Genetica MD - Curs 5 28 Octombrie 2013

GENETICA MEDICINA DENTARA

CURS 5 28 octombrie 2013

AUTOR: PROF.DR. EMILIA SEVERIN

UMF “Carol Davila” Bucuresti

CROMOZOMUL MITOTIC LA EUCARIOTE (Ek)

2

CROMOZOMUL MITOTIC LA Ek

•  Este un corpuscul colorat; •  Purtator de informatie genetic; •  Alcatuit din ADN si proteine; •  Numarul si morfologia crz. sunt:

ELEMENTE CARACTERISTICE FIECAREI SPECII

GENETICA MD

CURS 5 - A nu se copia sau distribui fara copyright

CELULA GAMETICA: n=23

CELULA HAPLOIDA

CELULA HAPLOIDA

CELULA DIPLOIDA

GENETICA MD


CELULA SOMATICA: n=46

3

ELEMENTE MORFOLOGICE SI FUNCTIONALE

COMUNE

TUTUROR CROMOZOMILOR UMANI

1. CROMATIDELE

2. CENTROMERUL

3. TELOMERELE GENETICA MD


4

CROMATIDELE

Sunt subunitati longitudinale identice , CROMATIDE-SURORI;

Sunt atasate una de cealalta la nivelul centromerului prin intermediul unui complex multiproteic (coezine);

Fiecare cromatida este impartita de centromer in doua brate, notate conventional p (bratul scurt) si q (bratul lung).

Brat scurt

p

Brat lung

q

CROMATIDE SURORI

1 cromatida = 1 molecula ADN GENETICA MD


5

CROMATIDA versus CROMOZOM

SINTEZA ADN (replicare)

CROMATIDA (cromozom monocromatidic/nereplicat)

CROMOZOM (cromozom bicromatidic/replicat)

ADN 1 MOLECULA ADN = 1 CROMATIDA ADN ADN

GENETICA MD


6

TELOMERE

ORIGINEA REPLICARII

CENTROMER

Bucla de replicare

Zone ale fusului de diviziune CROMOZOMI

REPLICATI in celulele fiice

INTERFAZA INTERFAZA MITOZA

CROMOZOMUL si CICLUL CELULAR

GENETICA MD


7

REPLICAREA CROMOZOMILOR LA EK.

In faza S de sinteza a ciclului celular

moleculele de ADN cromozomial sunt replicate pe baza

mecanismului semiconservativ, replicare care la

nivel de cromozom se manifesta prin

aparitia cromatidei sora.

REPLICAREA CROMOZOMILOR a

fost dovedita experimental.

GENETICA MD


8

In 1957 J. Herbert TAYLOR,

folosind tehnica autoradiografiei a examinat cromozomii din celulele radacinilor de VICIA FABA (2n=12)

A monitorizat procesul

replicarii prin marcarea ADN-ului din cz. cu timidina tritiata.

In acest experiment timidina marcata se gaseste numai in

cz. care contin ADN-nou sintetizat.

Autoradiografia este un procedeu citologic ce permite

localizarea izotopului radioactiv in cadrul celulei.

Vicia faba

GENETICA MD

CURS 5 - A nu se copia sau distribui fara copyright 9

REPLICAREA CROMOZOMILOR

REPLICAREA CROMOZOMILOR:

Experiment 1.

Radacinile de Vicia faba au fost tinute 8h in mediul cu timidina tritiata, mediu numit “cald”. De ce 8 ore? Pt. ca 8 ore dureaza

faza S.

2.

Radacinile au fost trecute pe un mediu “rece” care nu contine timidina tritiata ci colchicina,

care opreste celulele in metafaza si ajuta la

determinarea numarului de cicluri de diviziune.

Rezultatele obtinute au fost compatibile cu

modelul semiconservativ de replicare al ADN-ului, demonstrat de Meselson-

Stahl.

Dupa prima replicare ambele cromatide ale

cromozomilor sunt marcate (radioactive)

A II-a replicare – fiecare cz. are o cromatida “calda”

si una “rece”

A III-a replicare

– ½ din cz au o cromatida “calda” si una “rece”

– ½ au ambele cromatide “reci”

Concluzia:

Replicarea cz. are la baza mecanismul semiconservativ

GENETICA MD


10

GENERATIA I Ambele

cromatide marcate

radioactiv (galben).

GENERATIA II O cromatida marcata

radioactiv (galben) si o cromatida nemarcata

(albastru).

GENERATIA III – 50% din cz au o cromatida “calda” (marcata radioactiv – galben) si una “rece” (nemarcata radioactiv – albastru); – 50% din cz au ambele cromatide “reci”.

Fara 3H

Fara 3H

Fara 3H

Fara 3H

Fara 3H Cu

3H

EXPERIMENTUL LUI TAYLOR

GENETICA MD


11

REPLICARE I REPLICARE II REPLICARE III

Caracteristicile replicarii cromozomilor umani

Unitatea de

replicare a cz. uman este

REPLICON-ul;

Cromozomul este o unitate multirepliconica deoarece

acesta contine intre 200 - 1500 de repliconi liniari, independenti, dispusi in molecula de ADN ce

formeaza cromatida cromozomului.

Un replicon are intre 100-200 kb.

Cromozomii omologi se replica sincron (exceptie, cromozomul

X eucromatic, la femeie, care se replica precoce, iar cel

heterocromatic se replica tardiv.

Replicarea cz. este asincrona datorita distributiei diferite a

zonelor de eucromatina si de heterocromatina.

Replicarea asincrona poate fi:

- intracromozomiala: cz. 5q – devreme; 5p – tardiva;

- intercromozomiala: cz. 15, 17, X eucromatic – precoce; cz. 14 – intermediar; cz. 13, 16, 18, 21, 22, Y si X heterocromatic – tardiv

Replicarea este programata - fiecare cz. isi respecta modelul

specific de replicare.

GENETICA MD


15

Replicarea cromozomului MITOCONDRIAL

Este in acord cu particularitatile cz. mitocondrial;

(circular, alcatuit din ADN necombinat cu histone, densitatea diferita a celor 2 catene)

Are la baza mecanismul semiconservativ;

Este asincrona;

Relativ independenta fata de nucleu

(foloseste ADN polimeraza g sintetizata in nucleu).

CROMOZOM MITOCONDRIAL


GENETICA MD

16

CENTROMERUL

Segmentul cromozomial de la nivelul constrictiei

primare; - contine secvente de ADN satelit ce formeaza un bloc

de heterocromatina constitutiva la care se

fixeaza proteine specifice CENP (Centromer Proteins) si CLIP (Cytoplasmic Linker Proteins) formand in mitoza

KINETOCORUL ;

KINETOCORUL este o structura complexa, se

ataseaza ADN-ului centromeric si capteaza microtubulii fusului de

diviziune; protejeaza celula contra pierderii de

cromozomi.

FUNCTIILE CENTROMERULUI:

-- are rol in procesul de segregare normala a

cromatidelor / cromozomilor in timpul diviziunii celulare;

- adeziunea cromatidelor surori (coezina se asociaza

heterocromatinei centromerice dupa

replicarea cromozomilor).

GENETICA MD


17

ADN Centromeric

HETEROCROMATINA

KINETOCOR

Secvente inalt repetate

ADN alfa-satelit monomer 171 p.n.

MICROTUBULII FUSULUI DE DIVIZIUNE

HETEROCROMATINA formata din ADN alfa-satelit

Regiunea externa a kinetocorului formata din proteine specifice

Regiunea interna a kinetocorului formata din proteinele kinetocorice

legate de ADN alfa-satelit

CENTROMERUL

GENETICA MD


18

GENETICA MD

KINETOCOR MICROTUBULI

BRAT CROMOZOM

HETEROCROMATINA CENTROMERICA

REGIUNEA EXTERNA A KINETOCORULUI

-  Atasarea microtubulilor -  migrarea in anafaza

CENTROMER/ REGIUNEA INTERNA A KINETOCORULUI


20

CENTROMER si KINETOCOR

KINETOCOR

MICROTUBULI kinetocorici

MICROTUBULI astrali

MICROTUBULI polari

Subunitatile TUBULINEI

CENTROZOM

GENETICA MD


22

MARCAJUL C evidentiaza heterocromatina constitutiva

GENETICA MD


CENTROMER (heterocromatina

constitutiva)

23

TELOMERELE

sunt structuri specializate, formate din ADN repetitiv si proteine.

FUNCTIILE TELOMERELOR:

- mentin stabilitatea si integritatea structurala a

cromozomului .

- asigura replicarea completa a capetelor

cromozomilor.

- stabilirea arhitecturii

tridimensionale a nucleului.

GENETICA MD


24

CANCER

APOPTOZA SENESCENTA

INSTABILITATE GENOMICA

Alterari genetice multiple Activarea telomerazei

Grup nou de sindroame

*Activitatea telomerazei inceteaza la scurt timp dupa

incheierea diferentierii celulare

GENETICA MD


28

SCURTAREA TELOMERELOR

CELULA PRE-APOPTOTICA

APOPTOZA TIMPURIE

NEREGULARITATI ale MEMBRANEI

CELULARE

APOPTOZA TARZIE

CORPI APOPTOTICI

Fragmente NUCLEARE

GENETICA MD


29

TELOMERELE SI CICLUL CELULAR

SURSA: www.chrombios.com GENETICA MD


30

TIPURI DE ADN

din structura centromerului si telomerelor

TELOMER – repetitii in tandem TTAGGG (minisatelit). Marime: cateva Kb

Preferential in benzile

G +

ADN minisatelit hipervariabil (preferential in regiunile din vecinatatea telomerelor.

ADN microsatelit ( distribuitie uniforma)

CENTROMER ( tipuri variate de ADN satelit. Marime: cateva Mb. DETALII – Figura B)

Alpha-satelit Beta-satelit

Satelit 2 si 3

ADN

GENETICA MD


31

ELEMENTE MORFOLOGICE SI FUNCTIONALE

COMUNE UNOR CROMOZOMILOR UMANI

1. SATELITII 2. CONSTRICTII SECUNDARE

3. SITUSURI FRAGILE fra(Xq27.3)

GENETICA MD


32

ELEMENTE MORFOLOGICE COMUNE UNOR CROMOZOMI

A.SATELITII

Formatiuni de cromatina atasate de bratele scurte ale cz. acrocentrici. Atasarea se

face prin filamente de ADN ce contin genele de ARNr, formand organizatorii

nucleolari.

B.CONSTRICTIILE SECUNDARE

Regiuni cz. caracterizate printr-o relativa decondensare a

cromatinei, vizibila in interfaza.

C.SITUSURILE FRAGILE COMUNE (SFC)

Au aspect de lacune necolorate sau constrictii;

La acest nivel cz. se pot rupe usor atat in vivo cat si in vitro

(zone cu cromatina compacta, hipoacetilarea histonelor); Sunt

markeri normali.

GENETICA MD


33

MARCAJUL NOR (nucleolar organizing region) evidentiaza satelitii cromozomilor

GENETICA MD


34

ELEMENTE SPECIFICE FIECARUI CROMOZOM

BENZILE CROMOZOMIALE

Benzile cromozomiale

reflecta structura interna heterogena a

cz. si definesc regiuni cu structura

si functii diferite.

Prin tratamente diferite si colorantii specifici rezulta o serie continua de

benzi transversale: benzi intens

colorate/benzi slab colorate

Fiecare cz. prezinta un model

caracteristic de distributie a benzilor.

Pozitia, succesiunea, marimea si

intensitatea culorii benzilor permit

identificarea precisa a fiecarui cz.

Marimea benzilor variaza intre 5-10

Mb.

Modelul de benzi este identic pentru toate celulele unui organism si pentru toti indivizii speciei.

Benzile sunt markeri citologici ai

structurii heterogene a cz.

(gradul de compactare al

fibrei de cromatina in cz).

SUNT CORELATE CU ORGANIZAREA FUNCTIONALA A

CROMOZOMULUI !

GENETICA MD


35

BANDA Acel segment cromozomial , clar diferentiat de segmentele adiacente, avand o coloratie mai

inchisa sau mai deschisa.

REPERE SPECIFICE

- Centromerul - Unele benzi - Telomerele

REGIUNI BENZI SUB-BENZI

7q26.2

GENETICA MD


36

ELEMENTE SPECIFICE FIECARUI CROMOZOM

BENZILE CROMOZOMIALE

CARIOGRAMA :

aranjarea ordonata , dupa criterii bine stabilite,

a cromozomilor unei metafaze.

CARIOTIP

(formula cromozomiala)

descrierea alfa-numerica a

cromozomilor unei cariograme.

46,XY,t(8;15)(p23;q14)

IDIOGRAMA: reprezentare schematica

a dispozitiilor benzilor cromozomiale

CARIOGRAMA - CARIOTIP - IDIOGRAMA

GENETICA MD


37

CARIOTIPUL (CARIOGRAMA) NORMAL

aranjarea ordonata a cromozomilor unei metafaze.

Definiţie:

mărimea,

poziţia centromerului, prezenţa sateliţilor, prezenţa constricţiilor secundare,

modelul de benzi.

Criterii de aranjare:

Caracteristici:

Numărul total de cromozomi

este 46

Aranjaţi în şapte grupe de

cromozomi notate convenţional de la

A la G

Autozomii sunt numerotaţi de la 1

la 22 în ordinea descrescătoare a

mărimii

Gonozomii sunt aşezaţi separat,

la sfârşitul cariotipului.

GENETICA MD


38

GENETICA MD


CROMATIDA

Constrictie secundara

Constrictie secundara

Constrictie primara

CENTROMER

Brat scurt (p)

Brat lung (q)

CROMOZOM METAFAZIC CARIOTIP 46,XY

39

IDENTIFICAREA CROMOZOMILOR prin folosirea unor tehnici de analiza cromozomiala conventionale

1.  MARIMEA

2.  POZITIA CENTROMERULUI

3.  MODELUL DE BENZI (unic pentru fiecare cromozom)

GENETICA MD


40

LUNGIMEA CROMOZOMULUI

POZITIA CENTROMERULUI

MARI MIJLOCII MICI

metacentrici A 1-3 E 16 F 19-20

submetacentrici B 4-5 C 6-12, X

E 17-18

acrocentrici - D 13-15 G 21-22, Y

IDENTIFICAREA CROMOZOMILOR

GENETICA MD


41

marimea

modelul de benzi

pozi/a centromerului

1.marimea; 2.modelul de benzi; 3.pozitia centromerului.

GENETICA MD


42

Identificarea cromozomilor metafazici: CRITERII

DESCRIEREA SINTETICA A UNUI CARIOTIP NORMAL SAU ANORMAL

FORMULA DE BAZA CUPRINDE 3 ITEMURI:

• Precizeaza numarul de cromozomi. • Constitutia cromozomilor de sex (normala /

anormala). • Anomaliile de numar sau de structura (daca este

cazul).

De exemplu,

46,XX sau 46, XY sau 46,XX/47,XXX sau 47,XY,+21

GENETICA MD


43

TEHNICI DE ANALIZA CROMOZOMIALA

Tehnici de generatia a I-a:

asigura colorarea uniforma a cromozomilor;

Tehnici de generatia a II-a:

asigura obtinerea unui marcaj cromozomial in metafaza (marcaj Q,G,R,C,T si NOR);

Tehnici de generatia a III-a: asigura obtinerea unui marcaj cromozomial de inalta rezolutie pe cromozomi

prometafazici si metafazici;

Tehnici de generatia a IV-a: de citogenetica moleculara (FISH, MLPA, QF-PCR);

Tehnici de generatia a V-a: tehnici genomice bazate pe microretele (aCGH, SNP).

GENETICA MD


44

EXAMINAREA CROMOZOMILOR UMANI PRIN TEHNICI DE RUTINA:

TEHNICI DE GENERATIA I si II

1.Celula in INTERFAZA ciclului celular: CROMATINA SEXUALA

2. Celula in METAFAZA mitozei ciclului celular:

- Coloratia uniforma a crz. - Marcajul Q - Marcajul G - Marcajul C - Marcajul R / T - Marcajul NOR

Q

NOR R

G C

GENETICA MD


45

14 8

10

14

14 + 8 + 14 + 10 = 46

NUMARUL TOTAL DE CROMOSOMI:

CELULA SOMATICA: 2n=46 GENETICA MD


TEHNICI DE GENERATIA I coloratia uniforma a cromozomilor

46

PLACA METAFAZICA

large metacentric Metacentricii mari

Metacentricii mici

Acrocentricii mari

Acrocentricii mici

Restul crz. submetacentrici

CLASIFICAREA CROMOZOMILOR FOLOSIND: INDICELE CENTROMERIC si MARIMEA

Indice centriomeric Ic= p / p+q

GENETICA MD


47

PLACA METAFAZICA

TEHNICI DE GENERATIA III

Marcaj de inalta rezolutie

Sunt utilizati cromozomi slab

condensati caracteristici primelor

faze ale diviziunii;

Fiecare banda din crz.metafazic poate fi

subdivizata in sub-benzi;

Se identifica 550-850 benzi / genom

haploid.

*Fiecare banda are ~ 5 Mb = limita maxima de rezolutie in citogenetica conventionala.

GENETICA MD


48

CARIOTIP uman normal 46,XX – marcaj cromozomial G

A B

C

D E

F G

GENETICA MD


50

ADN tinta

SONDA

DENATURARE

HIBRIDIZARE

SONDA centromerica

SONDA wpc M-FISH

FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation)

[email protected]

SONDA locusspecifica

GENETICA MD


51

SONDA si tipul de secventa ADN

SONDA centromerica SONDA specifica unui locus dat

SONDA specifica unui cromozom SONDA telomerica

52

GENETICA MD


ARANJAREA CROMOZOMILOR in CARIOTIP

53 MARCAJ G M-FISH (Multiplex FISH)

INDICATII PENTRU ANALIZA CROMOZOMILOR

Analiza cromozomilor este utilă în următoarele situaţii:

PRENATAL

Sarcină în cazul unei femei cu o vârstă care depăşeşte 40 de ani;

Sexul fătului în cazul unor boli genetice legate de cromozomul X.

NEONATAL

Moarte neonatală;

Malformaţii congenitale;

Organe genitale ambigue;

Suspiciune de sindrom cromozomial.

GENETICA MD


54

INDICATII PENTRU ANALIZA CROMOZOMILOR

Analiza cromozomilor este utilă în următoarele situaţii:

ADOLESCENTA

Amenoree primară;

Retard al creşterii, statură mică.

ADULT

infertilitate, avorturi spontane repetate;

Handicap mintal;

Anumite tulburări maligne (leucemie);

Screening în cazul persoanelor care au rude cu tulburări cromozomiale cunoscute.

GENETICA MD


55

CLASIFICAREA SI NOMENCLATURA CROMOZOMILOR UMANI

•  Se utilizeaza criterii precis stabilite (ISCN).

IDENTIFICAREA CROMOZOMILOR SE FACE

PE BAZA MORFOLOGIEI CROMOZOMILOR

GENETICA MD


57

INTERNATIONAL SYSTEM of HUMAN CYTOGENETIC NOMENCLATURE – ISCN, 2013

versus

GENETICA MD


58

SIMBOLUL SEMNIFICATIE p Bratul scurt al cromozomului

q Bratul lung al cromozomului

cen centromer

ter terminal

A - G Grupe cromozomiale

1 - 22 Numerele perechilor de autozomi umani

X, Y Cromozomii sexului (gonozomi sau heterozomi)

Simboluri folosite pentru descrierea cariotipului (ISCN, 2009)

GENETICA MD


59

HETEROMORFISMUL CROMOZOMIAL UMAN

Sunt rare în populaţie;

(mai frecvente la cuplurile cu avorturi spontane repetate sau in grupul persoanelor cu retard mental)

Se moştenesc mendelian.

Aceste variaţii individuale nu au nici un efect fenotipic nefavorabil şi evident pentru individ –

NU AU EXPRESIE FENOTIPICA.

Defineste variatiile morfologice ale unor regiuni cromozomiale prezente la

indivizi din populatia generala;

GENETICA MD


60


WYANDT & TONK , 2004 Kluwer Academic Publisher

Regiunile cromozomiale variabile morfologic sunt zone de heterocromatina variabile ca marime si inactive genetic.

In citogenetica umană variaţiile morfologice

individuale sunt utilizate ca markeri genetici pentru identificarea

anumitor cromozomi.

GENETICA MD


61


Cromozomul marker este un cromozom diferit morfologic de omologul său.

SURSA: Tchinda & Lee, Bio Technique 2006, vol.14: 385-392

GENETICA MD


62

La om, au fost evidenţiate patru tipuri de regiuni

variabile: 1.Marimea variabila a regiunii heterocromatice a

cromozomului Y;

2.Regiunile pericentromerice ale tuturor cromozomilor

implicând mărirea heterocromatinei

adiacente centromerului.

3.Polimorfismul marimii si numarului satelitilor;

4.Situs-urile fragile induse de antifolati.


GENETICA MD


63

De exemplu:

Constricţia secundară prezenta pe bratul q al cromozomilor 1, 9 si 16 poate fi alungită (are o lungime dublă faţă de omolog) sau diminuată. Se notează astfel: 9qh+ sau 9qh-;

Variaţii dimensionale ale braţului q al cromozomului Y (10% din bărbaţii normali clinic). De exemplu, Yq+ (mai mare decât q al cromozomului 19) sau Yq- (mai mic decât q al cromozomului 22). Cromozomul Y foarte foarte mic favorizează nondisjuncţiile în meioza paternă.


GENETICA MD


64

PATOLOGIA CROMOZOMIALA IN CLINICA SI IN LABORATOR

CROMOZOMUL Philadelphia

CROMOZOMUL 21

CROMOZOMUL X

GENETICA MD


65

Pentru ilusrarea experimentelor si a mecanismelor moleculare prezentate s-au preluat imagini din domeniul public.

SURSE: http://images.google.com www.google.com http://www.juliantrubin.com/bigten/dnaexperiments.html http://nucleus.cshl.org/CSHLlib/DNAinNY/Case5/Case_5.htm http://www.allometric.com/tom/courses/bil255/bil255goods/09_dna.html https://wikispaces.psu.edu/display/230/DNA+and+Chromosomes https://deltawire.delta.ncsu.edu/around-campus/making-metabolism-easier-to-digest/

Pentru clarificarea unor probleme legate de tematica

predata la curs se pot trimite intrebari la adresa: [email protected]

CURS 5 - A nu se copia sau distribui fara copyright ES

http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/transcription.swf

REFERINTE ELECTRONICE

66

http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch11/

NE REVEDEM :

LUNI 11

noiembrie

Documents

Genetica MD - Curs 5 28 Octombrie 2013