provocano aumento nel rolling, adesione e migrazione dei neutrofili negli animali non infetti; in quelli infetti il reclutamento leucocitario è impedito

GM-CSF reverte completamente i difetti causati da FIV nella migrazione e nell’ adesione mediata da LPS

I neutrofili isolati da animali infetti sono incapaci di rispondere a chemoattraenti batterici (fMLP) o endogeni (IL-8)

GM-CSF aumenta la migrazione dei neutrofili fino a > 50%

GUARIGIONE DELLE FERITE:Stimola la migrazione e proliferazione delle cells endoteliali; promuove la crescita dei cheratinociti

Studiati gli effetti del trattamento con GM-CSF in ulcere venose croniche.

Analisi immunoistochimiche con Ab vs α-SMA (marca i vasi) aumento di densità dei vasi dopo trattamento con GM-CSF

Ibridazione in situ mostra marcato aumento di VEGF, prodotto da macrofagi e miofibroblasti

TERAPIA ANTITUMORALE:

Vaccinati topi immunocompetenti con cellule di leucemia murina letalmente irradiate, trasdotte con una forma transmembrana di GM-CSF, in modo da esprimere tmGM-CSF sulla superficie

Il 100% dei topi BALB/c vaccinati sono protetti da leucemia

REFERENCES

2) Hamilton JA et al., GM-CSF Biology, Growth Factors, 22:225, 2004;3) Martinez-Moczygemba M. et al. Biology of common β receptor-signaling

cytokines: IL-3, IL-5, e GM-CSF, J Allergy Clin Immunol, 112:653, 2003;4) Barreda DR et al., Regulation of myeloid development and function by colony

stimulating factors, Developmental and Comparative Immunology, 28:509, 2004;

5) Guthridge MA et al., Mechanism of activation of the GM-CSF, IL-3 and IL-5 family of receptors, Stem Cells, 16:301, 1998;

6) Geijsen N et al., Specificity in cytokine signal transduction: lessons learned from the IL-3/IL-5/GM-CSF receptor family, Cytokine and Growth Factor Reviews, 12:19, 2001;

7) Hamilton JA, GM-CSF in inflammation and autoimmunity,TRENDS in Immunology, 23:403, 2002;

8) Monfardini C et al., Structure-based design of mimetics for Granulocyte- macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), Current Pharmaceutical Design, 8:2185, 2002;11)Stacey AR et al., On the generation of allergic desease: from GM-CSF to

Kyoto, TRENDS in Immunology, 23:396, 2002;12)Ling X et al., Vaccination with leukemia cells expressing cell-surface-associated

GM-CSF blocks leukemia induction in immunocompetent mice, Oncogene, 25:4483, 2006;

1) Cianfarani F et al., Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor treatment of human chronic ulcers promotes angiogenesis associated with de novo vascular endothelial growth factor transcription in the ulcer bed,British Journal of Dermatology, 154:34, 2006;

2) Encke J et al., Genetic vaccination with Flt3-L and GM-CSF as adjuvants: enhancement of cellular and humoral immune responses that results in protective immunity in a murin model of hepatitis C virus infection, World J Gastroenterol, 12:7118, 2006;

3) Zhao P et al., Rapid immune reconstitution and dendritic cell engraftment post-bone marrow transplantation with heterogeneous progenitors and GM-CSF treatment; Experimental Hematology, 34:951, 2006;

4) Deng Z et al.,Effects of GM-CSF on the stem cells mobilization and plasma C-reactive protein levels in patients with acute myocardial infarction, International Journal of Cardiology, (article in press), 2006;

5) Heit B et al., HIV and other lentiviral infections cause defects in neutrophil chemotaxis, recruitment and cell structure:immunorestorative effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, The Journal of Immunology, 177:6405, 2006;

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7) Scott CL et al.,The beta common chain of the Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor , IL-3 and IL-5 receptors, The International Journal of Biochemestry & Cell Biology,31:1011, 1999.

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