GLUTATION REDUKTAZA

(Sigma assay kit- Miloš je ovako radio)

Reagensi:

1. Assay buffer (100 mM K-fosfatni pufer, 1 mM EDTA, pH 7,5) – steilno filtrovati0,5 M fosfat 10 ml200 mM EDTA 50 µldH2O 39,95 ml

2. Dilucioni pufer ( 100 mM fosfat pH 7,5; 1 mM EDTA; 1 mg/ ml BSA) 0,5 M fosfat 10 ml200 mM EDTA 50 µlBSA 50 mgdH2O 39,95 mlSterilno profiltrovati pufer, dodati BSA.

3. 2 mM NADPH- pripremiti svežeNADPH 9,25 mgAssay buffer 5 ml

4. 2 mM oksidovani gluatation ( GSSG)GSSG 7,1 mgAssay buffer 5 mlČuvati na sobnoj temperaturi do izvođenja testa. Može se čuvati na 2-8 ºC, 7 dana.

Priprema uzorka:

Lizirati eritrocite: 200 µl + 600 µl hladne dH2O na ledu 30 minuta. Razblažiti lizirane eritrocite u dilucionom puferu neposredno pre analize (5x i 10x).

Postupak:

Sve temperirati na sobnoj temperaturi 10 minuta pre početka reakcije.

Sipati u kvarcnu kivetu po navedenom redosledu, reakcija počinje dodatkom NADPH. Meriti A na 340 nm, interval 10s.

Blank Uzorak2 mM GSSG 500 µl 500 µlAssay buffer 450 µl 400 µlUzorak / 50 µl2 mM NADPH 50 µl 50 µl

Izračunavanje:

U/ml ¿ ( ΔAuz – ΔAblank) x R/ ε x V (u ml) ε= 6,22 mM-1 cm-1