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Genoma Umano e malattie genetiche. lezione 5-6 Martedì 12 Aprile. cluster Ig topo-uomo. mta1. crip2. crip1. hole. a. e. g2 a. g2 b. g1. g3. d. m. J. D. V. Mouse Igh cluster Chromosome 12. Em. hs 1,2. hs 3A. mta1. trascrizione. hs 4. hs 3B. JDV. 12F1. - PowerPoint PPT Presentation
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Genoma Umano e malattie genetiche
lezione 5-6 Martedì 12 Aprile
Mouse Igh cluster Chromosome 12
Human Igh cluster Chromosome 14
12F1
14q32.33
mta1
mta1
JDV
JDV
mta1 crip2 crip1 hole
mta1 crip2 crip1 hole
a b
J D V
J D V
elk 2.1 hs4 hs1.2 hs3 20bp 1
3’1
hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs320bp 2
3’2
hs 4
hs 3
Bhs
1,2
hs 3
A
hs 4
hs 1
,2hs
3
hs 4
hs 1
,2hs
3
3’2 3’1
BAC199M11(AF450245)
86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,065,000 86,070,000 86,075,00086,060,000
85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500
centromero telomero
trascrizione
IgH3’RR-A
IgH3’RR-B
(rischio riarrangiamenti)
cluster Ig topo-uomo
le regioni regolative delle Ig
centromero
Chromosome 14q32
enhancer 5’ 3 enhancers 3 enhancers
3 1 2 41 a2
geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili *
V D J *
regione duplicata regione duplicatareg. variab.*
IgH3’RR-A IgH3’RR-B
trascrizione
quante funzioni per la maturazione delle Ig ?
metodo riduzionistico
metodo olistico globale
che approccio possiamo usare nel topo e
quale nell’uomo ?
metodo riduzionista
la genomica permette studi globali
ma come si possono studiare le regioni cis regolative ?
si possono ottenere topi transgenici, ma uomini no
si possono ottenere linee cellulari transgeniche anche umane
il knock - out ed il knock - in sono molto usati
mutanti umani a disposizione ?
quali sono le mutazioni umane che si possono studiare ?
a = polimorfismi
b = patologie
modello della regolazione delle Ig
non ci sono due genomi uguali
(a parte i gemelli omozigoti)
infatti si trovano polimorfismi dovunque si cercano
prima della conoscenza di tutto il genoma erano più rari perchè si cercavano solo sulle sequenze codificanti
la nuova frontiera sta nelle sequenze regolative
epigenetica
nella oligarchia regolativa
la gerarchia ha le sue eccezioni
il sistema è bidirezionale e deve tener conto dell’ambiente
i semi sono programmati ma senza interazione con l’ambiente non possono germinare
esempio troppo banale
altro esempioil sistema immunitario ha una sua programmazione ma il suo compito è deve proteggere dalle infezioni edeve essere reattivo all’ambiente
quindi si tratta di gerarchia intelligente : modulabile
modello Jacob-Monod
fino da questo modello dellla regolazione del primo operone era chiara la necessità di interazione con l’ambiente
per ambiente non si intende solo lo spazio esterno all’organismo ma anche intercellulare o citoplasmatico
la cascata della regolazione ha a che fare con le modificazioni epigenetiche
non è sempre chiaro chi regola chi
LCR locus control region (nel topo 4 enhancers)
IgH3’RR-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus)
V D J
human chromosome 14 q 32
HS3A HS1,2A HS4A HS3B HS1,2B HS4B
3 1 2 41 a2 centromero
duplicazione 1 duplicazione 2
mouse Ig heavy locus
*HS3A HS1,2 HS3B HS4
L C R a b
LCR*HS = hyper sensitivity to DNase I
3’RR-A 3’RR-B
Chromosome 14
IgH3’RR-B
centromero 3 1 2 41 2
SF AL928742 (40 kb)
CHR77 (35.616 kb)X76785
Y14407AL928767
AL928765 U64453
IgH3’RR-A
contigs del sequenziamento genoma umano e precedenti
elkelk
l contigs delle regioni IgH 3’RR
Chromosome 14
IgH3’RR-BSF AL928742 (40 kb)
H
2
B
HS3
B
U2 U4
U5
B
R3
H
HS1,2
E
R3r U5rU1
R1
U3 U6
U7
U8r
B
U6r
HS4
Ub1 U4-5
R3 U7r
Ub2
B H
R4U9
R5
Ub3
U10
R5
U11
U12
R6
SA2.5 A2R A2F
Alu
U15 U16
H
LTR
END OF HOMOLOGY WITH ALFA1
U14U13
Ub4
H
1
B
HS3
B
U2U4
U5
B
R3
H*
HS1,2
E
R3r U5r
U1R1
Ua1
R2
U3
U6 U7 U8
B
U6r
HS4
B H
Ua2
R4
Ua3
U9 Ua4
R5U10
U11
R5
U12
R6
U13
SA2.5 A2R
Alu
U15 U16
H
LTR
END OF HOMOLOGY WITH ALFA2
K10 retrovirus
ELK2
H
U14
Ua5
A
B
centromero 3 1 2 41 2
CHR77 (35.616 kb)X76785
Y14407AL928767
AL928765 U64453
Poly A site
Poly A site
IgH3’RR-A
HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (2b, 3, ,) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue
and stage specific manner. (Ong et al, 1998)
Symergic effects
TOR VERGATAsynergism of HS3A-B-HS1,2-HS4
Immunology 2001, 103: 35-40
Polymorphism of the human a1 immunoglobulin gene 3’ enhancer HS1,2 and its relation to gene expression
se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ?
3 domande:
è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ?
nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si studiano male)
- dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ?
- hanno tempi di attivazione diversi?
le due 3’RR sono ridondanti
TOR VERGATA
- si attivano e disattivano nelle fasi diverse della vita del linfocita B?
come si possono studiare nell’uomo le 3’RRs
in vitro
in epidemiologia genetica
in patologia
perchè nell’uomo? il modello murino è parziale: una sola 3’RR
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Studio di correlazione dei polimorfismi
Che cosa possiamo andare a studiare nella struttura
La struttura regolatrice ha dei polimorfismi che coinvolgono la funzione in quanto variano i siti di legame dei fattori di trascrizione
Ad ogni forma allelica può corrispondere una diversa funzione
Studio della distribuzione degli alleli nelle diverse popolazioni
Esistono frequenze alleliche diverse nelle popolazioni umane
Internal spacers
Conserved sequence Unit
Selective amplification of HS1,2-B downstream C2 (IgH3’EC-2)
H
2m
HS 3
B B H
HS 1,2
E B
SA2.5
A2R A2F
HS1,24420 bp
ALLELE 3BP3Frw
HS1,2
D3Rev
EcoRI
ALLELE 4B
Poly A site
HPoly A site
1m
B
HS 3
B B H* B
5402 bp
SA2.5 A2R
HS1,2HS 3
Selective amplification of HS1,2-A downstream C1 (IgH3’EC-1)
ALLELE 1AHS1,2
P3Frw D3Rev
EcoRI
ALLELE 2A
ALLELE 3A
ALLELE 4A
HS 1,2
A B
BE
Core of enhancer HS1,2 External element - 31 bp
Repeated element - 38 bpExternal element -17 bp
EcoRI
EcoRI EcoRI
EcoRI
Ua1
R1 R2
U1 U5
U4U2
U3 R3 rR3
U6 U7
U8 U1 R1
U2
Ub1
UU3 4
U5
U6
R3 R3U8 r
U4-5
U7r R3r
U6r U5r
Ub2
R4
14bp 16bp 20bp
i polimorfismi
Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50)
Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)
ALLELE 1A17bp El. END HS1,2
CORE enhancer
17bp El. 38bp Rp
14bp Sp.
ALLELE 2A16bp Sp.
ALLELE 3A
ALLELE 4A
20bp Sp.
ALLELE 3B
31bp El
ALLELE 4B
Sites for : AP4; E47; MYOD; E5
Sites for : NF-kB (Q6)
Sites for : CMYB
M2M1
ALLELE 1
ALLELE 4ALLELE 3ALLELE 2
G A B G A B
CM11 CM 4 CM 5
G A B
100 bp
400 bp
200 bp
300 bp
A
B 72
114
178
198
250
250
gli alleli