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Genómica
Licenciatura em Ciências BiomédicasDepartamento de Ciências da Saúde, UCP
Fevereiro 2013
Sumário
• 1. Sequenciação• Evolução histórica:
– O método de Sanger– Sequenciação automática– Sequenciação completa de genomas
• Aspetos técnicos das várias formas de sequenciação– Preparação de fragmentos de DNA para sequenciação.– Reação– Deteção
• Aplicações dos resultados da sequenciação
Sequenciação
• O que é?• Para que serve?• Desafios?
• Eventos que permitiram a sequenciação:– Electroforese em acrilamida– PCR– Fluorimetria em capilares– Miniaturizãção
PERSPETIVA HISTÓRICA DAS TÉCNICAS
3 grupos principais
Manual (Maxam & Gilber e Sanger)
1975/1977
Automática (Baseado
em Sanger)1980’s
Massiva (Next Generation)
2000
Sequenciação Manual
• Maxam e Gilbert– Término de sequências em várias bases
• Sanger– Síntese de sequências que terminam em cada uma
das 4 bases aleatroriamente
Sequenciação de Sanger
Sequenciação de Sanger
Sequenciação de Sanger
Sequenciação de Sanger
Sequenciação automática de Sanger
• Em vez de radioatividade usa-se fluorescência.– Podem usar-se 4 fluorocromos diferentes
• Podem ler-se todas as reações num mesmo tubo capilar (e.g citometria de fluxo) ou poço do gel de eletroforese.
• Os detetores detetam cores diferentes no capilar ou no gel.
• Os resultdos são interpretados pelo software
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Manual/Automatizada
Técnicas de sequenciação massiva
• Sequenciação por síntese de novo• A síntese ocorre em dezenas de milhares de
fragmentos ao mesmo tempo. • É retirada uma “foto” em cada passo de forma
a que se sabe como é que a sequencia “cresce”
Um outro suporte são esferas
• Emulsion PCR
ASPETOS TÉCNICOS DAS VÁRIAS FORMAS DE SEQUENCIAÇÃO
Construção de Bibliotecas
• Genómicas DNA library conjunto dos clones de todos os fragmentos do genoma de um organismo.
• cDNA conjunto das regiões de um genoma expressas num momento e/ou condição fisiológica.
© John Wiley & Sons, Inc.
COMO SE OBTEM CADA UMA?
Preparação do DNA
• Fragmentação– Enzimas de restrição– Radiação
• Amplificação– Por clonagem (demorada e muito trabalhosa)– Por PCR
APLICAÇÕES DOS RESULTADOS DE SEQUENCIAÇÃO
Aplicações
• Conhecimento da diversidade• Aplicações individualizadas
Bibliografia
• Korf, Bruce & Irons, Mira (2013) Human Genetics and Genomics 4th edition John Wiley & Sons (Ltd). ISBN-13: 978-0-470-654477. Capítulo 14
• Artigos disponibilizados aos alunos na pasta da intranet relativa à Genómica.
• Snustad Principles of genetics. Capítulo 15 Secção de sequanciação