1

Genetica – definiŃie, obiect de studiu

Genetica, definită succint, este ştiinŃa eredităŃii şi variabilităŃii organismelor. Termenul genetică provine din grecescul “gennaein” care înseamnă “a naşte”.

Ereditatea (latinescul hereditas = moştenire) este o însuşire esenŃială a organismelor, care denotă asemănarea dintre părinŃi şi urmaşi. Indiferent de gradul de evoluŃie al organismelor (procariote sau eucariote) informaŃia genetică este codificată în acizii nucleici (ADN sau ARN), care intră în structura cromozomilor părinŃilor, iar în urma proceselor de replicaŃie, de tip semiconservativ este transmisă la descendenŃi.

Diviziunea celulară, replicaŃia acizilor nucleici, transcripŃia şi translaŃia informaŃiei genetice asigură constanŃa şi continuitatea caracterelor ereditare. Ereditatea este influenŃată, într-o oarecare măsură de factorii de mediu şi în urma acestor interacŃiuni apar deosebiri de ordin calitativ sau cantitativ între indivizii aceleiaşi unităŃi sistematice, totalitatea acestora fiind denumită variabilitate.

Variabilitatea este determinată pe de o parte de factorii genetici (mecanismele de recombinare intra şi intercromozomice, mutaŃiile), dar şi de factorii de mediu (fizici, chimici, biologici). Dacă în primul caz putem afirma că variaŃiile genetice se transmit cu mare fidelitate la urmaşi variaŃiile determinate de factorii de mediu pot provoca modificări temporare, care de obicei nu se transmit în descendenŃă.

Amploarea cercetării de genetică, mai ales de genetică moleculară depăşeşte orice imaginaŃie.

Astfel, genetica a realizat o coeziune a tuturor ştiinŃelor biologice, prin tratarea unitară a sistemului ereditar.

Metodele de cercetare folosite în genetică

Simplele observaŃii asupra modului de transmitere a caracterelor şi însuşirilor ereditare

au generat o multitudine de ipoteze care încercau să explice în diferite moduri, ereditatea şi variabilitatea organismelor vii.

IniŃierea, perfecŃionarea metodelor şi tehnicilor de cercetare specifice au determinat apariŃia şi extinderea geneticei ca ştiinŃă, în rândul celorlalte ştiinŃe biologice.

Principalele metode de cercetare folosite în genetică sunt: metoda hibridologică, metoda biometrică, metoda analizei genealogice, metoda citogenetică, metoda biochimică şi biofizică, metoda ontogenetică, metoda ADN – recombinat.

Metoda hibridologică constă în încrucişarea dintre indivizi ce posedă caractere ereditare distincte, urmată de analiza modului de manifestare a acestora la indivizii din diferite generaŃii. În generaŃiile segregante se analizează statistic modul de manifestare a caracterelor luate în studiu. Hibridarea s-a utilizat de multă vreme ca metodă de obŃinere a unor forme noi, dar bazele teoretice ale acesteia au fost stabilite de Johann Gregor Mendel de aceea metoda se mai numeşte analiză genetică mendeliană.

Indivizii ce urmează a se încrucişa sunt studiaŃi în prealabil, câteva generaŃii pentru a vedea dacă caracterele luate în studiu se transmit constant, cu alte cuvinte, dacă organismele sunt homozigote.

Metoda biometrică – această metodă s-a extins în analiza modului de transmitere al caracterelor cantitative în cadrul unui grup de indivizi.

Pe baza măsurătorilor biometrice (mărime, talie, greutate, cantitate de lapte, număr de ouă) se calculează o serie de valori biometrice care dau indicaŃii importante privind: interacŃiunea genotip – mediu în exprimarea fenotipului, tipurile de interacŃiuni genice corelaŃiile dintre diferite caractere, gradul de repetabilitate a acestora pe parcursul mai multor generaŃii.

2

Metoda citogenetică – studiază componenŃii celulari implicaŃi în ereditate în mod direct (cromozomii, plastidele, mitocondriile, plasmidele) şi efectul unor agenŃi mutageni asupra acestor componenŃi.

Cercetările de citogenetică corelează modificarea materialului genetic la nivel celular, cu modificările caracterelor ereditare ale organismelor aducând numeroase informaŃii privind activitatea genelor, grupelor de gene, a cromozomilor sau altor componente celulare.

Metoda biofizică şi biochimică. Arhitectura structurală deosebit de complexă a moleculelor de ADN şi ARN de diferite tipuri a fost descifrată prin metode biofizice şi biochimice.

PerfecŃionarea microscopului electronic, izolarea componentelor prin ultracentrifugare analizelor prin autoradiografie, microcinematografie, analiza componenŃei atomice, moleculare şi spaŃiale ale acizilor nucleici sunt realizări recente ale biofizicii şi biochimiei.

Metoda biofizică şi biochimică studiază şi efectul diverşilor agenŃi mutageni asupra materialului genetic, vorbindu-se frecvent de o genetică a radiaŃiilor.

Metoda ADN – recombinat constituie cea mai modernă metodă de studiu a geneticii, care reuneşte cele mai rafinate tehnici de lucru pentru izolarea moleculelor acizi nucleici, a unor segmente din aceştia şi realizarea de molecule hibride. Izolarea genei, sinteza artificială a genei, inserŃia genelor într-o serie de vectori (virusuri şi plasmide), transferul genelor de la o specie la alta sunt realizări recente ale unui nou domeniu al geneticii, ingineria genetică. Acestui domeniu aparŃin şi tehnicile de manipulare a celulelor, embrionilor şi Ńesuturilor care pe medii nutritive în condiŃii aseptice, pot fi înmulŃite reproducând fie clone celulare sau organisme întregi (la plante).

Materialul de cercetare în genetică În cercetarea eredităŃii caracterelor o importanŃă deosebită îl are materialul cu care

experimentăm. Alegerea lui se face în funcŃie de scopul cercetării. Sunt câteva condiŃii generale de care trebuie să Ńinem seama în alegerea acestui material:

- să prezinte caractere distincte, uşor de precizat şi urmărit, la părinŃi şi la urmaşi. - să aibă ciclul de viaŃă scurt. - să producă mulŃi urmaşi. - să producă mutaŃii uşor - să menŃină în descendenŃă caracterele şi însuşirile ce ne interesează. Dintre mamifere, se folosesc mult şoarecii, care au ciclul de dezvoltare de numai 2,5

luni şi sunt destul de prolifici. Dintre insecte, a fost folosită foarte mult musculiŃa de oŃet (Drosophila melanogaster). Aceasta se înmulŃeşte repede, mutează foarte uşor, are puŃini cromozomi (2n = 8), iar

în glandele salivare conŃine cromozomi gigantici. O importanŃă deosebită s-a acordat bacteriilor şi virusurilor, care au ciclul de viaŃă

foarte scurt în funcŃii limitate, uneori numai la cea de reproducere şi infecŃiozitate. Genetica moleculară şi-a clădit descoperirile cu privire la structura macromoleculară a acizilor nucleici, procesele biochimice ce stau la baza substratului material al eredităŃii, structura fină a genei folosind virusurile şi bacteriile ca material de studiu.

Pentru genetica animală s-a găsit un model ideal în nematodul Caenorhabdites

elegans. .adulŃii au aproximativ 1mm, o generaŃie se realizează într-un ciclu de 3 zile, necesită condiŃii simple de creştere, produce un număr mare de descendenŃi (200-300), indivizii sunt alcătuiŃi din exact 959 celule, dintre care 300 de neuroni.

3

Bazele mendelismului În anul 1865, profesorul de ştiinŃe naturale Gregor Mendel (1822 – 1884), cel care va

fi numit mai târziu părintele geneticii prezintă în cadrul SocietăŃii de Istorie Naturală din Brno, rezultatele cercetărilor sale privitoare la hibridarea plantelor. În experienŃele sale, efectuate pe diferite soiuri de mazăre, el a studiat statistic variabilitatea caracterelor la descendenŃi, timp de 5-6 generaŃii şi a interpretat matematic rezultatele obŃinute.

Gregor Mendel a elaborat teoria factorilor ereditari, sinteză a celor 2 legi ale eredităŃii: legea segregării caracterelor (legea purităŃii gameŃilor) şi legea segregării independente a

perechilor de caractere (legea liberei combinaŃii a factorilor ereditari). La începutul secolului XX aceste legi au fost redescoperite de către Hugo de Vries (Olanda), Carl Correns (Germania) şi Erich Tschermak (Austria).

Terminologia folosită în genetica mendeliană

În cercetările sale Gregor Mendel a luat în studiu următoarele caractere la mazăre: talia

plantelor (înaltă sau pitică), culoarea păstăilor (verde sau galbenă), suprafaŃa seminŃelor (netedă sau zbârcită), culoarea tegumentului boabelor (albă sau cenuşie), poziŃia florilor (axială sau terminală), forma păstăilor (dreaptă sau gâtuită între seminŃe).

Aceste perechi de caractere au fost numite mai târziu alelomorfe, din care a rezultat termenul de alele. DeterminanŃii ereditari au fost numiŃi şi factori ereditari (indicaŃii ulterior prin noŃiunea de genă).

Hibridarea este încrucişarea între 2 indivizi care se deosebesc prin una sau mai multe perechi de caractere. Hibridul este rezultatul hibridării. PărinŃii (genitorii) se notează cu P (parentes = părinŃi), iar urmaşii se notează cu F (filii=copii).

În funcŃie de numărul de perechi de caractere prin care se deosebesc părinŃii, există mai multe tipuri de hibridare: monohibridare (o pereche de caractere), dihibridare (2 perechi de caractere) etc.

În genetica modernă factorii ereditari ai lui Mendel au fost înlocuiŃi prin termenul de genă. Gena este unitatea elementară ce deŃine informaŃia genetică a unui caracter ereditar transmis de la părinŃi la urmaşi. Gena ocupă un loc precis în cromozom numit locus.

În celulele somatice, cromozomii omologi, unul de origine maternă, celălalt de origine paternă vor avea şi loci omologi, ocupaŃi de gene alele. Dacă alelele sunt identice (AA sau aa) indivizii se numesc homozigoŃi pentru această pereche de caractere, iar când alelele sunt diferite (Aa), indivizii sunt consideraŃi heterozigoŃi.

Ereditatea mendeliană presupune, în principal interacŃiunea dominanŃă – recesivitate între genele alele; alela care se manifestă fenotipic la hibrizi F1 este dominantă, iar perechea sa, care nu se exteriorizează este recesivă. Hibridările, de orice nivel, oferă posibilitatea unei duble analize: sub aspect genotipic şi sub aspect fenotipic.

Genotipul = totalitatea genelor unui individ (constituŃia genetică a acestuia). NoŃiunea de genotip se utilizează şi în sens restrâns, numai pentru una sau câteva perechi de gene alele (AA, Aa, aa, AaBb)

Fenotipul = totalitatea caracterelor morfologice, fiziologice, biochimice şi comportamentale ale individului, care rezultă din interacŃiunea genotipului cu mediul.

Legile mendeliene ale eredităŃii

Legea segregării caracterelor (legea purităŃii gameŃilor) Gregor Mendel a efectuat un număr impresionant de hibridări (monohibridări,

dihibridări şi trihibridări) la mazăre (Pisum sativum). Segregarea caracterelor ereditare a fost

4

formulată, în urma analizei fenotipice şi genotipice a unor monohibridări, dar poate fi demonstrată şi-n cazul celorlalte tipuri de hibridare.

Gregor Mendel a încrucişat o varietate de mazăre cu seminŃe galbene cu o varietate cu seminŃe verzi, ambele homozigote (pure din punct de vedere genetic). În generaŃia F1 au rezultat numai plante cu seminŃe galbene. Caracterul culoare galbenă a fost numit dominant, iar perechea sa culoare verde, recesiv (recessere = ascuns).

În urma autofecundării plantelor din F1 a rezultat generaŃia F2 în care s-au obŃinut 2 grupe fenotipice: 75% seminŃe galbene şi 25% seminŃe verzi, prin urmare un raport de segregare fenotipică de 3:1.

Mendel a explicat segregarea caracterelor factorilor ereditari astfel: în celulele somatice factorii ereditari se găsesc sub formă de pereche (AA, Aa ,aa). În urma meiozei, factorii ereditari segregă, astfel că gameŃii vor avea numai câte un singur reprezentant din fiecare pereche (A sau a), deci sunt puri din punct de vedere genetic.

PărinŃii homozigoŃi (AA şi AA) vor produce câte un singur tip de gameŃi (A sau a). În generaŃia F1 toŃi indivizii sunt identici fenotipic şi genotipic (Aa).

Indivizii generaŃiei F1, heterozigoŃi, vor forma 2 tipuri de gameŃi pentru fiecare sex: 50% A şi 50% a. Combinarea probabilistică a gameŃilor de sex diferit face ca în F2 să rezulte 3 combinaŃii genotipice, 25% AA, 50% Aa şi 25% aa (raport de segregare genotipică (1:2:1) şi 2 grupe fenotipice 75% seminŃe galbene şi25% seminŃe verzi (raport de segregare fenotipică 3:1).

Mendel a efectuat monohibridări şi cu alte perechi de caractere constând acelaşi lucru: în generaŃia F1 au rezultat indivizi asemănători unui părinte, iar în generaŃia F2, segregarea s-a realizat într-un raport de 3 dominant : 1 recesiv.

După redescoperirea legilor mendeliene, imediat după anul 1900, s-au realizat monohibridări şi la diferite specii de animale. ObŃinându-se rezultate asemănătoare celor de la plante, s-a demonstrat universalitatea legilor mendeliene.

În 1901, Bateson a încrucişat diferite rase de găini, care se deosebeau prin forma crestei. Formele tip “mazăre” şi “trandafir” sunt dominante faŃă de forma simplă, iar în generaŃia F2 segregarea s-a produs în raport de 3:1. La fel, zoologul francez L. Cuénot (1902) a încrucişat şoareci de culoare gri (caracter dominant) cu şoareci de culoare albă (caracter recesiv) şi a obŃinut în F1 numai indivizi de culoare gri. Prin împerecherea indivizilor din F1 între ei, în F2 raportul de segregare fenotipică a fost de 75% şoareci de culoare gri şi 25% şoareci de culoare albă, adică 3:1.

Legea segregării independente a perechilor de caractere

Această lege a rezultat din observaŃiile efectuate de Mendel asupra modului de

transmitere a caracterelor în cursul dihibridărilor şi polihibridărilor. ExperienŃa de dihibridare efectuată de Mendel la mazăre, devenită clasică, a fost

cea în care s-a încrucişat mazărea cu bobul de culoare galbenă şi formă netedă (caractere dominante – G şi N) şi mazărea cu bobul verde şi formă zbârcită (caractere recesive determinate de alelele în doză dublă gg şi nn). În F1 toate plantele au avut boabe galbene şi formă netedă. În acelaşi timp, hibrizii din F1 poartă în genotipul lor şi alelele corespunzătoare recesive, fiind GgNn.

Prin autofecundarea dihibrizilor F1 s-a obŃinut generaŃia F2, cu un total de 556 boabe de următoarele 4 categorii fenotipice: 315 galbene şi netede, 101 galbene şi zbârcite, 108 verzi şi netede şi 32 verzi – zbârcite, adică raportul de 9:3:3:1.

Rezultatele apărute în F1 şi F2 se explică astfel: dihibrizii din F1, GgNn au produs nu numai gameŃi GN şi gn (adică caracterele parentale), ci şi gameŃi cu o altă asociere a celor 2 gene, respectiv Gn şi gN (galben - zbârcit şi verde - neted). Acest lucru se întâmplă pentru că aceste perechi de caractere ale părinŃilor, determinate de perechi de gene aflate pe cromozomi diferiŃi, se moştenesc nu numai împreună, dar şi despărŃite, segregate. Mai mult,

5

genele respective (G şi N) precum şi alelele lor (g şi n) se transmit nu numai independent la descendenŃi, dar se produce şi o asociere liberă între ele.

Prin urmare, orice dihibrid din F1 formează 4 tipuri de gameŃi atât la sexul ♂ cât şi la sexul ♀ şi anume: GN, Gn, gN şi gn.

Deoarece întâlnirea fiecărui tip de gamet femel cu fiecare tip de gamet ♂ are loc la întâmplare se obŃin 16 tipuri de zigoŃi, care grupaŃi după fenotip, dau 4 categorii în raport de segregare de 9:3:3:1. După genotip, se grupează în 9 categorii în raport de segregare de 1:2:2:4:1:2:1:2:1.

Cercetările de dihibridare la animale au dus la obŃinerea unor rezultate identice cu cele obŃinute la plante.

Astfel, dacă la bovine (Bos taurus) se urmăresc 2 perechi de caractere – caracterul de culoare al părului şi modul de distribuire al culorii pe corp – se observă că din împerecherea exemplarelor de culoare neagră uniformă (caractere dominante) cu exemplarele roşii bălŃate (caractere recesive) se obŃin în F1 numai produşi de culoare neagră uniformă. Prin împerecherea indivizilor din F1 între ei, produşii din F2 prezintă 4 categorii fenotipice şi anume: negru – uniform, roşu – uniform, negru – bălŃat şi roşu-bălŃat, în raport de 9:3:3:1.

FaŃă de fenotipurile părinŃilor, 2 fenotipuri sunt noi: negru – bălŃat şi roşu – uniform ceea ce demonstrează asocierea independentă a caracterelor.

La aceeaşi specie, din împerecherea indivizilor de culoare neagră fără coarne (caractere dominante) cu indivizi de culoare roşie cu coarne (caractere recesive), sunt cele caracteristice unei dihibridări pentru F1 şi F2.

- în F1 – 100% indivizi culoare neagră fără coarne - în F2 – 9/16 negru fără coarne (ambele caractere dominante)

3/16 negru cu coarne (1 caracter dominant, al 2-lea recesiv) 3/16 roşii fără coarne (1 caracter recesiv, al 2-lea dominant) 1/16 roşii cu coarne (ambele caractere recesive).

Aceleaşi fenomene de segregare şi transmitere independentă a caracterelor s-au remarcat şi în experienŃele de polihibridare. În acest caz de experienŃă pentru o trihibridare, dacă părinŃii au genotipurile AABBCC şi aabbcc, hibridul din F1 cu genotipul AaBbCc va forma 8 tipuri de gameŃi: ABC, Abc, AbC, Abc, aBc, abC, aBC, abc.

În F2 rezultă 8 fenotipuri în raport de 27:9:9:9:3:3:3:1, respectiv 64 combinaŃii genotipice.

Probabilitatea şi raporturile mendeliene de segregare Pe baza legilor eredităŃii elaborate de Mendel se pot indica rezultatele care se

obŃin într-o hibridare. Raporturile mendeliene de segregare depind de numărul perechilor de caractere.

Astfel, la monohibridare, raportul fenotipic în F2 este de 3:1, la dihibridare de 9:3:3:1, la trihibridare de 27:9:9:9:3:3:3:1 şi aşa mai departe. Începând cu generaŃia F3 aceste raporturi se calculează Ńinându-se seama de homozigoŃia şi heterozigoŃia indivizilor, heterozigoŃii fiind singurii care segregă în descendenŃă.

Dacă se analizează termenii care alcătuiesc raporturile de segregare se observă că ei se obŃin prin ridicarea binomului (3+1) la puterea numărului perechilor de caractere (3+1)1, (3+1)2, (3+1)3. Pentru n perechi de caractere, binomul se ridică la puterea n (3+1)n.

Odată cu creşterea numărului de perechi de gene alele implicate într-o hibridare, creşte şi numărul de clase fenotipice, genotipice şi numărul combinaŃiilor posibile între Fiecare pereche de alele, adăugată la o încrucişare, măreşte de 2 ori numărul claselor fenotipice, de 3 ori numărul de clase genotipice şi de 4 ori numărul combinaŃiilor posibile ale gameŃilor produşi de hibrizii din F1.

Numărul tipurilor de gameŃi, fiecare cu alt conŃinut genetic se calculează cu formula 2n(n = numărul perechilor de caractere): monohibridare – 21→2 tipuri

6

dihibridare - 22→4 tipuri trihibridare - 23→8 tipuri

Rezultatele obŃinute în diferite tipuri de hibridări pot fi anticipate, dacă se aplică o regulă simplă de calcul a probabilităŃilor: şansa apariŃiei concomitente a 2 fenomene independente este egală cu produsul probabilităŃilor lor separate:

- la monohibridare -3/4 netede -3/4 galbene -1/4 zbârcite -1/4 verzi =>3/4 x 3/4 = 9/16 – boabe netede şi galbene 3/4 x 1/4 = 3/16 – boabe netede şi verzi 1/4 x 3/4 = 3/16 – boabe zbârcite şi galbene 1/4 x 1/4 = 1/16 – zbârcite şi verzi

Încrucişarea analizatoare (retroîncrucişarea)

În încrucişările mendeliene, fenotipul descendenŃelor poate fi prevăzut din

genotipul părinŃilor, ştiind care sunt genele care determină caractere dominante şi care sunt genele care determină caractere recesive.

Astfel, la oaie (Ovis aries), în cadrul rasei Merinos, părinŃii care posedă în genotipul lor gena pentru culoare albă dominantă a lânii (A) va da numai descendenŃi cu lână albă. De asemenea, părinŃii care posedă gena pentru culoare neagră recesivă a lânii în doză dublă (aa) vor da numai descendenŃi cu lână neagră.

Se pune însă întrebarea dacă este posibil să se determine genotipul unui individ pornind de la fenotipul său.

Această posibilitate este deosebit de importantă pentru practică (în lucrările de ameliorare) când este necesar să cunoaştem dacă lucrăm cu indivizi heterozigoŃi sau homozigoŃi pentru un anumit caracter urmărit.

Datorită fenomenului de dominanŃă nu se poate spune dacă un individ este homozigot sau heterozigot pentru o anumită genă dominantă, deoarece sub acelaşi fenotip se poate ascunde fie un genotip AA, fie Aa.

De aceea, în scopul cunoaşterii exacte a genotipului unui hibrid se recurge la retroîncrucişare (backcross), când se încrucişează hibridul F1 cu un membru al generaŃiei parentale (individ de tip parental).

Pentru forme parentale AA şi aa, indivizii din F1 sunt toŃi Aa. retroîncrucişarea unui individ Aa se face cu o formă parentală aa (homozigotă recesivă), caz în care descendenŃa va segrega fenotipic în 2 categorii în proporŃie de 1:1.

În cazul unei dihibridări, segregarea va fi în raport de 1:1:1:1. Deci, de regulă, încrucişarea analizatoare este o retroîncrucişare între un individ

cu genotip necunoscut şi un individ cunoscut ca homozigot recesiv pentru gena urmărită, cu scopul de a determina dacă individul în discuŃie este heterozigot sau homozigot pentru o anumită genă (testcross).

În concluzie, ori de câte ori într-un testcross rezultă o uniformitate fenotipică, individul de analizat este homozigot dominant şi ori de câte ori rezultă o segregare fenotipică de 1:1, individul monohibrid de analizat este heterozigot.

Revenind la exemplul cu oile Merinos cu lână albă, pentru a depista berbecii cu lână albă, dar genotip heterozigot, răspândind alela a pentru lână neagră şi impurificând turma, este necesar să se împerecheze masculul suspect cu lână albă cu o femelă homozigotă recesivă aa, deci cu lână neagră.

În cazul în care se produc în urma încrucişării numai miei cu lână albă, se poate afirma cu cea mai mare posibilitate că berbecul analizat este homozigot şi va fi păstrat în turmă pentru reproducŃie.

7

Dacă în urma retroîncrucişării se obŃin miei cu lână albă, dar şi mici cu lână neagră în raport de 1:1, se poate afirma cu siguranŃă că berbecul testat este heterozigot şi el trebuie eliminat din turmă.

Încrucişarea analizatoare dezvăluie starea genotipică nu numai pentru monohibrizi, ci şi pentru dihibrizi sau polihibrizi.

În afară de aflarea genotipului unui individ cu fenotip dominant, testcross-ul este extrem de util pentru a stabili dacă 2 gene se plasează pe acelaşi cromozom sau pe cromozomi diferiŃi (fenomen de linkage).

Abateri de la raporturile mendeliene de segregare fenotipică

De regulă, raporturile mendeliene de segregare din F2 (3:1, 9:3:3:1, etc.) s-au găsit şi se găsesc în continuare potrivit previziunilor.

Totuşi, în plus faŃă de aceste raporturi, experienŃele efectuate după Mendel au relevat apariŃia unor categorii de fenotipuri deosebite şi în alte proporŃii decât cele arătate de Mendel.

Aceste abateri de la raporturile mendeliene de segregare, aparente sau reale, nu numai că nu s-au opus principiilor lui Mendel, dar s-au extins şi au contribuit la dezvoltarea geneticii mendeliene.

Principala cauză a nerespectării a cestor raporturi mendeliene de segregare constă în interacŃiunea genelor.

InteracŃiunea genică, reprezintă fenomenul prin care o genă, prin efectul său, influenŃează în diferite grade, chiar până la anulare, efectul unei alte gene. Unele din aceste interacŃiuni se manifestă numai între genele alele, iar altele au loc şi între gene nealele (situate în loci diferiŃi).

InteracŃiuni alelice

InteracŃiunile alelice se manifestă sub forma dominanŃei incomplete

(semidominanŃa), codominanŃei, supradominanŃei, genelor letale şi fenomenului de polialelie. 1. DominanŃa incompletă (ereditate de tip Zea)

Efectuând experienŃe de monohibridare la speciile de plante Mirabilis jalapa (barba împăratului.) botanistul german Carl Correns a obŃinut rezultate diferite de cele ale lui Mendel, atât în F1 cât şi în F2. Astfel, încrucişând un soi de Mirabilis jalapa cu flori roşii (AA) cu un soi cu flori albe (aa) el a obŃinut în F1 doar plante cu flori roz, culoare intermediară părinŃilor (Aa).

Prin autofecundarea hibrizilor din F1, Correns a realizat în F2 trei categorii fenotipice: 25% indivizi cu flori roşii, 50% indivizi cu flori roz şi 25% indivizi cu flori albe. Deci, raportul de segregare fenotipică în F2 este de 1:2:1 şi nu 3:1. În acest caz raportul de segregare genotipică este identic cu raportul de segregare fenotipică. Prin urmare, gena A nu se manifestă ca total dominantă asupra alelei a, cele 2 gene manifestându-se cu intensitate egală (semidominanŃă). Rezultate identice au fost obŃinute şi la animale. Astfel, la găinile de Andaluzia, unii indivizi sunt de culoare neagră, alŃii de culoare albă, iar alŃii de culoare gri – albăstruie. Cei de culoare gri – albăstruie se obŃin din încrucişarea unui părinte de culoare neagră cu un părinte de culoare albă. Aşadar hibrizii din F1 prezintă un penaj de culoare diferită de cea a ambilor părinŃi. În generaŃia F2 se obŃin 25% indivizi de culoare neagră, 50% indivizi de culoare gri – albăstruie şi 25% indivizi de culoare albă, în raport de 1:2:1.

2. SupradominanŃa

8

Uneori, efectul unei gene este mai mare atunci când acŃionează în stare heterozigotă decât în stare homozigotă dominantă. Deci şi la plantele şi la animale există gene dominante care atunci când sunt cuplate într-un genotip heterozigot (Aa) au o activitate mult superioară faŃă de cazul când acestea se găsesc în stare homozigotă AA. În această situaŃie, fenotipul heterozigotului nu va mai fi acelaşi cu a homozigotului dominant.

Pentru majoritatea speciilor de animale, supradominanŃa este evidentă în cazul unor caracteristici fiziologice: robusteŃe, vigoare, viabilitate, dar şi morfologice: talia.

Împerecherea între indivizi homozigoŃi cu manifestări relativ slabe ale unor astfel de caracteristici au produs hibrizi heterozigoŃi care au prezentat o variabilitate, o vigoare şi o productivitate superioară formelor parentale fenomenul fiind denumit heterozis.

3. CodominanŃa

Este interacŃiunea dintre 2 gene alele, care în stare heterozigotă, ambele sunt funcŃionale, rezultând un fenotip nou.

Această interacŃiune poate fi considerată un tip particular de dominanŃă în care genele A şi a sintetizează proteine diferite ca structură şi funcŃie, însă la indivizii heterozigoŃi vor fi prezente ambele proteine, determinând un nou fenotip.

Un exemplu clasic de dominanŃă îl întâlnim în cazul determinismului genetic al grupelor sanguine la om şi mamifere în sistemul ABO.

Cele 4 tipuri de grupe sanguine la om (O, A, B, AB) sunt determinate de 3 gene alele notate LA, LB şi l. Genele LA şi LB sunt dominante asupra genei l, însă când se găsesc în acelaşi genotip, ambele sunt funcŃionale, rezultând un nou fenotip, respectiv grupa de sânge AB.

Genele letale Alelele letale sunt mutante dominante sau recesive care în stare homozigotă

provoacă moartea indivizilor. Fenomenul de letalitate schimbă proporŃia în care are loc segregarea caracterelor în urma hibridărilor.

La încrucişarea unor şoareci de culoare galbenă, Cuenot a obŃinut în F1, pe lângă indivizii de culoare galbenă şi indivizi de culoare neagră, într-un raport de 2:1.

ExplicaŃia dată arată că faŃă de raportul genotipic 1:2:1, lipsesc ¼ din genotipuri şi respectiv fenotipuri, a căror zigoŃi au murit înainte de naştere.

Şoarecii de culoare galbenă sunt întotdeauna heterozigoŃi. Notând: Ay – gena letală

a – gena normală O problemă de letalitate ce preocupă pe zootehnicieni se referă la oile brumării

din rasele Karacul şi łurcană. Din împerecherea între ei a indivizilor din oile brumării, întotdeauna rezultă atât miei de culoare brumărie cât şi miei de culoare neagră.

Din mieii brumării, o parte mor după naştere la diferite vârste până la 1 an. Deci ¼ din indivizi (homozigoŃi dominanŃi) mor.

Alături de gene letale dominante pot exista şi gene letale recesive, care de asemenea provoacă moartea descendenŃilor. La plante, se cunosc asemenea gene recesive, care în stare homozigotă împiedică formarea clorofilei, fără de care o plantă nu poate supravieŃui.

5. Polialelia (alelismul multiplu) Acest fenomen apare în cazul când în exprimarea unui anumit caracter există

mai multe gene alele decât 2, care pot fi plasate în acelaşi locus pe cromozom dar la indivizi diferiŃi.

Polialelia determină variaŃii ale aceluiaşi caracter pentru o anumită populaŃie din codul aceleiaşi specii.

Genele alele apar prin mutaŃie de gene originară sau “tipul sălbatic”, cu care ocupă acelaşi locus. Alela de “tip sălbatic” se consideră dominantă şi se notează cu A sau cu

9

a*. Seria de alele care apare prin mutaŃie se notează cu aceleaşi litere la care se adaugă un indice (fie cifre, fie litere) a1,a2,a3… S-a constatat că într-o serie de alele raportul de dominanŃă (recesivitate) este determinat de ordinea apariŃiei lor.

Seria de alele pentru culoarea ochilor la Drosophila melanogaster – a fost pusă în evidenŃă de T. Morgan şi colaboratorii săi. Tipul sălbatic are ochi de culoare roşie determinată de alela normală w+. S-a constatat că descendenŃii homozigoŃi au ochi de culoare foarte diferită, cu o intensitate care variază între roşu şi alb. Diferitele nuanŃe se manifestă recesiv: ww – roşu intens; wbl – roşu sângeriu; wch – roşu vişiniu; wh – culoarea mierii; wp – culoarea perlei; wi – alb – fildeş; w – alb.

InteracŃiuni nealelice

1. Epistazia

S-a arătat că dominanŃa poate să se manifeste între alelele perechi: A domină a, B domină bb etc. Un tip aparte de relaŃii de dominanŃă – recesivitate poate exista şi între genele nealele: AA domină Bb, bb domină pe A etc.

Acest fenomen a fost numit epistazie. Genele care inhibă acŃiunea unor gene nealele = gene epistatice, iar genele

inhibate se numesc gene hipostatice. Pot fi epistatice şi hipostatice atât alelele dominante, cât şi alelele recesive. În funcŃie de alela epistatică, epistazia poate fi: de dominanŃă, de dominanŃă – recesivitate, de recesivitate.

Prin epistazia de dominanŃă atât gena epistatică cât şi gena hipostatică sunt reprezentate de gene dominante nealele. Raportul de segregare în cazul epistaziei de dominanŃă este de 12:3:1.

Un exemplu îl oferă încrucişarea între oile negre Karakul şi oile albe Karakal. În F1 se obŃin miei de culoare neagră heterozigoŃi, iar în F2 are loc segregarea astfel: 12/16 miei negri, 3/16 miei bruni, 1/16 miei albi.

Notând cu N gene pentru culoare neagră, cu B gene pentru culoarea brună (comor), cu n şi b alelele lor producătoare a culorii albe, se pot scrie:

P NNBB X nnbb oi negre oi albe (N inhibă B) F1 Nn Bb oi negre F2 - 12 miei negri (ambele gene dominante: N şi B sau N şi b)

- 3 miei bruni – B scapă de sub influenŃa N - 1 miel alb – nnbb.

Prin epistazia genei recesive se înŃelege acŃiunea unei gene recesive în stare

homozigotă ce inhibă acŃiunea genelor dominante sau recesive din alte perechi de alele; de exemplu aa inhibă pe B sau aa inhibă pe bb.

Fenomenul se poate evidenŃia la încrucişarea unor şoareci negri. Tipul albinotic este genetic de tip sălbatic, deoarece posedă gena A, care însă nu se manifestă din cauza prezenŃei genei epistatice recesive cc care inhibă formarea culorii.

P(m) AA cc X aaCC

şoareci albi şoareci negri (cc inhibă A)

F1 AaCc şoareci agaati(tip sălbatic)

10

F2: 9/16 şoareci agonti (AC) 3/16 şoareci negri (Caa) 4/16 şoareci albi (Acc şi aacc)

Deci, în acest caz epistozia s-a manifestat din partea genei cc asupra genei A.

Şoarecii cu genotipul Acc erau albi, deoarece gena C în stare homozigotă împiedică producerea pigmentului.

2. InteracŃiunea complementară a genelor Constă în acŃiunea unor gene nealele, care în stare homozigotă dominantă

conlucrează pentru apariŃia unui caracter nou. Dacă una din aceste gene dominante lipseşte din genotip, caracterul nu se exteriorizează fenotipic.

La găini, creasta de tip mazăre, ca şi creasta de tip trandafir manifestă dominanŃă faŃă de creasta simplă. La încrucişarea rasei Wyandotte cu creasta tip trandafir (RRpp) cu rasa Brahma cu creasta tip mazăre (rrPP), în F1 indivizii aveau un nou tip de creastă, nuciformă, rezultată din interacŃiunea complementară între cele 2 gene dominante (Rr Pp).

Păsările hibride, încrucişate între ele, dau generaŃia F2 în care 9/16 indivizi aveau creastă uniformă (RP), 3/16 indivizi cu creastă trandafir (Rpp), 3/16 indivizi cu creastă mazăre (rrP) şi 1/16 creastă simplă (rr pp).

Deci, caracterul nou este produs numai prin acŃiunea comună a tuturor genelor dominante din genotip. Aceste gene nealele, în mod separat, nu pot provoca apariŃia caracterului respectiv.

3. Poligenia (interacŃiunea aditivă) Constă în conlucrarea mai multor gene nealele, dar echivalente dominante sau

recesive pentru exteriorizarea fenotipică a unui caracter. Asemenea caractere sunt caracterele cantitative (producŃia de ouă, de lapte, greutatea corporală).

Se consideră că în cazul fenomenului de poligenie, genele individuale au un efect redus asupra unui caracter şi ca atare ele pot fi greu evidenŃiate. Numai efectul cumulativ al acestor gene produce modificări calitative evidente.

Fenotipul caracterului cantitativ, determinat de gene aditive, se manifestă cu atât mai puternic cu cât este determinat de mai multe gene nealele dominante şi invers.

Tot la găină ,caracterele “încălŃat” şi “neîncălŃat” sunt rezultate ale poligeniei. Prin împerecherea cocoşilor “încălŃaŃi” cu găini “neîncălŃate” rezultă în F1

numai indivizi “încălŃaŃi”. Aceşti hibrizi din F1, împerecheaŃi între ei, dau în F2 15 indivizi “încălŃaŃi” la 1 individ “neîncălŃat”, deci un raport de 15:1, ceea ce arată că la realizarea acestui caracter interacŃionează activ 2 gene nealele.

Un alt exemplu îl constituie ereditatea culorii pielii la om, determinată de pigmentul melanină, care variază cantitativ la diferite rase. Caracterul de pigment din piele este determinat de efectul aditiv al genelor P1 şi P2, care la negri se află în stare homozigotă (P1P1P2P2)

- mulatri închişi – 3 gene pentru pigmentare (P1p1P2P2 sau - mulatri p – zişi – 2 gene (P1p1p2; P1P1p2p2; p1p1P2P2) - mulatri deschişi – 1 genă (P1p1p2p2 sau p1p1P2p2) - la rasa albă – genotip homozigot recesiv (p1p1p2p2) 4 Pleiotropias Analiza modalităŃilor de acŃiune a genelor a scos în evidenŃă şi fenomenul prin

care una şi aceiaşi genă poate să contribuie la formarea mai multor caractere. Aceste gene au fost denumite pleiotrope.

11

La Drosophila, gena mutantă “vestigial”- vg. care reduce mărimea aripilor, micşorează în acelaşi timp fecunditatea, reduce numărul de ouă, modifică poziŃia perişorilor de pe corp.

Gena mutantă “ivorg”, care răspunde de culoarea deschisă a ochilor, are acŃiune negativă asupra tuburilor lui Malpighi şi modifică forma spermoteciilor.

Genele pleiotrope determină corelaŃiile genetice dintre diferite caractere şi menŃin aceste corelaŃii de-a lungul generaŃiilor.

5. AcŃiunea modificatoare a genelor Există gene cu acŃiune de bază în determinarea unui anumit caracter, altele

interacŃionează cu alte gene, influenŃând acŃiunea acestora. Asemenea gene au primit numele gene modificatoare. Atunci când o genă

slăbeşte expresia fenotipică a altei gene nealele se numeşte reducătoare, iar când întăreşte expresia fenotipică a altei gene nealele se numeşte amplificatoare. Ori de câte ori acŃionează aceste gene, ele modifică proporŃiile mendeliene de segregare.

Astfel, există o genă la Drosophila (“tetraptera”) care poate să transfere balansierele în aripi de dimensiuni mari. O altă genă, tot la Drosophila, numită “erupt” determină dezvoltarea unui tars în ochi.

La porumbel (Columba livia), tipul sălbatic prezintă capul lipsit de moŃ. Când gena este prezentă în stare homozigotă apare şi moŃul. Dar forma şi dimensiunile moŃului sunt controlate de gene modificatoare, astfel că se observă o gamă variată de moŃuri de la un simplu smoc de pene, până la o glugă care acoperă parŃial sau total capul.

6. InfluenŃa factorilor externi asupra acŃiunii genelor Manifestarea acŃiunilor genelor poate fi influenŃată şi de condiŃiile de mediu,

care modifică proporŃiile fenotipice faŃă de cele teoretice. Astfel, larvele de Drosophila cu aripi vestigiale, crescute la temperaturi

ridicate, produc aripi aproape normale. Temperatura ridicată nu influenŃează genele respective decât la o anumită vârstă a larvelor, care coincide cu perioada sensibilă pentru dezvoltarea aripilor.

La iepurele de Himalaya, culoarea neagră a extremităŃilor este realizată de alela ch.

Acest tip de iepure, crescut la temperaturi de peste 35˚C este complet alb. Crescut la temperatură în jurul a 25˚C capătă culoarea neagră la extremităŃi: bot, picioare, urechi. Dacă se smulge o porŃiune din părul alb şi iepurele este crescut la temperaturi sub 25˚C, pe acel loc va apărea păr negru.

Există gene cu manifestare foarte variabilă la influenŃa condiŃiilor de mediu, dar care afectează numai o parte din indivizi, aparent cu acelaşi genotip. Fenomenul se numeşte penetranŃă. De exemplu la cobai, o genă recesivă până la 27,7٪ monştri cu cap mic, neviabili. Uneori gene afectează numai o parte din organism. Gena “eyeless” care reduce suprafaŃa ochiului la Drosophila, poate afecta numai un ochi la aceiaşi musculiŃă. Alteori, influenŃa mediului se poate resimŃi în mod diferit în ceea ce priveşte intensitatea de manifestare a caracterului. În acest caz, fenomenul poartă numele de expresivita \

12

Teoria cromozomică a eredităŃii

A fost elaborată de T.H. Morgan şi colaboratorii săi pentru care în anul 1933 a fost distins cu premiul Nobel. Morgan şi colaboratorii săi au folosit ca material biologic, musculiŃa de oŃet (Drosophila melanogaster) insectă la care s-au descris peste 500 forme mutante.

Prin numeroase încrucişări între diferite mutante cu tipul sălbatic sau a mutantelor între ele s-a stabilit modul de transmitere a genelor pe parcursul mai multor generaŃii.

În concepŃia lui Morgan, genele sunt plasate în cromozomi în anumite poziŃii denumite loci sub formă de pereche, determinând însuşiri contrastante ale aceluiaşi caracter.

Prin mutaŃia unei gene normale (de tip sălbatic) apare o genă nouă, dar care ocupă acelaşi locus în cromozomi omologi. Acest cuplu de gene, ce determină însuşirea normală şi cea mutantă a unui caracter a primit denumirea de gene alele. Gena este considerată unitate ereditară funcŃională, mutaŃională şi de recombinare genetică. Teoria cromozomică a eredităŃii cuprinde 3 teze:

1 – plasarea liniară a genelor pe cromozom 2 – transmiterea înlănŃuită a genelor (linkage) 3 – schimbul reciproc de gene între cromozomi omologi (crossing-over). 1. Plasarea liniară a genelor pe cromozomi

În experienŃele lui Morgan s-a arătat că la Drosophila melanogaster femelele au o pereche de cromozomi identici (XX) iar masculii, un singur cromozom X sub formă de bastonaş şi unul neomolog, numit cromozom Y, sub forma unui bastonaş frânt. Descoperirea cromozomului sexului constituie o dovadă că genele sunt plasate în cromozomi. Tot la Drosophila melanogaster s-a constatat că la unii indivizi poate lipsi un cromozom sau poate exista un cromozom în plus. Aceasta fiind corelată cu substanŃa unui caracter sau prezenŃa unui caracter constituie încă un argument că genele sunt plasate în cromozomi.

Mendel a analizat, în mod întâmplător caractere ce sunt localizate în perechi diferite de cromozomi, fapt ce permite segregarea şi combinarea independentă a caracterelor.

Morgan a urmărit într-un număr foarte mare de încrucişări transmiterea genelor localizate în acelaşi cromozom.

S-a constatat că există un număr mult mai mare de gene decât cromozomi, chiar dacă în unele cazuri o genă poate determina mai multe caractere. Rezultatele analizelor genetice nu se pot explica decât dacă se admite că genele sunt plasate liniar în cromozomi, ocupând un loc precis denumit locus.

2. Transmiterea înlănŃuită a genelor (linkage)

Morgan a efectuat o experienŃă la Drosophila melanogaster – s-a încrucişat o femelă cu corp gri şi aripi normale(b+vg+/b+vg+) cu un mascul ce prezenta caracterele mutante, corp negru şi aripi vestigiale (bvg/bvg). În prima generaŃie au rezultat indivizi cu corp gri şi aripi normale (b+vg+/bvg). Dacă un mascul din F1 este retroîncrucişat cu o femelă dublu mutantă homozigotă, în generaŃia F2 au rezultat numai 2 grupe fenotipice de indivizi (ca în cazul unei monohibridări) în raport de 1:1 şi nu 4 grupe cât ar fi trebuit să apară, în raport de 1:1:1:1 (cazul unei dihibridări la testeross)

Rezultatele obŃinute au arătat că genele ce determină culoarea corpului şi forma aripilor sunt plasate pe acelaşi cromozom şi se transmit înlănŃuit (împreună) la descendenŃi, fenomen numit linkage.

Linkage-ul este opus, aparent, fenomenului segregării independente a factorilor ereditari, postulat de Mendel. OpoziŃia este într-adevăr numai aparentă, deoarece segregarea independentă a genelor în timpul meiozei se referă la gene aflate pe cromozomi diferiŃi, pe când linkage-ul se referă la gene plasate pe acelaşi cromozom.

13

Studiul linkage la cele 5000 de mutante de Drosophila studiate de Morgan manifestă tendinŃa de a se grupa în 4 grupe: Grupa I - 141 mutante; grupa II – 228 mutante; grupa III – 156 mutante şi grupa IV – 12 mutante.

ExistenŃa a 4 grupe de înlănŃuire este încă dovadă că genele sunt plasate în cromozomi şi în plus există o corelaŃie evidentă între lungimea cromozomilor şi numărul de gene pe care le conŃin.

Deci, genele localizate pe acelaşi cromozom se transmit la descendenŃi în bloc, formând o singură grupă de linkage.

3. Schimbul reciproc de gene între cromozomi omologi (crossing-over) Fenomenul prin care se realizează schimbul de gene alele sau segmente cromatidice resurari între cromozomi omologi în timpul meiozei se numeşte crossing-over . ExistenŃa acestui fenomen dovedeşte că likage-ul nu este întotdeauna complet, ca atare crossing-over-ul este un linkage incomplet.

Atunci când dintr-un testaross rezultă 4 clase fenotipice ale căror proporŃii nu sunt egale de 1:1:1:1, ci 2 clase care posedă fenotipul parental mai mult de 50٪ din descendenŃi şi 2 clase fenotipice noi ,recombinate în proporŃie de sub 50٪ din totalul descendenŃilor, vom avea dovada sigură că cele 2 caractere analizate sunt determinate de gene situate pe acelaşi cromozom, dar înlănŃuire incompletă, favorizând realizarea crossing-over-ului.

Pentru a demonstra schimbul de gene între cromozomi omologi, Morgan a folosit următoarea experienŃă: a încrucişat un mascul de culoare neagră şi cu aripi vestigiale (bvg/bvg) cu o femelă cu corpul gri (b+vg+b+vg+). În generaŃia F1 a obŃinut o descendenŃă uniformă fenotipic, cu corpul gri şi aripi normale (b+vg+/bvg). Dacă se retroîncrucişează o femelă din F1 cu un mascul cu ambele caractere mutante, rezultă în F2 4 grupe fenotipice: 2 grupe fenotipice parentale şi 2 grupe fenotipice noi, neaşteptate, în următoarele proporŃii: corp gri-aripi normale 41,5٪ corp negru 41,5٪, corp gri-aripi vestigiale 8,5٪, corp negru-aripi normale 8,5٪.

Se observă că raportul de segregare nu este cel aşteptat de 1:1:1:1. Formele noi rezultate, în proporŃie mult mai mică decât de cât cele parentale sunt determinate de schimbul de gene între cromatidele vesurari ale cromozomilor omologi, fiind denumite forme recombinate.

Raportul de segregare, deosebit de cel median se datorează faptului că femela heterozigotă din F1 formează 4 tipuri de gameŃi, două de tip parental (b+vg+ şi bvg) şi două de tip recombinat (b+vg şi bvg+), care se fecundează cu unicul tip de gameŃi ai masculului (bvg).

Valoarea crossing-over-ului se exprimă în ٪ şi se arată cu cât forŃa de înlănŃuire a genelor este mai mică, frecvenŃa crossing-over-ului este mai mare.

Crossing-over-ul poate fi pus în evidenŃă numai în cazul când diferite perechi de gene alele se găsesc în stare heterozigotă, adică sub forma AB/ab. Atunci când genele sunt în stare homozigotă (AB/AB sau ab/ab) crossing-over-ul, deşi poate să aibă loc, nu poate fi evidenŃiat deoarece schimbul de segmente cromozomice identice nu dă combinaŃii noi de gene.

4. Tipuri de crossing-over Crossing-over-ul este un fenomen întâmplător ce se produce cu o anumită

posibilitate în unul sau mai multe puncte de pe cromozomi omologi. În funcŃie de numărul segmentelor cromatidice ce se pot schimba între

cromozomi pereche, crossing-over-ul poate fi simplu, când se realizează schimbul unui singur segment, dublu, când se produc 2 schimburi de segmente, caz în care trebuie să existe cel puŃin 2 chiasme între cromozomi omologi şi multiplu, când între cromozomi omologi se realizează mai multe schimburi de gene.

Aşa cum a fost prezentat fenomenul de crossing-over, se înŃelege că segmentele ce fac schimb între cromozomi omologi sunt egale. Nu întotdeauna procesul decurge astfel.

14

Se poate întâmpla ca cromatidele să se rupă în puncte diferite şi atunci segmentul ce se schimbă să nu mai fie egale ca lungime.

Acest tip se numeşte crossing-over inegal şi are drept consecinŃă dublarea sau triplarea unei gene pe un cromozom, iar pe celălalt cromozom lipsa locilor respectivi.

Crossing-over-ul este un fenomen specific diviziunii meiotice. Destul de rar, acest fenomen poate avea loc şi în celulele somatice, în profaza mitozei, numindu-se în acest caz crossing-over mitotic (somatic). Fenomenul apare foarte rar la plantele şi animalele superioare, însă destul de frecvent la microorganisme, la care hărŃile cromozomice s-au întocmit pe baza crossing-over-ului mitotic. Ex: s-au observat apariŃia unor caractere mozaicate la femelele de Drosophila atât pe corp cât şi pe ochi şi s-a demonstrat că fenomenul se datorează unui crossing-over între cromatidele cromozomilor omologi în timpul diviziunii mitotice. Acest tip de crossing-over poate avea loc atât între cromozomii sexului cât şi între autozomi.

5. Factorii care influenŃează crossing-over-ul Ca orice proces genetic şi crossing-over-ul este opus influenŃei a 2 categorii de

factori: interni şi externi. Dintre factorii interni studiaŃi până acum sunt: sexul, structura cromozomilor, aberaŃiile cromozomilor şi numerice, vârsta organismului iar dintre factorii externi: temperatura, nutriŃia.

Sexul. Cercetări efectuate de Bridges (1933) la Drosophila au evidenŃiat faptul că la masculi fenomenul de crossing-over nu se produce sau este foarte rar. De asemenea, lipsa crossing-over-ului a fost semnalată şi la B, la sexul femel care este heterogametic (xy).

AbsenŃa crossing-over-ului la sexul heterogametic al unor specii se datorează faptul că cromozomul sexului se asociază în meioză cap – la - cap în timp ce autozomii se asociază normal, latură pe latură. Deci între cromozomii sexului nu se poate produce crossing-over-ul. Sau, de multe ori, între cromozomii omologi, deşi fac sinapsă formând bivalenŃi, între cele 4 cromatide nu se formează chiasme şi deci nu se poate realiza nici crossing-over-ul.

În ce priveşte structura cromozomului, frecvenŃa crossing-over-ului este influenŃată de poziŃia centromerului şi localizarea heterocromatidei.

În regiunea centromerului, frecvenŃa crossing-over-ului este redusă, datorită faptului că genele sunt foarte apropiate una de alta.

AberaŃiile cromozomilor şi în special inversia şi translocaŃia, precum şi unele tipuri de poliploidie, determină o modificare a frecvenŃei crossing-over-ului.

Procentul de crossing-over depinde şi de vârsta organismului. Astfel, la Drosophila, după ce femelele au atins maturitatea sexuală, în următoarele 2 zile frecvenŃa crossing-over-ului a atins valoarea maximă, iar după 10 zile frecvenŃa acestuia este minimă.

Dintre factorii externi – rol important îl are temperatura. Astfel, unele regiuni de cromozomi II de la Drosophila formează mai multe recombinări la temperatura de 14-16˚C, iar în alte regiuni la temperatura de 25-30˚C.

HărŃile cromozomiale Stabilind dispunerea liniară a genelor pe cromozomi Morgan a presupus totodată

că procesul de crossing-over este atât mai frecvent cu cât este mai mare distanŃa dintre cele 2 gene luate în considerare, şi invers. Prin urmare, frecvenŃa crossing-over-ului poate reflecta distanŃa relativă dintre genele unui cromozom.

HărŃile cromozomului constituie reprezentarea grafică a cromozomilor şi a genelor care alcătuiesc diferite grupe de linkage, genele fiind plasate pe cromozomi la distanŃe relative exprimate în % de crossing-over.

DistanŃele dintre gene se exprimă în unităŃi de recombinare, denumite şi unităŃi Morgan sau morganide. Fiecare unitate de recombinare corespunde cu 1% crossing-over, iar 1٪ crossing-over este egal cu 1 unitate de pe harta cromozomului.

De exemplu, dacă la Drosophila melanogaster se consideră 3 gene mutante recesive: b – corp negru; vg – aripi vestigiale şi c – aripi îndoite, pentru a stabili distanŃa

15

dintre ele şi ordinea lor pe cromozom, se fac următoarele încrucişări: indivizii normali cu indivizi ce prezintă mutaŃiile b şi c, rezultând un procent de 27% crossing-over, indivizi normali cu indivizi ce prezintă mutaŃiile c şi vg în urma căreia a rezultat 8,5% indivizi recombinaŃi.

Se poate afirma că distanŃa dintre locii b şi c este de 27 unităŃi, iar între locii c şi vg distanŃa este de 8,5 unităŃi.

Pentru a determina poziŃia genei vg faŃă de celelalte gene este obligatorie şi a treia încrucişare între indivizi normali şi indivizi cer genele b şi vg, caz în care frecvenŃa crossing-over-ului a fost de 18,5%, deci distanŃa dintre aceşti loci este de 18,5 unităŃi pe hartă.

Gena vg este plasată între genele b şi c, deoarece dacă ar fi plasată dincolo de gena c, ar fi trebuit să se obŃină un procent de crossing-over de 35,5%. (27+8,5).

Când într-un punct al cromozomului are loc un crossing-over, în vecinătatea sa, probabilitatea ca să se producă un alt crossing-over se reduce, iar fenomenul se nueşte interferenŃă.

S-a constatat că dacă distanŃa dintre 2 gene este minim 12 unităŃi (morganide), în acest segment nu mai are loc un alt crossing-over

Determinismul genetic al sexului

În cursul evoluŃiei au acŃionat 3 mecanisme de determinism genetic al sexelor

pe care le remarcăm şi astăzi: 1– prin conjugare (fenomenul de parasexualitate la bacterii) 2– prin gene specializate, dar situate pe diverşi cromozomi 3– prin gene specializate concentrate pe cromozomi specializaŃi (cromozomi

sexuali) 1. Mecanismul de determinism sexual prin conjugare La bacterii, cele 2 sexe nu sunt diferenŃiate morfologic, ci se deosebesc prin

prezenŃa sau absenŃa unui factor de fertilitate, notat cu F. Celulele bacteriene F+ se consideră că sunt ♂ iar cele cu F absent, deci F − sunt

considerate bacterii de tip ♀. Bacteriile F − pot primi prin conjugare de la bacteriile F+ o copie a acestui factor de fertilitate.

2. Mecanismul de determinism genic al sexelor Acest mecanism este prezent la peşti şi reptile. La aceste specii, diferenŃierea sexuală este determinată de gene specifice care

însă nu sunt plasate şi concentrate pe heterozomi (crmozomi sexuali),ci pe autozomi. De asemenea, în cadrul aceluiaşi mecanism, la unele reptile genele determinate ale sexelor pot fi activate sau inactivate de temperatura mediului exterior, mai ales cea de la incubarea ouălor. De exemplu la aligatorul american Alligator mississippiensis) temperaturi scăzute sub 300C produc masculi din ouă, iar temperatura de peste 340C produc femele, ambele sexe fiind produse la temperaturi intermediare.

3. Mecanismul de determinism cromozomic al sexelor Acest mecanism este caracteristic celor mai multe specii de vertebrate şi

nevertebrate. Sexele sunt separate morfologic, fiecare sex având structuri cromozomice

proprii. Cei 2 cromozomi sexuali sunt notaŃi X şi Y sau Z şi W. La majoritatea speciilor

de animale, cromozomii XX determină sexul femel iar cromozomii XY caracterizează sexul ♂.

În gametogeneză, sexul XX formează un singur tip de gameŃi (cu cromozom X) şi este denumit sex homogametic, iar sexul XY sau XO (când Y lipseşte) formează 2 tipuri de gameŃi (cu cromozom X sau cu cromozom Y şi fără cromozom Y) şi este denumit sex heterogametic.

16

Se cunosc 2 tipuri principale de determinări cromozomice a sexelor: - tipul Drosophila - tipul Abraxas Tipul Drosophila – a fost studiat mai întâi la Drosophila, dar se întâlneşte şi la

alte insecte, viermi, moluşte, peşti, batracieni, mamifere inclusiv omul. În timpul meiozei la aceste organisme, toate ovulele primesc cu cromozom X,

pe când spermatozoizii 50% primesc cromozomi X, iar 50% cromozomi Y. Oul ce va rezulta din fecundarea unui ovul cu spermatozoid ce posedă cromozomi X va fi femel (XX), pe când ovulul fecundat de un spermatozoid cu cromozomi Y va forma un mascul (XY).

Tipul Drosophila cuprinde 3 subtipuri: - subtipul Ly gaens (clasic):♀ posedă 2 cromozomi XX iar ♂ unul X şi unul Y. - subtipul Protenar: ♀ posedă 2 cromozomi XX, iar masculul un singur X

(XO). Se întâlneşte la ortopere, miriapode, viermii nematozi. - subtipul Ascaris; ♀ posedă 2 cromozomi XX, iar ♂ un singur X care nu este

independent, ci ataşat curtozomilor. Tipul Abraxas – numele vine de la genul de fluturi la care s-a descoperit şi

studiat acest tip. În acest caz sexul femel este heterogametic – XX. Femelele formează ovule cu X şi ovule cu Y, în timp ce masculii un singur tip de spermatozoizi care primesc câte un cromozom X. După cum spermatoidul, care posedă un cromozom X va întâlni un ovul cu X sau cu Y, va lua naştere un mascul (XX) sau o femelă (XY).

Tipul Abraxas cuprinde şi el 2 subtipuri: - subtipul clasic, descris mai sus: ♀XY ♂XX. - subtipul deficiens – la sexul ♀ lipseşte cromozomul Y şi rămâne un singur

cromozom X;♂posedă XX. Acest tip îl întâlnim la păsări, reptile, fluturi. Se mai numeşte şi tipul pasăre.

Alte tipuri de determinism cromozomic al sexelor Au fost descrise şi alte tipuri înlănŃuite mai rar. Astfel, se cunoaşte tipul cu

heterozomi multipli întâlnit la unele rozătoare şi marsupiale şi caracterizat prin prezenŃa mai multor cromozomi X (X1, X2,X3) sau mai multor cromozomi Y notaŃi Y1, Y2, Y3.

De asemenea, un tip particular este întâlnit la albină (Apis melifera) la care sexul este determinat de numărul seturilor de cromozomi. Ouăle fecundate produc femele diploide (2n = 32), în timp ce ouăle nefecundate se divid partenogenetic pentru a produce masculi hoploizi (n = 16). Ca urmare, la masculi spermotogeneza se realizează prin mitoză.

Un alt aspect particular îl întâlnim chiar la Drosophila melanogaster, la care deşi ♀ este XX iar masculul XY, cromozomul Y nu este determinator de sex. Determinismul sexual la D. nu este dat de raportul dintre numărul de cromozomi X şi numărul de autozomi.

Dacă se notează numărul seturilor haploide de autozomi cu A un ♂ diploid normal are formula X/A = 1/2 = 0,5 iar o ♀ diploidă normală are formula X/A = 2/2 = 1.

Indiferent de numărul cromozomilor Y sau de prezenŃa sau de absenŃa lui Y, un raport X/A egal sau mai mic de 0,5 dă masculi, iar un raport X/A egal sau mai mare decât 1 dă femele. Raportul X/A situat între 0,5 şi 1 dă insecte normale din punct de vedere sexual.

Ereditatea caracterelor legate de sex La hibridări, în general, nu are importanŃă dacă un caracter homozigot urmărit

se găseşte în autozomii mamei sau tatălui.Ei nu afectează segregarea caracterelor în descendenŃă. În cazul în care aceste caractere (gene) se găsesc în cromozomii sexului, caracterul eredităŃii şi al segregării este condiŃionat de modul de comportare al cromozomului sexului în meioză şi mai apoi în procesul fecundării.

17

Deoarece cromozomul Y este aproape ivert-un conŃine gene-genele care se găsesc în cromozomul X nu au toate perche alelică. Moştenirea caracterelor care sunt determinate de gene pe cromozomul sexului se numeşte ereditate legetă de sex (sex – linkaje).

Ex: caracterul „ochi albi” de la Drosophila s-a încrucişat o femelă de tip sălbatic, homozigotă, cu ochi de culoare roşie, dată de gene w+ de pe croozomul X (w+w+), cu un mascul cu ochi de culoare albă, caracter recesiv dat de alela w (genotip wY). În F1 s-au obŃinut numai indivizi cu ochi de culoare roşie, conform principiului mendelian al dominanŃei, iar în F2 75% din indivizi au prezentat ochi roşii şi 25% au avut ochi albi. Deci, raportul de segregare a fost de 3:1. Dar, indivizii cu ochi albi au fost numai de sex mascul, iar cei 75% indivizi cu ochi roşii nu au fost 1/2 ♂ şi 1/2 ♀, ci 2/3 ♀ şi 1/3 ♂.

În încrucişarea reciprocă, în care s-a utilizat o ♀ cu ochi albi homozigotă (ww) şi un mascul cu ochi roşii (w+Y) nu s-au mai obŃinut aceleaşi rezultate ca la prima încrucişare.

În F1, în loc de uniformitate fenotipică, s-a produs un raport de segregare de 1:1, în care toŃi indivizii cu ochi roşii erau femele şi toŃi indivizii cu ochi albi erau masculi. De asemenea, în F2, în loc de un raport de 3:1, s-a obŃinut un raport de 1:1, iar în cadrul categoriei de indivizi cu ochi roşii, 1/2 erau ♂ şi 1/2 ♀.

De asemenea în cadrul categoriei de indivizi cu ochi albi, 1/2 erau♀ şi 1/2 erau ♂.

Din acest exemplu, rezultă următoarele particularităŃi de transmitere ale caracterelor X – linkate:

1 - deoarece cromozomul X ai mamei homozigote se transmit la fii, iar unicul cromozom X al sexului ♂ se transmite la fiice, acest fel de transmitere a caracterelor de la mamă la fii şi de la tată la fiice se numeşte transmitere în cruce (criss-cross). 2 – o femelă hetrozigotă va transmite gena recesivă X – linkată la 1/2 din fiicele sale şi la 1/2 din fiii săi.

Ereditatea limitată de sex şi ereditatea influenŃată de sex. Ereditatea holandrică

În cazul eredităŃii limitate de sex, caractere condiŃionate de gene autozomale

prezente la ambele sexe se manifestă numai la un singur sex. De exemplu, la animalele domestice producŃiile de lapte şi de ouă sunt caracteristice numai indivizilor de sex femel, cu toate că şi masculii poartă aceleaşi gene autozomale.

Ereditatea influenŃată de sex constitue o categorie aparte. În acest caz genele autozomale implicate sunt prezente, de asemenea, la ambele sexe, dar manifestarea lor fenotipică este diferită fiind influenŃată de sex. Caracteristicile de acest tip nu sunt limitate la un singur sex.

O genă oarecare poate fi dominantă la un sex şi recesivă la celălalt sex. Rasa de oi Dorset prezintă coarne atât la masculi cât şi la femele, în schimb la rasa de oi Suffolk, ambele sexe sunt fără coarne.

S-a considerat că rasa Dorset deŃine o genă dominantă C, în timp ce rasa Suffolk deŃine gena recesivă c. Din încrucişarea celor 2 rase CC x cc, la indivizii din prima generaŃie, masculii au coarne, iar femelele nu, deşi au aceeaşi formulă genetică Cc. Gena C este influenŃată în acŃiunea ei de hormonii secretaŃi de glandele sexuale. Masculii heterozigoŃi castraŃi nu formează coarne.

Ereditatea holandrică se referă la caractere nelegate de sex, condiŃonate de gene situate pe cromozomul Y. Ele se transmit exclusiv pe linie masculă şi se manifestă exclusiv la masculi. Deocamdată, asfel de caractere nu au fost încă evidenŃiate la animale.

Inversiunea sexului

18

Prin inversiunea sexului se înŃelage schimbarea sexului în cursul autogeniei. Spre bătrâneŃe sexele tind să capete unele caractere ale sexului opus. Femelele de

fazan încetează a mai oua şi se îmbracă cu penaj de masculi. Găinile bătrâne cântă uneori ca şi cocoşii. Sunt peşti care la tinereŃe se prezintă ca masculi, iar la bătrâneŃe produc icre. Peştele sabie (Xiphophorus – crescut în acvarii) are dimorfismul sexual distinct: masculul are o prelungire a aripii codale în formă de sabie, care la femelă lipseşte.

Uneori femelele bătrâne se transformă în ♂ şi le creşte aripa codală. Unii batracieni la început imediat după metamorfoză sunt femele, iar mai tîrziu la unele ovarul se transformă în testicule, devenind masculi.

Fenomenul de inversiune poate apărea la gemenii uterini, la animale care nasc de obicei un singur pui. La taurine, s-a arătat că în cazul gemenilor uterini de sex opuse, sexul♂ este normal, iar cel♀ este steril. Femelele capătă tuburi seminale sterile şi în plus şi canale deferente proprii organelor de reproducere a masculilor.

Aceste rudimente ale sexului mascul există în mod normal la femele, dar ele nu se dezvoltă când există o sarcină cu un singur embrion.

Bazele moleculare ale eredităŃii

În urmă cu 3 decenii nimeni nu şi-ar fi închipuit că oamenii vor cunoaşte

structura genelor şi modul lor de exprimare într-un sistem celular. Într-o perioadă scurtă de timp, s-a demonstrat că moleculele de ADN şi ARN, atât la organismele inferioare, cât şi la cele superioare conŃin în mod codificat informaŃia genetică pentru sinteza proteinelor. S-au descifrat mecanismele intime care stau la baza complicatelor reacŃii prin care se sintetizează o proteină în organism, fenomene ce au fost apoi reproduse şi în laborator. Natura şi structura proteinelor determină specificitatea biologică a organismelor a fiecărei specii în parte, a organelor şi Ńesuturilor, deci a caracterelor în ultimă instanŃă..

Acizii nucleici sunt componenŃii cei mai importanŃi ai celulelor vegetale sau animale. Ei participă la procesele de diviziune celulară, de creştere şi diferenŃiere celulară şi determină specificitatea materiei vii.

Acizii nucleici au fost descoperiŃi în anul 1869, când medicul elveŃian F. Mischer a extras din puroiul chirurgical o substanŃă pe care a numit-o nucleină. Ulterior, s-a constatat că nucleina conŃine un acid organic a fost numit de Altmam, în 1899, acid nucleic.

Apoi, s-a demonstrat că nucleina este formată din 2 acizi nucleici: ADN şi ARN. ADN se găseşte în cea mai mare parte în nucleul celulelor iar în ARN se găseşte atât în nucleu, cât şi în citoplasmă.

Acizii nucleici constituie alături de alte proteine, substanŃele de bază din care este alcătuit cromozomul.

Identificarea rolului genetic al ADN

Cercetările care s-au făcut la începutul secolului XX privind proteinele şi

enzimele au demonstrat marea diversitate şi complexitate a acestora considerându-se că şi genele ar fi fost de natură proteică.

Problema care se punea era dacă genele care ar avea o natură proteică pot să determine sinteza altor proteine şi respectiv enzime.

Cercetările au demonstrat că din punct de vedere chimic, un lanŃ polipeptidic nu poate servi la propria sa sinteză, în primul rând datorită faptului că aminoacizii nu manifestă atracŃie chimică pentru aminoacizi identici.

Prima ipoteză a legăturii dintre o genă şi sinteza unei enzime a fost elaborată în anul 1908 de către medicul englez Garrod, care a studiat maladiile ereditare umane ce afectează metabolismul intermediar al fenilalaninei.

19

Identificarea materialului genetic a fost posibilă datorită descoperirii unor fenomene ereditare de maximă importanŃă:

- transformarea bacteriană - transformarea la eucariote - recombinarea genetică în cursul reproducerii sexuate la bacterii (conjugarea) - transducŃia bacteriană cu ajutorul virusurilor - transmiterea informaŃiei ereditare de către ARN viral

Transformarea la procariote

În anul 1928, bacteriologul englez F. Griffith a efectuat mai multe experienŃe cu pneumococi (Diplococcus pneumoniae), o bacterie care produce la mamifere boala numită pneumonie.

Această bacterie se prezintă sub 2 forme: un tip virulent, capsulat şi un tip nevirulent, necapsulat. VirulenŃa bacteriei este dată deci de prezenŃa capsulei, formată din polizaharide.

Tipul virulent, capsulat formează colonii netede cu S (smooth = neted), în timp ce tipul nevirulent, necapsulat formează colonii rugoase notate cu R (rongh = rugos, aspru).

După reacŃia imnuologică determinată de tipul de polizaharide ce alcătuiesc capsula, există mai multe tipuri de pneumococi S: SI, SII, SIII.

Prin mutaŃii spontane, tipul S dă naştere la forme lipsite de capsulă, respectiv tipul R nevirulent. Deci există pneumoci de tip RI, RII, RIII. în funcŃie de tipul S din care provin. Injectând la şoareci, pneumococi în diferite variante experimentale,Griffth a constatat că:

- tipul virulent S produce boala şi animalele mor. - tipul virulent S, inactivat prin căldură, nu produce boala. - tipul virulent R este inofensiv, nu produce boala. - dacă la şoareci se inoculează un amestec de tip SIII inactivat prin căldură şi

tipul RII nevirulent, paradoxal, animalele se îmbolnăvesc şi mor. De la şoarecii astfel infectaŃi, s-au izolat pneumococi vii capsulaŃi şi deci

virulenŃi. Concluzia care s-a desprins a fost că pneumococii de tip RII s-au transformat

în pneumococi de tip SIII. MutaŃia este exclusă în acest caz, deoarece tipul RII ar fi trebuit să muteze în tipul SII şi nu SIII.

Cauza transformării pneumococilor nevirulenŃi în pneumococi virulenŃi a rămas necunoscută, până în anul 1944 Griffith neputând să găsească o explicaŃie plauzibilă. El a dedus doar că suspensia de pneumococi omorâŃi conŃine un factor rezistent de căldură,inductor de transformare.

În anul 1944, un grup de cercetători americani O.T. Avery, C.M. Mclarty au reluat experienŃele lui Griffth, cu scopul de a identifica substanŃa chimică ce induce transformarea. Ei au extras ADN de la pneumococii de tip SIII şi l-au introdus în mediul de cultură al pneumococilor de tip RII.

În cultură pe lângă pneumococi RII au apărut şi un număr mic de pneumococi SIII dovedindu-se că agentul transformator este ADN de la tipul donor.

RII + ADN – SIII 24 h RII + SIII ADN transformator a indus pneumococilor nevirulenŃi, necapsulaŃi, însuşirea

de virulenŃă de formare a acestei capsule, deci ADN are rol în transmiterea caracterelor ereditare.

Cu ajutorul ADN s-au realizat transformări genetice şi pentru alte însuşiri la bacterii (rezultate la streptomicină) sau la alte specii de bacterii.

20

Materialul genetic al ribovirusurilor

Există 2 categorii de virusuri, unele au ca material genetic ADN

(dezoxiribovirusuri), iar altele conŃin ARN (ribovirusuri). Ribovirusurile cele mai cunoscute sunt: VMT, virusul poliomielitei al encefalitei, virusul gripal.

Rolul genetic al ARN a fost pus în evidenŃă la VMT. Acest virus conŃine 6% ARN-v şi 94% proteine. S-a izolat ARN-v de proteina virală şi s-au făcut infecŃii cu ambele componente pe frunze sănătoase de tutun.

S-a constatat că boala s-a manifestat numai la frunzele infectate cu ARN-v.

Structura moleculară a ADN

Structura moleculară a ADN a fost descifrată în anul 1953 de cercetătorii Watson şi Crick care au studiat structura ADN prin difracŃie în raze X.

Cei doi cercetători au studiat ADN "în vitro", neştiind dacă structura lui corespunde cu cea existentă în materia vie. Tot în anul 1953, Wiekins şi colaboratorii au efectuat cercetări asupra ADN "în vitro" confirmând structura stabilită de Watson şi Crick. În anul 1962, cei trei cercetători au fost distinşi cu premiul Nobel pentru medicină şi biologie.

Structura chimică a moleculei de ADN Molecula de ADN este formată din unităŃi simple denumite nucleotide. Un

nucleotid este alcătuit din trei tipuri de molecule: o bază azotată, un zahar şi un radical fosforic.

Bazele ce intră în alcătuirea ADN sunt de două tipuri: baze purinice şi baze pirimidinice.

Purina este o bază azotată alcătuită dintr-un heterociclu ce cuprinde 5 atomi de C şi 4 atomi de N, iar pirimidina este o bază azotată ce derivă din inelul benzenic, cuprinzând 4 atomi de C şi 2 atomi de N.

Bazele azotate purinice ce intră în constituŃia moleculei de ADN sunt adenina (A) şi guanina (G), iar bazele pirimidinice sunt citozina (C) şi timina (T).

Zaharul component al dezoribonucleotidului se numeşte dezoxiriboză, fiind o pentoză.

Radicalul fosforic are 3 hidroxili liberi care pot fi esterificaŃi. În cazul acizilor nucleici se esterifică 2OH, deci acizii nucleici sunt fosfoidesteri.

Prin unirea unei baze azotate purinice sau pirimidinice cu un zahar rezultă un dezoxiribonucleosid, iar prin ataşarea la aceasta a unui radical fosforic rezultă un dezoxiribonucleotid. Ataşarea radicalului fosforic se face în mod obişnuit prin intermediul C 5' al dezoxiribozei, prin pierderea unei molecule de H2O.

Radicalul fosforic al unui nucleotid se leagă de un alt nucleotid prin C 3' al aceluia.

Deci constituie o punte de legătură între nucleotizii vecini, realizându-se un lanŃ polinucleotidic, cu o formă de zig-zag, prin legăturile de C 3'→5'. Această structură constituie structura primară sau monocatenară a moleculei de ADN.

La majoritatea organismelor molecula de ADN este constituită din 2 lanŃuri (catene) polinucleotidice complementare, aceasta fiind structura secundară a ADN stabilită de Watson şi Crick.

Una din permisele importante pentru stabilirea structurii secundare a ADN a fost deducerea experimentală a regulii lui Chargaff (1951), conform căreia pot fi definite următoarele reguli cantitative:

A + G = T + C sau A/T = G/C = 1.

21

Aceste relaŃii dintre nucleotide a dus la concluzia că ADN este alcătuit din 2 catene. Răsucirile pe care la suferă o catenă sau molecula biocatenară alcătuiesc structura terŃiară, iar interacŃiunea dintre 2 sau mai multe molecule biocatenare alcătuiesc structura cuatenară a acizilor nucleici.

Watson şi Crick au stabilit că macromolecula de ADN este alcătuită din 2 catene polinucleotidice paralele, înfăşurate elicoidal în jurul unui ax comun, imaginar, o catenă având sens ascendent (3'→5'), iar cealaltă un sens descendent (5'→3'). DistanŃa dintre 2 nucleotide succesive este de 3, 4 Å, iar pasul elicei este 34Å ceea ce corespunde la 10 nucleotide. Diametru macromoleculei de ADN este de 20Å.

Molecula de ADN are dimensiuni foarte mari fiind cea mai mare moleculă biologică, cu o masă moleculară ce poate ajunge la 12 – 16 x 106 daltoni (1 dalton = 1/12 din masa atomului de C).

Cele 2 catene din molecula de ADN se leagă între ele prin punŃi de H2 ce se realizează între o bază azotată purinică de pe un lanŃ şi o bază azotată pirimidinică de pe celălalt lanŃ. Prin urmare, în macromolecula de ADN există următoarele tipuri de legături: A – T, T – A , G – C şi C – G. Legăturile de H2 sunt duble între A = T şi triple între C ≡ G. Ele sunt legături slabe, dar sunt destul de numeroase de-a lungul moleculei de ADN, ceea ce îi conferă stabilitate şi coeziune.

Cele 2 catene polinucleotidice din molecula de ADN sunt complementare, în sensul că ordinea nucleotidelor de pe o catenă determină ordinea nucleotidelor de pe cealaltă catenă.

Legăturile chimice slabe, cum sunt cele de H2 sunt eficiente numai în cazul moleculelor complementare, cum este ADN şi anume când o protuberanŃă a unei molecule intră într-o cavitate a altei molecule. Luate separat, moleculele pirimidinice sunt mai mici decât cele purinice, însă cuplurile purină-pirimidină sunt de aceeaşi dimensiune, conferind moleculei de ADN regularitate şi stabilitate.

Macromolecula de ADN este stabilită la temperaturile fiziologice, datorită numărului mare de legături chimice şi faptului că moleculele de baze azotate se găsesc în interiorul moleculei, contactul lor cu apa fiind limitat.

ReplicaŃia ADN Una dintre însuşirile de bază ale macromoleculelor de ADN este cea de

replicaŃie, constituind funcŃia autocatalitică a materialului genetic. La eucariote, replicarea ADN are loc în timpul ciclului mitotic şi anume în perioada S a interfazei.

Watson şi Crick (1953) au emis şi ipoteza replicării ADN după tipul semiconservativ.

Acest model de sinteză constă în ruperea punŃilor de H2 dintre cele 2 catene complementare. Fiecare catenă serveşte apoi ca matriŃă pentru sinteza unei catene noi. În final, dintr-o moleculă veche de ADN vor rezulta 2 molecule, dar care sunt noi numai pe jumătate.

Acest model asigură o mare fidelitate în sinteza noilor molecule de ADN. În acest proces intervin mai multe enzime: - endonucleazele, care determină incizii în molecula de ADN şi care dau

naştere punctelor de start în replicare. - primaza, care este o ARN – polimerază ce determină sinteza unui scurt lanŃ

ribonucleotidic denumit primer sau amorsă. Acest segment amorsă se leagă prin punŃi de H2 de catena matriŃă.

- ADN – helicazele, capabile să desfacă moleculele lungi de ADN, rupând legătura de H2 dintre bazele complementare.

- ADN – polimerazele, care catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice între nucleotidele lanŃului monocatenar în creştere. Sunt mai multe tipuri de ADN –

22

polimeraze (I,II.III), unele din ele intervenind în procesul de reparare a unor nucleotide încatenate greşit.

- ADN – ligazele, care unesc fragmentele scurte de ADN monocatenar rezultate din sinteza discontinuă.

Sinteza ADN se desfăşoară în 3 etape: 1). iniŃierea replicării 2). alungirea (elongarea) lanŃului polinucleotidic 3). terminarea replicării 1). IniŃierea Din complexul enzimatic amintit, prima enzimă care acŃionează este o

endonuclează ce determină producerea unor întreruperi la nivelul catenelor. În aceste breşe formate pătrund ADN – helicazele, care rup legăturile de H2 dintre perechile de baze, despărŃind cele 2 catene şi dând naştere unui ochi de sinteză.

Ar trebui să urmeze acŃiunea ADN – polimerazei. Dar nici una din ADN – polimeraze nu poate iniŃia singură sinteza "de novo" a ADN. Ele necesită acŃiunea unui primer (iniŃiator) alcătuit din 10 – 60 de ribonucleotide la procariote şi 6 – 10 ribonucleotide la eucariote.

Un astfel de primer are o grupare OH liberă. La eucariote, replicarea începe în puncte de iniŃiere diferite. În acest fel molecula de ADN este împărŃită în mai multe unităŃi de replicare numite repliconi. Lungimea repliconilor este egală cu lungimea dintre 2 puncte de iniŃiere iar 2 replicări încep replicarea în momente diferite unidirecŃional sau, cel mai des, bidirecŃional.

2). Alungirea lanŃului polinucleotidic Alungirea catenei fiice se face de către ADN – polimerază, care se foloseşte de

gruparea OH liberă a primerului pentru a realiza prima legătură fosfodiesterică, ataşând trifosfatul nucleotidic corespunzător bazei de pe catena matriŃă. În felul acesta, sinteza ADN are loc prin alungirea primerului, todeauna în direcŃie 5'→3', încorporându-se câte un nou nucleotid la capătul terminus cu OH liber prin respectarea complementarităŃii bazelor.

S-a stabilit că în replicare intervine o singură enzimă esenŃială: ADN – polimeraza III la procariote şi ADN – polimeraza α la eucariote.

Această enzimă are specifitate de direcŃie, nu de secvenŃă de nucleotide şi ca atare ea se deplasează numai în dircŃie 3' - 5', pe ambele catene matriŃe, determinând polimerizarea noilor catene numai în direcŃie 5'→3'.

ExperienŃele efectuate de Okazaki (1970) au adus dovezi pentru existenŃa unui model discontinuu de replicare, în care noile catene sunt sintetizate pe segmente nucleotidice mici de 100 – 200 nucleotide la eucariote şi 1000 – 2000 la procariote. Aceste fragmente nou obŃinute = fragmente Okazaki şi sunt unite ulterior de către ADN – ligaze spre a forma o catenă unică.

La procariote, catena care se sintetizează pe catena matriŃă ca orientare 3'→5' a primit denumirea de catenă conducătoare, iar catena care se sintetizează antiparalel este denumită catenă decalată. Sinteza catenei conducătoare se desfăşoară continuu, în timp ce sinteza catenelor decalate se desfăşoară prin intermediul fragmentului Okazaki, deci discontinuu. La eucariote, denumirile formaŃiunilor de la nivelul furcii de replicare sunt diferite. În loc de catena conducătoarese se foloseşte denumirea de catenă progresivă, iar în loc de catena decalată, denumirea de catenă retrogradă.

3). Terminarea alungirii Asamblarea catenei decalate necesită îndepărtarea primerului ribonucleotidic,

înlocuirea lui cu o secvenŃă corespunzătoare de ADN şi legarea acestuia. ADN – polimeraza III extinde catena în creştere până ajunge la ribonucleotidul primerului, sintetizat la iniŃiere. Atunci părăseşte terminusul OH, lăsând în acest loc o întrerupere, pe care ADN – lingaza nu o

23

poate suda cu P de la C5' al primerului pentru că acesta este sub formă de trifosfat, iar ADN – lingaza poate lega numai OH de la C3' cu un monofosfat 5'.

Acum intervine ADN – polimeraza I, care îndepărtează ribonucleotidul trifosfatic de la capătul 5' al primerului.

În felul acesta, ADN – polimeraza I acŃionează la capătul OH-3' părăsit de ADN – polimeraza III şi se mişcă în direcŃia 5', îndepărtând ribonucleotidele primerului una câte una şi adăugând dezoxiribonucleotide la capătul 3' al catenei fiice în creştere. Când toate ribonucleotidele au fost eliminate, ADN – lingaza poate interveni legând gruparea OH 3' a catenei ADN în creştere de capătul 5' cu P al fragmentului Okazaki.

ReplicaŃia acizilor nucleici la bacterii şi virusuri

Celula bacteriană conŃine un singur cromozom format dintr-o moleculă de

ADN cu o lungime de aproape 1000µ, şi de formă circulară. În timpul replicaŃiei la bacterii, molecula de ADN îşi păstrează forma

circulară,iar replicaŃia ADN se realizează după modelul semiconservativ. Procesul de replicaŃie a cromozomului bacterian începe într-un punct numit

replicator, care este ataşat de membrana celulară într-o regiune numită mezozom. La bacterii, fiecare diviziune a bacteriei este precedată de o singură derulare

completă a cromozomului circular. La dezoxiribovirusurile cu ADN monocatenar (Ф x 174, S13 etc.) procesul de

replicaŃie decurge astfel: în momentul în care ADN monocatenar notat cu (+) pătrunde în celula bacteriană infectată, serveşte ca matriŃă pentru sinteza unei catene complementare notată cu (-). În interiorul bacteriei infectate a rezultat un ADN bicatenar, dar în continuare, numai catena (-) serveşte ca matriŃă pentru sinteza catenelor (+) ale virusului.

La ribovirusurile cu ARN-v monocatenar (F2), s-a constatat că după pătrunderea ARN-v monocatenar notat cu (+) în celule bacteriană, se ataşează de ribozomi, pentru a declanşa sinteza enzimei necesare desfăşurării replicaŃiei, respectiv ARN – polimeraza. Pe matriŃa catenei (+) se formează o catenă complementară notată cu (-) iar pe matriŃa acesteia, se formează un număr mai mare de molecule de ARN-v (+).

O parte din aceste molecule de ARN-v (+) se ataşează de ribozomi, sintetizându-se proteinele virale, după care are loc unirea acestora cu ARN-v, rezultând un număr foarte mare de fagi, ce distrug celula gazdă (liza bacteriei).

Codul genetic

După elucidarea structurii ADN, cercetătorii au fost confruntaŃi cu problema

modului în care ADN poate servi ca matriŃă pentru formarea proteinelor. Ciberneticianul Gamow (1954) este primul care a descoperit legătura dintre secvenŃa de nucleotide din ADN şi ordinea aminoacizilor din lanŃurile polipeptidice, emiŃând ipoteza că în macromolecula de ADN se găseşte codificată biochimic informaŃia genetică necesară sintezei moleculelor proteice.

Dacă proteinele cu cei 20 AA esenŃiali diferiŃi reprezintă limbajul vieŃii, molecula de ADN cu cele 4 baze azotate ale sale poate fi socotită ca un fel de cod pentru acest limbaj.

În felul acesta a intrat în uz aşa-zisul cod genetic. În general, unitatea de bază a unei codificări este simbolul, iar totalitatea simbolurilor formează un alfabet. În cazul alfabetului genetic, cele 4 tipuri de baze azotate reprezintă simbolurile. Aceste simboluri sunt: A pentru adenină, G pentru guanină, T pentru timină şi C pentru citozină. O grupare de 2,3,4 simboluri care semnifică o idee, un cuvânt se numeşte cuvânt de cod. Potrivit concepŃiei lui Gamow, codificarea celor 20 de AA nu se poate realiza de un singur nucleotid (4' = 4) şi nici de grupe formate din câte 2 nucleotide (42 = 16), pentru că în ambele cazuri numărul total de

24

combinaŃii este mai mic decât numărul aminoacizilor. Ca urmare, el a considerat că numai secvenŃe de câte 3 nucleotide (43 = 64) pot realiza codificarea celor 20 de AA.

Grupul de câte 3 baze azotate formează o tripletă şi deoarece tripleta reprezintă un cuvânt de cod, s-a numuit codon.

La început, nu s-a putut explica excendentul de 44 codoni. Apoi, investigaŃiile făcute de Crick şi colaboratorii săi au arătat că acelaşi AA poate fi codificat de mai mulŃi codoni diferiŃi.

Deoarece codul genetic pentru cei 20 AA a fost studiat pe ARN-m, a intrat în uz ca în desemnarea codonilor să se folosească uracilul (U) în loc de timină (T). Din cei 64 de codoni, 2 marchează începutul sintezei unei catene polipeptidice (AUG şi GUG), iar 3 codoni sunt nonsens (UAA, UAG şi UGA), care marchează terminarea sintezei unei catene polipeptidice (codoni STOP). Fiecare aminoacid, cu excepŃia triptofanului şi metioninei, este specificat de cel puŃin 2 codoni diferiŃi, câŃiva AA sunt specificaŃi de 6 codoni diferiŃi (arginina, leucina, serina). Codonii diferiŃi care determină acelaşi aminoacid se numesc codoni sinonimi.

Caracteristicile codului genetic

Codul genetic are caracteristici: este universal, degenerat, neacoperit şi fără virgule.

Prin universalitatea codului genetic se înŃelege faptul că un anumit codon, codifică acelaşi AA la orice organism, indiferent de gradul său de evoluŃie, de la virusuri la om. Asta înseamnă că mesajul genetic al oricărui sistem biologic poate fi tradus de mecanismele de traducere ale oricărui alt sistem biologic. Dar, există şi excepŃii.

Astfel, codul genetic din mitocondrii şi de la unele protozoare prezintă mici deosebiri faŃă de codul standard. Dovada cea mai evidentă a universalităŃii codului genetic a fost următoarea: s-a izolat ARN-m ce răspunde de sinteza hemoglobinei la iepure şi s-a injectat în ovocitele de broască. S-a constatat că în ovocitele de broască se sintetzează hemoglobina, deşi în mod normal, ovocitele nu sintetizează niciodată hemoglobina.

Codul genetic este degenerat, în sensul că mai mulŃi codoni codifică acelaşi aminoacid (codoni sinonimi).

Caracteristica de degenerare a codului genetic se mai numeşte redundanŃă, termen preluat din informatică. RedundanŃa constă într-un exces de informaŃie, într-un sistem, pentru a asigura transmiterea corectă a informaŃiei, chiar în cazul unor perturbări.

Totuşi există şi fenomenul invers degenerării şi anume un codon poate codifica mai mulŃi aminoacizi. Aşa este cazul codonilor GCG care modifică alanina şi arginina; CGG – prolina şi arginina; AGG – glicina şi fenilalanina şi GGA – glicerina şi acidul glutanic.

Codul genetic este neacoperit în sensul că 2 codoni nu au nucleotide comune şi este fără virgule, între 2 codoni nu există spaŃii sau alŃi codoni care să joace rolul unor semne de punctuaŃie. Deci codonii sunt independenŃi şi bazele azotate dintr-o catenă de ADN se citesc todeauna secvenŃial, în aceeaşi direcŃie 5'→3', în grupuri de câte 3. AbsenŃa unui nucleotid (deleŃie) sau adăugarea altuia (adiŃie) schimbă sensul mesajului.

Structura genei

NoŃiunea de genă şi evoluŃia ei

Gregor Mendel a arătat că în celule există factori ereditari care determină

caracterele ereditare perechi în celulele somatice şi sub formă simplă în celulele sexuale. Termenul de genă (genos = urmaş) a fost introdus de Johannsen (1903), însă nu îl consideră ca pe o unitate fizică, ci ca pe un corespondent al factorilor ereditari imaginaŃi de G. Mendel.

În concepŃia geneticii clasice, gena prezintă 3 caracteristici de bază: unitate funcŃională, unitate mutaŃională şi unitate de recombinare.

25

Ca unitate funcŃională, gena este cel mai scurt fragment dintr-un cromozom, în interiorul căruia orice modificare afectează acelaşi caracter, deci gena este cea mai mică unitate care produce un anumit efect fenotipic.

Ca unitate mutaŃională, gena este cea mai mică parte dintr-un genom, care dă naştere prin mutaŃie la alelă sau alelele sale, cu caracter modificat.

Ca unitate de recombinare, gena este cel mai mic segment dintr-un cromozom, care se poate transfera prin crossing-over şi în interiorul căruia nu are loc crossing-over.

Acest mod de a defini gena s-a dovedit a fi simplist, deoarece chiar la începutul secolului XX s-a demonstrat că gena este o unitate genetică mult mai complexă, formată din sublocusuri sau subgene.

Apogeul în concepŃia clasică despre genă l-a constituit "o genă = o enzimă", concept elaborat de Beadle şi Tatum (1941).

Acest concept s-a perimat însă, evidenŃiindu-se că majoritatea proteinelor conŃin mai multe lanŃuri polipeptidice, fiecare lanŃ fiind sintetizat separat, după care se produce agregarea lor într-o proteină finală.

Cercetările lui Benzer la fagul T4 sunt cele care au condus la o înŃelegere nouă a noŃiunii de genă, ea fiind înlocuită cu noŃiunea de cistron. Benzer a demonstrat că ceea ce se considera până atunci că este o genă, nu era o unitate de structură şi funcŃie, ci ea putea fi subdivizată în alte subunităŃi funcŃionale, pe care le-a denumit cistroni, de la fenomenul biochimic cis-trans. În felul acesta, cistromul apare ca un sector de genă, sector care sintetizează un anumit polipeptid, ce intră în componenŃa moleculei de proteină (enzimă) sintetizată de întreaga genă.

Cercetători mai noi au demonstrat că unitatea mutaŃională este perechea de nucleotide, care în acelaşi timp este şi cea mai mică unitate de recombinare genetică.

Gena, în concepŃia geneticii moleculare este definită drept un segment din macromolecule de ADN (sau ARN-v) format dintr-o secvenŃă anumită de nucleotide care acŃionează ca o unitate funcŃională şi care conŃine informaŃia genetică ce determină secvenŃa nucleotidelor dintr-o moleculă de ARN (transcripŃie genetică) şi respectiv, a aminoacizilor într-o catenă polipeptidică (translaŃie genetică). Benzer a denumit muton, cea mai mică unitate a genei în care poate avea loc o mutaŃie, independentă de alta, recon, cea mai mică unitate în care are loc recombinarea genetică şi cistron, cel mai mic segment de ADN (sau genă) care poate funcŃiona unitar şi ale cărui limite pot fi stabilite prin testul cis-trans.

Din punct de vedere funcŃional, genele pot fi clasificate în: - gene structurale – ce determină secvenŃa AA într-o catenă polipeptidică; - gene reglatoare – ce controlează sinteza proteinelor prin intermediul unui

represor. Represorul este un factor polipeptidic cu rol de reglare. La eucariote, din grupul de gene structurale, fac parte o serie de gene numite

constitutive (menajere). Ele se exprimă permanent pentru că îndeplinesc funcŃii absolute vitale pentru toate tipurile de celule (genele pentru sinteza enzimelor respiraŃiei celulare). Genele constitutive contrastează evident cu altă categorie de gene structurale, care se exprimă numai în celulele puternic specializate. Ele sunt reduse ca număr de aceea sunt denumite şi de gene de lux. Aşa este gena pentru insulină care se exprimă numai în celulele pancreasului, deşi este prezentă în toate celulele din organism.

Din grupa genelor reglatoare, fac parte o serie de gene de importanŃă vitală, care acŃionează la începutul vieŃii embrio-fetale, cum sunt genele homeotice. Ele specifică factori proteici ce reglează transcripŃia unor gene structurale specifice.

În genomul oricărui organism se găsesc şi numeroase pseudogene. O pseudogenă este o genă nefuncŃională, care prezintă similitudini mari cu o anumită genă funcŃională cunoscută din alt locus. Datorită defectelor acumulate în structura sa, pseudogena nu poate fi transcrisă.

26

Structura genei la procariote

Modelul funcŃional al unei gene la procariote este modelul operonului. Există 3 categorii de gene la procariote: - genele structurale, genele reglatoare şi genele operatoare. Genele structurale – sunt segmente din macromolecule de ADN şi au rolul de a

determina secvenŃa AA în moleculele proteice. Genele reglatoare sunt localizate tot pe ADN şi au rolul de a sintetiza represorii

specifici ce controlează activitatea genelor structurale din subordine. Represorul nu interacŃionează direct cu genele structurale, ci prin intermediul

celui de-al treilea tip de gene, genele operatoare sau operator. Operatorul este o genă adiacentă genelor structurale, care are posibilitatea de a se combina sau nu cu represorul, inducând sau blocând funcŃionarea genelor structurale. Gena operatoare este un fel de comutator chimic, care declanşează sau nu intrarea în activitate a genelor structurale.

Înaintea operatorului şi genelor structurale este localizat promotorul, care iniŃiază procesul de transcripŃie a informaŃiei genetice de pe genele structurale. Ansamblul format din promotor, gena operatoare şi genele structurale se numeşte operon, ocupă un fragment din cromozom şi funcŃionează coordonat.

Cea mai importantă urmare a existenŃei operonilor formaŃi din mai multe gene structurale este sinteza unui ARN-m unic, comun pentru toate genele structurale (un operon – un mesager).

Structura genei la eucariote

Spre deosebire de procariote, la eucariote nu sunt reunite mai multe gene în

vederea funcŃionării comune, sub forma unui operon. Fiecare genă este independentă şi are propriile sale elemente de reglare. O altă deosebire faŃă de procariote este faptul că gena la majoritatea

eucariotelor nu este continuă, ci este alcătuită din secvenŃe cu rol informaŃional intercalate de secvenŃe cu rol informaŃional. SecvenŃele nucleotidice care specifică un produs funcŃional: ARN sau lanŃuri polipeptidice, sunt secvenŃe exprimabile şi se numesc exoni. SecvenŃele care nu specifică un produs, fiind neexprimabile se numesc introni. Prin urmare, alternanŃa exonilor şi intronilor conferă discontinuitatea genei la eucariote. Diverse gene de la eucariote au un număr diferit de exoni şi introni: gena β – globinei de la şoarece are 2 introni şi 3 exoni, gena ovalbuminei de la găină: 7 introni şi 8 exoni, genele proteinelor şocului termic de la Drosophila melanogaster nu conŃin introni.

Pentru a se realiza fenomenul de transcripŃie a ARN-m, se formează mai întâi un ARN precursor, care determină eliminarea segmentelor neinformaŃionale (a intronilor), sintetizându-se apoi un ARN-m care copie informaŃia genetică numai a exonilor.

Gene suprapuse şi gene săritoare

În cazul cromozomului bacterian şi viral, genele sunt dispuse liniar, într-o

anumită ordine alcătuind o singură grupă de linkage. Destul de recent, la fagul Ф x 174 s-au descoperit aşa numitele gene suprapuse,

ceea ce înseamnă că o anumită secvenŃă de codoni poate fi decodificată de mai multe ori, realizându-se sinteza a 2 catene polipeptidice diferite. Structura genomului fagului Ф x 174 a fost descifrată integral, fiind constituit din 9 gene, notate A,B,C,D,E.....J. Identificarea nucleotidelor din genomul virusului a permis delimitarea celor 9 gene, constatându-se că genele A şi B, precum genele D şi E sunt suprapuse. Gena B reprezintă partea terminală a genei A, care este mult mai mare, gena B fiind translată dintr-un punct de iniŃiere intern genei A. Totuşi genele A şi B determină sinteza a 2 proteine diferite.

27

Suprapunerea genelor înseamnă pe de o parte economie de material genetic, dar pe de altă parte poate fi şi un dezavantaj, deoarece apariŃia unei mutaŃii într-o genă determină modificarea şi celorlalte gene suprapuse. Genele suprapuse s-au observat şi la alŃi fagi: S13, SV40 etc.

Genele săritoare (jumping genes) sunt acele gene care se pot include în diferite regiuni ale cromozomului. De exemplu, la bacterii, s-au identificat segmente de ADN alcătuite din 800 – 2000 nucleotide care se pot însera în diferite regiuni ale cromozomului şi pot provoca mutaŃii. Aceste segmente de inserŃie şi au fost notate:IS1, IS2, IS3 şi IS4.

Factorul de fertilitate F, precum şi alte plasmide prezintă în structura lor normală şi fragmente IS. De exemplu, factorul F are segmentele de inserŃie IS2 şi IS3 ce determină capacitatea acestuia de a se integra în cromozomul bacterian.

Unele segmente de ADN ce determină rezistenŃa la antibiotice pot "sări" dintr-un locus în altul găsindu-se la nivelul unui plasmid, apoi în genomul fagului, apoi în cromozomul bacterian şi apoi iar în plasmid. Aceste gene săritoare sunt denumite transpozoni, fiind unităŃi independente, în funcŃie de rezistenŃa pe care o determină (streptomicina, penicilina, kanamicină, tetraciclină etc).

La eucariote, încă din anul 1951, Barbara McClintock studiind culoarea boabelor de porumb de-a lungul mai multor generaŃii a arătat că anumite structuri din masa genetică "sar" câte 1 – 2 generaŃii. După aproape 2 decenii s-a descoperit că este vorba despre o genă structurală ce deŃine informaŃia genetică şi alte 2 tipuri de gene ce controlează strict elementele de disociere la nivel cromozomic.

În anul 1983, B. McClintock a primit laurii Premiului Nobel, iar pe baza descoperirilor sale s-au formulat noi ipoteze privind geneza cancerului.

În general, se consideră că transpozonii determină o mare frecvenŃă de rearanjamente moleculare la nivelul macromoleculei de ADN (inversii, deleŃii, duplicaŃii, inserŃii) cu rol esenŃial în evoluŃie şi se pare, că şi în procesul de citodiferenŃiere.

Reglajul genetic al activităŃii genelor

Celula vie conŃine o cantitate mare de informaŃie genetică iar procesele metabolice ce au loc funcŃionează cu o mare eficienŃă, asigurând economisirea la maximum a energiei.

Cantitatea mare de informaŃie din celulele procariotelor şi eucariotelor permite funcŃionarea acestora în cele mai variate condiŃii de mediu. În timp ce virusurile posedă în programul lor genetic 3-4 gene, bacteriile 2.000-3.000 gene, plantele şi animalele superioare au un program genetic foarte complex, constituit din câteva zeci de mii de gene.

Genele ce alcătuiesc programul genetic al vieŃuitoarelor nu funcŃionează toate deodată, ci intră în funcŃie în mod succesiv, în funcŃie de tipul şi cantitatea de enzime şi proteine, pe măsura dezvoltării individului. FuncŃionarea celulei este dependentă de cele două laturi ale metabolismului: catabolismul (dezasimilaŃia), prin care o serie de substanŃe sunt descompuse şi se eliberează şi o anumită cantitate de energie şi anabolismul (asimilaŃia) în urma căreia se sintetizează substanŃe complexe din substanŃe simple. Fiecare etapă a asimilaŃiei şi dezasimilaŃiei este catalizată de o anumită enzimă, care la rândul ei este dependentă de informaŃia uneia sau a mai multor gene.

Reglajul activităŃii genetice la procariote

Teoria reglajului genetic la procariote a fost elaborat de geneticienii francezi

Francois Jacob, André Lwoff şi Jaques Monod, în anul 1961, realizare pentru care ei au fost distinşi, în anul 1965, cu premiul Nobel. În această lucrare ei demonstrează experimental şi practic că sinteza proteinelor şi a enzimelor variază în funcŃie de necesităŃile celulei şi este controlată genetic. F. Jacob şi J. Monod au descoperit mai multe moduri de reglare genică a sintezei proteice:

28

- inducŃia enzimatică; - represia enzimatică; - retroinhibiŃia enzimatică. InducŃia enzimatică este fenomenul prin care celulele produc sistemul enzimatic

necesar pentru metabolizarea substanŃelor care de obicei nu sunt prezente în mediu. ProprietăŃile enzimatice ale bacteriilor sunt influenŃate de mediul în care cresc,

fenomen denumit adaptare enzimatică, ceea ce conferă acestor organisme posibilitatea de a creşte în medii diferite.

J. Monod (1941) a descoperit fenomenul de diauxie prin care o bacterie ce creşte pe un mediu de glucoză şi lactoză, creşte şi se înmulŃeşte până ce glucoza este epuizată, iar după o perioadă de stagnare, creşte din nou şi se înmulŃeşte folosind însă lactoza.

Un exemplu de inducŃie enzimatică a fost descoperit la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) care poate să fermenteze lactoza din lapte cu ajutorul enzimei lactaza. Tulpinile de drojdie de bere, care au fost crescute mai multe generaŃii pe mediu de lactoză, vor conŃine în cantitate mare enzima lactaza, iar în acest caz, fenomenul de fermentaŃie începe foarte repede (aproximativ o oră de la incubaŃie). În cazul unor tulpini care nu au fost crescute în prealabil pe mediu de lactoză, fermentaŃia nu are loc pentru că acestor tulpini le lipseşte lactaza. Dacă aceste tulpini sunt Ńinute în continuare în mediu de lactoză, după aproximativ 14 ore, fermentaŃia se declanşează, fapt ce arată că lactoza induce producerea lactazei de către celulele drojdiei. În acest caz lactoza ce trebuie metabolizată acŃionează ca un inductor.

În concluzie se poate afirma că inducŃia enzimatică este caracteristică sistemelor de catabolism (dezasimilaŃie) fiind declanşată de substanŃe denumite inductori.

Represia enzimatică este un fenomen opus inducŃiei enzimatice, prin care este inhibată sinteza unei proteine datorită unui produs final al unui lanŃ metabolic denumit represor.

Fenomenul de represie enzimatică a fost pus în evidenŃă la bacteria Escherichia coli. Astfel, s-a demonstrat că sinteza aminoacidului triptofan este inhibată atunci când în mediul de cultură se adaugă cantităŃi mici de triptofan sau analogi ai acestuia. Represia enzimatică este caracteristică unor sisteme enzimatice ce intervin în anabolismul unor constituenŃi cu rol esenŃial în organism (aminoacizi, nucleotide). Represia enzimatică poate acŃiona asupra mai multor proteine ce fac parte din acelaşi lanŃ metabolic, prin intermediul represorului. Dacă un metabolit acŃionează asupra represorului suprimându-i activitatea, se deblochează sinteza tuturor enzimelor din acelaşi lanŃ metabolic. Efectul genetic al represorului constă în blocarea uneia sau a mai multor gene prin aceasta sistarea sintezei uneia sau a mai multor proteine specifice.

SubstanŃele capabile să modifice efectul de represie al represorului se numesc efectori. Efectorii pot fi inductori, când inhibă activitatea represorului şi corepresori, când intensifică activitatea de represie a represorului.

RetroinhibiŃia enzimatică denumită şi inhibiŃia prin feed-back sau inhibiŃia prin produs final este un sistem de reglare a sintezei proteice prin cantitatea de produs final. În cazul unui lanŃ metabolic, există mai multe etape, fiecare fiind catalizată de o anumită enzimă, rezultând un produs final. În cazul retroinhibiŃiei enzimatice, produsul final, într-o cantitate mai mare decât cea normală, acŃionează asupra enzimei din prima treaptă a lanŃului metabolic şi întreg lanŃul metabolic este oprit.

Fenomenul a fost studiat la bacteria Escherichia coli. Aminoacidul L-treonină se transformă într-un alt aminoacid, L-izoleucină în cinci etape, fiecare fiind catalizată de către o enzimă.

29

Represia enzimatică şi retroinhibiŃia enzimatică

în cazul căii metabolice ce asigură sinteza izoleucinei. În acest exemplu, cantitatea de izoleucină poate fi reglată atât prin retroinhibiŃie

enzimatică cât şi prin represie enzimatică. Prin retroinhibiŃie enzimatică, izoleucina în cantitate prea mare blochează activitatea primei enzime din lanŃul metabolic, treonină deaminază şi întreg lanŃul metabolic este oprit. Prin represie enzimatică, aminoacidul izoleucină blochează activitatea tuturor celor 5 enzime din lanŃul metabolic. Prin urmare sinteza izoleucinei este controlată printr-un sistem dublu, cele două sisteme fiind independente.

În cazurile de mai sus, produşii celulari sunt controlaŃi numai de produşii finali ai liniei metabolice respective. Sunt însă şi cazuri când unii produşi celulari sunt controlaŃi de produşii finali ai altei linii metabolice. De exemplu, bazele azotate purinice şi pirimidinice ce intră în alcătuirea acizilor nucleici sunt sintetizate de două linii metabolice paralele, dar cele două linii se reglează reciproc. Acest lucru are o mare importanŃă deoarece cele două grupe de baze trebuie că fie într-un anumit raport în momentul replicării acizilor nucleici. Experimental s-a demonstrat că proporŃia bazelor pirimidinice este controlată de produşii finali pirimidinele, dar şi de purine, astfel: pirimidinele în exces inhibă prima enzimă din lanŃul metabolic al pirimidinelor, iar purinele în exces stimulează activitatea aceleiaşi enzime. Prin acest proces, bazele azotate sunt sintetizate economic, exact în cantităŃile necesare replicării acizilor nucleici.

Reglajul activităŃii genelor la eucariote

Structura moleculară a cromozomului la eucariote este mult mai complexă decât la

procariote. Cromozomii eucariotelor sunt alcătuiŃi din: 13-16% ADN, 12-13% ARN şi 68-72% proteine histonice şi nehistonice. La eucariote, programul genetic este alcătuit dintr-un număr foarte mare de gene (câteva zeci de mii), gene care nu funcŃionează simultan, chiar mai mult, în unele celule diferenŃiate, majoritatea genelor sunt inactive. Toate aceste aspecte fac ca reglajul genetic la eucariote să fie mult mai complex, reglajul sintezei proteice realizându-se la nivelul genei şi nu la nivelul operonilor.

FuncŃionarea ADN al eucariotelor ca matriŃă pentru sinteza ARNm este dependentă de conformaŃia spaŃială tridimensională a nucleohistonelor. Superspiralizarea nucleohistonelor face ca ADN să nu poată funcŃiona ca matriŃă pentru ARNm. Ca regulă, cromatina condensată nu poate fi transcrisă, pe când cromatina difuză permite ca ADN să funcŃioneze ca matriŃă pentru ARNm, sinteza acestuia realizându-se în interfază.

La eucariote, reglajul activităŃii genelor are loc la trei niveluri: a) Reglajul la nivelul transcripŃiei, care constă în cuplarea proteinelor cromozomice

cu un segment din macromolecula de ADN de pe care trebuie să se transcrie informaŃia genetică şi în acest caz se blochează sinteza ARNm.

30

b) Reglajul la nivelul translaŃiei, ce constă în degradarea ARNm format prin transcripŃie de către enzime denumite nucleaze, localizate de o parte şi de alta a membranei nucleare.

c) Reglajul posttranslaŃional ce se manifestă la nivelul catenelor polipeptidice, unde intervin o serie de factori ce împiedică agregarea monocatenelor pentru a forma stucturi cuaternare, ştiindu-se că această structură este funcŃională.

În realizarea reglajului genetic la eucariote, un rol deosebit de important îl au proteinele cromozomice, histonele şi nehistonele, care împreună cu catena ADN şi ARN cromozomic formează cromatina.

Histonele sunt proteine bazice deoarece sunt bogate în aminoacizii bazici, arginina, lizina şi histidina şi complet lipsite de triptofan.

Histonele asigură stabilitatea structurii cromozomului şi sunt implicate în transcripŃia mesajului genetic, în mod nespecific.

Nehistonele sunt proteine cromozomice foarte variate ca structură şi funcŃie, cu o greutate moleculară cuprinsă între 10.000 şi 15.000 daltoni. Din grupul proteinelor nehistonice fac parte: ADN şi ARN polimerazele, enzimele ce intervin în sinteza şi degradarea proteinelor, proteinele cu rol structural şi reglator din cromozom.

Proteinele nehistonice reacŃionează în mod specific cu molecula de ADN, determinând transcripŃia diferenŃiată a genelor în funcŃie de Ńesut şi de celule, determinând ce gene vor fi transcrise, având un caracter reglator specific.

Modelul de reglaj genetic la eucariote este următorul: proteinele nehistonice se ataşează în mod specific la nivelul unei gene, care în mod obişnuit este represată de proteinele histonice. Între cele două tipuri de proteine are loc o reacŃie de fosforilare, prin care se eliberează un radical fosforic, în urma căreia complexul histonă-nehistonă rămâne încărcat negativ. Acest complex este respins de molecula de ADN a cărei sarcini electrice sunt tot negative, în această zonă, ADN eliberat de histone, putându-se realiza transcripŃia ARNm. În momentul în care gena respectivă încetează să mai funcŃioneze, se refac moleculele de histone pe segmentul respectiv de ADN.

La organismele eucariote reglajul genetic se realizează nu numai la nivelul genelor individuale ci la nivelul segmentelor cromozomice, a cromozomilor sau chiar a genomului.

Astfel, reglajul genetic se poate realiza şi prin heterocromatinizare. Heterocromatina este de obicei localizată în jurul centromerului şi în zona satelitului cromozomului. În zona heterocromatică, cromatina este puternic spiralizată iar ADN are o funcŃionalitate redusă.

Heterocromatina este de două tipuri: constitutivă şi facultativă. Heterocromatina constitutivă conŃine o cantitate mare de ADN repetitiv (redundant) formând de obicei gene nefuncŃionale. Heterocromatina facultativă rezultă din heterocromatinizarea unor regiuni eucromatice. Prin transferul unui segment eucromatic în apropierea heterocromatinei constitutive, acesta se heterocromatinizează şi invers.

Un alt fenomen este heterocromatinizarea unuia din cei doi cromozomi X de la sexul femel al mamiferelor, formând cromatina sexuală, astfel încât, la ambele sexe funcŃionează numai câte un cromozom X din perechea de cromozomi ai sexului. Acest fapt a fost demonstrat la multe organisme la care sexul femel este homogametic. Heterocromatinizarea unui cromozom X se realizează numai în celulele somatice, în celulele sexuale ambii cromozomi X sunt funcŃionali.

Se poate constata că, în cazul acesta, reglajul genetic se realizează la nivelul întregului cromozom, deoarece toate genele de pe cromozomul X sunt inactive.

Reglajul genetic se poate realiza la unele organisme prin inactivitatea întregului genom sau cu ajutorul unor hormoni.

În ultimă instanŃă diferenŃierea celulară la eucariote este tot un proces de reglaj genetic celular, deoarece în unele celule sunt activate numai anumite gene şi anume în celulele specializate.

31

Biosinteza proteinelor Proteinele au un rol esenŃial în metabolismul celular, însăşi funcŃiile materialului

genetic sunt condiŃionate de o serie de enzime sau proteine cu rol structural. Enzimele participă la replicarea ADN şi ARN, la transcripŃia informaŃiei genetice şi

la sinteza proteinelor. Proteinele structurale intră în alcătuirea cromozomului, a membranelor celulare, a

componentelor celulare, participă la asamblarea ribozomilor. Procesul de biosinteză a proteinelor este mult mai complex decât cel de sinteză a

acizilor nucleici şi cuprinde două etape importante: transcripŃia informaŃiei genetice şi translaŃia informaŃiei genetice.

TranscripŃia informaŃiei genetice TranscripŃia constituie fenomenul prin care informaŃia genetică de pe o porŃiune din

catena de ADN este transcrisă (copiată) într-o moleculă de ARNm. TranscripŃia mesajului genetic din molecula de ADN pe cea din ARNm se face într-o formă care serveşte ca matriŃă pentru sinteza proteinelor. Sinteza ARNm este catalizată de enzima ARN-polimeraza, enzimă universală ce a fost identificată în celulele bacteriene, vegetale şi animale.

Mecanismul propriu-zis al transcripŃiei informaŃiei genetice din ADN în molecula de ARNm se realizează astfel: enzima ARN-polimeraza se leagă specific într-o poziŃie a moleculei de ADN, ce corespunde cu începutul unei gene. Legăturile de hidrogen se rup pe porŃiunea genei respective, segmentul respectiv de catenă se roteşte cu 180° în spaŃiu, servind ca matriŃă pentru sinteza catenei de ARNm. ARN-polimeraza asigură încatenarea corectă a ribonucleotidelor existente în nucleu. Odată cu înaintarea ARN-polimerazei de-a lungul matriŃei ADN, se eliberează treptat noua catenă în citoplasmă, unde se asociază cu ribozomii formând complexe denumite poliribozomi.

După ce s-a realizat transcripŃia, se refac legăturile de hidrogen între catenele moleculei de ADN.

De o foarte mare importanŃă este descoperirea că procesul de transcripŃie la nivelul unei gene se realizează pe o singură catenă de ADN. Aşa se explică faptul că o genă deŃine informaŃia genetică necesară sintezei unei singure proteine.

În ceea ce priveşte locul de pe catena de ADN unde se iniŃiază procesul de transcripŃie, J. D. Watson (1974) arată că ARN-polimeraza este cea care recunoaşte codonii de iniŃiere.

Spre deosebire de ADN-polimeraza care este formată dintr-un singur lanŃ polipeptidic, ARN-polimeraza este alcătuită din cinci lanŃuri polipeptidice notate cu β', β, δ, α2 şi W, fiecare cu o masă moleculară diferită. Enzima poate să catalizeze formarea legăturilor dintre nucleotide, chiar dacă lipseşte lanŃul δ, deci acest lanŃ nu are rol catalitic, ci acela de a recunoaşte catena matriŃă şi secvenŃa de dezoxiribonucleotide, de unde se iniŃiază transcripŃia. PoziŃia din molecula ADN unde se leagă ARN-polimeraza pentru a iniŃia transcripŃia se numeşte promotor. Încheierea transcripŃiei ARNm este controlată de o proteină specifică numită factor σ.

În sens mai larg, transcripŃia se referă şi la sinteza celorlalte două tipuri de ARN implicate în procesul de biosinteză a proteinelor.

Acidul ribonucleic solubil sau de transfer (ARNs) se sintetizează tot pe o matriŃă de ADN. Fiecare tip de ARNs este codificat de câte o singură secvenŃă de nucleotide din ADN, deci de câte o genă. Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr) este produsul direct al mai multor gene. Detalii despre ARNs şi ARNr au fost precizate într-un paragraf anterior.

32

TranslaŃia informaŃiei genetice TranslaŃia este mecanismul prin care secvenŃa codonilor din ARNm este tradusă într-

o anumită succesiune de aminoacizi ce intră în constituŃia unui lanŃ polipeptidic. Realizarea procesului de translaŃie implică participarea mai multor componente celulare ce alcătuiesc un aparat de translaŃie. Aparatul de translaŃie cuprinde următoarele elemente: diferite tipuri de ARNs corespunzătoare tipurilor de aminoacizi, aminoacizii, ribozomii, enzimele activatoare ale aminoacizilor, cofactorii energetici, ATP şi GTP, factori de iniŃiere, alungire şi terminare a sintezei lanŃului polipeptidic.

Pentru sinteza celulară a proteinelor este necesară o anumită cantitate de energie, formarea unei singure legături peptidice necesitând 0,5 kcal/mol. Această energie este asigurată de acidul adenozintrifosforic (ATP) care, prin hidroliză, pune în libertate unul sau doi radicali fosforici eliberând energia corespunzătoare:

ATP + H2O AMP + P ∼ P + 8 kcal/mol

Sinteza proteică se desfăşoară concomitent cu hidroliza ATP în AMP şi doi radicali fosforici, rezultând 8 kcal/mol, din care 0,5 kcal/mol sunt folosite pentru realizarea legăturii peptidice iar restul de 7,5 kcal/mol pentru menŃinerea echilibrului reacŃiei în favoarea sintezei proteice şi nu a hidrolizei.

O primă etapă în sinteza proteinelor o constituie activarea aminoacizilor şi formarea complexului aminoacil-ARNs. Activarea aminoacizilor se realizează cu ajutorul energiei rezultate din hidroliza ATP şi în prezenŃa enzimei aminoacilsintetaza (E). ReacŃia de activare a aminoacizilor poate fi redată astfel:

AA1 + ATP + E AA1 ∼ AMP ∼ E + P ∼ P

Aminoacizii, după ce au fost activaŃi, se pot ataşa de molecula unui ARNs specific:

AA1 ∼ AMP ∼ E + ARNs1 AA1 - ARNs1 +

+ AMP + E

Cele două reacŃii au loc succesiv, sunt catalizate de aceeaşi enzimă

(aminoacilsintetaza) şi ca atare se poate scrie reacŃia generală: aminoacilsintetaza

AA1 + ATP + ARNs1 AA1 - ARNs1 +

+ AMP + P ∼ P

În următoarea fază complexul aminoacil-ARNs se ataşează de poliribozomi, la nivelul cărora are loc iniŃierea sintezei lanŃului proteic. Ribozomul asigură de aşa manieră asocierea acestor elemente încât zona anticodon a ARNs să poată recunoaşte codonul corespunzător din ARNm, ducând astfel la o descifrare corectă a mesajului genetic. După fixarea aminoacidului, ARNs devine liber putând transporta alte molecule de aminoacid la nivelul ribozomului. Încatenarea aminoacizilor se realizează de către enzima peptidiltransferaza şi constă în realizarea legăturilor peptidice între gruparea carboxil a unui aminoacid şi gruparea aminică a celuilalt.

ReacŃia de încatenare a aminoacizilor poate fi redată astfel:

33

peptidiltransferaza

AA1 - ARNs1 + AA2 - ARNs2 + AA3 - ARNs3 +…

AA1 - AA2 - AA3 … + ARNs1 + ARNs2 + ARNs3 + …

Încheierea sintezei catenei polipeptidice se realizează cu ajutorul a doi factori proteici care sunt activaŃi în prezenŃa codonilor de încheiere UAA, UAG şi UGA. Ca urmare, catena polipeptidică se detaşează de ribozomi şi de ARNs care a adus ultimul aminoacid.

În ceea ce priveşte viteza cu care se realizează biosinteza proteică, există o serie de date atât la procariote cât şi la eucariote. TranscripŃia genei ce determină sinteza enzimei ce intervine în producerea triptofanului la Escherichia coli are loc cu o viteză de 28 nucleotide/sec., iar translaŃia cu viteza de 7 aminoacizi/sec. O moleculă completă de hemoglobină umană este sintetizată în 35 secunde (gena ce determină hemoglobina conŃine 670 nucleotide).

În prezent s-a reuşit sinteza unor substanŃe proteice într-un sistem celular liber (populaŃii de celule la care s-a distrus membrana celulară), folosind ARNm artificial (M. W. Niremberg, 1961).

Ereditatea extranucleară

Prin fenomenul de ereditate extranucleară se înŃelege moştenirea caracterelor şi însuşirilor

organismului prin elementele citoplasmatice.

Metode de evidenŃiere a eredităŃii extranucleare

Ereditatea extranucleară se evidenŃiază prin mai multe metode: - fecundarea unui ovul anucleat de la o specie, cu un spermatozoid de la altă specie

(merogonie); - hibridarea reciprocă; - prin intermediul incluziunilor şi organitelor citoplasmatice; - testul heterocarion; - segregarea nemendeliană;

Fenomenul merogoniei

Prin merogonie se înŃelege formarea unui embrion prin fecundarea unui ovul

anucleat cu un spermatozoid normal. Din fecundarea unui ovul anucleat cu un nucleu străin, rezultă un zigot haploid, deoarece posedă nucleul patern, haploid şi citoplasmă maternă. În astfel de cazuri, nu se obŃin organisme mature deoarece zigoŃii, din cauza perturbării raportului dintre nucleu şi citoplasmă, mor într-un stadiu timpuriu.

Primele indicaŃii asupra existenŃei acestui fenomen au fost experienŃele embriologului T. Boveri (1899). El a folosit ovule de arici de mare pe care le-a centrifugat puternic, astfel încât membrana lor s-a rupt, nucleul fiind expulzat. Aceste ovule anucleate au fost fecundate cu spermatozoizi de la o specie înrudită – crinul de mare. Larvele obŃinute erau haploide şi conŃineau pe lângă caracterele tatălui şi caracterele materne, transmise prin intermediul citoplasmei ovulului.

În afară de metoda centrifugării, nucleii din ovul pot fi îndepărtaŃi şi cu ajutorul micromanipulatorului, prin operaŃii de microdisecŃie, sau cu ajutorul unei micropipete, prin aspirare.

O altă metodă folosită este distrugerea nucleilor din celulă cu ajutorul şocurilor de temperatură, a radiaŃiilor ionizante, a razelor ultraviolete sau a unor substanŃe chimice.

34

Folosind unele din aceste metode I. Danielli şi colab. (1957) au înlocuit nucleii de la Amoeba discoides, cu nucleii de la Amoeba proteus. Nucleii transplantaŃi au suferit influenŃa citoplasmei străine, modificându-şi forma în sensul nucleilor de la Amoeba discoides.

Cercetări interesante de acest gen s-au efectuat şi cu specii din genul Triton (Triton

palmatus şi Triton cristatus) de către Paula Hertwig (1936, 1942), V. Curry (1931) ş.a., în care nucleii din ovule au fost distruşi prin iradiere. Ereditatea citoplasmatică a fost pusă în evidenŃă la embrionii proveniŃi prin fecundarea acestor ovule cu nucleii de la altă specie. Embrionii însă se dezvoltau numai până în faza de blastulă, apoi mureau.

ElveŃianul E. Hadorn (1955) a reuşit să înlăture acest neajuns procedând în felul următor: fecundează ovule anucleate de Triton palmatus cu spermatozoizi de la specia Triton

cristatus. Din embrionii rezultaŃi a desprins o porŃiune de epidermă şi a transplantat-o pe embrionii speciei Triton alpestris. Indivizii rezultaŃi aveau porŃiunea de epidermă transplantată asemănătoare ca aspect şi culoare cu cea de la Triton palmatus. Citoplasma ovulului de Triton palmatus şi-a imprimat deci caracterele epidermei transplantate, la embrionul nou format.

Ereditatea extranucleară în hibridarea reciprocă

În încrucişările formelor îndepărtate (interspecifice şi intergenerice), apare foarte

frecvent fenomenul de matroclinie, prin care se înŃelege transmiterea evidentă a unor caractere materne. De aceea, la astfel de hibridări nu este indiferent care dintre cele două specii constituie forma maternă sau paternă.

Practica a demonstrat că la hibridarea dintre Equus caballus şi Equus asinus se obŃin hibrizi a căror mărime şi constituŃie este asemănătoare formei materne. Din hibridarea dintre ♀ Equus caballus şi ♂ Equus asinus rezultă catârul (Equus mullus), de mărimea şi conformaŃia lui Equus caballus, iar din hibridarea dintre ♀ Equus asinus şi ♂ Equus caballus rezultă bardoul (Equus hinnus) de mărimea şi conformaŃia lui Equus asinus. Cei doi hibrizi se deosebesc foarte mult ca mărime, culoare, forŃă ş.a., deşi, în celulele somatice au acelaşi număr de cromozomi, (2n = 63).

Testul heterocarion

Prin heterocarion se înŃelege o celulă în care, pe lângă nucleul propriu, mai există

inclus un nucleu străin. În urma includerii unui nucleu străin se formează un dicarion, o celulă cu doi nuclei. Fenomenul a fost pus în evidenŃă la ciupercile inferioare, care se înmulŃesc asexuat.

Realizări în această direcŃie au fost obŃinute de către R.E. Wright şi J. Lederberg (1957) la drojdia de bere, Saccharomyces cerevisiae. Dacă notăm, la o primă celulă nucleul cu A şi citoplasma cu α, iar la a doua celulă nucleul cu B şi citoplasma cu β, dicarionul, format prin transferul nucleului B în celula α va deveni AB. În descendenŃa acestuia vor rezulta celulele cu A α şi B β. Cu această ocazie se constată că celulele B manifestă caracteristici ale celulei A. Rezultă că, aceste caracteristici sunt transmise prin citoplasma α şi nu de nucleu (figura 9.1).

Schema formării celulelor heterocarion

35

Segregarea nemendeliană

Există la drojdia de bere, Saccharomyces cerevisiae, o mutantă determinată de o genă recesivă homozigotă “petite” şi care determină formarea unor colonii mici autosterile. Prin fuzionarea unor celule haploide mutante cu celule haploide normale se formează celule heterocarion, fertile, ce se înmulŃesc prin înmugurire şi formează colonii normale. În anumite condiŃii celulele haploide mutante şi normale pot fuziona pe cale sexuată dând naştere unei asce cu patru ascospori haploizi, doi cu gene normale şi doi cu gene mutante. Cu toate acestea, toŃi cei patru ascospori, prin înmulŃire sexuată, au dat naştere la colonii normale. Lipsa de segregare care ar fi trebuit să se producă în raport de 1:1 dovedeşte că expresia fenotipică a celor patru ascospori este de natură citoplasmatică.

Tot la drojdia de bere B. Ephrussi, H. Hottingner şi H. Roman (1955) au studiat o altă mutantă denumită “suppressive petite”. Din fuzionarea unei celule mutante cu o celulă normală s-au obŃinut în descendenŃă asce cu ascospori normali şi mutanŃi în proporŃie egală, deşi ambele conŃin acelaşi genotip. Aceasta dovedeşte că segregarea nemendeliană a fost influenŃată de către citoplasmă.

Segregarea somatică se manifestă în cazul înmulŃirii vegetative şi se explică prin distribuirea inegală a structurilor citoplasmatice implicate în determinarea unor caractere. Această situaŃie imprimă la organisme un aspect de pestriŃ sau vărgat.

Un exemplu ni-l oferă segregarea plastidelor în cazul plantei Mirabilis jalapa var. “albomaculatus” la care, plante pestriŃe conŃin plastide verzi şi albe.

Acestea se repartizează prin mitoză în mod întâmplător în citoplasma celulelor fiice. Când din astfel de celule se formează celulele mamă ale megasporilor şi în continuare celule sexuale, acestea vor conŃine proplastide verzi, albe sau de ambele tipuri. În urma fecundării se vor dezvolta plante verzi, albe sau pestriŃe.

Manifestarea eredităŃii extranucleare

Tipurile de manifestare a eredităŃii extranucleare îmbracă diferite forme şi ele depind

de structurile din citoplasmă care poartă şi transmit anumite caractere.

Ereditatea prin plastide

E. Baur a studiat ereditatea culorilor mozaicate, la Pelargonium zonale. Această plantă

posedă frunze pestriŃe (alb-gălbui cu verde). Observând la microscop secŃiuni din aceste frunze, se constată existenŃa unor grupe de celule cu plastide necolorate în epiderma şi sub epiderma frunzei, în timp ce în partea centrală a ei se găsesc plastide verzi (cloroplaste). La această plantă pot să apară, uneori, atât ramuri cu frunzele pestriŃe, cât şi ramuri cu frunze verzi sau albe. Executând hibridări între flori de pe ramuri cu frunze diferite, el obŃine seminŃe care produc în majoritatea cazurilor plante ce au caracterele frunzelor de la forma mamă.

Aceste încrucişări ne arată că transmiterea cloroplastelor la urmaşi se realizează prin citoplasma celulei ou şi într-o mică măsură de către spermatie, care are o cantitate mică de citoplasmă.

C. Correns, descrie un caz de ereditate citoplasmatică la Mirabilis jalapa. Această plantă are ramuri cu frunze verzi, albe şi mozaicate. El a efectuat polenizarea florilor de pe ramurile verzi, albe şi pestriŃe, cu polenul de la florile acestor trei tipuri. Plantele pe care le-a obŃinut din seminŃe au avut caracterul mamei în ceea ce priveşte culoarea frunzelor. Fenomene asemănătoare au fost observate la Anthirrinum sp., Plantago sp., Humulus sp. ş.a.

36

Ereditatea prin intermediul incluziunilor citoplasmatice

În afară de mitocondrii sau plastide, prin citoplasmă se transmit şi particule submicroscopice ce au proprietatea de a se reproduce odată cu diviziunea celulei. Aceste particule nu sunt deocamdată elemente separabile ale celulei vii, dar pot fi responsabile pentru transmiterea unor însuşiri pe linie maternă.

Un exemplu de acest fel este transmiterea din generaŃie în generaŃie a sensibilităŃii Drosophilei la CO2. Cercetătorul francez Ph. L'Héritier şi colaboratorii (1937), au descoperit linii de Drosophila sensibile la CO2. De obicei, Drosophila care trăieşte în atmosfera de CO2 rezultat în urma fermentaŃiilor (de fructe, struguri etc.) este rezistentă la acest gaz. Pentru a verifica ipoteza că sensibilitatea la CO2 se transmite prin citoplasmă, autorii au înlocuit cromozomii de la aceste linii cu cromozomii normali de la muştele normale. Pentru aceasta, au efectuat încrucişări între femelele sensibile la CO2, cu masculi rezistenŃi la CO2. Au realizat indivizi sensibili la CO2. În cazul când s-au încrucişat masculi sensibili la CO2 cu femele rezistente la CO2 au realizat indivizi normali. Femelele hibride sensibile la CO2 au fost din nou încrucişate cu masculi normali. DescendenŃii femeli au fost din nou încrucişaŃi cu masculi normali. După mai multe retroîncrucişări au rezultat forme materne cu nucleul de la forma paternă. Cu toate acestea, descendenŃele prezentau sensibilitate la CO2. Însuşirea de sensibilitate la CO2 s-a transmis prin citoplasmă.

Concluzia acesta a fost verificată prin metoda injectării de hemoglobină de la Drosophila sensibilă la CO2 la femelele de Drosophila normale. Acestea au produs indivizi sensibili la CO2.

Toate acestea demonstrează că sensibilitatea la CO2 se transmite prin particule din citoplasmă care au fost denumite “sigma”.

Androsterilitatea citoplasmatică şi nucleo-plasmatică

Androsterilitatea (sterilitatea masculă) este însuşirea plantelor de a nu produce polen,

sau de a produce polen steril. Fenomenul acesta a fost studiat foarte mult la porumb şi are importanŃă pentru producerea hibrizilor simpli şi dubli, obŃinuŃi din încrucişarea liniilor consangvinizate.

Se cunosc trei tipuri de androsterilitate: nucleară, citoplasmatică şi nucleo-plasmatică. Prima se cunoaşte de multă vreme şi a fost sesizată la multe plante. La porumb, Emerson, Beadle şi Frase (1935) comunicau existenŃa a mai mult de 25 gene ce produc androsterilitatea.

Această sterilitate nu a putut fi folosită în lucrările de ameliorare deoarece din cauza segregării, în descendenŃă, apar şi plante fertile.

Androsterilitatea ce se moşteneşte pe calea citoplasmei se transmite în descendenŃă de către partenerul femel şi ea se foloseşte în lucrările de ameliorare. A fost descoperită la o plantă sterilă de porumb de Peru de către Rhoades (1931, 1933). Încrucişând descendenŃele cu aceeaşi formă paternă, nu s-a modificat în descendenŃă caracterul de androsterilitate. S-a ajuns la concluzia că în acest caz, androsterilitatea este determinată exclusiv de citoplasmă.

Totuşi, Rhoades dă unele date care ne arată că în unele cazuri, în urma polenizării libere la porumb, pot apărea în descendenŃă şi plante fertile sau parŃial fertile. Deci acest caracter depinde şi de genele nucleare care intră în acŃiune cu genele din citoplasmă (ereditatea nucleo-plasmatică).

Numeroase linii care posedă polen fertil, prin încrucişare produc forme cu polen steril. În aceste cazuri, genotipul nu influenŃează caracterul de androsterilitate, moştenirea realizându-se pe cale citoplasmatică. Au fost totuşi găsite linii cu factori genotipici capabili de a restabili fertilitatea polenului în urma încrucişării cu forme androsterile citoplasmatic.

Tipurile de androsterilitate se deosebesc după gradul de sterilitate şi după comportarea lor la încrucişarea cu diferite linii fertile. Se pot obŃine descendenŃe fertile, parŃial fertile sau sterile.

37

Restaurarea fertilităŃii. Se întâlnesc rare cazuri când androsterilitatea la porumb se moşteneşte numai prin citoplasmă, în mod independent faŃă de genotip. Există cazuri când genotipul inhibă acŃiunea citoplasmei ce produce sterilitatea polenului, precum şi cazuri când din contra, citoplasma poate influenŃa genotipul provocând androsterilitatea nucleară. Caracterul de androsterilitate este condiŃionat deci de interacŃiunea dintre genotip şi citoplasmă. Această interacŃiune este studiată cel mai bine la tipul T (Texas).

Cercetătorii Jones (1950), Rogers (1954), Eckardt (1954), Thomas şi Johnson (1956), au emis ipoteza că restabilirea fertilităŃii polenului la timpul Texas se datorează prezenŃei a două gene dominante existente la linia care restabileşte fertilitatea.

Cele trei tipuri de androsterilitate: nucleară (I), citoplasmatică (II) şi nucleo-citoplasmatică (III)

După comportarea lor faŃă de liniile sterile, liniile consangvinizate pot fi clasificate: 1. linii fixatoare de sterilitate; 2. linii restauratoare de fertilitate; 3. linii semirestauratoare de fertilitate (semifixatoare de sterilitate). Trebuie menŃionat că liniile consangvinizate de porumb se comportă în mod deosebit

faŃă de diferite tipuri de sterilitate. Uneori, aceeaşi linie poate fi restauratoare pentru un tip de androsterilitate şi fixatoare pentru alt tip.

Pentru a urmări comportarea plantelor faŃă de androsterilitate în funcŃie de acŃiunea genelor din citoplasmă şi nucleu vom nota cu S gena ce produce sterilitatea, cu F gena ce asigură fertilitatea şi cu R gena restauratoare de fertilitate.

În această figură se poate urmări modul de acŃiune a genelor la cele trei tipuri de androsterilitate.

Folosirea androsterilităŃii în producerea de hibrizi reduce lucrările de castrare a plantelor şi cheltuielile de producŃie. Pentru producŃie se lucrează la obŃinerea de linii consangvine, acestea se încrucişează şi formează hibrizi simpli, iar aceştia din urmă încrucişaŃi produc hibrizi dubli cultivaŃi în producŃie.

38

Schema pentru obŃinerea de hibrizi dubli pe bază de androsterilitate

Aparatul genetic al eredităŃii extranucleare

ExistenŃa unui aparat al eredităŃii extranucleare a fost dovedită în primul rând prin prezenŃa, rolul şi funcŃiile acizilor nucleici în organitele citoplasmatice, cloroplaste şi mitocondrii. S-a admis, în general, că în citoplasmă se găsesc plasmagene spre deosebire de genele nucleare numite cromogene.

ADN din citoplasmă prezintă unele caracteristici care-i conferă proprietatea de a înmagazina şi transmite o informaŃie ereditară. Pe lângă ADN, organitele celulare conŃin şi ribozomi, enzime, ARNr şi ARNs. Acestea constituie un aparat genetic care poate funcŃiona relativ independent faŃă de cel nuclear.

ADN din organite are o structură bicatenară ca şi cel nuclear, dar diferă prin greutate moleculară (60-70 x 106 dal cel din mitocondrii) şi este de 100 ori mai mult în cloroplaste. DiferenŃe se constată şi în ceea ce priveşte raportul de baze, timpul de denaturare şi renaturare. Din această cauză nu se pot obŃine hibrizi moleculari între ADN citoplasmatic şi cel nuclear. ADN din organite se replică independent de ADN nuclear.

O altă deosebire constă în faptul că în cloroplaste şi mitocondrii ADN are formă circulară, se replică după tipul semiconservativ, independent de ADN nuclear.

Deosebirile ADN din cloroplaste şi mitocondrii faŃă de acel nuclear şi asemănarea lui cu ADN întâlnit la bacterii, alge albastre ş.a., au dus la presupunerea că aceste organite, cândva, au dus o viaŃă independentă ca procariote şi cu timpul, pătrunzând în celule, au realizat o simbioză. Ele au stabilit unele relaŃii cu celula, în afara căreia nu mai pot exista. Descoperirile din acest domeniu au dus la formularea unei teorii privind originea exogenă a organitelor citoplasmatice.

Tot în celulă se mai găsesc şi alte structuri cu rol genetic, cum ar fi particulele Kappa, sigma şi alte plasmagene, încă nelocalizate. La unele din ele a fost pusă în evidenŃă prezenŃa ADN. Şi pentru aceste structuri există părerea că ar avea o origine exogenă, dar cercetările care s-au întreprins nu au lămurit complet structura şi funcŃia unui aparat genetic propriu.

Sisteme genetice pentru controlul reproducerii organismelor

Comportarea şi transmiterea caracterelor ereditare la eucariote depind foarte mult de

modul de reproducere al organismelor. Există două moduri, principale de reproducere:

39

reproducerea asexuată, în care se poate include şi înmulŃirea vegetativă şi reproducerea sexuată.

Ereditatea în cazul reproducerii asexuate şi sexuate

În cazul înmulŃirii asexuate, în general, toate caracterele organismelor se transmit ca atare la descendenŃi. DescendenŃele poartă numele de clone sau suşe. În rare cazuri, se pot produce şi modificări ereditare prin mutaŃii de genă, genom sau restructurării cromozomale, care se transmit la urmaşi. Acest mod de înmulŃire, prezintă unele avantaje pentru producŃie, deoarece, pot perpetua la urmaşi, caractere constante (pomi, viŃă de vie, cartof ş.a.).

Ereditatea în cazul reproducerii sexuate îmbracă forme mai complexe, deoarece indivizii rezultaŃi pe această cale, reprezintă organisme în care au loc, atât o continuitate genetică cât şi o recombinare de caractere. Reproducerea sexuată se realizează cu ajutorul gameŃilor, produşi de un singur organism (hermafrodite sau monoice), sau de organisme de sex diferit (bisexuate sau dioice).

Hibridarea sexuată constituie o importantă metodă de analiză genetică. Cu ajutorul acesteia, se evidenŃiază modul de transmitere a caracterelor de la o generaŃie la alta. Pentru ameliorarea plantelor şi animalelor, constituie o importantă metodă de ameliorare deoarece se pot întruni într-un organism nou (hibrid), caracteristici ereditare, de la doi părinŃi cu eredităŃi diferite.

Hibridarea ca metodă de înmulŃire şi creare de forme noi, se practică de mult timp. Cercetări în această direcŃie, din partea oamenilor de ştiinŃă, se fac de abia de la sfârşitul secolului al XVII-lea. Începând cu a doua jumătate a secolului al XIX-lea, în urma descoperirii unor legi cu privire la modul de transmitere a caracterelor, hibridările încep să se aplice în mod ştiinŃific, întocmindu-se totodată, o evidenŃă genealogică a ascendenŃilor şi descendenŃilor.

Există multe criterii de clasificare a hibridărilor; cele mai importante, fiind următoarele:

1. łinând seama de factorii care contribuie la realizarea hibridării, deosebim: hibridarea naturală şi hibridarea artificială.

2. Din punct de vedere al gradului de înrudire a formelor parentale, deosebim: hibridarea apropiată, în care părinŃii aparŃin unor soiuri sau varietăŃi botanice apropiate şi hibridarea îndepărtată, în care ele aparŃin unor specii sau chiar genuri diferite.

3. După numărul formelor parentale care participă la încrucişare, deosebim o hibridare simplă (A x B), dublă (A x B) x (B x C), triplă (A x B) x C sau complexă etc.

În cele ce urmează ne vom referi la diferite forme de hibridare, precum şi la unele forme de interes teoretic şi practic.

Ereditatea în cazul unor forme particulare de reproducere

La unele plante şi animale embrionul nu este rezultatul unui proces de fecundare la care participă cei doi gameŃi, ci el poate lua naştere din elementele nefecundate ale sacului embrionar sau din celulele nucelei sau integumentelor, fenomen numit apomixie. Dintre formele apomictice fac parte partenogeneza şi apogamia.

Partenogeneza poate fi accidentală sau permanentă, haploidă, cu n cromozomi sau diploidă atunci când celula din care ia naştere embrionul este diploidă. Embrionul poate să se formeze dintr-un ovul nefecundat (ginogeneză) sau dintr-o celulă masculă (androgeneză). Partenogeneza duce la moştenirea caracterelor numai de la părintele din care a luat naştere. Starea haploidă prezintă unele avantaje în cercetările de genetică deoarece genele nu au pereche alelică, sunt hemizigote, ceea ce permite analiza lor şi, totodată, prin diploidizare se pot obŃine organisme perfect homozigote. Asemenea caracteristici prezintă şi reproducerea apogamică când embrionul se formează dintr-o sinergidă sau antipodă.

40

Polispermia este fenomenul prin care o celulă sexuală femelă este fecundată de mai mulŃi gemeŃi masculi. GameŃii pot fecunda celula sexuală femelă sau se pot resorbi în citoplasmă. Individul care se naşte poartă caracterele mai multor forme paterne.

Poliembrionia ia naştere prin dezvoltarea unor embrioni suplimentari, fie din celulele terminale ale proembrionului sau din sinergide şi antipode în interiorul sacului embrionar (poliembrionia de gameŃi), fie din celulele nucelei şi integumentelor care pătrund în sacul embrionar (poliembrionie de metamorfoză). Fenomenul este mai frecvent la citrice, rosacee, trifoi ş.a. Ereditatea lor depinde atât de forma maternă cât şi de forma paternă, care au participat la formarea zigoŃilor.

Xenia este fenomenul prin care nucleul spermatic care fecundează nucleul secundar al sacului embrionar imprimă unele caractere ale formei paterne. Un exemplu îl constituie formarea pe ştiuletele de porumb a unor boabe de altă culoare decât cea a soiului matern.

Sisteme genetice pentru controlul reproducerii

Plante autogame se polenizează cu polen propriu, fenomen care nu afectează vitalitatea plantelor şi determină un grad avansat de homozigoŃie. Procentul de polenizare între plantele autogame, în mod natural, este foarte mic. Artificial, ele pot fi hibridate prin intervenŃia omului.

Plantele alogame şi unele plante sau animale hermafrodite pretind o polenizare sau fecundare străină. Modul de reproducere alogam asigură vigoarea descendenŃei.

La microorganisme, cum ar fi la ciuperci, contopirea hifelor haploide genetic diferite are loc numai atunci când există între ele diferenŃe notate cu + şi – (sistem heterotalic). DiferenŃele sunt condiŃionate de o pereche de alele ce ocupă un singur locus (J.L. Brewbaker, 1964). La bacterii conjugarea nu poate să aibă loc decât atunci când una din ele, conŃine un factor de fertilitate (F+) şi care lipseşte la cea de a doua (F-).

La plantele superioare există mai multe sisteme de incompatibilitate ce împiedică autofecundarea:

- Incompatibilitatea heteromorfică depinde de structura florii (staminele ies mult în afară corolei sau rămân mult în interior, în timp ce, stilul se găseşte la distanŃă mare). O altă cale constă în înflorirea nesincronă a inflorescenŃelor mascule şi femele: protandrie când înfloresc mai întâi inflorescenŃele mascule (porumb) sau protoginie când inflorescenŃele femele înfloresc primele. Alături de aceste căi mai există diferite complexe, cum ar fi complexul entomofil (culoarea florii şi prezenŃa parfumului şi a nectarului pentru a atrage insectele ce transportă polenul) sau complexul anemofil (prezenŃa unor saci cu aer în polen, pentru a putea pluti în aer).

- Incompatibilitatea genetică este dictată de o serie de gene alele care împiedică autofecundarea (genele autosterilităŃii). Acesta poate fi gametofitică sau sporofitică.

- Incompatibilitatea gametofitică - în acest caz polenul nu poate germina dacă în el şi în Ńesuturile ovarului, stilului şi stigmatului se găsesc aceleaşi alele, de exemplu S1S2 (figura 10.1.a). Când incompatibilitatea se referă numai la unii grăunciori de polen căzuŃi pe stigmat în timp ce alŃii, de pe acelaşi stigmat, germinează, ea poartă numele de semi-incompatibilitate. De exemplu, polenul are constituŃia S1S3 iar ovarul, stilul şi stigmatul S1S2. În acest caz, numai polenul S3 germinează şi nucleul său spermatic produce fecundarea unindu-se cu S2 (figura 10.1.b). A treia situaŃie o formează alelele compatibile care fiind heterozigote S1S2 în ovar şi S3S4 în polen, fecundarea este posibilă (figura 10.1.c).

Sistemele genetice de incompatibilitate au fost studiate la Trifolium, Oenothera,

Prunus, Gramineae, Solanaceae ş.a - Incompatibilitatea sporofitică. Acest sistem este mai puŃin răspândit la plante, la

circa 1/3 din ele. Şi în acest caz este implicat locusul S cu o serie de alele. Comportarea polenului nu depinde de constituŃia genetică a polenului ci de genotipul diploid al plantei care îl produce. Între alelele din polen şi stil există relaŃii de dominanŃă şi recesivitate. De

41

exemplu, dacă în polen S1 manifestă dominanŃă faŃă de S2, polenul va avea reacŃia alelei S1 şi va fi capabil să germineze şi să străbată stilul cu reacŃia S2. Acest sistem a fost studiat la tutun, varză ş.a.

Reprezentarea grafică a reacŃiei autoincompatibilitate-compatibilitate în sistemul gametofitic pentru controlul polenizării:

a-polenizare autoincompatibilă; b-polenizare semicompatibilă c-polenizare compatibilă

Sistemele de alele ale incompatibilităŃii prezintă importanŃă pentru crearea unor noi

genotipuri. La plantele alogame, ce se reproduc prin seminŃe nu se urmăreşte obŃinerea unor forme autocompatibile deoarece consangvinizarea reduce vigoarea plantelor. La speciile pomicole, care se înmulŃesc vegetativ se urmăreşte crearea unor forme autocompatibile pentru a nu mai fi nevoie să introducem în apropiere alte soiuri bune polenizatoare. ObŃinerea formelor autocompatibile se poate realiza prin mutaŃii în locusul S, deleŃia (îndepărtarea) acestui locus şi poliploidie (multiplicarea garniturilor de cromozomi).

Vigoarea hibrizilor (heterozis)

Fenomenul vigorii hibride a fost observat şi descris încă din secolul al XVIII-lea şi prima jumătate a secolului al XIX-lea.

Iosef Gottlieb Kölreuter (1763) a executat printre primele hibridări artificiale la plante. Încrucişând diferite specii de Nicotiana semnalează vigoarea sporită a descendenŃilor faŃă de formele parentale.

Andrew Knight (1787) constată că hibrizii obŃinuŃi la diferite specii pomicole, soiuri de mazăre şi cartof, se caracterizează prin vigoare, care întrece pe aceea a părinŃilor şi că ea scade treptat în generaŃiile următoare.

Fenomenul de vigoare la hibrizi a fost sesizat şi la animale. Se cunoaşte din practică că hibrizii obŃinuŃi între diferite rase se deosebesc prin unele calităŃi faŃă de părinŃi. Darwin arată că animalele obŃinute prin încrucişare sunt mai viguroase, au talie şi greutate mai mari.

În perioada 1908–1914 cercetătorii americani G. H. Shull, E. M. East şi H. K. Hayes întreprind studii asupra consangvinizării (autopolenizării) şi hibridării la porumb şi elaborează metodele de consangvinizare şi hibridare la plantele agricole. Termenul de “heterozis” a fost introdus de G. H. Shull în 1914, înŃelegând prin el dezvoltarea luxuriantă a hibrizilor din F1.

Heterozisul se întâlneşte atât la plante autogame cât şi la plantele alogame. La plantele alogame vigoarea este mult mai puternică decât la cele autogame. Acest fenomen diferă şi de la plantă la plantă şi este mai pronunŃat la hibridările în interiorul speciei decât între specii sau genuri. Există însă şi excepŃii, cum ar fi de exemplu hibrizii între genurile

Raphanus – Brassica, Triticum – Secale sau speciile Triticum dicoccum – Triticum aestivum. După clasificarea făcută de A. Gustafsson (1951) se deosebesc trei categorii de

heterozis:

42

a) heterozisul somatic, care se referă la creşterea evidentă a părŃilor vegetative ale plantelor;

b) heterozisul reproductiv, ce determină o dezvoltare sporită a organelor de reproducere, a fructelor şi a seminŃelor;

c) heterozisul adaptiv, caracterizat prin vitalitate mai mare şi rezistenŃă mai bună la condiŃiile nefavorabile de viaŃă. Pentru producŃie, importanŃă are aşa numitul “transheterozis”, care duce la un excedent de producŃie.

Fenomenul de heterozis prezintă o deosebită importanŃă atât pentru cercetările de genetică cât şi pentru lucrările de ameliorare la plante sau animale. O preocupare importantă a geneticii este explicarea mecanismelor intime care stau la baza lui, în scopul fixării heterozisului din F1, pentru generaŃiile următoare.

Teorii care explică fenomenul heterozis

Teoria dominanŃei. În anul 1910, în perioada de înflorire a mendelismului, A.B.

Bruce emite o teorie asupra naturii heterozisului, bazată pe calculele matematice, “Teoria

factorilor dominanŃi”. Conform acestei teorii, numărul total de caractere dominante, cu acŃiuni favorabile, în

populaŃiile hibride este mai mare decât la formele parentale. Teoria demonstrează existenŃa unei corelaŃii pozitive, între numărul de factori dominanŃi din genotip şi gradul de manifestare a heterozisului fenotipic. Dacă de exemplu, cei doi părinŃi ar conŃine câte trei perechi de factori dominanŃi, AABBCCddeeff x aabbccDDEEFF, hibridul rezultat va deŃine şase loci cu gene dominante AaBbCcDdEeFf.

Ipoteza lui Bruce a fost împărtăşită şi de alŃi cercetători. Genele ce acŃionează favorabil sub influenŃa selecŃiei naturale devin dominante, iar

genele nefavorabile, recesive. Prin autofecundare, genele recesive trec în stare homozigotă. Prin încrucişare ele devin heterozigote şi inhibate de alelele dominante favorabile.

Această ipoteză explică consecinŃele nefavorabile ale consangvinizării şi restabilirea vigorii prin încrucişare, însă nu şi efectul heterozis în general. Nu toate însuşirile recesive sunt dăunătoare. Uneori se găsesc şi forme homozigote dominante, inferioare părinŃilor. Această teorie nu poate explica fenomenul de heterozis în cazul poligeniei (polimeriei), care se caracterizează prin lipsa de dominanŃă.

Teoria heterozigoŃiei. G. H. Shull (1909 – 1914) elaborează o teorie a heterozisului, care se bazează pe corelaŃia pozitivă dintre vigoarea hibridului şi gradul de diferenŃiere între gameŃii ce iau parte la fecundare. DiferenŃierea gameŃilor ar fi un stimulent pentru o creştere mai intensă. Din această cauză, teoria lui a mai fost numită “ipoteza stimulării fiziologice”.

Ideile lui Shull au fost dezvoltate în lucrările altor cercetători: E. M. East şi H. K. Hayes (1912) au admis părerea lui Shull. Ei arătau că vigoarea

hibrizilor F1, se datorează revenirii organismelor la starea heterozigotă. Prin încrucişarea formelor homozigote se obŃine hibridul F1 în care se acumulează gene dominante ce anihilează acŃiunea dăunătoare a alelelor recesive. În F2 vigoarea scade în urma segregării genelor.

Încrucişarea creează heterozigoŃia iar consangvinizarea duce la homozigoŃie şi descreşterea vitalităŃii.

Sunt însă şi cazuri când în F1 nu se manifestă fenomenul de heterozis sau micşorarea heterozigoŃiei nu este însoŃită totdeauna de scăderea productivităŃii. Hibrizii simpli pot depăşi uneori hibrizii complecşi, deşi sunt mai puŃini heterozigoŃi. S-a mai constatat că, la autogame, de foarte multe ori, hibrizii nu depăşesc formele parentale, homozigote. Toate aceste fenomene nu pot fi explicate cu această teorie.

Următoarea etapă a dezvoltării ideilor lui Shull, East şi Hayes a fost apariŃia lucrării lui Castle (1926), care susŃine că încrucişarea duce la creşterea metabolismului, iar heterozisul, ar fi urmarea diferenŃierii chimice din gameŃi.

43

Teoria înlănŃuirii (factorilor dominanŃi), a fost elaborată de D.F. Jones, urmare a dezvoltării teoriei dominanŃei. După această teorie, heterozisul s-ar datora înlănŃuirii genelor dominante (grupe de gene înlănŃuite), localizate pe diferiŃi cromozomi.

Este însă greu de admis rămânerea în stare cuplată a factorilor dominanŃi, care presupune un schimb foarte mare de gene. De asemenea, deoarece genele dominante sunt înlănŃuite cu cele recesive, nefavorabile, este imposibilă eliminarea acestora fără ca, în acelaşi timp, să nu se elimine şi genele dominante.

Teoria alelomorfismului multiplu. A fost elaborată de E. M. East în anul 1936. Această teorie susŃine că heterozisul s-ar datora influenŃei unor alele multiple ce determină funcŃii fiziologice favorabile. O alelă normală A1 poate da naştere prin mutaŃii alelelor A2, A3, A4…Cu cât o asemenea alelă este mai îndepărtată de alela normală, cu atât şi efectul ei ar fi mai mare.

Dar şi această teorie prezintă dificultatea că nu poate admite acŃiunea genelor normale şi neagă dominanŃa şi recesivitatea.

Teoria supradominanŃei a fost elaborată de G. H. Shull (1945 – 1946). Această teorie este o dezvoltare a teoriei privind efectul stimulator al heterozigoŃiei. Din cauza aceasta, a mai fost numită şi teoria heterozigoŃiei propriu-zise. Autorul afirmă că, în unele combinaŃii, interacŃiunea între membrii aceleaşi perechi de alele poate duce la faptul că heterozigotul Aa va depăşi ca vigoare ambii homozigoŃi AA şi aa. Se presupune că amândouă alelele heterozigote execută funcŃiuni întrucâtva diferite, completându-se una pe alta. HeterozigoŃia este determinată de o singură pereche de alele spre deosebire de vechea teorie a heterozigoŃiei (a stimulării de azi) unde heterozigoŃia este determinată de mai multe alele.

Teoria heterozigoŃiei structurale a fost elaborată de Dobzhansky. Autorul susŃine că acŃiunea alelelor dominante favorabile asupra alelelor recesive nefavorabile poate fi înlocuită de inversiuni. Drept argument se aduce existenŃa a 70,3% de indivizi ce prezintă inversii heterozigote la Drosophila tropicalis, ce trăieşte în America Centrală. Efectul de heterozis produs de această restructurare a fost denumit euheterozis balansat în sensul că echilibrează polimorfismul biologic al populaŃiei.

Teoria homoplasmiei este susŃinută de N.H. Nilson (1937). Depresiunea la linii consangvinizate s-ar datora omogenităŃii citoplasmei. Prin încrucişare se produce o diferenŃiere biochimică şi funcŃională a ei. Această teorie nu are adepŃi, deoarece este greu de susŃinut că numai citoplasma răspunde de fenomenul de heterozis.

Teoria echilibrului genetic. Ipoteza a fost elaborată de C. Bridges (1922), K. Mather (1943) şi N. V. Turbin (1961), încercând o sinteză a celorlalte teorii.

Prin echilibru genetic se înŃelege complexitatea de legături între factori ereditari şi mediu. Dezvoltarea fiecărui caracter ar fi determinată de influenŃa corelativă asupra lui a numeroşi factori cu acŃiune diferită: unii acŃionează în mod stimulator, alŃii în mod inhibitor. Caracterul apare ca o rezultantă a unor tendinŃe opuse.

După această ipoteză, dezvoltarea caracterelor ar fi deci rezultatele echilibrului genetic realizat. În cadrul acestei ipoteze diferite forme de interacŃiune a factorilor ereditari menŃionaŃi în ipotezele arătate mai înainte sunt termenii componenŃi ai acestui echilibru.

Realizarea echilibrului genetic diferă la plantele autogame de cele alogame. În cadrul plantelor autogame echilibrul se stabileşte în cadrul fiecărui sortiment haploid de cromozomi. GameŃii sunt echilibraŃi, fapt care asigură vitalitatea la descendenŃi. La speciile alogame echilibrul se stabileşte în relaŃiile dintre organisme, a genotipurilor diferite. La aceste plante, în cazul consangvinizării, descendenŃa nu menŃine echilibrul genetic, iar vitalitatea şi prolificitatea scade. Heterozisul este un fenomen opus consangvinizării şi el apare la organisme ca rezultat al unui echilibru genotipic optim între frecvenŃele alelelor homo şi heterozigote.

Cercetarea fenomenului de heterozis în cadrul concepŃiei de echilibru genetic nu exclude posibilitatea studierii în mod izolat a diferitelor tipuri de interacŃiuni a factorilor ereditari ce constituie componenŃi ai echilibrului genetic şi care determină heterozisul.

44

În afară de aceste componente ale bilanŃului genetic ce determină mărimea heterozisului, trebuie adăugată şi interacŃiunea dintre nucleu şi citoplasmă şi între gene şi mediu.

Pentru a înŃelege cum acŃionează diferitele cauze care duc la dezvoltarea caracterelor concrete ce manifestă heterozisul este nevoie clarificarea componentele echilibrului genetic de care depinde mărimea acestor caractere.

Teoria mitocondrială. A fost formulată de D. F. Jones (1952) şi J. B. Hanson şi colab. (1960), (după Butnaru Gallia, 1985). Cercetările efectuate la porumb au evidenŃiat o corelare pozitivă între intensitatea heterozisului şi activitatea mitocondrială. Aceste corelaŃii au fost sesizate şi la alte plante: sorg, grâu, secară, triticale, mazăre, bumbac etc.

Mitocondriile sunt implicate în menŃinerea homeostaziei intracelulare, în felul acesta explicându-se marea stabilitate fenotipică a hibrizilor, în condiŃii foarte diferite de mediu. Nu se cunoaşte prea bine care este evoluŃia populaŃiilor mixte de mitocondrii, în celulele organismelor hibride. Micşorarea diversităŃii mitocondriilor, după părerea specialiştilor, ar explica declinul multor soiuri obŃinute prin hibridare după un anumit număr de generaŃii.

Dacă aruncăm o privire de ansamblu teoriilor expuse putem, desprinde următoarele concluzii:

- heterozisul este un fenomen complex, la realizarea lui contribuind, în primul rând genotipul organismului, iar în al doilea rând, condiŃiile de viaŃă;

- diferitele teorii explică numai unele laturi ale fenomenului de heterozis fără să descopere toate cauzele;

- merită să ne oprim atenŃia, în primul rând, asupra teoriei stimulării (heterozigoŃiei) şi a teoriei dominanŃei, teorii care, de fapt, se pot completa una pe alta; cercetări multiple, confirmă prin date, cele susŃinute de aceste teorii.

Nu trebuie neglijate nici celelalte teorii care explică în parte sau în cazuri speciale manifestarea heterozisului.

ImportanŃa practică a heterozisului impune o intensificare a cercetărilor teoretice şi practice în acest domeniu.

Manifestarea heterozisului

Sesizarea fenomenului heterozis a plecat de la constatarea că, în majoritatea cazurilor

indivizii obŃinuŃi din încrucişări, se caracterizau printr-o vigoare sporită faŃă de părinŃii din care au provenit. Faptul că această vigoare este însoŃită de o creştere a capacităŃii de producŃie la plantele agricole sau animalele domestice, a făcut ca fenomenul să fie amplu cercetat, atât în ceea ce priveşte cauzele lui cât şi a efectelor ce le produce.

Din cercetările de morfofiziologie s-a desprins concluzia că hibrizii se deosebesc de formele parentale prin următoarele însuşiri: au embrionii de dimensiuni mai mari; au o creştere a organelor vegetative mult mai rapidă; posedă o activitate mai intensă a Ńesuturilor meristematice; au o fotosinteză mai intensă; posibilităŃi mai bune de a absorbi substanŃele nutritive; capacitate mai mare de a sintetiza stimulatori de creştere.

Manifestarea vigorii hibride depinde de ereditatea celor doi părinŃi: este mai pronunŃată la hibrizii intraspecifici, la hibrizii obŃinuŃi din linii consangvinizate (homozigote), decât la hibrizii dintre soiuri sau rase.

Heterozisul se manifestă şi la animale, folosindu-se în producŃie unii hibrizi, fie între rase, fie între linii consangvinizate (fluturele de mătase, păsări, porci ş.a.). Produşii dovedesc o mai mare capacitate de producŃie (lapte, carne, ouă etc.).

Fenomenul de heterozis îmbracă manifestări foarte variate, el prezintă o importanŃă covârşitoare pentru producŃie, iar aspectele privind tehnica producerii lui vor fi tratate în cursul de ameliorarea plantelor.

45

Consangvinizarea şi folosirea ei în crearea liniilor destinate încrucişării

Organismele alogame, fie monoice, dioice sau hermafrodite se reproduc în mod

natural prin fecundare străină. Artificial, noi putem forŃa această categorie de organisme să se autofecundeze prin polenizare cu polen propriu, fenomen numit consangvinizare. La animale, consangvinizarea are loc prin încrucişarea între indivizi cu grad de rudenie apropiat. Consangvinizarea nu este tot una cu autofecundarea de la plantele autogame, unde constituie un mod normal de reproducere.

Asupra plantelor alogame, consangvinizarea are următoarele efecte: 1. Scăderea vitalităŃii organismelor. În urma consangvinizării, plantele alogame îşi

micşorează capacitatea de creştere. Dimensiunile lor se micşorează atât în ceea ce priveşte înălŃimea, lungimea şi lăŃimea frunzelor, diametrul tulpinii, cât şi mărimea şi greutatea fructelor; de asemenea, prezintă şi o fertilitate scăzută. La porumb, majoritatea liniilor consangvinizate dau o producŃie cu mult sub cea a soiurilor din care au fost extrase.

Această depresiune biologică se manifestă foarte intens în prima generaŃie consangvină, pentru ca în generaŃiile următoare să scadă şi să se oprească la o anumită limită de stabilitate numită şi “minimum de consangvinizare”.

Nu toate plantele răspund în acelaşi mod la scăderea vigorii în procesul de consangvinizare; faŃă de porumb la care este foarte accentuată, la secară, lucernă, floarea-soarelui este numai accentuată, iar la dovleac şi mai puŃin.

Depresiunea biologică îşi găseşte explicaŃia în faptul că, în populaŃia supusă consangvinizării creşte procentul de genotipuri homozigote în defavoarea celor heterozigote. În stare homozigotă, genele nefavorabile organismului îşi evidenŃiază acŃiunea. Aceste urmări pot fi explicate într-o oarecare măsură de teoria dominanŃei sau supradominanŃei.

Gradul de homozigotare a indivizilor creşte odată cu repetarea consangvinizării la descendenŃi şi el se poate afla calculându-se coeficientul de consangvinizare (Cn);

Cn = m

n2

1n2

− , în care:

n – reprezintă generaŃiile de consangvinizare, iar m – numărul perechilor de alele care se homozigotează.

Reducerea heterozigoŃiei şi creşterea homozigoŃiei prin efectul consangvinizării

46

Efectul consangvinizării asupra heterozigoŃiei şi homozigoŃiei în funcŃie de numărul perechilor de alele în diferite generaŃii de consangvinizare

2. Desfacerea populaŃiei în biotipuri. Plantele alogame au o structură ereditară

heterozigotă. Caracterele şi însuşirile lor se găsesc în diferite raporturi, de dominanŃă şi recesivitate. Multe din defecte sau calităŃi nu se pot manifesta prezentându-se sub forma recesivă. Prin consangvinizare, acestea devin homozigote şi se manifestă producând o desfacere a populaŃiei în biotipurile (liniile) componente. Dintre însuşirile recesive, ce se manifestă fenotipic, unele constituie defecte, altele din contra, sunt valoroase pentru practică (unii indivizi posedă rezistenŃă la boli, la ger, precocitate, un conŃinut ridicat în proteină, grăsimi ş.a). În afară de caracterele homozigote recesive favorabile sau defavorabile apar şi caractere homozigote dominante pozitive, care se pot folosi cu succes în ameliorare.

3. Scăderea variabilităŃii. În prima generaŃie consangvină variabilitatea formelor apărute este foarte mare. Reproduse prin autofecundare, fiecare formă în parte, mai multe generaŃii, variabilitatea în cadrul descendenŃelor scade până se ajunge la linii consangvinizate, care nu mai segregă, fiind foarte uniforme şi stabile. Acestea sunt liniile homozigote. La porumb se obŃin astfel de linii în generaŃiile 7 – 8 de consangvinizare. Nu se poate afirma însă că s-a ajuns la o homozigoŃie absolută.

Liniile consangvinizate obŃinute, sunt diferenŃiate genetic şi destul de diferenŃiate din punct de vedere fenotipic. Ele nu se utilizează ca atare deoarece dau producŃii mici. Prin încrucişarea lor se obŃin însă hibrizi, foarte valoroşi, cu producŃii mari faŃă de formele iniŃiale din care au fost extrase. La porumb, astfel de hibrizi, aduc sporuri de 50 – 70%.

Hibridarea sexuată indepărtată

Hibridarea îndepărtată are loc între specii sau chiar genuri diferite. Din cauza unor dificultăŃi care însoŃesc această formă de hibridare, folosirea ei este mult mai restrânsă faŃă de hibridarea în interiorul speciei. Mai poartă numele de hibridare interspecifică.

Hibridarea sexuată îndepărtată se cunoaşte, de sute de ani, fie ca fenomen natural, fie ca metodă practică folosită de om pentru obŃinerea de forme noi de plante şi animale.

J. Kölreuter, la începutul sec. XVIII, vorbea despre astfel de hibrizi la plante şi îi numea “catâri vegetali” după denumirea noŃiunii de catâr, hibrid animal obŃinut pe cale artificială înainte de a se obŃine astfel de hibrizi la plante.

Hibridarea îndepărtată este şi un criteriu pentru determinarea speciilor. În cazul când nu se pot obŃine indivizi în urma unei asemenea hibridări sau, deşi se obŃin sunt sterili, se afirmă că cei doi părinŃi care au luat parte la hibridare aparŃin unor specii diferite. Nu trebuie însă să considerăm că hibridarea îndepărtată este singurul criteriu pentru determinarea speciilor.

Ch. Darwin a observat că în obŃinerea hibrizilor îndepărtaŃi se întâmpină greutăŃi şi a căutat să analizeze amănunŃit unele condiŃii de care depinde uşurinŃa încrucişării între formele îndepărtate. El descrie următoarele situaŃii: - apropierea sistematică este într-adevăr un factor determinant în reuşita încrucişării, dar nu singurul; - sunt cazuri când două varietăŃi aparŃinând aceleaşi specii nu se pot încrucişa şi din contra, în alte cazuri când două specii diferite, se pot încrucişa între ele. În cazul când nu se pot încrucişa, Darwin arată că: fecundarea nu poate avea loc în cazurile când tuburile polinice nu pot ajunge până la ovul din cauza stilului prea lung; tuburile polinice nu pot străbate stigmatul de la plantele altei specii; gametul mascul ajunge la oosferă, dar dezvoltarea embrionului nu are loc; fecundarea poate avea loc, embrionul începe să se formeze, dar piere în scurt timp.

47

ObservaŃiile lui Darwin sunt juste, dar nivelul cunoştinŃelor din vremea lui nu i-au permis să cerceteze şi din punct de vedere genetic cauzele ce îngreuiază realizarea hibrizilor interspecifici. Aceasta a fost posibil mai târziu, odată cu dezvoltarea geneticii.

ObŃinerea şi comportarea primei generaŃii hibride

În general, hibrizii interspecifici se obŃin cu greutate, iar reuşita depinde în mare

măsură şi de speciile pe care le folosim. Există totuşi anumite specii de plante care, încrucişate, posedă facultatea de a produce hibrizi fertili. În schimb, la animale, aplicarea hibridării îndepărtate întâmpină mai multe dificultăŃi.

Delimitarea speciilor cu diferenŃieri de la una la alta, atât din punct de vedere genetic, cât şi fenotipic a determinat izolarea lor sistematică şi genetică şi a creat dificultăŃi la încrucişarea dintre ele.

Aceste dificultăŃi sunt datorate incompatibilităŃii de ordin genetic sau morfologic, privind structura florii, a incompatibilităŃii dintre embrion şi endosperm şi perturbări în formarea celulelor sexuate.

La animale, atunci când se obŃin hibrizi, defectele se manifestă de obicei la unul din sexe, în special la sexul heterogametic. La încrucişarea dintre femele de Drosophila

pseudoobscura cu masculi de Drosophila miranda, în F1, se obŃin femele sterile. În cazul când se inversează părinŃi, în F2 se obŃin ambele sexe, dar masculii sunt anormali. La încrucişarea dintre o femelă de Bos taurus şi un mascul de Bizon americanus, numai hibrizii femeli ajung la maturitate.

Mecanismul genetic care duce la dezvoltarea numai a indivizilor de un singur sex este mai uşor de explicat dacă ne gândim la diferenŃele de ordin genetic ce se întâlnesc la cele două sexe. Deşi genotipul celor două specii conŃine genele corespunzătoare, dispoziŃia acestor gene poate fi pe cromozomi diferiŃi: la una din specii ele pot să fie situate pe autozomi, la cealaltă pe cromozomii sexuali. În afară de aceasta se pot ivi şi diferenŃe în structura cromozomilor autozomi omologi sau ai sexului.

Când se obŃin totuşi hibrizi interspecifici, aspectul lor fenotipic este în general intermediar între cei doi părinŃi şi numai în unele cazuri se manifestă o dominanŃă din partea unuia din părinŃi.

Fenomenul obişnuit de vigoare, constatat la hibrizii intraspecifici caracterizează uneori şi hibrizii interspecifici (hibridul între Raphanus sativum x Brassica oleracea sau hibridul Equus caballus x Equus asinus – catârul). Adesea, o anumită grupare a genelor pe cromozomii omologi favorizează acŃiunea genelor letale sau semiletale şi atunci hibrizii sunt letali, sau prezintă fenomene de debilitate.

Unii hibrizi interspecifici, prezintă şi anomalii sexuale (intersexuali). Aceştia, au aspectul exterior al unui sex dar posedă organe sexuale, ale celuilalt sex. De obicei ei sunt sterili.

Fenotipul hibrizilor interspecifici depinde şi de modul în care se folosesc ca mamă sau ca tată, cele două specii, la care există diferenŃele morfologice tranşante între femele şi masculi. Catârul are conformaŃia foarte apropiată de cea a mamei, Equus caballus, în timp ce bardoul (hibridul reciproc) are conformaŃia mamei de Equus asinus, Equus caballus fiind în acest caz tată. Este cazul influenŃei citoplasmei materne, a fenomenului de matroclinie.

O caracteristică principală, destul de frecventă a hibrizilor interspecifici este sterilitatea lor. Ea se manifestă de obicei la sexul heterogametic, cu diferite intensităŃi şi se împarte în mai multe tipuri:

- gonadele, în cazul animalelor sau florile plantelor nu se dezvoltă sau avortează, la hibrid. Această situaŃie este mai frecventă la animale;

- dezvoltarea gonadelor şi a florilor este normală dar, perturbările încep odată cu meioza. Cele două garnituri de cromozomi diferă prin structură sau prin număr. Aceste

48

anomalii fac ca meioza să nu se poată desfăşura normal sau încetează într-un stadiu timpuriu, iar în cazul în care se formează gameŃi, ei sunt improprii pentru fecundare.

Când ambii părinŃi deŃin genomuri omoloage, dar diferă prin numărul de cromozomi, conjugarea cromozomilor în meioză decurge normal, dar în loc de bivalenŃi se formează polivalenŃi. În alte cazuri, părinŃii deŃin o parte din genomuri omoloage, dar restul sunt omoloage numai parŃial. Cromozomii parŃial omologi rămân ca univalenŃi. În acest caz, celulele sexuale sunt sterile. Când părinŃii deŃin genomuri neomoloage, cromozomii nu fac sinapsă, repartiŃia la cei doi poli ai celulei este neregulată şi ca atare, apar gameŃi sterili. Pentru înlăturarea sterilităŃii pot fi folosite mai multe metode: retroîncrucişarea individului F1, cu unul din părinŃi; multiplicarea numărului de cromozomi prin tratamente cu colchicină etc.

Aceste metode asigură genomuri care dau posibilitatea de conjugare a cromozomilor în meioză.

DificultăŃile de obŃinere a hibrizilor îndepărtaŃi, pot fi de ordin cantitativ şi calitativ. DiferenŃele cantitative se referă la numărul de cromozomi ai celor doi părinŃi.

Atunci când ele depind de germinarea polenului şi creşterea tubului polinic, hibridarea decurge mai bine, când forma maternă are un număr mai mare de cromozomi decât forma paternă (de exemplu între speciile genului Datura, Galeopsis, Nicotiana). La o altă categorie de plante, creşterea tubului polinic decurge mai bine când forma maternă are un număr mai mic de cromozomi decât forma paternă (de exemplu între speciile genului Helianthus,

Triticum, Rosa). A treia categorie o reprezintă plantele indiferente privind raportul cromozomic (de exemplu, între speciile genului Brassica).

Perturbări pot să apară şi odată cu formarea seminŃelor. La plantele angiosperme diploide, dezvoltarea normală a embrionului are loc când în embrion există 2n cromozomi, în endosperm 3n cromozomi, iar în ovar 2n cromozomi. Când raportul acesta se schimbă din cauza numărului modificat de cromozomi, perturbările apar mai întâi în endosperm, în care are loc o sistare a fluxului de hrană care duce la sufocarea lui. Este vorba de o sterilitate somatoplastică care duce la moartea embrionului. Acest fenomen poate fi evitat dacă în primele stadii de dezvoltare a embrionilor ei sunt detaşaŃi şi cultivaŃi pe medii nutritive.

Într-un stadiu mai târziu, perturbările pot apărea în procesul de dezvoltare a seminŃelor, afectând capacitatea lor de germinare.

DiferenŃele calitative a genomurilor celor doi părinŃi constituie cazuri mai frecvente. Ele se pot produce în cazul unui număr egal de cromozomi şi genomuri omoloage (A x A sau AB x AB) sau un număr diferit de cromozomi şi genomuri parŃial omoloage (A x AB). În sfârşit, se mai pot întâlni situaŃii în care numărul de cromozomi a formelor parentale să fie egal, dar genomurile neomoloage (A x B).

Toate aceste diferenŃe de ordin cantitativ şi calitativ dintre formele parentale, produc perturbări în procesul de fecundare sau de formare a seminŃelor, de dezvoltare sau de formare a celulelor sexuale.

În meioză, în asemenea cazuri, conjugarea şi segregarea cromozomilor nu decurge normal şi nu se formează celule sexuale sau acestea sunt sterile.

Comportarea celei de a doua generaŃii hibride

Se poate obŃine a doua generaŃie la hibridarea îndepărtată numai atunci când hibridul

F1 este cel puŃin parŃial fertil. Când numai unul din sexe este steril, cel fertil poate fi încrucişat cu părintele de sex opus.

DescendenŃa hibrizilor îndepărtaŃi se caracterizează printr-o puternică segregare, care în general nu se încadrează în normele mendeliene. Pot să apară forme asemănătoare tatălui , mamei, intermediare sau aberante. În unele cazuri, în urma segregării toŃi indivizii seamănă numai cu unul din părinŃi.

În generaŃiile următoare, la hibrizii parŃial fertili se măreşte procentul de fertilitate. Prin repetarea unui backcross se observă o revenire evidentă la formele parentale.

49

Rolul hibridării îndepărtate în evoluŃia speciilor

Hibridarea îndepărtată prezintă importanŃă, pentru apariŃia de specii noi de plante şi

posibil, şi de animale inferioare. Se observă în natură, existenŃa unor forme ce au caractere comune pentru două

genuri sau specii diferite, cum este hibridul dintre Sorbus sibirica şi Cotoneaster

melanocarpa. Acesta a moştenit gustul şi coloraŃia fructelor, forma frunzelor, culoarea argintie a frunzelor, forma mugurilor de la Sorbus sibirica, iar structura fructului, forma inflorescenŃei, caracterul pubescenŃei, de la Cotoneaster melanocarpa.

Ca urmare a hibridării îndepărtate, apar uneori organisme amfidiploide (ce însumează numărul de cromozomi somatici ai părinŃilor), cu genotipuri echilibrate, constante şi care prin încrucişare pot reproduce tipul din care fac parte. Dacă noua formă se dovedeşte adaptată ea se răspândeşte. O condiŃie pentru menŃinerea ei o constituie izolarea reproductivă de speciile înrudite.

Orice individ obŃinut prin hibridarea îndepărtată este începutul unei specii noi. Pe de o parte, trebuie să Ńinem seama de unele trăsături esenŃiale ce caracterizează specia autentică: specificul morfologic, lipsa indivizilor intermediari speciilor parentale, capacitatea de a se reproduce, fertilitatea deplină în cazul încrucişării şi izolarea reproductivă totală de alte specii. Pe de altă parte, acestor forme le lipsesc unele trăsături esenŃiale ce sunt caracteristice speciilor naturale: arealul geografic, locul ocupat în relaŃiile biocenotice, numărul de indivizi ş.a. Aşa că, asemenea hibrizi nu pot fi consideraŃi specii noi, ci mai degrabă “forme specifice”. O specie nouă se formează într-un proces îndelungat, pe baza selecŃiei naturale.

Prin metoda hibridării îndepărtate au fost sintetizate multe forme, foarte asemănătoare cu speciile răspândite în natură. Müntzing (1930) a realizat prin hibridări îndepărtate sinteza unei forme asemănătoare speciei Galeopsis tetrahit (2n = 32 cromozomi). A încrucişat Galeopsis pubescens cu Galeopsis speciosa. Hibridul, încrucişat cu una din formele parentale, Galeopsis pubescens, era greu de deosebit de Galeopsis tetrahit.

La plante, posibilitatea de o obŃine hibrizi îndepărtaŃi diferă de la un gen la altul. Există genuri ale căror specii se hibridează destul de uşor (Dianthus, Triticum, Prunus, Pirus etc.) dar şi genuri a căror specii nu se hibridează, chiar dacă sunt destul de înrudite (Liliacee, Umbelifere, Leguminoase etc.).

Există şi genuri care se hibridează cu destulă uşurinŃă, cum ar fi: Triticum x Secale,

Triticum x Aegilops, Raphanus x Brassica etc. Studiul citogenetic al hibrizilor îndepărtaŃi, oferă posibilitatea stabilirii cauzelor ce

determină sterilitatea totală sau parŃială a acestora. În ameliorarea plantelor, hibridările îndepărtate, chiar dacă necesită condiŃii de lucru

deosebite, s-au extins, deoarece oferă posibilitatea obŃinerii de hibrizi cu cromozomi de adiŃie (Triticale) sau cu cromozomi de substituŃie, aceste recombinări genetice, permiŃând o diversificare mai mare a materialului biologic.

NoŃiuni de inginerie genetică

Aprofundarea cunoştinŃelor de genetică moleculară, cunoaşterea structurii fine a

genelor şi a cromozomilor, a deschis noi posibilităŃi de izolare şi sinteză a genelor, de transfer de la o specie la alta, uneori chiar îndepărtate filogenetic, de cultură “in vitro” a celulelor şi de hibridare a acestora.

Ingineria genetică poate fi definită ca un ansamblu de metode şi tehnici moderne

prin care este posibilă manipularea materialului genetic la nivel celular şi molecular.

La nivel celular, ingineria genetică a însemnat extinderea hibridărilor celulare în afara graniŃelor determinate de specie, obŃinându-se hibrizi celulari între diferite specii de procariote şi eucariote, între celule vegetale şi animale.

50

La nivel molecular, ingineria genetică a însemnat izolarea genei, sinteza artificială a genei, realizarea ADN recombinat şi transferul de gene de la o specie la alta. În sens strict, ingineria genetică constă în crearea de ADN hibrid sau ADN recombinat, derivat de la două specii diferite, integrarea şi clonarea acestuia într-o celulă bacteriană, unde poate funcŃiona normal, realizându-se în felul acesta transferul de gene, nu pe cale sexuată, ci pe baza ADN recombinat. În felul acesta se deschide calea transformării dirijate a eredităŃii organismelor la nivel molecular, acŃionându-se direct asupra bazei moleculare a eredităŃii.

În sens mai larg, tot ingineriei genetice îi aparŃin şi tehnicile de modificare a structurii şi numărului cromozomilor prin mutaŃii, putându-se transfera fie cromozomi întregi de la o specie la alta, fie segmente de cromozomi, domeniu al ingineriei genetice denumit chirurgie cromozomică. În acest domeniu, de remarcat sunt rezultatele obŃinute de J. G. O'Mara (1940), care a reuşit să combine caracterele a două specii prin transferul unuia sau a câtorva cromozomi de la diferite specii. S-a reuşit transferul unor cromozomi în cadrul unor hibridări intergenerice, grâu x secară sau grâu x pir, transferându-se gene ce conferă rezistenŃa la rugina galbenă şi neagră de la secară şi respectiv pir, la grâu.

Din multitudinea de aspecte ale ingineriei genetice, vor fi prezentate aspecte privind sinteza artificială a genei, hibridarea celulară la animale şi plante, haploidia prin androgeneză, importanŃa cercetărilor de inginerie genetică.

Sinteza artificială a genei

Sinteza artificială a genelor a fost precedată de o altă mare realizare şi anume sinteza artificială a ADN de la virusul ∅x174 de către Arthur Kornberg, laureat al premiului Nobel

H. G. Khorana, genetician american de origine indiană, împreună cu o echipă de cercetători din Massachusetts, a realizat în 1970, prima sinteză artificială a unei gene şi anume gena ce determină sinteza unui ARNs ce transportă aminoacidul alanina la nivelul ribozomilor, la Saccharomyces cerevisiae. Această genă este destul de mică, formată din 77 nucleotide, iar tehnica folosită a fost următoarea: s-au sintetizat pe cale chimică, segmente de ADN formate din 10-14 nucleotide. Cu ajutorul enzimei ligaza s-au asamblat aceste segmente rezultând segmente bicatenare mai lungi. S-au obŃinut 3 segmente mai lungi cu ajutorul enzimei polinucleotid-kinaza, care au fost legate între ele rezultând segmentul de ADN, corespunzător genei ARNs ce transportă aminoacidul alanina la ribozomi. Această genă nu era funcŃională biologic.

În anul 1973, geneticianul D. Agarwal, a sintetizat artificial o genă de la bacteria E.coli, ce determină sinteza ARNs ce transportă aminoacidul tirozina la ribozomi. Această genă s-a dovedit a fi funcŃională biologic. În anul 1975 geneticianul A. Efstradiatis şi echipa sa de la Universitatea Harvard, au sintetizat artificial genele ce intervin în sinteza hemoglobinei la iepure, fiind prima sinteză artificială a unei gene de la mamifere. În anul 1976 H. Köster, a sintetizat gena pentru hormonul angiotensina, care reglează tensiunea arterială şi contracŃia musculară la om, fiind prima genă umană sintetizată artificial.

În ultimii ani s-au sintetizat artificial genele ce determină sinteza hormonului de creştere, somatostatina şi a insulinei.

În prezent tehnica de sinteză artificială a genei utilizează ARNm, care cu ajutorul enzimei reverstranscriptaza, determină sinteza de ADN complementar şi deci de gene.

Sinteza artificială a genelor prezintă o importanŃă deosebită. Dacă genele sunt inserate în virusuri sau plasmide, acestea le pot transfera în celulele bacteriene. Celulele bacteriene vor putea sintetiza o serie de enzime, hormoni, antibiotice şi, deoarece bacteriile se pot creşte uşor, va fi o cale foarte eficientă de producere a acestor substanŃe. Genele sintetizate artificial vor putea fi integrate în cromozomii celulelor, în locul genelor cu defecte, combătându-se astfel, cauza unor maladii ereditare şi nu efectul lor.

51

Izolarea genei

A fost efectuată pentru prima dată de J. Beckwith de la Universitatea Harvard din SUA, în anul 1969. Izolarea primei gene s-a realizat la bacteria E.coli, cu ajutorul fenomenelor de transducŃie specializată şi sex-ducŃie. Mai întâi s-a izolat întregul operon lac. Genele care constituie acest operon sunt: genele structurale (z, a şi y), gena reglatoare (i), promotorul (p) şi operatorul (o).

Prin cartarea acestui operon s-a stabilit că ordinea acestor gene în operon este: a y z o p i.

Etapele mai importante ale izolării genei lac sunt redate în fig.4.1. În prima etapă prin transducŃie specializată fagul λ s-a detaşat de cromozomul bacteriei alături de gena gal, iar alături de acesta s-a ataşat un factor de fertilitate F ce conŃinea gene ale operonului lac. În etapa a doua, operonul lac a fost inserat în cromozomul bacteriei, în mijlocul genei gal, iar fagul λ într-o regiune alăturată, dar separată printr-un segment din cromozom. În cea de a treia etapă s-au separat bacteriile la care s-a pierdut segmentul dintre gena lac şi fagul λ astfel că fagul λ este plasat adiacent genei lac. Fagul λ capătă mai întâi o formă circulară, având inclus şi operonul lac (etapa 5), iar în ultima etapă prin iradieri cu raze U.V. fagul s-a eliberat de cromozomul bacterian, şi-a recăpătat forma lineară având inclus în interiorul său operonul lac.

Etapele izolării operonului lac la bacteria Escherichia coli

OperaŃiile descrise mai sus s-au efectuat şi cu un alt fag, ∅80, ce realizează transducŃia specializată. ADN al fiecărui fag are o catenă cu o greutate moleculară mai mare (catenă “grea”) şi o catenă cu o greutate moleculară mai mică (catenă “uşoară”). Prin denaturare, catenele fagilor s-au izolat una de alta, iar prin ultracentrifugare s-au separat catenele “grele” de cele “uşoare”. Catenele grele s-au pus împreună şi prin procesul de renaturare, între ele, se refac legăturile de hidrogen, dar numai în zona operonului lac, acolo unde cele două catene au nucleotide complementare, în rest catenele rămân distanŃate. Cu ajutorul enzimelor ce hidrolizează ADN monocatenar, s-au eliminat catenele libere, rămânând doar operonul lac, bicatenar.

Izolarea genelor a avut o importanŃă deosebită pentru că a deschis calea spre studiul aprofundat al materialului genetic “in vitro”, dar mai ales spre transferul de gene de la un organism la altul.

52

Transferul de gene (transgeneza)

În natură se realizează pe mai multe căi: la organismele superioare, în procesul de fecundare sau prin transducŃie cu ajutorul virusurilor, iar la organismele inferioare (procariote) transferul de gene se realizează prin intermediul fenomenelor de transformare, conjugare, sex-ducŃie şi transducŃie.

Transferul de gene între speciile îndepărtate filogenetic are la bază tehnica ADN recombinat, care constă în realizarea de hibrizi moleculari ADN, ce provin de la cele două specii.

PerfecŃionarea tehnicii ADN recombinat nu a fost posibilă decât după descoperirea unor enzime care rup molecula de ADN în anumite puncte, denumite endonucleaze de restricŃie (restrictaze) şi a ADN-ligazelor care resudează molecula de ADN, în vederea realizării de ADN hibrid.

Enzimele de restricŃie se găsesc în număr foarte mare, fiecare fiind specifică unei anumite secvenŃe de nucleotide, deci unei gene. Recunoscând secvenŃa specifică, restrictazele determină tăieturi la nivelul ambelor catene de ADN, fragmentând molecula.

Restrictazele constituie adevărate bisturie biologice, cu ajutorul cărora se poate desprinde din molecula de ADN, o genă ce urmează a fi transferată. Genele ce trebuiesc transferate pot fi sintetizate “in vitro”.

În realizarea transferului interspecific al genelor, prima problemă ce trebuie rezolvată este izolarea unei gene, prin una din tehnicile descrise şi găsirea unui vector sau vehicul. Rolul de vehicul îl poate avea atât ADN plasmidial, cât şi ADN al unor virusuri cum ar fi, λ, SV40. În general vehiculele sunt molecule de ADN circular.

În anul 1973, A. Chang şi S. Cohen, au reuşit să obŃină plasmide hibride care conŃineau genele de la două bacterii şi anume gena pentru rezistenŃa la tetraciclină, de la E.

coli şi gena pentru rezistenŃa la penicilină de la Staphylococcus aureus. O altă cale prin care se realizează transferul de gene este folosirea ca vectori a

virusurilor temperate, care la un moment dat se găsesc integrate în cromozomul bacterian, sub formă de profagi. La un moment dat, profagii se eliberează din cromozomul bacterian şi produc liza bacteriei. În acest caz, bacteriofagii pot lua o genă din cromozomul bacteriei şi la o nouă infecŃie o pot transfera într-o altă bacterie.

În anul 1971, geneticianul C. Merril a reuşit să transfere gena ce răspunde de metabolizarea galactozei de la bacteria E. coli în celulele umane. Pentru realizarea acestui transfer s-a procedat astfel: bacteriile E .coli au fost infectate cu bacteriofagul λ, care se inseră adiacent genei gal din cromozomul bacterian. Se provoacă liza bacteriei şi se vor elibera fagi λ care posedă gena gal. Aceşti fagi recombinaŃi au fost introduşi într-o cultură de celule umane, ce proveneau de la un individ ce prezenta maladia ereditară galactosemia (lipsa genei ce determină enzima necesară metabolizării galactozei, în glucoză). După un timp s-a constatat că celulele umane au început să metabolizeze galactoza. Se poate spune că bacteriofagii se comportă în mod similar cu plasmidele, putând încorpora în cromozom gene străine, pe care le poate transfera în alte celule pe care le infectează.

Aceste transferuri de gene deschid mari perspective mai ales în cazul transferului de gene de la plante sau animale în celulele bacteriene, care ar putea să producă pe medii relativ simple, mari cantităŃi de enzime, hormoni, proteine, de care are nevoie omenirea.

În acest sens se poate menŃiona transferul genei ce determină sinteza ovalbuminei, proteină din oul de găină, la E. coli K12 (λ). S-a izolat mai întâi ARNm ce codifică ovalbumina din ovocitul găinilor. Folosind fenomenul de complementaritate s-a sintetizat ADN, respectiv gena ovalbuminei care a fost inclusă apoi într-un plasmid recombinat, care prin fenomenul de conjugare a fost transferat în celula bacteriană. În urma acestui transfer, celulele bacteriene au început să producă între 30000-90000 molecule de ovalbumină, ceea ce reprezintă în jur de 0,5-1% din cantitatea totală de proteine a bacteriei. A. Riggs (citat de P. Raicu, 1980) a reuşit să transfere gena ce determină sinteza insulinei umane în pancreas, la o

53

bacterie care a început să sintetizeze insulina. Insulina umană este formată din două catene polipeptidice alcătuite din 21 şi 30 de aminoacizi. În experienŃa amintită A. Riggs a folosit o genă sintetizată artificial.

În anul 1977 s-a reuşit să se transfere gena ce determină sinteza hormonului de creştere somatostatina, produs de hipotalamus, pancreas, stomac şi intestine, din celulele umane în celulele bacteriene care au început să sintetizeze acest hormon.

O altă realizare a ingineriei genetice este transferul genelor ce determină sinteza interferonului din celulele umane în celula bacteriei E.coli.

Interferonul este o proteină cu rol antiviral şi este produs de leucocitele umane din sânge. Cercetările Institutului de Oncologie şi Imunogenetică din Villejuif arată că interferonul este capabil să vindece şoarecii bolnavi de diferite tipuri de cancer, ce nu păreau induse de virusuri, că această substanŃă stimulează globulele albe, denumite NK (natural

killers - celule ucigaşe), o linie de apărare împotriva celulelor canceroase. Producerea interferonului prin infectarea leucocitelor cu virusuri, pentru a stimula

fabricarea de interferon, era foarte scumpă şi se obŃineau cantităŃi infime de substanŃă. La începutul anului 1980, Charles Weismann de la Institutul de biologie moleculară din Zurich, a realizat sinteza interferonului, cu ajutorul bacteriei E. coli.

Astăzi se ştie că interferonul are următoarele funcŃii: inhibă creşterea celulelor în general, reglează activităŃile imunitare, măreşte activitatea celulelor albe (ce recunosc şi distrug celulele tumorale), stimulează celulele macrofage ce distrug virusurile, bacteriile şi alte particule.

Se poate spune că interferonul este un mediator celular, deoarece acŃionează ca un activator al celulelor specializate în distrugerea virusurilor şi a celulelor canceroase şi nu un antibiotic antiviral.

Transgeneza, transferul de gene sau fragmente de ADN de la un organism (donor) la altul (receptor) se poate realiza fie prin metoda directă (introducerea moleculei de ADN în celule receptor), fie prin metode indirecte (ADN este introdus în receptor printr-un vector).

Prin metoda directă, ADN exogen poate fi transferat în celule gazdă prin mai multe tehnici: endocitoză, electroporare, microinjecŃie şi biolistic (Butnaru Gallia, 1999).

Endocitoza presupune obŃinerea mai întâi a protoplaştilor, celule vegetale cărora li s-a îndepărtat peretele celular rigid, pectocelulozic, cu ajutorul enzimelor (pectinaza, celulaza) sau pe cale mecanică.

ADN transformant este adsorbit la suprafaŃa celulelor receptoare, iar apoi este inclus în celule. Această metodă presupune protejarea moleculei de ADN prin includerea sa în lipozomi, prin tratare cu polietilenglicol şi fosfat de calciu şi existenŃa a mai multor molecule de ADN transformant pentru ca transferul să se realizeze cu o frecvenŃă cât mai mare.

Electroporarea constă în transferul moleculelor de ADN în protoplaşti cu ajutorul unor impulsuri electrice de scurtă durată sau cu ajutorul razelor laser (porare laser). Se apreciază că eficienŃa transformării genetice este destul de mică fiind dependentă de greutatea moleculară a ADN, concentraŃia polietilenglicolului, durata şi intensitatea impulsului electric, starea fiziologică a celulei receptor (Butnaru Gallia, 1999).

MicroinjecŃia este o metodă mult mai precisă, deoarece o moleculă cunoscută (ADN, ARN, proteine) se introduce cu o microseringă din sticlă montată pe un micromanipulator, într-un receptor (protoplast, celulă animală), fixat pe o lamă de sticlă, în gel de agaroză.

Metodele biolistice constau în introducerea unui ADN exogen într-un receptor prin intermediul aşa numitului tun de particule sau cu ajutorul arcului electric.

Cu ajutorul tunului de particule, microparticule de aur sau tungsten asociate cu molecule de ADN donor sunt direcŃionate într-o celulă sau grup de celule. Celulele sau Ńesuturile bombardate cu aceste microparticule, crescute pe un mediu de cultură vor regenera plante, transformate genetic.

54

Transgeneza indirectă presupune izolarea unui segment de ADN (o genă), clonarea genei respective şi transferul într-o celulă receptor prin intermediul unui vector (Butnaru Gallia, 1999).

Gena ce trebuie transferată a primit denumirea de pasager; de obicei pasagerul, pătruns într-o celulă receptor este degradat de sistemul enzimatic al acesteia. Pentru a evita această degradare, gena (pasagerul) se asociază cu un vector, iar împreună constituie o macromoleculă complexă, de ADN recombinant.

Izolarea ADN de la diferite organisme procariote sau eucariote se realizează prin diferite metode fizico-chimice (centrifugare, tratare cu diferite enzime etc.). Deoarece fragmentul de ADN izolat poate conŃine mai multe gene este necesară fragmentarea acestuia, pentru izolarea genei (pasagerului) ce trebuie transferată. Pentru izolarea unei gene de interes se foloseşte ARNm al genei respective, care în prezenŃa reverstranscriptazei se va transforma într-o moleculă de ADN complementar (ADN-c) monocatenar. În prezenŃa ADN-polimerazei I, ADN-c îşi va sintetiza catena complementară, devenind ADN bicatenar, care va avea înscrisă informaŃia nucleotidică din ARNm.

Genele ce urmează a fi transferate nu vor fi funcŃionale dacă nu au ataşate promotorul, intensificator sau atenuator ai transcripŃiei informaŃiei genetice, care intră în structura genelor şi reglează activitatea acestora.

În procesul de transgeneză sunt absolut necesare enzimele de restricŃie (endonucleaze de restricŃie), produse în mod natural de bacterii, cu rol imunitar, respectiv de a distruge moleculele de ADN exogen ce pătrund în acestea. Sunt cunoscute în prezent peste 500 de tipuri de endonucleaze de restricŃie care acŃionează ca nişte “bisturie” moleculare, secŃionând moleculele de ADN, în secvenŃe scurte între două baze azotate adiacente cunoscute (“Ńintă”).

Cele mai cunoscute endonucleaze de restricŃie sunt: EcoR1 (izolată de la Escherichia

coli), Hpa I (din Haemophilus parainfluenzae), Alu I (din Arthriobacter luteus) etc. Fiecare enzimă are un mod particular, unic, de acŃiune, de aceia sunt nelipsite în operaŃiunile de fragmentare a moleculelor de ADN.

Transgeneza necesită folosirea unui alt grup de enzime şi anume ADN-ligazele, care leagă fragmentele de ADN ce trebuie transferat, de ADN al unui vector.

Trebuie avut în vedere şi receptorul în care trebuie transferat ADN exogen, care poate fi o bacterie, o celulă vegetală sau animală.

Între receptor şi vector trebuie să fie o compatibilitate perfectă, aşa încât, un vector este funcŃional numai la un anumit receptor.

Principalii vectori utilizaŃi în transgeneză Vectorii sunt molecule mici de ADN ce încorporează genele ce trebuie transferate

(pasagerul). Vectorii trebuie să aibă capacitatea de a pătrunde într-o celulă gazdă, iar gena ce trebuie transferată să fie marcată genetic cu un marker specific, pentru a putea fi recunoscută.

Ingineria genetică foloseşte un număr mare de vectori, funcŃie de pasager şi de receptor.

Plasmidele bacteriene, cromozomi miniaturali, care pot include gene străine sunt utilizate frecvent ca vectori: plasmida pBR322, plasmida pUC, plasmida Ti, plasmida Ri ş.a.

Ca vectori pentru celulele vegetale, în vederea obŃinerii plantelor transgenice se folosesc plasmidele Ti (tumor inducing) de la Agrobacterium tumefaciens şi Ri (root inducing) de la Agrobacterium rhizogenes.

Mărimea plasmidelor, exprimată în kilobaze (1000 de perechi de baze) este în jurul a 200 kb şi pot include şi transfera segmente de ADN de 8-10 kb.

Un alt grup de vectori îl reprezintă bacteriofagii. Cosmidele sunt vectori hibrizi realizaŃi între fagul λ şi plasmide, combinând

însuşirile plasmidelor şi a fagului, în sensul că sunt funcŃionale, exprimându-se fenotipic, fără

55

să se integreze în cromozomul celulelor gazdă. Se folosesc frecvent pentru clonarea şi transferul fragmentelor de ADN de la eucariote, fragmente de aproximativ 45 kb, care în mod normal nu pot fi incluse în fagul λ.

Fagii monocatenari au ca material genetic o singură catenă de ADN notată convenŃional cu (+). Această catenă pătrunde în celula gazdă, în momentul infecŃiei, constituind matricea pentru sinteza unei catene complementare, notată cu (-). Împreună cu catena (+) va forma o moleculă bicatenară de ADN, care poate fi izolată şi folosită pentru clonarea ADN.

Realizări ale transgenezei la plante

În ultimii ani s-au realizat plante transgenice, denumite şi plante modificate genetic. Aşa cum s-a specificat anterior, la plantele superioare se folosesc ca vectori ai

genelor “de interes” plasmidele Ti de la Agrobacterium tumefaciens, care în mod natural dau naştere la tumori şi plasmidele Ri de la Agrobacterium rhizogenes, care dau naştere la rădăcini filiforme.

Plasmidele Ti, datorită regiunii denumite ADN-T funcŃionează ca transpozoni (elemente genetice mobile). Numai această regiune se integrează în cromozomul celulei gazdă.

Bacteriile din genul Agrobacterium oferă singurul exemplu de inginerie genetică naturală, deoarece în urma infecŃiei, bacteria transferă în nucleul celulei vegetale o mică porŃiune din ADN al plasmidei, care determină transformarea celulei infectate în celulă tumorală. Prin eliminarea genelor tumorale (oncogenelor) şi asocierea acestei plasmide “dezarmate” cu o plasmidă ce conŃine gena “de interes”, clonată în bacteria Escherichia coli se obŃine un vector de transformare foarte eficient pentru dicotiledonate (în condiŃii naturale Agrobacterium nu atacă monocotiledonatele).

Indiferent de metoda de transfer, frecvenŃa de integrare a genelor în genomul celulei vegetale este destul de redusă. Din această cauză, genei “de interes” îi este asociată o genă marker, care permite selecŃia celulelor transformate. Se folosesc frecvent ca gene marker, genele care conferă rezistenŃă la un antibiotic sau la un erbicid, care-i va permite celulei transformate să supravieŃuiască pe un mediu de cultură ce posedă antibioticul sau erbicidul.

Cele mai importante plante transgenice aflate deja în cultură sunt soia Roundup Ready, tolerantă la erbicidul total Roundup (care are ca principiu activ glifosat) şi porumbul Bt, rezistent la atacul sfredelitorului (Ostrinia nubilalis), urmând a se obŃine plante tolerante la doi sau mai mulŃi factori (rezistenŃă la un erbicid asociată cu rezistenŃa la o insectă, androsterilitate asociată cu rezistenŃa la un erbicid etc.).

O altă realizare a ingineriei genetice o constituie tomatele, la care s-a modificat procesul de coacere a fructelor, denumite Flavr Savr, fructele menŃinându-şi prospeŃimea timp îndelungat. În acest caz, s-a folosit tehnologia ARN antisens, blocându-se sinteza uneia din enzimele ce degradează pereŃii celulari ai fructului sau a hormonului etilenă (cel care accelerează procesul de coacere, aceasta fiind întârziată).

O altă direcŃie a ingineriei genetice este transferul genelor nif de la plantele leguminoase la plantele cerealiere.

Transferul genelor fixatoare de azot

Plantele din familia Leguminoase (mazărea, fasolea, bobul, soia etc.) au capacitatea

să fixeze N atmosferic cu ajutorul unor bacterii cu care trăiesc în simbioză. Bacteriile fixatoare de azot pătrund în Ńesuturile rădăcinilor, formând aşa numitele nodozităŃi, iar din această simbioză beneficiază ambele specii: plantele obŃin azotul atmosferic iar bacteriile obŃin de la plante compuşii organici de care au nevoie. Există şi alte plante, în afară de cele

56

leguminoase, care trăiesc în simbioză cu bacterii fixatoare de azot: unele graminee (Digitaria), chiar unii arbori cum ar fi aninul (Alnus).

Azotul atmosferic poate fi fixat de unele bacterii din genurile: Rhizobium,

Azotobacter, Desulfovibrio, Hydrogenomonas etc. sau de unele alge verzi-albastre. Mecanismul fixării azotului atmosferic a fost descifrat în 1960, în laboratoarele Du

Pont de Nemours (SUA). La bacteria Clostridium pasteurianum s-a izolat enzima nitrogenaza, care catalizează fixarea azotului atmosferic. Această enzimă este formată din două molecule proteice, una cu greutate moleculară mare (220.000 daltoni) şi cealaltă cu greutate moleculară mică (55.000 daltoni). Molecula mare conŃine atomi de fier, sulf şi molibden, iar molecula mică doar fier şi sulf. Cele două molecule sunt active împreună şi numai în absenŃa oxigenului atmosferic. Protejarea moleculei de nitrogenază împotriva oxigenului atmosferic este asigurată de un pigment denumit leghemoglobină care se combină cu oxigenul şi protejează astfel enzima.

Sinteza enzimei nitrogenaza este determinată de un grup de gene notate cu nif care sunt localizate pe cromozom alăturat de gena his, ce determină metabolismul histidinei. Se pare că este vorba de două gene nif: una ce determină sinteza moleculei mari a nitrogenazei şi alta ce determină sinteza moleculei mici.

Transferul genelor nif de la bacteriile fixatoare de azot la altele nefixatoare se poate realiza pe căile cunoscute de recombinare la bacterii: transformare, conjugare, sex-ducŃie şi transducŃie. Geneticianul R. Dixon de la Universitatea din Sussex (Anglia) a transferat genele nif şi his de la bacteria F+ de Klebsiella pneumoniae, la bacteria F- de E. coli.

Tot Dixon în 1974 a obŃinut un factor de fertilitate recombinat care includea în el şi genele nif, denumite FN 68. Acest factor de fertilitate, introdus în mediul de cultură a unor bacterii incapabile să fixeze azotul atmosferic (ex. E.coli), a produs transformarea acestora în bacterii fixatoare de azot.

Pentru transferul genelor nif se pot folosi ca vectori şi bacteriofagii în procesul de transducŃie. S. Stroicher a folosit fagul P1 pentru transferul genelor nif.

Transferul genelor nif de la o bacterie la alta a creat premisele realizării unor simbioze a acestor bacterii nu numai cu leguminoasele, ci şi cu alte plante care nu au capacitatea de a fixa azotul atmosferic.

În viitor se preconizează transferul acestor gene nif în cromozomul plantelor sau în cromozomul cloroplastelor, situaŃie în care plantele nu ar mai avea nevoie de simbioze cu bacteriile, plantele fixându-şi direct azotul atmosferic.

Hibridarea celulară la plante

Hibridarea celulară la plante s-a putut realiza numai după ce s-au obŃinut aşa numiŃii protoplaşti, care sunt celule vegetale cărora li s-a îndepărtat membrana rigidă pecto-celulozică. Îndepărtarea membranei pecto-celulozice s-a realizat la început pe cale mecanică iar mai târziu, după anul 1960, prin metode chimice, folosind o serie de enzime cum ar fi: celulaza, pectinaza, macerozima. În anul 1971, francezul J. P. Nitsch a obŃinut o plantă complet dezvoltată, prin regenerarea protoplaştilor. În ultimii ani s-au izolat protoplaşti şi s-au regenerat plante întregi la: soia, morcov, petunia, bob, mazăre, grâu etc.

57

ObŃinerea enzimatică a protoplaştilor Fuzionarea protoplaştilor ridică aceleaşi probleme ca şi fuzionarea celulelor animale:

mărirea frecvenŃei celulelor hibride şi selectarea acestora. Pentru a mări frecvenŃa de fuzionare a protoplaştilor se folosesc: polietilenglicolul, nitratul de sodiu, ionii de Ca la un pH ridicat, ser proaspăt de iepure etc.

Selectarea celulelor fuzionate se realizează prin folosirea de medii selective, care elimină celulele nefuzionate păstrându-le pe cele hibride. La plante s-a constatat că mediile de cultură ce nu posedă substanŃe de creştere (citochinină şi auxină) elimină celulele parentale, în timp ce celulele hibride se pot dispensa de aceste substanŃe.

P. S. Carlson (1972) a obŃinut plante hibride întregi, prin fuzionarea protoplaştilor de la speciile de tutun, Nicotiana glauca (2n=24) şi N. langsdorffii (2n=18). Plantele rezultate erau amfiploizi ce aveau 2n=42 cromozomi, identici cu hibrizii obŃinuŃi pe cale sexuată (fig.4.4.)

Această metodă de obŃinere a hibrizilor a permis însă obŃinerea de hibrizi celulari între speciile îndepărtate filogenetic care în mod obişnuit nu se pot hibrida sexuat: morcov x tutun, porumb x ovăz, porumb x soia, morcov x petunia.

58

Hibridarea celulară la plante

Un aspect foarte important este acela că protoplaştii pot include molecule de ADN

străine, existente în mediu, particule străine(virusuri) şi alte molecule. Fenomenul a fost numit transgenoză, iar pe această cale se pot transfera gene sau chiar organite citoplasmatice de la un organism la altul.

Din punct de vedere genetic, protoplaştii prezintă o serie de avantaje: - permit înmulŃirea rapidă a unor genotipuri valoroase; - se pot obŃine hibrizi celulari între două specii îndepărtate din punct de vedere

filogenetic, care nu se pot încrucişa sexuat; - se pot obŃine forme cu grade diferite de poliploidie; - se pot induce mutaŃii la nivelul protoplaştilor haploizi sau diploizi; - se pot transfera gene, cromozomi sau cloroplaste; - protoplaştii pot regenera plante libere de viroze. În ultimii ani cercetările privind hibridarea celulară a luat o mare amploare, reuşindu-

se hibridarea unor celule animale cu celule vegetale. În anul 1976 A. Lima de Faria (Suedia) a reuşit fuzionarea unor celule tumorale umane de tip HeLa cu protoplaşti de morcov, folosind polietilenglicolul ca agent inductor.

Aceste hibridări urmăresc combinarea unor genotipuri extrem de diferite, depăşindu-se limitele impuse de reproducerea sexuată.

Haploidia prin androgeneză la plante

Dezvoltarea partenogenetică a unui embrion sau a unei plante dintr-un microspor haploid poartă numele de androgeneză iar dezvoltarea unui organism haploid dintr-o oosferă sau un nucleu secundar al sacului embrionar se numeşte ginogeneză.

În anul 1964 cercetătorii indieni S. Guha şi S. C. Maheswari au cultivat pe un mediu artificial, antere de Datura innoxia şi au obŃinut numeroşi embrioizi. Cu doi ani mai târziu s-au obŃinut plante haploide complet dezvoltate la tutun (Nicotiana tabacum) (Raicu P., 1980).

Androgeneza este de două tipuri: directă şi indirectă (fig.4.5.). Androgeneza directă constă în faptul că programul normal al microsporului este deviat sub influenŃa unor stimuli externi, având loc o evoluŃie particulară a nucleului haploid, care prin diviziuni mitotice devine embrioid şi apoi plantă matură. În cazul androgenezei indirecte, se formează mai întâi un Ńesut nediferenŃiat denumit calus, din care se pot diferenŃia apoi plante haploide cu diferite grade de poliploidie.

ObŃinerea unor plante haploide prin androgeneză este condiŃionată de numeroşi factori, cum ar fi vârsta anterelor, temperatura, lumina, compoziŃia mediului de cultură, fapt ce a făcut ca numai la unele specii să se poată obŃine haploizi pe această cale.

Pentru genetică, haploizii obŃinuŃi prin androgeneză prezintă o mare importanŃă. În primul rând se demonstrează că în nucleul celulelor vegetale există toată informaŃia ereditară a organismului, inclusiv programul embriogenezei, deoarece dintr-o singură celulă se regenerează un organism întreg.

Plantele haploide sunt pure din puncte de vedere genetic, deoarece sunt hemizigote, existând o corespondenŃă completă între genotip şi fenotip.

Prin dublarea numărului de cromozomi se obŃin plante diploide, complet homozigote, aşa numitele linii izogene, într-un timp foarte scurt, de o importanŃă deosebită pentru ameliorare. Dacă prin metodele clasice liniile homozigote la plantele alogame se obŃin în 8-9 generaŃii de consangvinizare, prin haploidie liniile homozigote se obŃin într-o singură generaŃie.

59

La plantele haploide se manifestă toate genele recesive iar mutaŃiile se pot detecta foarte uşor.

Haploizii s-au dovedit utili în studiile de embriogeneză experimentală, de citologie, citogenetică, de mutageneză, de fiziologie şi biochimie, de citodiferenŃiere, datorită faptului că expresivitatea genelor la plantele haploide, care sunt hemizigote, este totală, într-o singură generaŃie.

MutaŃiile şi mecanismul lor molecular

NoŃiunea de mutaŃie a fost introdusă de Hugo de Vries (1901), înŃelegând prin aceasta, o schimbare bruscă a însuşirilor ereditare. E. Baur (1919) o defineşte drept o modificare ereditară care a apărut în afara hibridării, iar E. Guyenot, o variaŃie bruscă şi ereditară ce poate apare spontan sau sub influenŃa unor factori experimentali.

MutaŃia este o însuşire a materialului genetic şi este tot atât de importantă ca şi stabilitatea lui. Ea apare la toate organismele şi alături de recombinarea genetică este principala sursă de variabilitate.

Omul poate obŃine mutaŃii, acŃionând asupra organismelor cu diferiŃi factori mutageni. Modificările obŃinute afectează diferite caractere morfologice sau însuşiri fiziologice şi biochimice. MutaŃia este una din metodele principale folosită în ameliorare, pentru obŃinerea de soiuri sau linii noi.

ApariŃia spontană a mutaŃiilor a fost sesizată de mult, iar concepŃia care s-a format asupra lor a avut un rol important în explicarea evoluŃiei. EvoluŃia, în concepŃia de astăzi, nu este altceva decât o rezultată a procesului de modificare ereditară a organismelor şi acŃiunea selectivă a mediului. MutaŃia poate determina direcŃii de evoluŃie atunci când modificarea este utilă organismului, reprezentând un avantaj în perpetuarea speciei la care a apărut.

Clasificare mutaŃiilor

MutaŃiile se pot clasifica în mai multe tipuri, fiecare având un anumit criteriu. 1. După modul de apariŃie, ele se împart în mutaŃii naturale şi mutaŃii artificiale: - mutaŃiile naturale numite şi spontane apar în condiŃiile din natură fără intervenŃia

omului. Datorită faptului că mediul totalizează o mare complexitate de factori ce influenŃează organismul este foarte greu de precizat care sunt cauzele ce determină apariŃia acestor mutaŃii;

- mutaŃiile artificiale, numite şi induse, sunt provocate de om cu ajutorul diferiŃilor agenŃi mutageni.

2. După capacitatea de expresie fenotipică ele pot fi: mutaŃii mari (macromutaŃii) ce se deosebesc prin caracterul lor net vizibil, uşor sesizabile; mutaŃii mici (micromutaŃii), care

60

spre deosebire de primele, sunt greu perceptibile, dar mai frecvente şi cu rol important în evoluŃie.

3. După acŃiunea genei mutante, mutaŃiile pot fi: morfologice, fiziologice sau biochimice; mutaŃiile morfologice afectează caracterele morfologice ale organismelor (formă, mărime, culoare etc.) şi sunt uşor detectabile; mutaŃiile fiziologice produc schimbări în procesele fiziologice, (ritmul de creştere, perioada de vegetaŃie, rezistenŃa la boli ş.a.); mutaŃiile biochimice determină modificarea cantitativă sau calitativă a componenŃilor chimici din organism, (substanŃe de rezervă, principii activi, enzime etc.).

4. După natura substratului material al eredităŃii mutaŃiile sunt: genice, cromozomice, de genom, citoplasmatice; mutaŃiile genice (punctiforme) provoacă modificarea genei fără a produce o schimbare în morfologia cromozomului. Ele se referă la schimbările de structură chimică. O alelă se transformă în alta, fără a-şi schimba locus-ul în cromozom. Cea mai mică unitate mutaŃională, este perechea de nucleotide, mutaŃie denumită punctiformă, fiind o mutaŃie intragenică. MutaŃiile cromozomice se referă la restructurările ce pot avea loc în cromozom (deficienŃă, deleŃie, inversie, translocaŃie, translaŃie). MutaŃiile de genom afectează întregul genom sau numai un anumit număr de cromozomi (poliploidia şi aneuploidia). MutaŃiile citoplasmatice se referă la modificările pe care le pot suferi cloroplastele şi mitocondriile şi odată cu ele şi caracterele de care răspund.

5. După originea lor mutaŃiile pot fi: germinale şi somatice. MutaŃiile germinale apar în celulele sexuale şi se manifestă în zigoŃii la a căror formare participă. MutaŃiile somatice apar în celulele somatice. Cu cât apar mai devreme în ontogeneză, vor afecta o porŃiune mai mare din organism. La organismele cu înmulŃire vegetativă ele se pot menŃine pe cale vegetativă şi pe cale sexuată când din Ńesuturile somatice afectate se dezvoltă celule sexuale.

6. După direcŃia de manifestare a mutaŃiilor: mutaŃia directă (forward mutation) şi de reversie (back-mutation). Când o genă normală (de tip sălbatic) se transformă într-o alelă diferită, mutaŃia este directă, iar când o genă se retransformă în tipul iniŃial, mutaŃia este de reversie.

FrecvenŃa acestor mutaŃii este diferită, mai mare pentru cele directe, comparativ cu mutaŃiile de reversie.

7. În funcŃie de locul de plasare a genelor, mutaŃiile pot fi: mutaŃii autozomale plasate pe autozomi, mutaŃii heterozomale plasate în cromozomii sexuali (manifestând sex-linkage) şi mutaŃii extranucleare, ale genelor din citoplasmă.

8. După modul de manifestare a genelor mutante, mutaŃiile pot fi dominante, codominante, semidominante sau recesive. La organismele diploide, mutageneza a creat relaŃii de alelism între gene, exprimându-se fenotipic cele dominante, în timp ce la organismele haploide orice mutaŃie se exteriorizează fenotipic.

9. FuncŃie de modul de reacŃie a indivizilor purtători ai unei mutaŃii, mutaŃiile pot fi viabile, subletale şi letale.

10. Un tip special de gene mutante, sunt genele mutatoare, care măresc frecvenŃa mutaŃiilor altor gene.

Detectarea mutaŃiilor

MutaŃiile pot fi identificate, după modificările fenotipice ereditare sau după

schimbările suferite în structura sau numărul cromozomilor, indiferent dacă acestea sunt sau nu însoŃite momentan de modificări fenotipice.

Cel mai uşor pot fi descoperite mutaŃiile somatice sau cele germinale, dominante, vizibile, care deşi în stare heterozigotă, apar chiar în prima generaŃie. MutaŃiile recesive se pot evidenŃia mai greu şi este nevoie de o analiză genetică efectuată în mai multe generaŃii. Numai în cazul când este homozigotă, mutaŃia recesivă se evidenŃiază în prima generaŃie.

61

Majoritatea mutaŃiilor sunt recesive şi pentru determinarea lor se fac hibridări şi autofecundări. Pentru Drosophila se folosesc cromozomi marcaŃi prin gene dominante şi purtători ai inversiilor ce împiedică crossing-over-ul.

MutaŃiile fiziologice se pot sesiza uşor atunci când sunt letale sau semiletale, deoarece organismele ce posedă astfel de mutaŃii se dezvoltă slab sau pier. Există însă multe mutaŃii ce manifestă mici schimbări în procesele fiziologice sau biochimice şi sunt foarte greu de sesizat. Este imposibil de sesizat apariŃia tuturor mutaŃiilor naturale sau artificiale oricât de minuŃios s-ar lucra.

La organismele diploide mutaŃiile dominante, foarte rare, se manifestă imediat şi pot fi detectate. MutaŃiile recesive se menŃin în genotip mai multe generaŃii (perioadă de lag) până devin homozigote, moment când, se manifestă fenotipic. Cea mai eficientă metodă pentru depistarea lor este autofecundarea urmată de depistarea lor, după un număr de generaŃii (M1, M2, M3…). MutaŃiile care se produc în endosperm, cum ar fi cele care-i afectează culoarea sau alte aspecte, se identifică uşor, prin polenizarea plantelor cu polen ce posedă mutanta respectivă şi care, datorită dublei fecundări, o va manifesta. MutaŃiile recesive se pot menŃine numai prin autogamie şi consangvinizare.

La plantele haploide, starea de hemizigoŃie face posibilă detectarea mutaŃiilor chiar din momentul apariŃiei lor. Aceste mutaŃii pot fi menŃinute şi prin înmulŃire vegetativă.

Cercetări multiple s-au efectuat la microorganisme, la care mutaŃiile pot fi detectate analizându-se diferite caracteristici ale aspectului şi mărimii plajelor, cerinŃele faŃă de factorii de creştere ş.a. Metodele de detectare au fost elaborate de mai mulŃi biochimişti, printre care mai importanŃi sunt: S. W. Beadle şi E. L. Tatum (1941, 1945) pentru Neurospora crassa şi J. Lederberg (1952) pentru bacterii.

Se folosesc metode de inducere a mutaŃiilor care perturbă sinteza unor anumiŃi metaboliŃi la bacterii, ciuperci inferioare şi alte microorganisme haploide. Formele parentale sunt supuse acŃiunii unui agent mutagen, sunt crescute apoi pe medii minimale sau complete şi prin separarea indivizilor se obŃin descendenŃe (clone), dintre care unele mutante.

La bacteriofagi, mutantele afectează morfologia plajelor din culturile de bacterii pe suportul cărora se reproduc.

MutaŃiile cu efect letal în stare homozigotă pot fi detectate foarte uşor. Din încrucişarea a doi indivizi heterozigoŃi, ce posedă o genă letală recesivă raportul genetic de segregare nu va fi 1:2:1 ci, 2:1 deoarece ¼ din indivizii homozigoŃi pentru această genă mor, fie în stadiul embrionar sau post embrionar.

Pentru depistarea genelor mutante letale de pe cromozomii sexuali au fost elaborate diferite metode numite şi teste. Aşa este metoda ClB elaborată de H. J. Müller care permite recunoaşterea mutaŃiilor letale localizate pe cromozomul X la Drosophila melanogaster. Femelele ClB au un cromozom X normal şi unul la care regiunea centrală a suferit o inversie care opreşte un eventual crossing-over pe această porŃiune. Pe acest cromozom se găseşte o alelă mutantă l şi o alelă dominantă B (ochi bar). Alela B îndeplineşte rolul de marker (identificator). Femelele ClB au fost încrucişate cu masculi de tip normal. Dacă la mascul a apărut o mutaŃie letală recesivă, atunci femelele cu ochi bar vor prelua de la mamă şi tată câte un factor letal. În generaŃia următoare toŃi masculii vor muri fie că au moştenit factorul letal ClB, fie mutaŃia care a apărut la cromozomul X (figura 11.1).

O altă metodă pentru determinarea mutaŃiilor letale la Drosophila melanogaster este şi metoda Müller 5, în care se folosesc femele la care cromozomul X este marcat cu o alelă recesivă pentru culoarea apricot a ochilor. Pentru tipul Abraxas această metodă se poate folosi, dar în cazul de faŃă letalitatea se manifestă la sexul femel.

62

Testul ClB de detectare a mutaŃiilor letale ce afectează gene localizate în cromozomul sexului X la Drosophila melanogaster

MutaŃiile spontane ApariŃia spontană a unor indivizi deosebiŃi în cadrul unei populaŃii, cu posibilităŃi de

a transmite modificarea lor la urmaşi, a fost sesizată de foarte mult timp. Unele mutaŃii mai deosebite au fost descrise în diferite lucrări. O mutaŃie descoperită în sec. XVI, de către farmacistul german Sprenger, din Heidelberg, la planta Chelidonium majus avea frunzele şi petalele laciniate (spintecate); caracterul a apărut spontan şi s-a transmis ca atare la descendenŃi. Noua formă a fost denumită Chelidonium laciniatum şi a fost menŃinută prin autofecundare. La frag, există o mutaŃie descoperită de Duchesne (1763) care are frunza compusă dintr-o singură foliolă, numită fragul monofil.

Darwin, în lucrarea sa “VariaŃia animalelor şi plantelor sub influenŃa domesticirii” (1868), descrie diferite mutaŃii pe care le-a denumit sporturi. A descris piersicul cu fructe netede, prunul cu fructe de culoare galbenă ş.a. La animale, citează numeroase mutaŃii: rasa de vite Niatos, cu maxilarul superior mai scurt decât cel inferior, asemănător câinilor buldogi, rasa de oi Ancona cu picioare foarte scurte, păunul cu umeri, cu pene de culoare neagră ş.a.

În afara acestor mutaŃii, există foarte multe exemple în literatura de specialitate: câinii basseŃi, cunoscuŃi cu 3000 de ani înaintea erei noastre, merinosul de Maüchamp cu lâna puŃin ondulată, dispariŃia coarnelor la oi, taurine şi capre, porcii solipezi, care au o singură copită şi nu se îmbolnăvesc de febră aftoasă, rasa de oi chineză Yang-ti, fără urechi, porumbeii rotaŃi, guleraŃi, moŃaŃi, fluturi de culoare neagră ş.a.

Un studiu sistematic al mutaŃiilor spontane l-a realizat Hugo de Vries (1848 – 1936). El a pus bazele teoriei mutaŃioniste. Teoria lui încearcă să explice că evoluŃia se face exclusiv pe baza mutaŃiilor. Lucrarea sa de bază este “Teoria mutaŃiilor” (1901 – 1903).

După De Vries, în viaŃa speciilor sunt anumite perioade sensibile, care fac să apară aceste mutaŃii. El precizează însă că, nu mediul provoacă propriu-zis apariŃia acestor mutaŃii. MutaŃiile sunt determinate de cauze interne, iar mediul nu face altceva decât să declanşeze apariŃia perioadei sensibile a speciei. MutaŃiile nu substituie speciile vechi din care au apărut, ci continuă să trăiască, mai departe, alături de ele. Transformările acestea, spune De Vries, nu

63

au o direcŃie bine definită faŃă de organism. Ele pot fi folositoare organismului după cum pot fi şi nefolositoare, putând chiar periclita existenŃa speciei nou apărute.

De Vries a studiat amănunŃit speciile genului Oenothera, plantă caracterizată printr-un polimorfism accentuat, originară din America şi care fusese introdusă de curând în Olanda, unde lucra De Vries. El a remarcat că numeroase forme noi, erau ereditare. Unele experienŃe păreau să demonstreze că Oenothera lamarckiana, la origine provine din încrucişarea a două forme deosebite. Mai târziu, s-a demonstrat că anumite specii, cum ar fi Oenothera gigas, sunt poliploide.

Teoria mutaŃiilor s-a dezvoltat prin lucrările lui T. H. Morgan. Mecanismele cromozomice descoperite de acesta privind transmiterea caracterelor, cuplarea şi recombinarea genelor, mecanismul de apariŃie a aberaŃiilor cromozomice, au constituit o bază ştiinŃifică pentru fundamentarea procesului mutaŃional.

Procesul mutaŃional se caracterizează printr-o anumită frecvenŃă a mutaŃiilor. Este rar, atunci când luăm în considerare o singură genă şi mult mai frecvent atunci când se iau în considerare toate genele şi toate mutaŃiile posibile de la un anumit organism. În primul caz raritatea se explică prin aceea că din perechile de alele mutează de obicei numai una singură, iar în al doilea rând ele sunt în majoritate recesive şi nu se exteriorizează decât în stare homozigotă. Există factori ce influenŃează frecvenŃa mutaŃiilor spontane.

În primul rând, frecvenŃa mutaŃiilor genice, depinde de specie şi de gena respectivă. Există unele aprecieri privind frecvenŃa lor, calculată în raport cu numărul de gameŃi studiaŃi. După Wagner şi Mitchell (1955) mutaŃiile spontane la diferiŃi loci la porumb, sunt cuprinse între 0,001 şi 0,110 la 10000 gameŃi, iar la Drosophila între 0,29 şi 1,5 la 10000 gameŃi. După alte date ale unor autori, reiese că una şi aceeaşi genă de la diferite linii de porumb mutează diferit. Aşa de exemplu gena Rr formează mutante rr cu frecvenŃe diferite la aceste linii: la una de 6,2 la 10000 gameŃi, la cealaltă de 18,2 la 10000 gameŃi. Se presupune că aceste diferenŃe se datorează existenŃei unor gene speciale, care influenŃează frecvenŃa mutaŃiilor altor gene (gene mutatoare).

Numărul de mutaŃii ce se acumulează în celule este proporŃional cu vârsta lor. În seminŃele plantelor care sunt depozitate un număr mai mare de ani, creşte numărul de mutaŃii faŃă de seminŃele de curând recoltate. H. Stubbe a constatat la seminŃele de Antirrhinum majus o creştere a procentului de mutaŃii de la 1,5% la 14% pentru o perioadă de la 5 la 10 ani. Astfel de observaŃii s-au făcut şi asupra mutaŃiilor letale spontane, înlănŃuite cu sexul, în spermatozoizii precoci şi tardivi de la Drosophila melanogaster. Aceste constatări au dus la formularea unei păreri generale că, numărul de mutaŃii este proporŃional cu vârsta celulei deşi există şi excepŃii.

Descoperirea mutaŃiilor naturale cu ajutorul unora dintre metodele şi tehnicile cunoscute face posibil calculul procentului de mutante în sânul unei populaŃii de indivizi. Este însă foarte greu de stabilit prin acest calcul în mod exact proporŃia mutaŃiilor, din mai multe motive:

- în primul rând, mutaŃiile au apărut în decursul timpului, odată cu formarea populaŃiilor şi multe din ele pot fi considerate caractere normale;

- multiplicarea celulelor mutante poate fi mai lentă sau mai rapidă decât acea a celulelor nemodificate;

- acŃiunea genelor sau a genotipurilor mutante poate fi favorabilă sau letală organismelor;

- toate acestea fac ca numărul de mutaŃii să sufere mereu modificări. Numărul de mutaŃii, fiind foarte mare, este greu de determinat frecvenŃa fiecăreia în

parte. De aceea, se poate face o apreciere cantitativă a lor după numărul de gameŃi care posedă mutaŃii. Această apreciere globală se referă de fapt numai la frecvenŃa unei singure gene mutante sau a unei clase oarecare de mutaŃii. Mai trebuie adăugat că mutaŃia germinală nu se produce întotdeauna în gameŃi, ci şi în gonii, care în urma diviziunilor celulare produce gameŃi mutanŃi. Dacă folosim metoda unei clase de mutaŃii trebuie să subliniem că mutaŃiile

64

letale nu reprezintă o clasă omogenă; ele pot să apară sub influenŃa a mai multor cauze: mutaŃii genice, cromozomice, efecte de poziŃie etc.

În afară de factorii analizaŃi mai sus, frecvenŃa mutaŃiilor este influenŃată şi de hibridare; la organismele hibride, faŃă de cele homozigote, pentru acelaşi locus frecvenŃa mutaŃiilor este mai mare. De asemenea, procesul mutaŃional spontan este influenŃat şi de starea fiziologică şi biochimică a organismului.

MutaŃiile artificiale

Odată cu descoperirea unor factori ce pot fi folosiŃi de om în obŃinerea de mutaŃii,

interesul oamenilor de ştiinŃă pentru studiul acestora şi a efectelor pe care le produc asupra organismelor a crescut foarte mult. Paralel cu aceste studii s-au elaborat şi s-au perfecŃionat metodele pentru producerea de mutaŃii artificiale, denumite şi induse.

Dintre factorii mutageni folosiŃi de om pentru prima dată, au fost razele X. În anul 1925, G. A. Nadson iradiind ciupercile inferioare cu raze X a obŃinut mutaŃii morfo-fiziologice.

AcŃiunea mutagenă a razelor X a fost demonstrată de H. J. Müller în 1927 şi 1928 la Drosophila. Rezultatele le publică în lucrarea “TransmutaŃia artificială a genei”, (laureat Nobel în 1946). Tot în această perioadă, L. J. Stadler între 1927 şi 1929, obŃine cu ajutorul radiaŃiilor, mutaŃii la orz, porumb şi tutun.

Descoperirea efectului mutagen al radiaŃiilor a deschis calea unor ample cercetări ştiinŃifice, importante atât din punct de vedere teoretic, cât şi practic. T. H. Morgan şi şcoala sa, au obŃinut la Drosophila peste 500 de forme mutante (figura 11.2).

Ulterior, metodele producerii experimentale a mutaŃiilor la plante, au fost folosite din plin de A. Gustafsson (1954), J. MacKey (1956), H. Stubbe (1959), C. F. Konzak (1957) ş.a.

Dintre agenŃii mutageni folosiŃi de om şi mai bine studiaŃi fac parte: radiaŃiile, temperatura şi unele substanŃe chimice.

RadiaŃiile mutagene

RadiaŃiile electromagnetice au o gamă de lungimi de undă foarte întinsă, care variază

de la 10-3 m cât au razele gamma până la peste 1 m, cazul undelor hertziene. Între aceste limite se găsesc razele X, razele ultraviolete, razele infraroşii.

RadiaŃiile mutagene sunt radiaŃiile care produc mutaŃii şi din ele fac parte: 1) radiaŃii ionizante electromagnetice (raze X şi gamma); 2) radiaŃii ionizante corpusculare (radiaŃii α, protoni, neutroni, raze β, diferite particule grele); 3) radiaŃii neionizante (raze ultraviolete).

Razele X şi gamma, prin energia absorbită, provoacă ionizări în Ńesuturile plantei şi modifică metabolismul celular. Razele X sunt foarte mult folosite, deoarece aparatele Roentgen sunt uşor utilizabile. Pentru iradierea cu raze gamma se foloseşte cobaltul radioactiv. Razele gamma sunt mai penetrante decât razele X.

Razele Beta (β) sunt formate din electroni eliberaŃi de radioizotopii de P32 şi S35. Cu aceştia se realizează soluŃii radioactive, în care se introduc seminŃe uscate sau germinate.

Neutronii sunt particule neutre din punct de vedere electric, rezultaŃi din dezintegrarea atomilor. Ei acŃionează prin curentul dens şi ionizant de protoni de hidrogen. Efectul iradierii cu neutroni este mai puternic, cu cât elementele celulei au o structură mai densă (plastide, nuclei şi cromozomi).

Razele ultraviolete fac parte din spectrul solar invizibil, sunt constituite din fotoni, cu o lungime de undă între 136 Å şi 4.000 Å. Absorbite în organism, transformă energia lor în reacŃii chimice, provocând diferite efecte genetice. Ele au o mai mică putere de pătrundere şi sunt absorbite la suprafaŃa Ńesuturilor.

În lucrările de genetică se foloseşte mai frecvent acŃiunea mutagenă a razelor X, gamma şi a neutronilor termici. Studiul şi folosirea radiaŃiilor în genetică a dus la fundamentarea unei

65

noi ramuri a biologiei – radiogenetica – care în ultimul timp a căpătat o amploare foarte mare.

Efectele iradierii asupra plantelor. Efectele produse de radiaŃii sunt directe şi imediate. SeminŃele tratate cu doze maxime, de obicei nu supravieŃuiesc, iar embrionii lor, cercetaŃi la microscop conŃin numeroase zone de Ńesut necrotic. Tratamentele cu doze mai mici duc la apariŃia de mutaŃii.

Unele substanŃe au o acŃiune de protecŃie a organismelor, diminuând efectul distructiv al razelor X, cum sunt, de exemplu, substanŃele reducătoare din grupul sulfhidrelor. SeminŃele uscate, iradiate cu raze X, într-un mediu de hidrogen sulfurat, nu manifestă perturbări în celulele lor, întrucât acest mediu anihilează într-o măsură oarecare, acŃiunea radicalilor oxidanŃi produşi de radiaŃii.

Spre deosebire de acŃiunea razelor X, iradierea cu neutroni provoacă tulburări mai evidente şi o sterilitate pronunŃată a indivizilor în descendenŃă. S-a emis ipoteza conform căreia, neutronii ar acŃiona direct asupra nucleului, iar razele X asupra celorlalte elemente din celulă.

Deşi plantele provenite din iradierea seminŃelor cu neutroni manifestă tulburări profunde, dând naştere la porŃiuni de Ńesuturi necrotice, răsăritul lor este mai uniform, cu un procent ridicat de plante, deoarece în urma iradierii cu neutroni, celulele seminŃelor rămân viabile într-o proporŃie mai mare şi au o turgescenŃă normală.

Razele ionizante au o influenŃă dăunătoare asupra organismelor deoarece ele descompun apa din Ńesuturi în radicali liberi. În organismele care conŃin o cantitate apreciabilă de apă, supuse tratamentului cu radiaŃii, apa este descompusă în elemente componente. Acestea intră în acŃiune cu restul substanŃelor biologice din celule şi provoacă modificări oxidante pronunŃate. Bacteriile ce atacă plantele şi animalele, supuse iradierii într-un mediu cu o concentraŃie mai redusă de oxigen, devin mai rezistente după acŃiunea razelor ionizante.

Perturbările din celulele iradiate sunt datorate şi sistării, într-o oarecare măsură a activităŃii enzimelor, care suferă o puternică oxidare.

AcŃiunea razelor ionizante modifică şi structura nucleo-proteinelor din organism. Vom vedea mai departe că acizii nucleici, atât ADN cât şi ARN suferă modificări structurale importante şi determină modificări fenotipice.

Studiile citogenetice arată că în organismele iradiate, celulele îşi modifică mersul diviziunii. Se produc ruperi la nivelul centromerilor, cromozomilor şi cromatidelor, perturbări în formarea fusului sau aglutinarea cromozomilor.

Ruperile cromozomice duc la restructurări cromozomice, iar frecvenŃa acestora este proporŃională cu doza de radiaŃii. Acest lucru este valabil numai în cazul unei singure rupturi. În cazul a două rupturi frecvenŃa lor este proporŃională cu pătratul dozei.

Ruperile cromozomice depind de faza în care se găseşte celula. În ultimele stadii ale mitozei, cromozomii nu par să sufere asemenea rupturi. În interfază şi începutul profazei ruptura se produce la nivelul ambelor cromatide. În profază, fiecare cromatidă poate să sufere în mod independent acŃiunea radiaŃiilor. Numărul de rupturi este proporŃional cu lungimea cromozomului. Regiunile heterocromatice sunt cele mai sensibile la rupturi.

În urma tratamentului cu radiaŃii suferă nu numai cromozomii ci şi citoplasma celulei. Nucleul izolat de citoplasmă prin microdisecŃie şi supus unei doze maxime de iradiere (25.000 - 65.000 r), prezintă aceleaşi proprietăŃi chimice şi fizice ca şi nucleul extras dintr-o celulă neiradiată. Nucleul izolat de citoplasmă devine radiorezistent. Dacă un nucleu neiradiat este inclus într-un mediu citoplasmic iradiat vor apare toate radioleziunile caracteristice, fapt ce justifică legătura dintre citoplasmă şi nucleu.

SeminŃele uscate sau umectate, se supun diferitelor doze de iradiere cu raze X, în aparate speciale. Iradierea materialului biologic cu neutroni se face în reactori, ciclotroni şi betatroni nucleari.

Iradierea plantelor în cursul vegetaŃiei se face în câmpuri special amenajate în acest scop. Plantele sunt aşezate în cercuri concentrice şi după distanŃa faŃă de sursa de iradiere

66

primesc diferite doze. Doza de iradiere exprimă numărul perechilor de ioni ce se formează într-un anumit volum de aer.

Unitatea de iradiere, denumită Roentgen (r) corespunde formării într-un cm3 de aer uscat, la o temperatură de 0oC şi la presiunea de 760 mm coloană mercur, a unui număr de 2,1 x 109 perechi de ioni sau într-un gram de aer a unui număr de 1,6 x 1012 perechi de ioni.

Există deja stabilită doza critică de iradiere pentru seminŃele unor plante de cultură. Prin doza critică (DL 50%), se înŃelege doza la care supravieŃuiesc 50% din indivizii trataŃi (tabelul 11.1).

FrecvenŃa mutaŃiilor induse este mai mare în cazul tratării seminŃelor vechi, păstrate un interval de ani, decât la cele proaspete. Plantele tinere sunt mai sensibile decât cele mature, celulele în diviziunea meiotică sunt mai sensibile decât celulele în diviziunea mitotică, iar cele mai sensibile stadii din cursul meiozei sunt profaza avansată şi metafaza.

Poliploizii sunt mai rezistenŃi la iradiere comparativ cu formele diploide înrudite. Astfel, apariŃia mutaŃilor clorofiliene este mai mică la speciile de grâu şi orz cu un număr mai mare de cromozomi.

Organismele care au o structură ereditară heterozigotă tratată cu radiaŃii produc un număr mai mare de mutaŃii decât cele homozigote.

MutaŃia este urmarea unor complicate procese morfofiziologice şi biochimice în organism, pentru care îşi dau concursul o diversitate de factori interni şi externi. Pentru studiul complex al acestor factori s-au întreprins multiple cercetări, dintre care vom menŃiona pe cele care prezintă mai mult interes.

S-a studiat acŃiunea radiaŃiilor ionizante, în funcŃie de anumite temperaturi la care au fost Ńinute organismele înainte, în timpul şi după tratament. Aşa de exemplu, scăderea temperaturii de la 20 – 30oC la 4oC în perioada tratamentului cu radiaŃii creşte frecvenŃa mutaŃiilor (aberaŃiilor cromozomice) la Tradescantia şi a translocaŃiilor şi mutaŃiilor letale la Drosophila. Aplicarea unei temperaturi ridicate (37oC) la o oră după iradiere, de asemeni creşte frecvenŃa mutaŃiilor letale la Drosophila.

Lipsa oxigenului sau diminuarea procentului de oxigen din aer în timpul expunerii organismului la iradiaŃii reduce frecvenŃa mutaŃiilor letale şi a translocaŃiilor la Drosophila, a mutaŃiilor la bacterii şi diferite aberaŃii cromozomice la diferite plante (porumb, ricin ş.a.).

Tratamentul combinat al razelor X cu raze ultraviolete sau cu raze infraroşii sau a substanŃei etilamina, duce la o creştere efectivă a mutaŃiilor.

Prin acŃiunea în complex a factorilor mutageni şi a factorilor de mediu, se poate dirija într-o măsură oarecare obŃinerea de mutaŃii artificiale, cu valoare pentru practică. W.R. Kaplon (1953) a descoperit că prin tratarea seminŃelor de orz cu bioxid de carbon şi amoniac înainte de iradiere s-a redus procentul de plante sterile. Se ştie că aplicarea colchicinei înainte de iradiere, sporeşte frecvenŃa de mutaŃii. F. D. Amato şi A. Gustafsson (1948) au tratat seminŃe de orz cu colchicină, după care le-au supus tratamentului cu raze X. Prin acest procedeu au reuşit să modifice frecvenŃa unor mutaŃii clorofiliene. A scăzut frecvenŃa mutaŃiilor de tip albino-viridis şi a crescut procentul mutaŃiilor de tip xantha alboviridis.

Deşi s-a cercetat acŃiunea multiplă a factorilor mutageni şi a celor externi, foarte multe rezultate rămân încă disparate fără prea multe posibilităŃi de generalizare. Aceasta se datorează necunoaşterii în suficientă măsură a tuturor manifestărilor care stau la baza procesului de apariŃie a mutaŃiilor.

Pe lângă seminŃe, se pot iradia polen, muguri, tuberculi, rizomi, butaşi etc. În toate aceste cazuri, se aplică doze mai mici de iradiere, în funcŃie de natura speciei de plante supuse iradierii. Prin experienŃe s-a stabilit că, în medie, dintr-o 1000 spice de grâu, apar 3-7 mai rezistente la cădere, la boli sau mai precoce.

În lucrările de genetică şi selecŃie, prima generaŃie şi generaŃiile următoare se notează cu litera iniŃială a sursei de iradiere, indicând anul respectiv de studiu. Astfel, generaŃiile seminŃelor iradiate cu raze X se notează X1, X2, X3 etc.; cele iradiate cu neutroni n1, n2, n3,

67

etc.; în ultimul timp s-a admis notarea generală a generaŃiilor cu litera M, care reprezintă acŃiunea oricărei surse a factorilor mutageni (M1, M2, M3 etc.).

Plantele din prima generaŃie, provenite din seminŃele iradiate prezintă uneori modificări teratologice, sunt sterile şi au o fertilitate redusă. Modificările morfologice din prima generaŃie nu se moştenesc şi poartă denumirea de radiomorfoze. VariaŃiile ereditare se observă foarte rar în prima generaŃie, deoarece mutaŃiile sunt în cea mai mare parte recesive şi se manifestă numai în generaŃiile ulterioare. Plantele primei generaŃii iradiate au un pronunŃat caracter de himere, deoarece se dezvoltă din grupe de celule în care apar diferite leziuni şi modificări provocate de radiaŃii.

ExperienŃele întreprinse pentru obŃinerea unor mutante au dus la crearea de forme cu valoare agronomică superioară la orz, ovăz, mazăre, soia, in, muştar alb, rapiŃă şi altele.

RadiaŃiile ultraviolete sunt mai puŃin folosite în radiogenetică, deoarece şi modificările genetice pe care le produc sunt mai puŃin importante. Ele produc mai ales mutaŃii genice şi foarte rar restructurări cromozomice. Provoacă toate tipurile de mutaŃii. AcŃionează mai eficace atunci când lungimea lor de undă este în jur de 2.600 Å. Razele cu această lungime de undă au o acŃiune mai mare asupra structurii moleculei de ADN, alterând structura normală a bazelor azotate. S-a constatat că bazele pirimidinice sunt mai sensibile faŃă de acŃiunea UV decât bazele purinice. Cu cât ne îndepărtăm spre stânga sau spre dreapta acestei lungimi de undă eficacitatea lor scade. Eficacitatea razelor ultraviolete, în funcŃie de lungimea de undă de 2.600 Å, coincide de fapt cu spectrul de absorbŃie al ADN.

Razele ultraviolete au o acŃiune germicidă şi de aceea în doze mari, aplicate la microorganisme omoară o parte din germeni. Microorganismele sunt însă destul de sensibile la UV. Uneori numai simpla iradiere a mediului de cultură înainte ca el să fie însămânŃat, provoacă mutaŃii.

Temperatura Temperatura este un agent mutagen slab. AcŃiunea ei a fost sesizată în special la

Drosophila. Odată cu ridicarea temperaturii la care sunt menŃinute muştele, frecvenŃa mutaŃiilor creşte. Creşterea sau scăderea treptată a temperaturii determină o creştere nesemnificativă a frecvenŃei mutaŃiilor.

Mult mai eficace sunt şocurile de temperatură, aplicate pentru o perioadă scurtă de timp. Prin tratarea larvelor de Drosophila cu temperaturi de 36–380C, timp de 12 – 14 ore, frecvenŃa mutaŃiilor letale creşte de două ori faŃă de cea a larvelor crescute la temperaturi normale. Dacă şocul termic este de –6oC timp de 25' - 40', frecvenŃa mutaŃiilor creşte de trei ori faŃă de cea a larvelor crescute la temperaturi normale.

S-au făcut încercări pentru a pune în evidenŃă efectul variaŃiilor de temperatură asupra mutabilităŃii diferitelor specii de plante şi animale, dar nu s-au putut formula concluzii generale.

SubstanŃele chimice mutagene

AcŃiunea mutagenă a unor substanŃe a fost pusă în evidenŃă mai ales în ultimele

decenii. Oehlkers, în 1943 (după Serra A. J., 1968) descoperă acŃiunea de dezintegrare a cromozomilor de Oenothera prin tratarea acesteia cu uretan. Cercetări sistematice fuseseră iniŃiate încă din 1940 de către C. Auerbach şi J. M. Robson Primele rezultate s-au obŃinut prin tratarea Drosophilei cu iperită (gaz muştar), obŃinându-se peste 24% mutaŃii letale sex-linkate. Ulterior s-au obŃinut rezultate şi la plantele superioare, la ciuperci şi microorganisme.

În prezent, se cunosc un număr foarte mare de substanŃe chimice cu efect mutagen. Dat fiind structura lor, de la cea mai simplă, la cea mai complexă, este greu de clasificat după un anumit criteriu. Modificările produse de ele sunt asemănătoare cu cele ale mutaŃiilor spontane. Nici una nu posedă specificitate pentru inducerea unui anumit tip de mutaŃie (tabelul 11.2.).

68

Tabelul 11.2.

SubstanŃe mutagene şi eficacitatea lor la câteva specii Nr crt

SubstanŃa mutagenă Drosophila Cromozomi

plante Bacterie Neurospora

1. Iperita + + + +

2. Apa oxigenată ? - + + 3. Oxizi organici + + ? + 4. Formaldehidă + + + + 5. Diazometan + - ? + 6. Propiolactonă ? + ? + 7. Cazeină ? + + + 8. Uretan + + + - 9. Fenoli + + + - 10 Etilenimină + + ? + 11 Cetonă + ? ? - 12 Epoxizi şi diepoxizi + + ? + 13 Penicilină ? + ? ? 14 Carcinogene ? ? + - 15 Dezoxicolat de Na ? ? + - 16 Acriflavină ? + + ? 17 Clorură de fier - ? + ? 18 Clorură de mangan ? ? + ? 19 Clorură de aluminiu ? + ? ?

SubstanŃele chimice se administrează în raport cu specia de plantă sau animal. De

exemplu, la Drosophila s-a acŃionat asupra larvelor prin soluŃii administrate sub formă de aerosoli. SubstanŃele pătrund în trahee şi de aici ajung în gonade. Prin contact direct cu soluŃia se pot trata sporii de ciuperci, polenul, meristemele vegetale.

AcŃiunea acestor substanŃe provoacă în organismul în care au pătruns modificări biochimice şi fiziologice. La nivelul cromozomilor, se produc ruperi cromozomice şi ca urmare reconstrucŃii de diferite tipuri, corelate cu modificări fenotipice. La nivelul genei se produc mutaŃii genice. Întreaga acŃiune a substanŃelor depinde de foarte mulŃi factori pe care-i vom analiza în cele ce urmează.

În primul rând, o anumită substanŃă poate avea o influenŃă mutagenă asupra unei specii, iar asupra alteia să nu exercite nici un fel de influenŃă. Aşa de exemplu, apa oxigenată exercită o influenŃă mutagenă la bacterii sau Neurospora, dar nu are nici un efect asupra plantelor. Penicilina constituie factor mutagen numai pentru plante.

AcŃiunea mutagenă a substanŃelor depinde şi de stadiul de dezvoltare a celulelor sexuate sau embrionare. De exemplu, uretanul are acŃiune numai asupra celulelor sexuate mascule de Drosophila deja formate şi nu influenŃează spermatogoniile.

Formaldehida acŃionează numai asupra gameŃilor masculi, când ei se găsesc în stadiu timpuriu de dezvoltare. Asupra femelelor, indiferent de stadiul în care se găsesc, această substanŃă nu are nici o influenŃă asupra genelor din ovule.

În afară de factorii menŃionaŃi mai sus, pot exista şi diferiŃi factori exteriori, care în combinaŃie cu agenŃii mutageni pot mări sau diminua eficacitatea lor.

SubstanŃele chimice mutagene care provoacă modificări în structura acizilor nucleici sunt foarte variate. Există o gamă de substanŃe, precursori ai ADN, care au o structură analogă bazelor azotate, care blochează formarea nucleotidelor şi în consecinŃă sinteza ADN. În tabelul 11.3 sunt menŃionate câteva cu această însuşire. Dintre ele, azaserina s-a dovedit eficientă în blocarea bazelor purinice. Adenina induce aberaŃii cromozomice atât la plante cât şi la animale, producând rupturi şi schimburi cromatidice.

Unii analogi ai bazelor purinice şi pirimidinice pot fi încorporaŃi în molecula acizilor nucleici în locul bazelor azotate normale. Ei au constituŃia nucleilor purinici sau pirimidinici la care s-a adăugat sau substituit anumite grupări funcŃionale sau atomi. Cei mai frecvent

69

folosiŃi sunt derivaŃii halogenaŃi ai uracilului (5-bromuracil, 5-cloruracil, 5-floruracil, 5-ioduracil) sau derivaŃi aminaŃi ai purinei (2 amino-purina şi 2,6 diamino-purina).

DerivaŃii halogenaŃi ai uracilului înlocuiesc timina, un analog al acestuia. Aceasta se vede şi din constituŃia lor (figura 11.3.).

Bacteria Escherichi coli, fiind cultivată pe un mediu ce conŃine 5-bromuracil a produs mutante, la care perechea de baze adenina-timina a fost înlocuită cu perechea guanina-citozina, în felul următor: adenina-timina-adenina-5-bromuracil-guanina-5-bromuracil-guanina-citozina. Mai întâi, adenina se leagă de 5-bromuracil în loc de timină, dintr-o eroare 5-bromuracil se leagă de guanină în locul adeninei, iar, în final, guanina se leagă în mod normal de citozină.

În mod analog, 2 amino-purina înlocuieşte adenina în încorporare, prin împerechere cu timina: adenina-timina-2-amono-purina-timina-aminopurina-citozina-guanina-citozina.

Încorporarea analogilor bazici a fost studiată la fagi şi bacterii demonstrându-se că încorporarea analogilor are loc numai într-o singură catenă.

O altă categorie de substanŃe (acidul nitros, hidroxilamina, hidrazina ş.a.) au o acŃiune primară asupra acizilor nucleici acŃionând fie numai asupra bazelor azotate fără a modifica lanŃul glucido-fosforic, sau modifică atât bazele azotate cât şi lanŃul glucido-fosforic (alkilanŃii, peroxizii organici, clorura feroasă ş.a.).

AgenŃii alkilanŃi, dintre care face parte şi iperita (gaz muştar) se numesc astfel, deoarece conŃin un radical numit alkil (metil, etil, propil), care poate fi transferat nucleotidelor. Majoritatea lor opresc diviziunea mitotică, de aceea sunt folosiŃi şi în tratamentul cancerului. Ei intră în reacŃie cu molecula de ADN unde pot produce modificările următoare: ruperea coloanei glucido-fosforice, alkilarea bazelor purinice şi pirimidinice, depurinizarea moleculei de ADN, blocarea mitozei prin formarea unei legături transverse intercatenare. Efectul mutagen al agenŃilor alkilanŃi a fost pus în evidenŃă la bacterii, Drosophila melanogaster, Neurospora crassa, Vicia faba ş.a. SubstanŃele alkilante acŃionează în perioada S a ciclului mitotic.

Acidul nitros (HNO2) este un agent mutagen care acŃionează asupra bazelor purinice şi pirimidinice, dezaminându-le. Prin tratarea ARN din virusul mozaicului tutunului cu acid nitros, se produce dezaminarea bazelor azotate şi adenina a trecut în hipoxantină, guanina în xantină iar citozina în uracil (figura 11.4.).

Aceste treceri au repercusiuni asupra blocării biosintezei unei enzime şi în consecinŃă asupra unei proteine.

Acidul nitros produce mutaŃii şi la fagii T4, la Escherichia coli, la stafilococi ş.a. Hidroxilamina (NH2OH) acŃionează în special asupra citozinei care face parte din

bazele pirimidinice. Ea provoacă o dezaminare a citozinei şi transformarea ei în uracil. A fost experimentată asupra virusului mozaicului tutunului, asupra fagului T4.

Acridinele sunt coloranŃi bazici care produc mutaŃii, acŃionând asupra moleculelor de ADN, dar ale căror mecanisme nu sunt însă bine elucidate. În afară de substanŃele arătate mai sus se mai cunosc şi altele cu acŃiune mutagenă: hidrazina, formaldehida, clorura de mangan, peroxizi organici, apă oxigenată, clorură feroasă ş.a.

Factorii mutageni biologici Cercetările care s-au efectuat în ultimii ani la microorganisme au scos în evidenŃă că

virusurile şi micoplasmele produc mutaŃii la plante şi animale. Se cunosc ribovirusurile care produc sarcomul la găini şi leucemia la păsări şi mamifere. Dintre dezoxiribovirusuri pot fi menŃionate: virusul poliomei sau virusul oncogen. Teoria virotică a cancerului uman câştigă tot mai mult teren. Este vorba de ribovirusuri defective care se integrează în cromozomii umani. Dar pătrunderea virusurilor în celulă determină restructurări cromozomice, pulverizări cromozomice. Sunt citate chiar şi apariŃii de mutaŃii genice.

70

Micoplasmele, cele mai mici organisme, de dimensiuni cuprinse între cele mai mici virusuri şi cele mai mici bacterii, capabile şi de viaŃă independentă, introduse în culturi de celule produc restructurări şi pulverizări cromozomice. La nivel molecular, sinteza ADN micoplasmic opreşte sinteza ADN în celula gazdă.

Mecanismul molecular al mutaŃiilor

Deoarece un anumit tip de secvenŃă nucleotidică este purtătoarea unei anumite

informaŃii ereditare, orice schimbare a acesteia schimbă şi conŃinutul informaŃiei. În procesul de diviziune celulară, această schimbare se va transmite şi celulelor fiice.

Se cunosc astăzi unele substanŃe chimice, care venind în contact cu organismele sau numai cu acizii nucleici extraşi din ele, modifică structura acestora şi fac să apară mutaŃii. Schimbările se produc în anumite regiuni ale moleculei şi nu au nimic comun cu restructurările cromozomice ce se produc în cromozomi.

Schimbarea secvenŃei nucleotidelor se referă de fapt la schimbarea bazelor azotate, acestea constituind elementul mobil. Există mai multe modalităŃi de schimbare a lor: substituŃia, deleŃia, adiŃia şi inversia.

Prin substituŃie, se înŃelege înlocuirea unei baze purinice sau pirimidinice printr-o altă bază purinică sau pirimidinică. Dacă această înlocuire are loc numai într-o catenă, odată cu replicarea moleculei, înlocuirea se va transmite şi în catena complementară. Înlocuirea este şi ea de două tipuri: a) când o bază purinică este înlocuită cu o bază purinică, iar una pirimidinică tot cu una pirimidinică, ea poartă numele de tranziŃie (de exemplu se înlocuieşte adenina cu guanina sau timina cu citozina); b) când o bază purinică este înlocuită cu o bază pirimidinică sau invers, poartă numele de transversie.

DeleŃia este pierderea uneia sau mai multor nucleotide, modificând mesajul genetic. AdiŃia este adăugirea uneia sau mai multor nucleotide în cadrul secvenŃei iniŃiale. Inversia este schimbarea ordinii unui număr de baze într-un segment al catenei din

molecula ADN. Pentru a da o explicaŃie diferitelor tipuri de modificări structurale a ADN, Watson şi

Crick au emis teoria copierii greşite în procesul de replicaŃie a ADN. Schimbarea de secvenŃă a unei baze va comanda în procesul de sinteză baza corespunzătoare cu care se va lega catena nouă, complementară. Această nouă ordine va fi copiată şi la o nouă replicaŃie a moleculei de ADN.

MutaŃii ale acizilor nucleici s-au obŃinut prin acŃiunea cu diferiŃi agenŃi mutageni, fie asupra organismului, fie direct asupra acizilor nucleici. În cazul radiaŃiilor ionizante, mecanismul de obŃinere a mutaŃiilor la nivel molecular nu este încă complet elucidat. Există ipoteze, care susŃin că acestea produc ruperi ale moleculei de ADN, urmate de realipirea fragmentelor în diferite poziŃii. Razele ultraviolete cu lungimea de undă de 2600 Å acŃionează asupra bazelor purinice şi pirimidinice. S-a demonstrat acest lucru acŃionându-se direct asupra acestor baze. S-a constatat că acestea sunt sensibile la tratamentul cu raze ultraviolete şi se descompun în mod diferenŃiat. Temperaturi anormale pot produce alterări în molecule de ADN: disocierea catenelor şi depurinizarea catenelor de ADN.

ImportanŃa mutaŃiilor

În natură, supravieŃuiesc formele mutante care favorizează individul şi deci şi specia

căreia îi aparŃine. Ele pot constitui puncte de plecare pentru formarea de noi specii. MutaŃia are, deci, rol în evoluŃie.

MutaŃiile artificiale se obŃin cu ajutorul unor metode ce depind de specie, factorul cu care se acŃionează, momentul în care se aplică tratamentul ş.a. Dat fiind efectul foarte variat, puŃine mutaŃii prezintă interes pentru amelioratorul de plante sau animale. De aceea, este necesar pentru obŃinerea de mutaŃii valoroase la plantele de cultură să se folosească un număr

71

foarte mare de indivizi. De multe ori se opresc drept genitori, mutante care posedă multe caractere şi însuşiri defectuoase, dar care conŃin una, două însuşiri valoroase. Prin hibridare şi selecŃie, aceste calităŃi pot fi transmise la descendenŃi, realizându-se noi soiuri.

La animalele de producŃie, s-au folosit şi se folosesc puŃin mutaŃiile artificiale deoarece formele mutante, cu defecte letale cer cheltuieli care întrec beneficiile. În general, foarte rar s-a reuşit să se obŃină mutante valoroase.

O importanŃă deosebită o constituie obŃinerea de mutaŃii la microorganisme. MutaŃia şi recombinarea, după părerea unor microbiologi, sunt singurele mecanisme prin care bacteriile pot deveni rezistente sau sensibile la antibiotice. Microorganismele oferă multiple posibilităŃi de studiu al procesului mutaŃional, la diferite niveluri de organizare a materiei vii, de la individ până la moleculă.

Una din direcŃiile actuale de cercetare a mutaŃiilor este de a găsi posibilităŃile de a induce mutaŃii după dorinŃa omului. Problema nu va putea fi rezolvată prin studierea mutaŃiilor cromozomice, care înseamnă schimbarea unor segmente mari, de cele mai multe ori cu caracter letal, ci prin mutaŃiile punctiforme ce se produc în structura moleculelor de acizi nucleici. Aceste schimbări modifică biosinteza proteinei şi în consecinŃă fenotipul.

MutaŃiile de genom

Speciile de plante şi animale posedă în mod obişnuit un număr constant de

cromozomi, în celulele somatice 2n, iar în cele sexuale, n. Numărul de cromozomi a speciilor eucariote variază în limite foarte mari: Ascaris megalocephala var. univalens are 2n = 2, în timp ce radiolarul Aulacantha 2n = ± 1600.

În cadrul unor genuri, s-a constatat că unele specii au un număr de cromozomi ce reprezintă un multiplu al unui număr de cromozomi de bază sau genom, care se notează cu x. De exemplu, în cadrul genului Triticum, există specii ce posedă 14, 21 şi 42 de cromozomi, deci, un multiplu al genomului x = 7; în cadrul genului Rosa, speciile pot avea 14, 21, 28, 35, 42, 56 cromozomi, genomul în acest caz fiind x = 7 ş.a.

Celulele sexuale, conŃinând câte un set cromozomic, sunt haploide. Numărul haploid de cromozomi (n) nu corespunde întotdeauna cu numărul de cromozomi de bază (x). De exemplu, la Triticum monococcum x = 7 şi n = 7, pe când la Triticum aestivum, x = 7 dar n = 21. Când numărul haploid de cromozomi corespunde cu numărul de cromozomi de bază (genomul sau numărul monoploid), numărul cromozomilor din celulele somatice corespunde cu starea diploidă a organismului, iar când în celulele somatice există un multiplu al numărului monoploid, determină starea poliploidă.

Fenomenul de multiplicare a numărului de genomuri se numeşte poliploidie. Poliploidia este considerată o mutaŃie de genom.

Există cazuri când variaŃia numărului de cromozomi se manifestă chiar la nivelul unor Ńesuturi diferite ale aceluiaşi individ. Astfel, în cazul spanacului (Spinacea oleracea) care are 2n = 12, în celulele meristematice ale rădăcinilor s-au identificat în celule cu 2n = 24, 48 şi 96 cromozomi, iar la mamifere, în ficat, sunt celule cu număr dublu sau quadruplu de cromozomi.

Clasificarea variaŃiilor numeric cromozomice

łinând seama de multitudinea de tipuri de variaŃii numeric cromozomiale, este necesară clasificarea acestora, folosindu-se nomenclatura din literatura de specialitate. Această clasificare este redată în figura 13.1.

Euploidia se împarte în: monoploidie, când celulele somatice ce posedă un număr de cromozomi egal cu cel al genomului (x) şi poliploidie, când celulele somatice au un multiplu al numărului de genomuri.

72

monoploidia perisoploidia Euploidia autopoliploidia poliploidia artioploidia alopoliploidia (amphiploidia)

VariaŃii numeric cromozomice

nulisomia (2n-2) hipoploidia monosomia (2n-1) Aneuploidia trisomia (2n+1) hiperploidia tetrasomia (2n+2)

Clasificarea variaŃiilor numeric cromozomice

În funcŃie de numărul garniturilor cromozomice poliploizii pot fi triploizi (3x), tetraploizi (4x), pentaploizi (5x), hexaploizi (6x) etc., observându-se că unii conŃin un număr par de genomuri şi se numesc artioploizi (4x, 6x, 8x etc.), iar alŃii un număr impar de genomuri, denumiŃi perisoploizi (3x, 5x, 7x, 9x etc.). În funcŃie de originea garniturilor cromozomice poliploidia poate fi de mai multe tipuri: autopoliploidia, când organismele posedă mai multe garnituri omoloage, rezultate prin multiplicarea genomului propriu; alopoliploidia, când organismul are mai multe garnituri cromozomice, dar de origine diferită, rezultate în urma hibridărilor interspecifice. Organismele care înglobează genomurile a două sau mai multe specii, urmată de o dublare a numărului de cromozomi, se numesc amphiploide. Poliploidia este urmată de o mărire a cantităŃii de ADN per nucleu. Există specii la care, deşi are loc o multiplicare a numărului de genomuri, cantitatea de ADN nu se modifică acestea fiind denumite pseudopoliploide. Modificarea numărului de cromozomi dintr-o garnitură cromozomică, prin absenŃa unuia sau a mai multor cromozomi sau prezenŃa în plus a unuia sau mai multor cromozomi, se numeşte aneuploidie. Mărirea numărului de cromozomi în cadrul genomului se numeşte hiperploidie, iar micşorarea numărului de cromozomi, hipoploidie. Aneuploidia este însoŃită de modificarea cantităŃii de ADN per nucleu, există însă şi fenomenul de pseudoaneuploidie, când numărul de cromozomi din genom variază, însă cantitatea de ADN rămâne constantă.

Monoploidia

Denumită şi haploidia adevărată sau euhaploidie, constă în faptul că organismele posedă în celulele somatice un număr de cromozomi egal cu numărul de cromozomi de bază sau un genom (2n = x). Având un singur genom în celulele somatice, monoploizii au o serie de caracteristici morfologice şi biologice, cum ar fi: sunt aproape complet sterili, ceea ce îi face inutilizabili în practică. Avantajul monoploizilor constă în faptul că, în urma studiilor genetice, dacă prezintă caracteristici avantajoase, numărul cromozomilor poate fi dublat, obŃinându-se linii complet homozigote. După testarea capacităŃii combinative a liniilor respective, unele pot fi folosite ca

73

genitori în obŃinerea de hibrizi. Utilizarea monoploizilor scurtează foarte mult timpul de obŃinere a liniilor total homozigote, de la 6-8 ani după metoda clasică, la numai doi ani. În mod natural, monoploizii apar cu o frecvenŃă redusă, de la 0,01% până la 6%, pe următoarele căi:

a) ginogeneză, când embrionii se dezvoltă din oosfere nefecundate; b) androgeneză, când embrionii rezultă din celule mascule (fără fecundare); c) apogamie, când embrionii rezultă din sinergide sau antipode.

Având în vedere importanŃa monoploizilor, monoploidia a fost indusă prin iradierea polenului cu raze X sau UV, pentru a distruge unul din cei doi nuclei spermatici şi în felul acesta, reducându-se posibilitatea fecundării oosferei, creşte şansa apariŃiei monoploizilor sau inactivarea ambilor nuclei spermatici cu diferite substanŃe chimice, caz în care, oosfera nefecundată poate forma un embrion monoploid. Din punct de vedere morfo-fiziologic, monoploizii, comparativ cu formele normale din care au provenit, au o vigoare redusă, creştere lentă, grad ridicat de sterilitate. Diviziunea mitotică la organismele monoploide prezintă mari modificări, dar mai ales meioza, pe parcursul căreia, nerealizându-se sinapsa cromozomilor, deoarece nu există omologie între cromozomi, nu se formează celule sexuale sau cele ce se formează sunt neechilibrate genetic, ceea ce determină sterilitatea monoploizilor.

Haploidia este fenomenul de reducere la jumătate a numărului de cromozomi în celulele somatice. După modul cum rezultă din diploizi, tetraploizi, hexaploizi etc., haploizii pot fi: monoploizi, diploizi, triploizi etc. Haploidia corespunde numai într-un singur caz cu monoploidia, atunci când reducerea la jumătate a numărului de cromozomi are loc la organismele diploide (2n = 2x). Haploidia poate fi întâlnită ca fenomen natural, la unele Bryophitae şi Talophitae, la masculii unor insecte (albine, viespi, termite), la unele metazoare şi ciuperci (Aspergillus, Fusarium etc.) şi în gametofitul plantelor superioare. Când haploidia este utilă, este provocată prin androgeneză sau prin eliminarea de cromozomi.

Haploizii şi monoploizii au o deosebită importanŃă teoretică şi practică: - având un singur set de cromozomi, studiul fiecărui cromozom a furnizat informaŃii asupra valorii genetice a unui genom; - din punct de vedere citologic, monoploizii oferă posibilitatea cunoaşterii modului de segregare a cromozomilor neperechi, în meioză, realizarea sau nu a sinapsei, arată gradul de înrudire dintre specii; - diploidizarea monoploizilor duce la realizarea liniilor complet homozigote, într-un timp scurt; - monoploizii androgeni oferă posibilitatea studiului efectului citoplasmei străine asupra genotipului, transformarea într-un timp scurt a liniilor consangvine normale în linii androsterile. În ultimul timp, studiul acestor forme preocupă colective mari de geneticieni şi amelioratori, deoarece obŃinerea de hibrizi pe calea monoploidiei este simplificată şi de scurtă durată.

Poliploidia

Primele cercetări referitoare la fenomenul de poliploidie au fost efectuate de I. I. Gherasimov (1889) care a dublat numărul de cromozomi la alga Spyrogira, prin scăderea temperaturii în timpul metafazei. Denumirea de poliploidie a fost introdusă de G. Winkler (1916), pentru a desemna plantele ce posedau un număr multiplicat de genomuri. În funcŃie de originea garniturilor cromozomice, poliploidia poate fi de două feluri: autopoliploidia (autoploidia) şi alopoliploidia (aloploidia).

74

Autopoliploidia este multiplicarea garniturilor de cromozomi pe seama aceluiaşi număr de bază al unei specii. Multiplicarea este cauzată de tulburări în procesele de diviziune mitotică sau meiotică şi anume: - În diviziunea meiotică, din cauza nereducerii cromatice se formează gameŃi cu acelaşi număr de cromozomi, egal cu cel din celulele somatice. Un asemenea gamet diploid, în procesul de fecundare cu un al doilea gamet, normal, haploid, va forma un zigot, respectiv un organism triploid (2n = 3x). Dacă ambii gameŃi sunt diploizi se va forma un organism tetraploid (2n = 4x). - În diviziunea mitotică pot interveni cauze care să oprească formarea fusului nuclear, migrarea cromozomilor spre cei doi poli ai celulei ne mai având loc. Ca urmare, nu se mai formează celulele fiice, cromozomii, în număr dublu, rămân în aceeaşi celulă. Dacă fenomenul are loc la începutul formării zigotului, organismul devine tetraploid iar gameŃii pe care îi va forma vor fi diploizi. Aceştia vor menŃine mai departe autotetraploidia. - În diviziunea mitotică într-un singur organ, de exemplu al unei plante, se va produce la o celulă fenomenul de dublare a numărului de cromozomi. Dintr-o astfel de celulă, cu un număr dublu de cromozomi, poate lua naştere o formaŃiune vegetativă, o ramură, care va forma în flori gameŃi diploizi. Prin autofecundare vor apărea forme tetraploide. Mai recent J. A. Serra (1968) consideră ca prim factor al formării autopoliploizilor endomitoza, în care nu se formează fusul de diviziune, membrana nucleară nu se fragmentează, astfel că un nucleu diploid devine 4n, 8n, 16n etc. Se întâlnesc două tipuri de plante autopoliploide: Perisoploide, cu un număr impar de garnituri cromozomice (3x, 5x, 7x). Din cauza numărului impar de genomuri repartiŃia echilibrată a cromozomilor în gameŃi nu este posibilă, astfel de plante vor produce gameŃi sterili, supravieŃuind numai prin reproducerea vegetativă.

Artioploide, cu un număr par de garnituri cromozomice (2x, 4x, 6x). La aceste plante meioza decurge normal. Cu toate acestea, cromozomii omologi, în profaza meiozei, se asociază în mod diferit, formând univalenŃi. Dacă polivalenŃii au un număr impar de cromozomi, repartiŃia regulată a cromozomilor la cei doi poli ai celulei devine imposibilă şi, ca urmare, gameŃii formaŃi sunt sterili. PrezenŃa sterilităŃii la un număr mare de plante autopoliploide a determinat pe unii autori să considere că există o corelaŃie între autopoliploide, sterilitate şi înmulŃirea vegetativă a plantelor. La genurile Chrysanthemum, Polygonum şi Discorea, formele diploide nu au rizomi, în timp ce cele tetraploide, hexaploide şi octoploide au. Din cauza sterilităŃii ele s-au menŃinut pe cale vegetativă. Meioza la autotetraploizi este variabilă, putând decurge normal, dar existând şi posibilitatea apariŃiei multor anomalii. Aceste anomalii se datorează prezenŃei în profaza I a câte patru cromozomi omologi, deci în stadiul de zigonemă vor forma sinapsă patru monovalenŃi, nu doi (bivalenŃi). În meioza autotetraploizilor, datorită asocierii întâmplătoare a cromozomilor, are loc o segregare fenotipică şi genotipică, diferită de cea a diploizilor. La un diploid heterozigot Aa, în F2 segregarea genotipică este 1/4 AA : 2/4 Aa : 1/4 aa, iar cea fenotipică, ¾ dominant, ¼ recesiv. În descendenŃa autogamă a unui tetraploid AAaa, în funcŃie de repartiŃia alelelor în cei patru cromozomi, pentru acelaşi locus pot apărea cinci genotipuri: AAAA (quadruplex), AAAa (triplex), AAaa (duplex), Aaaa (simplex), aaaa (nulliplex). Din cauza deficienŃelor ce apar în meioză, autopoliploizii nu au, în general, şanse de a supravieŃui, aşa că rolul lor în evoluŃie este mai puŃin important. Există specii ale unor genuri care au apărut totuşi pe calea autopoliploidiei: în genul Chrysanthemum, specii ce au 18, 36, 54, 72, şi 90 de cromozomi, în genul Solanum, specii ce au 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108, 120 şi 144 cromozomi precum şi alte specii ale genurilor Medicago, Arachis, Phleum, Festuca, Poa ş.a.

Alopoliploidia (amphipoliploidia) este tipul de poliploidie care apare în urma hibridării între specii, prin adiŃia de garnituri cromozomice străine. DiferenŃa dintre genomuri

75

face ca între garniturile de cromozomi a alopoliploizilor să nu existe omologie. Acestea sunt diferite atât ca număr de cromozomi cât şi ca tip de gene. Când alopoliploidul însumează cele două garnituri cromozomice somatice ale părinŃilor, el se numeşte amphidiploid. Alopoliploizii sunt în majoritatea cazurilor sterili. Din cauza neomologiei dintre cromozomi, în profaza meiozei fiecare cromozom se comportă independent, ca univalent. În anafaza meiozei, ei se distribuie în mod neregulat la cei doi poli, aşa încât în gameŃi va apărea un număr diferit de cromozomi. GameŃii vor fi sterili, în afară de cazul unei omologii parŃiale, când fertilitatea lor va fi scăzută. Alopoliploizii care însumează cele două garnituri diploide de cromozomi a celor două specii parentale se numesc amphidiploizi. Ei sunt fertili deoarece fiecare cromozom având omologul său, are cu cine să se conjuge în meioză şi formează bivalenŃi pentru cromozomii fiecărei specii în parte. Dacă din gameŃii care participă la fecundare unul este haploid iar celălalt diploid, se va forma un alotriploid. Acesta este steril deoarece cromozomii unei specii va forma bivalenŃi, dar a celeilalte vor rămâne univalenŃi şi se vor distribui neuniform în meioză la polii celulei. Amphidiploidia prezintă importanŃă atât pentru menŃinerea ei în natură cât şi pentru activitatea practică a omului. Sunt citate în literatura de specialitate numeroase exemple privind apariŃia spontană sau dirijată de om a amphidiploizilor. L. Dicby (1912) descrie apariŃia unui amphidiploid, Primula kevensis (cu 2n = 36) prin încrucişarea dintre Primula floribunda (2n = 18) cu Primula verticillata (2n = 18). G. D. Karpecenko (1927) obŃine un amphidiploid Raphanobrassica (2n = 36) prin încrucişarea dintre Raphanus sativus (2n = 18) cu Brassica oleracea (2n = 18) (figura 13.2.). J. Gregar şi F. Sansome (1930) obŃin un amphidiploid Phleum pratense hexaploidum (2n = 42) încrucişând Phleum pratense (2n = 14) cu Phleum alpinum (2n = 28). A. Müntzing (1932) obŃine amphiploidul Galeopsis tetrahit (2n = 32) din încrucişarea lui Galeopsis pubescens (2n = 16) cu Galeopsis speciosa (2n = 16). H. A. Jones şi A. E. Clarke (1942) încrucişând Allium cepa (2n = 16) cu Allium fistulosum (2n = 16) au obŃinut amphidiploidul cu 2n = 32 (fig. 13.3.).

Amphiploidia la Allium cepa: A-cromozomii la Allium cepa; B-cromozomii la amphiploid; C-cromozomii la Allium fistulosum

(după Jones şi Clarke, 1942)

Dacă formele noi prezintă avantaje pentru producŃie, ele pot fi utilizate ca soiuri. Amphidiploidia naturală poate constitui puncte de plecare în geneza unor specii noi, dar numai în cazul în care ea modifică ereditatea în avantajul perpetuării lor. În caz contrar, dispar fără a lăsa urme. Alopoliploizii se pot obŃine din încrucişarea a două, dar şi a mai multor specii de plante. De obicei, hibrizii dintre două specii sunt sterili, numai cei amphidiploizi sunt fertili. Aceştia, încrucişaŃi cu o altă specie diploidă produc un hibrid alotriploid, care de asemenea este steril. Hibridul alotriploid poate deveni fertil în cazul în care reuşim să-i dublăm garnitura de cromozomi prin autopoliploidie. În funcŃie de modul cum ia naştere, amphidiploidia poate fi de trei tipuri: amphidiploidie genomică, amphidiploidie segmentală, autoalopoliploidia.

76

Amphiploidia genomică sau clasică este rezultatul hibridării între specii cu genomuri diferite (ex. AA x BB) şi ca urmare, cromozomii uneia nu realizează sinapse cu cromozomii celeilalte, planta fiind sterilă. Prin dublarea numărului de cromozomi a hibridului din generaŃia F1 se obŃin amphidiploizi fertili. Amphidiploidia segmentală este tipul de amphidiploidie care provine din hibridarea unor specii cu genomuri parŃial sau complet omoloage, astfel că, după ce se realizează dublarea numărului de cromozomi, în meioză cromozomii nu se împerechează normal, ci formează tetravalenŃi, trivalenŃi şi univalenŃi, determinând un anumit grad de sterilitate. Autoalopoliploidia este fenomenul prin care se dublează numărul de cromozomi la un amphidiploid. De exemplu, amphidiploidul AABB poate deveni un autoalooctoploid, AAAABBBB. Alopoliploidia poate determina diferite grade de sterilitate, deoarece tipurile de abateri de la mersul normal al meiozei sunt foarte variate.

Modificările morfologice şi fiziologice ale poliploizilor

Poliploidia atrage modificări fenotipice foarte variate. Variate ca proporŃie, începând cu unele foarte discrete, greu de sesizat şi terminând cu altele foarte vizibile, până la gigantism; variate ca efect vital, producând debilitatea organismului sau vigoarea lui sporită. Modificările pot afecta întregul organism sau numai o parte din el. La plante, tetraploizii prezintă foarte frecvent organe vegetative şi de reproducere mult mai mari în comparaŃie cu diploizii din care s-au format. În unele cazuri efectul este însă invers aşa cum este la tomate unde tetraploizii sunt de dimensiuni mai mici decât plantele diploide. O caracteristică generală a poliploizilor este creşterea în dimensiune a celulelor. Este un caracter după care se poate pune în evidenŃă gradul de poliploidie al plantelor. Stomatele, în general, sunt mai mari la plantele tetraploide decât la cele diploide. La Crepis capilaris (2n = 6) există o corelaŃie directă între mărimea celulelor şi numărul de garnituri cromozomice ce se găsesc în nucleul acestora. Creşterea în dimensiune a celulelor atrage după sine, în unele cazuri, scăderea numărului de celule din Ńesutul respectiv. Acest fapt s-a observat, de exemplu, în frunzele muşchiului Funaria. Mărirea volumului celulelor atrage după sine şi modificarea raportului dintre substanŃele care se găsesc în celule şi de aici şi modificări de ordin fiziologic. Frunzele plantelor poliploide pot prezenta modificări vizibile în ceea ce priveşte forma lor, mărimea sau culoarea. La tetraploizi, în general, frunzele sunt mai groase, mai late şi de o culoare mai închisă. Creşterea în dimensiuni a frunzei este însoŃită foarte adesea de scăderea numărului de frunze pe plantă. Creşterea în mărime a ligulei la graminee, face posibilă distingerea plantelor poliploide de cele diploide normale. Există de asemenea, o corelaŃie directă între gradul de poliploidie a plantei şi dimensiunea grăunciorilor de polen şi a numărului porilor germinativi ai polenului. Pe această constatare se bazează şi una din metodele de determinare a gradului de poliploidie la plante. Tulpinile plantelor poliploide prezintă de asemenea în numeroase cazuri dimensiuni mai mari şi o ramificare mai abundentă. O altă caracteristică, poate cea mai des întâlnită a plantelor poliploide, este creşterea dimensiunilor florilor şi seminŃelor. Paralel cu aceasta, scade numărul lor pe plantă. Toate modificările morfologice observate la poliploizi sunt corelate de modificări fiziologice şi genetice. Faptul că poliploizii apar în natură în condiŃii neobişnuite, la limitele de răspândire a arealului ocupat de diferite genuri, ei sunt dotaŃi cu anumite însuşiri de rezistenŃă la factorii nefavorabili.

77

Poliploidia naturală şi rolul acesteia în evoluŃie

Hugo de Vries (1901) a studiat îndeaproape specia Oenothera lamarckiana şi a

constatat că ea se caracterizează printr-un polimorfism accentuat. Una dintre aceste forme, cu dimensiuni foarte mari a denumit-o Oenothera gigas. Gates, în 1909 a constatat că această formă avea un număr dublu de cromozomi (28) faŃă de specia iniŃială. H. Nilsson Ehle (1935) descoperă un plop gigantic, care un an mai târziu este determinat de Müntzing ca triploid. Scherz a observat un caz de poliploidie la viŃa de vie, Riesling de Mosela cu 4n = 76 cromozomi faŃă de soiul Riesling, ce avea 2n = 38 cromozomi. Noul soi se prezintă ca o mutantă cu struguri cu boabe mari, cu coacere mai timpurie şi cu procent de zahăr mai mare. Navasin (1929) face o legătură între fenomenul de poliploidie şi arealul ocupat de anumite specii şi ajunge la concluzia că poliploizii apar mai frecvent la indivizii care au depăşit arealul speciei. Prin determinarea numărului de cromozomi, s-a constatat că diferite specii ale unor genuri, nu sunt altceva decât serii poliploide care au apărut în mod natural.

La genul Triticum, se observă că speciile au ca număr de cromozomi un multiplu de 7: Triticum monococcum 2n = 14 cromozomi Triticum durum 2n = 28 cromozomi Triticum aestivum 2n = 42 cromozomi La genul Rumex, speciile au un multiplu de 10 cromozomi: Rumex alpinus 2n = 10 cromozomi Rumex domesticus 2n = 20 cromozomi Rumex patientia 2n = 30 cromozomi Rumex cardifolius 2n = 40 cromozomi Rumex hymenosepalus 2n = 50 cromozomi.

Poliploidia este deci foarte frecventă în natură. Totuşi plantele de cultură prezintă mai des cazuri de poliploidie decât cele sălbatice. Această constatare i-a făcut pe unii cercetători să tragă concluzia că evoluŃia plantelor de cultură de la formele sălbatice s-a făcut prin multiplicarea numărului de cromozomi. ApariŃia procesului sexual a făcut ca primul zigot să constituie prima celulă poliploidă (diploidă), iar endospermul angiospermelor este un triploid. A. Müntzing arată că, în general, la speciile perene există un număr mai mare de cromozomi decât la speciile anuale ale aceluiaşi gen. De aici, trage concluzia că un număr mare de specii au provenit din forme anuale, cu un număr mai mic de cromozomi. De asemenea, el trage concluzia că există o corelaŃie pozitivă între numărul de cromozomi şi durata vieŃii unei plante. De exemplu, porumbul autotetraploid obŃinut pe cale experimentală este peren, în timp ce formele anuale sunt diploide. Sorgul anual (Sorgum sudanensis) are n = 10 cromozomi, pe când sorgul peren (Sorgum hallepense) are n = 20 cromozomi. Formele anuale de Taraxacum sunt diploide, în timp ce formele perene sunt poliploide. Sunt însă şi excepŃii, când la speciile perene numărul de cromozomi este egal sau chiar mai mic decât la speciile anuale. În evoluŃia plantelor autogame şi a animalelor care se înmulŃesc asexuat, un rol important l-a jucat autopoliploidia. La plantele alogame sau la animalele ce se reproduc sexuat, acest rol l-a jucat alopoliploidia. TranziŃiile între auto şi alopoliploidie sunt continui şi de aceea este greu să le descoperim originea. Numai autopoliploidia poate fi absolută, în timp ce la alopoliploidie genomurile nu pot fi întotdeauna complet diferite. IndicaŃii pentru descoperirea lor le poate da analiza meiozei: dacă la o specie tetraploidă există quadrivalenŃi în meioză, este vorba de autopoliploidie, dacă există numai bivalenŃi, este prezentă alopoliploidia. Alopoliploidia a jucat în evoluŃie un rol mult mai mare decât autopoliploidia.

78

O dovadă că într-adevăr unele specii noi îşi au originea în alopoliploidizarea unor specii vechi sunt resintezele de specii, pe care omul le poate face pe cale artificială. A. Müntzing (1932) a resintetizat, pe cale artificială, specia Galeopsis tetrahit (2n = 32), încrucişând Galeopsis pubescens (2n = 16), cu Galeopsis speciosa (2n = 16). Hibridul a fost numit Galeopsis pseudotetrahit şi este un alotetraploid. E. S. Mac Fadden şi E. R. Sears (1944) încrucişând Triticum dicoccoides (2n = 28) cu Aegylops squarrosa (2n = 14) au resintetizat specia Triticum spelta (2n = 42). H. Kihara şi F. Lilienfeld (1949) au resintetizat specia Triticum aestivum (2n = 42), încrucişând speciile Triticum persicum (2n = 28) cu Aegylops squarrosa (2n = 14). În literatura de specialitate se întâlnesc numeroase exemple de acest fel.

Poliploidia artificială

Cunoaşterea fenomenului de poliploidie a contribuit la elaborarea unor metode speciale pentru obŃinerea pe cale artificială a poliploizilor. Oricare ar fi metoda, scopul este de a acŃiona asupra diviziunii celulelor sau prin procesul de hibridare, pentru a provoca multiplicarea garniturilor de cromozomi. Nu toate plantele se comportă la fel la poliploidizare. Acesta depinde de metodă, specie, soi sau chiar individ. Dau rezultate mai bune: - plantele cu un număr mic de cromozomi; - plantele alogame; - plantele folosite mai mult pentru masă verde, decât pentru fructe; - plantele ce se înmulŃesc pe cale vegetativă; Poliploizii obŃinuŃi pe cale experimentală prezintă inconvenientul de a nu putea fi folosiŃi imediat în producŃie. De obicei, au o fertilitate scăzută, produc fructe puŃine. MulŃi nu sunt rezistenŃi la condiŃiile adverse ale mediului, la atacul dăunătorilor sau au un ritm de creştere lent. Unii, din contra, prezintă modificări valoroase şi utile pentru practica agricolă şi horticolă, cum ar fi de exemplu un procent ridicat de morfină la mac, de mentol la mentă, un procent mai mare de masă verde la trifoiul roşu tetraploid sau un procent ridicat de zahăr la sfecla triploidă.

Metode de inducere a poliploidiei. Există astăzi diferite metode pentru producerea poliploizilor: metode chimice, fizice şi biologice. - Metoda altoirii, costă în altoirea a două plante din genuri sau specii deosebite şi apoi secŃionarea locului de concreştere. Din secŃiune apar muguri şi apoi lăstari, din care unii sunt tetraploizi. Metoda a fost elaborată de H. Winkler (1916), W. A. Greenleaf (1938) la genul Nicotiana şi E.W. Lindstrom şi K. Koos (1931) la tomate (după Raicu P., 1980). - Metoda centrifugării plantelor a fost elaborată de D. Kostoff (1937). Ea se bazează pe acŃiunea forŃei de centrifugare asupra celulelor în diviziune, fiind împiedicaŃi cromozomii să migreze la polii celulei. Se aplică pe cale restrânsă deoarece este greoaie şi dă rezultate slabe. - Metoda acŃionării cu unele insecte parazite asupra vârfurilor de creştere a plantelor. Se folosesc diferite insecte care se hrănesc prin înŃeparea vârfurilor vegetative a plantelor. AcŃiunea mecanică, înŃepăturile, produc perturbări în diviziunea celulelor din Ńesuturi. Metoda se aplică pe cale restrânsă. - Metoda şocurilor de temperatură se foloseşte cu scopul de a influenŃa zigotul plantelor în primele stadii ale diviziunii. A fost elaborată de L. F. Randolph (1932) şi aplicată la porumb. Imediat după fecundare, planta de porumb a fost Ńinută circa 24 ore la temperaturi de 440 C. Nici această metodă nu se foloseşte pe scară largă. Folosirea substanŃelor chimice (alcaloizi, narcotice etc.) a dus la elaborarea metodelor chimice folosite şi astăzi intens la obŃinerea poliploizilor. Acestea îşi manifestă acŃiunea, fie blocând cromozomii în metafază, fie oprind formarea membranelor ce ar trebui să separe celulele aflate în diviziune. Din prima categorie fac parte în primul rând colchicina, acenaftenul,

79

monobromnaftenul ş.a.; din a doua categorie fac parte, paradiclorbenzen, monoclorbenzen ş.a. Dintre toate, cea mai folosită este colchicina. A. F. Blakeslee şi A. S. Avery (1937) au elaborat diferite tehnici de aplicare a tratamentului cu colchicină la plante şi au obŃinut rezultate remarcabile la genurile Nicotiana, Mirabilis,

Trifolium ş.a. În general se folosesc soluŃii foarte slabe de colchicină, administrate la diferite organe sau părŃi din acestea. Se pot trata seminŃe, prin îmbibarea lor în soluŃii de colchicină 0,02% - 0,05%, timp de 24-48 ore. SoluŃia de diferite concentraŃii poate fi administrată pe vârfurile vegetative de tulpină sau rădăcină. Cu soluŃie de colchicină, se pot trata şi plante mici, tuberculi, butaşi etc. Cu ajutorul metodelor chimice, în diferite Ńări, s-au obŃinut forme foarte valoroase care se folosesc în cultură; în Suedia s-au obŃinut două soiuri de trifoi. În Germania au fost create linii poliploide la Galega şi Seradela (plante de nutreŃ). În Japonia se cultivă un pepene verde triploid; în diferite Ńări, şi la noi, se cultivă sfeclă pentru zahăr triploidă; de asemenea, există în cultură forme valoroase poliploide de secară, hrişcă, bumbac; la plante horticole rezultate bune s-au obŃinut la plante ornamentale (narcise, stânjenei, dalii, cyclamen ş.a), pomi (măr, păr, lămâi ş.a) şi viŃă de vie.

Aneuploidia

Aneuploidia numită şi heteroploidie sau polisomie este modificarea numărului diploid de cromozomi prin adăugarea sau lipsa unuia sau a mai mulŃi cromozomi. După numărul de cromozomi în plus sau în minus, ea se clasifică astfel:

- nulisomie 2n-2 - monosomie 2n-1 - trisomie 2n+1 - tetrasomie 2n+2 - dublă trisomie 2n+1+1

ApariŃia de celule aneuploide se explică prin abateri de la segregarea normală a perechilor de cromozomi în timpul diviziunii. Ele apar atât în celulele somatice cât şi în cele sexuale, de aceea aneuploidia poate fi atât mitotică cât şi meiotică. Mai frecventă este aceea meiotică, bivalenŃii putând fi repartizaŃi numai într-o celulă, iar în alta lipsind. Când garnitura diploidă are un cromozom în plus, aneuploidul va avea formula 2n+1, când va avea un cromozom în minus va avea formula 2n-1. În alte cazuri aneuploidul 2n+1 (trisom) mai poate primi un cromozom suplimentar şi atunci va avea formula 2n+2 (tetrasomi). Dacă adăugarea de cromozomi suplimentari se face în două perechi de cromozomi atunci se formează un dublu trisom 2n+1+1. Când se pierde o pereche de cromozomi omologi se formează un nulisom 2n-2. Primul studiu de aneuploidie la plante a fost făcut în 1924 de către Blakeslee şi Belling la Datura stramonium. Această plantă are 2n = 24 cromozomi, deci un trisom, cu 24 + 1 cromozomi. Spre deosebire de plantele obişnuite, avea capsulele mai mici, şi Ńepi mai mici. Executând diferite încrucişări au obŃinut 12 tipuri de trisomi, adăugând pe rând câte un trisom pentru fiecare pereche de cromozomi. Toate aveau fenotipuri bine distincte. La animale, aneuploidia a fost descoperită la Drosophila de către Bridges. Cazul a fost citat la capitolul referitor la ereditatea sexului, unde s-a prezentat un caz de aneuploidie datorat nondisjuncŃiei primare în meioză a cromozomilor sexului. Din încrucişarea drosofilei femele cu ochi albi cu masculi cu ochi roşii, au apărut forme neaşteptate, femele cu ochi roşii şi masculi cu ochi albi. Aceasta din cauză că în urma nondisjuncŃiei cromozomilor X au apărut ovule ce aveau XX şi altele nici unul. Primele, fecundate cu spermatozoizi normali, au produs trisomi XXX şi XXY. ZigoŃii cu autosomi normali dar cu un singur X sau Y au fost monosomi, primii, masculi sterili, ultimii neviabili.

80

În aceste cercetări, Bridges a arătat că se pot adăuga cromozomi suplimentari şi la cromozomii autosomi. Lipsa cromozomilor mari II şi III determină letalitatea, a celor din perechea a IV-a, foarte mici, influenŃează în sens negativ insecta, fără a provoca neapărat moartea. După cum se adaugă un cromozom la autosomii IV sau lipsesc, aneuploidul se numeşte triplo IV sau haplo IV. Modificările acestea atrag modificări fenotipice: Drosophila

haplo IV este de dimensiuni mai mici decât tipul sălbatec şi cu fertilitate scăzută; Drosophila

triplo IV, din contra, are dimensiunile corpului mai mari. Astfel de forme aneuploide au fost studiate şi la alte organisme, în special la plante: ciumăfaie, tutun, porumb, tomate, cereale. Foarte multe forme aneuploide nu sunt viabile sau, unele viabile sunt mai greu de sesizat. Cercetările din domeniul aneuploidiei au o mare importanŃă teoretică şi deschid perspective largi pentru ameliorarea plantelor. Înlocuirea unor cromozomi duce la cunoaşterea importanŃei lor ereditare şi a genelor ce le conŃin. Prin aneuploidie se schimbă numărul de cromozomi dar nu şi grupele de înlănŃuire. Modificarea genomului, corelată cu modificările fenotipice constituie o cale de obŃinere a unor noi soiuri. Aneuploidia ajută şi la înlocuirea sau adăugarea unor cromozomi de la unele soiuri de plante de cultură, cu cromozomi de la alte soiuri ce conŃin gene valoroase. S-au obŃinut în acest sens diferite forme de cereale superioare unora existente în cultură. La grâu, s-au transmutat cromozomi de la alte specii ce conŃineau gene răspunzătoare de anumite însuşiri (rezistenŃă la boli, secetă ş.a.) de la secară, Aegilops ş.a. La tutun s-au transferat cromozomi de la alte specii apropiate pentru a imprima rezistenŃa la viroza tutunului. În general, se folosesc forme monosomice sau nulisomice care se încrucişează cu formele ce deŃin calităŃile ce ne interesează din punct de vedere economic. Pseudoaneuploidia. Este o variaŃie a numărului de cromozomi ce se realizează cu ajutorul unui mecanism de fuzionare-fisionare a cromozomilor însoŃit de un proces de translocaŃie reciprocă, fără să se modifice cantitatea de ADN per nucleu. Prin fisionarea centromerului unui cromozom metacentric, submetacentric sau subtelocentric se formează cromozomi acrocentrici. Prin fuzionarea a doi cromozomi acrocentrici rezultă cromozomi metacentrici, submetacentrici sau subtelocentrici. Fenomenul a fost pus în evidenŃă de W.R. Robertson în anul 1916. Speciile înrudite, care au un număr variat de cromozomi, dar acelaşi număr fundamental (NF) de braŃe cromozomice formează o serie robertsoniană. Un exemplu bine studiat este în cadrul genului Drosophila, la care cariotipul primar de la Drosophila virilis (2n=12) s-a transformat prin translocaŃia şi fuzionarea centromerilor, dând naştere la mai multe specii: D. texana (2n=10) la care au fuzionat perechile 2 şi 3 de cromozomi, D. littoralis (2n=10) la care au fuzionat perechile 3 şi 4, D. americana (2n=10) la care au fuzionat perechile 2 şi 3 şi cromozomii X cu perechea a IV-a. Fenomenul aneuploidiei se poate manifesta chiar în cadrul aceleaşi specii, ducând la apariŃia aşa-numitului polimorfism cromozomial. Acest fenomen a fost semnalat la Spalax leucodon (orbetele), specie cu posibilităŃi reduse de migrare. La indivizii răspândiŃi în Caucaz, 2n=48, cei din Bulgaria au 2n=54, iar la noi în Ńară, în Transilvania au 2n=50, iar cei din Dobrogea şi Moldova 2n=56. Aceste serii robertsoniene sugerează existenŃa unui proces de evoluŃie a cariotipului, proces favorizat de posibilităŃile reduse de migrare şi deci formarea de populaŃii distincte.

Pseudopoliploidia

Fenomenul de pseudopoliploidie este descoperit relativ recent, iar denumirea lui propusă pentru prima dată de E. Bataglia în anul 1956. Este vorba de o multiplicare a numărului de genomuri fără dublarea cantităŃii de cromatină-respectiv ADN. Fenomenul de pseudopoliploidie a fost sesizat la unele specii care posedă cromozomi ce au mai mulŃi centromeri sau aceştia sunt localizaŃi difuz, pe toată lungimea lor. ApariŃia

81

pseudopoliploizilor se datorează regrupării substanŃei cromatice într-un alt număr de cromozomi fără o multiplicare a ei, din punct de vedere cantitativ. Există specii pseudopoliploidie la genul plantei Luzula: Luzula purpurea cu 2n=6, Luzula

glabrata cu 2n=12, Luzula campestris cu 2n=12, Luzula parviflora cu 2n=24, Luzula sudetica cu 2n=48; la genul Tatera: Tatera brantsii draco cu 2n=26, Tatera indica ceylonica cu 2n=72. Mai întâlnim pseudopoliploizi şi la genurile de plante Spirogyra, Carex, ş.a. sau la cele de animale Ascaris, Thyanta (hemipter) ş.a. Identificarea pseudopoliploizilor se poate face folosindu-se mai multe căi: - Încrucişându-se speciile pseudopoliploide ale aceluiaşi gen se pot urmări la hibrizii F1 cromozomii atât în diviziunea somatică cât şi în cea meiotică: în diviziunea somatică apare un număr de cromozomi 2n + 2n fiecare garnitură păstrându-şi mărimea şi forma cromozomilor respectivi. De exemplu, încrucişând Luzula sudetica cu 2n = 48 cromozomi, mici, cu Luzula

campestris cu n = 12 cromozomi, obŃinem în F1 un hibrid cu 2n = 30 cromozomi dintre care 24 cromozomi sunt mici şi 6 mari. În meioza plantelor din F1 cei 30 de cromozomi se conjugă în felul următor: la cromozomii mari se asociază cei 24 cromozomi mici formând 6 cromozomi mari. - Lungimea totală a cromozomilor de la speciile diploide trebuie să fie egală cu cea a speciilor pseudopoliploide, deoarece cromozomii formelor pseudopoliploide s-au format prin fragmentarea cromozomilor speciilor diploide. Cea mai sigură metodă pentru identificarea pseudopoliploizilor este determinarea cantităŃii de ADN din celulele acestora. Multiplicarea numărului de cromozomi trebuie să fie corespunzătoare multiplicării cantităŃii de ADN. În figura 13.4. este reprezentată schematic lungimea cromozomilor unor specii diploide (a) şi lungimea cromozomilor de la două specii pseudopoliploide (b şi c), provenite prin fragmentarea cromozomilor speciei diploide (a).

Pseudopoliploidia: a-specie diploidă cu 6 cromozomi; b-specie pseudopoliploidă cu 12 cromozomi; c-specie

pseudopoliploidă cu 24 cromozomi (Specia b a provenit din specia a şi specia c a provenit din specia b)