Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
GENERAREA UNUI MODEL in vivo
TRANSGENETIC AL SINDROMULUI SECKEL
Autor: Fotea Nicoleta-Monica
Sindromul Seckel este cea mai frecventă formă de nanism osteodisplazic microcefalic cu
o prevalență estimată la 5/1.000.0001. Se caracterizează prin nanism proporțional cu debut
antenatal, caracteristici dismorfice specifice cu microcefalie severă, retard mental și
transmitere autozomal recesivă2. În descrierea clinică a sindromului sunt incluse următoarele:
o retard de creștere intrauterină cu greutate medie la naștere de 1540 g, statură mică
proporțională cu microcefalie (talia medie la – 7 SD, cuprinsă în intervalul -5- -13 SD,
diametru orbitofrontal mediu la – 9 SD, cuprins în intervalul -4- -14 SD)
o facies particular cu retrognație, protuzia nasului, micrognație, frunte teșită, ochi mari
Transmiterea genetică a bolii este autozomal recesivă cu trei variante ale sindromului
Seckel ce implică mutații în 3 locusuri diferite; pentru sindromul Seckel 1 pe cromozomul 3
(3q22-q24), Seckel 2-cromozomul 18 (18p11.31-q11), Seckel 3-cromozomul 14 (14q21-q22).
Gena implicată în Seckel 1 este gena pentru ataxie-telangiectazie. Genele implicate în
sindroamele Seckel 2 și 3 nu sunt cunoscute.
Mutația CENPJ, o proteină centrozomală înalt conservată, a fost asociată cu
microcefalia esențială și sindromul Seckel. Într-o familie din Arabia Saudită, sindromul
Seckel a fost cauzat de mutația homozigotă de tip splice-acceptor în ultimul nucleotid al
intronului 11 al genei CENPJ3. Aceasta este o proteină care joacă un rol esențial în formarea
fusului de diviziune și dezintegrarea microtubulilor. CENPJ are în structura sa 17 exoni și
codifică o proteină de 1338 de aminoacizi, având un domeniu ATP-azic și un domeniu C-
terminal tip complex T-proteină 10 (TCP 10).
Multe întrebări referitoare la sindromul Seckel au rămas fără răspuns. Datele actuale
sunt insuficiente pentru a afirma dacă heterogenitatea genetică poate fi relaționată cu
heterogenitatea clinică4. Instabilitatea cromozomilor la nivelul situsurilor fragile după
replicare a fost descrisă recent și corelată cu fenotipul clinic5.
Pentru a putea studia această patologie sunt necesare modele in vivo, animale
transgenice care să prezinte fenotipic caracteristicile sindromului.
Studiul de față are drept scop generarea unui model in vivo care să copieze
principalele caracteristici ale sindromului Seckel și care să poată fi folosit în experimente
ulterioare pentru descoperirea mecanismele care stau la baza nanismului și microcefaliei.
Materiale și metode
Generarea animalelor transgenice
Acest studiu s-a desfășurat între 01.06.2015-31.08.2015 și a inclus un număr de 366 de
șoareci specia 57BL/6NTac ce au fost modificați genetic.
Șoarecele de laborator a fost modificat genetic prin mutația genei CENPJ în vederea
recapitulării caracteristicilor fundamentale ale sindromului Seckel și anume: microcefalia și
nanismul esențial.
La generarea animalului transgenic s-a utilizat recombinarea genetică situs-specifică,
prin care s-a realizat deleția exonului critic, cu nr.4 al genei CENPJ. Mutația plasată în locusul
genei normale a fost denumită tm1a(EUCOMM)Wtsi. Pentru ca animalul să exprime mutația
inserată în genom s-au utilizat secvențele LoxP. Acestea au fost inserate în imediata apropiere
a exonului critic cu nr.4. Expresia ulterioară a enzimei Cre de către același șoarece duce la
recombinarea secvenței target flancată între cele două LoxP, secvență care este deletată
întrucât cele 2 secvențe LoxP sunt în același sens (plasarea acestora în sens invers, una
5’3’, iar cealaltă 3’5’duce la inversia secvenței). În acest caz secvența deletată va fi gena
normală cu expresia mutației inserate în amonte.
Caseta L1L2_gt16 a fost introdusă în poziția 56555711 a cromozomului 14 în amonte
de exonul critic. Caseta este compusă din secvența codantă pentru lacZ/neomicină flancată de
FRT (secvența scurtă target a flipazei) urmată de loxP. O secvență loxP adițională este
inserată în aval de exonul target. Alela condițională a fost creată prin expresia flipazei. O alelă
condițională este acea alelă care are mutația în genomul său, dar care nu se exprimă decât în
momentul în care apare secvența LoxP. Expresia ulterioară a Cre recombinazei duce la
formarea liniei knock-out, care exprimă mutația la nivel fenotipic. Dacă expresia Cre nu este
însoțită de expresia flipazei, se creează o linie knock-out reporter. Linia reporter este utilizată
pentru a urmări dacă mutația indusă este sau nu exprimată, fiind considerată controlul intern.
Caseta tm1a(EUCOMM)Wtsi este introdusă în locusul genei CENPJ și determină truncarea
ARNm prin generarea unor produși out-of-frame după deleția exonului esențial, în acest caz
exonul 4. Pe parcursul lucrării se vor utiliza următoarele abrevieri:
tm1a(EUCOMM)Wtsi-alela de inserat cu mutația silențioasă - a
tm1b(EUCOMM)Wtsi- alela cu deleția exonului critic(post expresie de Cre)-b.
Obținerea animalului transgenic final s-a obținut în etape. Inițial mutația de inserat a
fost introdusă într-un lentivirus și transfectată prin electroporare în celulele embrionare
multipotente. Celulele embrionare multipotente au fost inseminate la femelele wild-type.
Astfel, acestea au dat naștere la embrioni cu mutația CENPJ, dar silențioasă, neexprimată
translațional. Prin încrucișări succesive cu șoareci ce exprimau Cre și LoxP s-au generat
celule stem cu mutația uni/bialelică și expresie fenotipică.
Șoarecii mutanți au fost generați utilizând specia 57BL/6NTac. Adresarea corectă a mutației
în generația 1 s-a verificat prin PCR standard. Confirmarea ulterioară a genotipurilor s-a făcut
prin PCR utilizând primeri pentru alela mutantă și wild-type a CENPJa și CENPJ
b
(Tabel 1
ANEXE
Tabel 1). În toate experimentele șoarecii au fost grupați în funcție de vârstă și sex.
Îngrijirea și utilizarea șoarecilor s-a făcut în conformitate cu regulile impuse de UK Home
Office, UK Animals (Scientific Procedures) Act 19867. Animalele au fost menținute într-o
unitate liberă de agenți patogeni cu un ciclu zilnic de 12h lumină: 12h întuneric cu închiderea
luminii la 7:30 pm și fără perioadă de tranziție. Temperatura ambientală de 21±2oC și
umiditate de 55±10%. Densitatea per cușcă a fost de 3-5 animale (dimensiunile standard-
LxlxÎ 365x207x140 mm, suprafața podelei de 530 cm2) cu sistem individual de ventilație
(Tecniplas Seal Seif 1284L) ce asigură 60 de schimbări de aer/oră. Șoarecii au primit apă și
hrană ad libitum.
Pentru a confirma prezența nanismului și a microcefaliei la animalele de experiență
s-au efectuat diverse măsurători, printre care lungimea cranio-caudală, greutatea și diametrul
cranian.
Genotiparea animalelor transgenice
Proba de utilizat pentru genotipare este fragmentul de ureche. Inițial, se obține un lizat
utilizând ca țesut urechea recoltată. Fragmentul se scufundă într-un tub Eppendorf și se
lizează cu 100µl Yolk Sac Lysis Buffer (BD Bioscience, UK Biosciences, UK) ce conține
proteinaza K la o concentrație de 1.0 mg/ml. Probele se incubează pe termomixer la 55°C
pentru 5-6 ore sau până când nu se mai observă resturi celulare nedigerate. Dacă este necesar,
incubația se poate prelungi pe parcursul nopții. Inactivarea proteinei K realizată prin
incubarea la 85°C-86°C pentru 45-50 de minute este esențială pentru protejarea Taq
polimerazei de proteinaza K. După extracție, ADN-ul este purificat conform următorului
protocol: NaCl la o concentrație finală de 250 mM la care se adăuga 0.7 volume de
isopropanol, iar ADN-ul precipită. Se centrifughează la viteză mare timp de 1 minut, se
îndepărtează supernatantul și se spală cu 1 ml de alcool 70%. Se omogenizează pe vortex, se
îndepărtează supernatantul, se lasă să se usuce pentru 5 minute și se dizolvă ADN-ul în 50µl
apă distilată pură.
Analiza statistică
Prin Shapiro-Wilk s-a verificat distribuția normală a datelor, urmat de F-test pentru
confirmarea/infirmarea egalității variațiilor. Semnificația diferențelor observate între mediile
diferitelor genotipuri a fost testată cu T-test bidirecțional acolo unde F-testul a generat o
valoare p>0.05. Pentru cazurile în care nu s-a putut aplica T-testul întrucât Shapiro-Wilk a
fost negativ(p<0.05), s-a înlocuit cu testul non-parametric, Mann-Whitney-Wilcoxon. Analiza
statistică s-a realizat utilizând SPPSS Statistics 22.
Rezultate
Studiul modelului transgenic
Pentru a utiliza modelul animal mutant în vederea cercetării mecanismelor nanismului
și ale microcefaliei s-a verificat dacă acesta recapitulează caracteristicile principale ale
sindromului Seckel. Prezența nanismului s-a verificat prin măsurarea greutății la șoarecii ce
s-au născut viabili, iar la cei ce au decedat in utero, după extracția embrionilor s-a determinat
distanța cranio-caudală. Pentru definirea microcefaliei s-a măsurarea circumferința craniană,
atât la embrioni, cât și la adulți. Pentru măsurarea distanței cranio-caudale și a circumferinței
craniene la embrioni, inițial aceștia erau vizualizați la microscop, iar apoi măsurați utilizând
softul Nickon, unitatea de măsură notată de program fiind pixelul.
Microcefalia este definită la animalele având diametrul cranian mai mic de 2 derivații
standard comparativ cu animalele wild-type. Nanismul esențial este definit ca lungimea
cranio-caudală la embrioni sau greutatea la adulți sub 2 derivații standard față de normal.
Pentru a urmări evoluția nanismului în perioada ulterioră nașterii, s-a determinat curba de
creștere timp de 3 luni post-partum pentru animalele viabile prin măsurarea săptămânală a
greutății, care la șoarecele de laborator este o determinare relevantă pentru evaluarea
nanismului. Animalele nu au mai fost urmărite din punct de vedere al greutății după perioada
de 3 luni, întrucât creșterea este minimă după această vârstă.
Toate animalele utilizate în studiu au deleția exonului critic cu numărul 4 al genei
CENPJ, atestată prin PCR.
Numărul total de animale de experiență a fost de 366 cu următoarea distribuție
genotipică: sex feminin wild-type n=58, +/a=56, a/a=55 și a/b=40 și sex masculin, wild-type
n=52, +/a=50, a/a=45 și a/b=10. 6 animale +/a și 8 a/a au decedat în perioada de evoluție
intrauterină și nu au fost luate în considerare în studiu, dar raportul mendelian a fost apropiat
de cel calculat teoretic. Niciun animal a/b nu s-a născut viu.
Șoarecii a/a și +/a au o greutate mică la naștere și constant pe tot parcursul celor 3 luni
comparativ cu +/+ (genotipul wild-type). 90% dintre șoarecii +/a și 95% dintre a/a au
corespuns definiției nanismului. Greutatea finală la 3 luni pentru +/a și a/a a fost cu 30.77%,
respectiv 33% mai scăzută comparativ cu +/+(p=0.01 și respectiv, p<0.001, t-test) (
Figură 1, Figură 2 2). Curbele de creștere ale +a și a/a comparativ cu
controlul(+/+)timp de 3 luni, diferențiate în funcție de sex se pot observa în Figură 3 și Figură
4.
Toate animalele cu genotipurile a/b și a/a au microcefalie conform criteriilor definite și 87%
dintre cele cu genotip +/a.
S-a determinat distanța cranio-caudală și circumferința craniană la embrionii E13.5-
15.5 decedați in utero. Embrionii homozigoți pentru alela nulă(b/b) nu supraviețuiesc
perioadei embrionare, decedând precoce în timpul organogenezei(E 9.0) și nu au fost luați în
considerare în studiu. a/b mor in utero înainte de naștere cu dezvoltare până la E16.5, cu o
medie a circumferinței craniene de 4.72 și o distanță cranio-caudală de 5.20 la E14.5. Șoarecii
homozigoți pentru alela hipomorfică(a/a) au avut retard de creștere intrauterină, o medie a
circumferinței craniene de 7.632(p=0.003, Mann-Whitney-Wilcoxon test), iar +/a o medie de
8.91 (p=0.002, Mann-Whitney-Wilcoxon test). Circumferința craniană a genotipului a/b a fost
cu 88.7% mai mică comparativ cu +/a (p=0.0380) și cu 61.7% mai mică față de
a/a(p=0.01,Mann-Whitney-Wilcoxon test)( Figură ). Lungimea cranio-caudală a genotipului
a/a este cu 27% mai mare comparativ cu a/b(p=0.004, Mann-Whitney-Wilcoxon test) și cu
23.6% mai mică față de +/a(p=0.05, Mann-Whitney-Wilcoxon test)( Figură ).
Discuții
Scopul studiului de a genera un model in vivo al sindromului Seckel prin mutația
proteinei centrozomale CENPJ a fost îndeplinit. Animalele transgenice întrunesc
caracteristicele definitorii ale sindromului Seckel: nanism esențial și microcefalie. Curbele de
creștere pentru toate genotipurile sunt paralele ceea ce sugerează că mecanismele ce
determină nanismul acționează prenatal și nu postnatal și că dezvoltarea postnatală nu este
artificial indusă prin condițiile externe.
Gravitatea fenotipului este genotip dependentă, întrucât severitatea nanismului și a
microcefaliei crește de la +/a la a/a și a/b. Genotipul a/b este atât de sever încât determină
deces in utero; la aceștia pe lângă microcefalie severă se observă o creștere a lichidului
cefalorahidian la nivelul sistemului ventricular și canalului spinal. Importanța creșterii
nivelului de LCR nu a mai fost semnalizată anterior și necesită studii ulterioare.
Concluzii
Animalul transgenic obținut în urma mutației CENPJ la nivelul exonului 4 poate fi
utilizat drept model in vivo al sindromului Seckel, deoarece întrunește toate caracteristicile ce
definesc această patologie. Studiul de față este important pentru că a generat un model ce
poate fi utilizat pentru evaluarea mecanismelor microcefaliei și ale nanismului, dar și pentru
investigarea dezvoltării sistemului nervos central în general.
BIBLIOGRAFIE:
1. Orphanet: Seckel syndrome. http://www.orpha.net/
2. Shanske A, Caride DG, Menasse-Palmer L, Bogdanow A, Marion RW. Central
nervous system anomalies in Seckel syndrome: report of a new family and review of
the literature. Am J Med Genet. 1997;70(2):155-158.
3. Al-Dosari MS, Shaheen R, Colak D, Alkuraya FS. Novel CENPJ mutation causes
Seckel syndrome. J Med Genet. 2010;47(6):411-414.
4. Redlinger-Grosse K, Bernhardt BA, Berg K, Muenke M, Biesecker BB. The decision
to continue: the experiences and needs of parents who receive a prenatal diagnosis of
holoprosencephaly. Am J Med Genet. 2002;112(4):369-378.
5. Mokrani-Benhelli H, Gaillard L, Biasutto P, et al. Primary microcephaly, impaired
DNA replication, and genomic instability caused by compound heterozygous ATR
mutations. Hum Mutat. 2013;34(2):374-384.
6. http://www.mousephenotype.org/about-ikmc/eucomm-program/eucomm-targeting-
strategies.
7. Animals (Scientific Procedures) Act 1986. 1986.
ANEXE
Tabel 1- Primeri PCR
PCR F primers R primers
Figură 1- Greutatea modelelor transgenice și a animalelor wild-type de sex feminin la 3 luni
post-partum; n-efectivul populațional pentru fiecare genotip, valoarea p este calculată prin
raportare la control(+/+)
Cenpj WT TCAAGCTATTTTGGCTCCACAG ACAGCGTGGTGGTACCTTAT
Cenpjtm1a
GCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCA TTGATGATTCCCAGCACCAC
Cenpjtm1a,b
TTGATGATTCCCAGCACCAC TGTTTATTCCAGGCTGTCTTCAG
Figură 2 - Greutatea modelelor transgenice și a animalelor wild-type de sex
masculin la 3 luni post-partum; n-efectivul populațional pentru fiecare genotip,
valoarea p este calculată prin raportare la control(+/+)
Figură 3- Curba de creștere la 1,2 și 3 luni a modelelor transgenice la șoareci, gen masculin;
n-efectivul populațional pentru fiecare genotip
Figură 4- Curba de creștere la 1,2 și 3 luni a modelelor transgenice la șoareci, gen feminin;
n-efectivul populațional pentru fiecare genotip
Figură 5- Circumferința craniană medie a modelelor transgenice la E14.5 în pixels calculată
cu softul Nikon(unitatea de măsură-pixel)
Figură 6- Lungimea cranio-caudală medie a modelelor transgenice la E14.5 în pixels calculată
cu softul Nikon(unitatea de măsură-pixel)
Aceasta lucrare este efectuată în cadrul Programului Operațional Sectorial pentru Dezvoltarea
Resurselor Umane (POSDRU), finanțat din Fondul Social European și Guvernul României
prin contractul nr. POSDRU/156/1.2/G/141745