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Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung 139. BAND/HEFT 4 ABGESCHLOSSEN AM 18. M_~RZ 1969

Genauigkeit der Bestimmung von 4-Hydroxyprolin in Fleisch- und Wurstwaren

H. BENGER, I. 1}0YER, H. LORENZ und A. SCHINZEL

Mitteilung aus dem Institut /i~r Hygiene und Mikrobiologie der Universitiit Innsbrwck *

Eingegangen am 8. Juli 1968

Die Qualit~t yon Fleiseherzeugnissen, insbesondere yon Wurstwaren, ist yon ihrer Zusammen- setzung weitgehend abh~ngig. Als Ausgangsstoff ftir Wtirste dient maschinell mehr oder weniger zerkleinertes Fleisch, das unter Zusatz yon Speck, Gewiirzen und Salz und manchmal aueh yon P6kelhilfsstoffen sowie gegebenenfalls yon Wasser zu einer bindungsf~higen Masse verarbeitet wird. Bei Erzeugnissen minderer Qualit~t kommen auSer reinem Fleisch der Skeletmuskulatur auch noch andere Teile des Tierk6rpers wie Blur, Sehwarten, Sehnen, innere Organe zur Verwendung. Seitens des Konsumenten besteht im allgemeinen eine Abneigung gegen gewisse Teile des tierischen KSrpers wie z. B. Sehwarten, Sehnen, Pansen, Adern, Luftr6hre und dergleiehen. Diese binde- gewebsreiehen Teile sind erheblieh billiger als reines Skeletmuskelfleisch. Neben anderen Qualiti~ts- merkmalen kann daher der Anteil an bindegewebigen Substanzen als ein Merkma] fiir die Be- urt~ilung der Qualit~t yon Fleiseherzeugnissen herangezogen werden. In einem solchen Produkt setzt sich der Gesamteiweil3gehalt ira wesentliehen aus zwei Anteilen zusammen, n~mlieh dem Muskeleiweil~ und dem BindegewebseiweiB. Voraussetzung ist, dab kein weiterer Zusatz yon Fremdstoffen wie Blutplasma oder MileheiweiB stattgefunden hat. In jedem Muskel ist neben dem Muskelprotein in mehr oder weniger groBen Anteilen auch BindegewebseiweiB enthalten; doch ist dieser Anteil bei reinen Bindegeweben wie Sehnen, Schwarten und dergleichen wesentlich hSher. Aus der Bestimmung des Gehaltes an Bindegewebe kann daher ein SchluB auf die Aus- gangsmaterialien gezogen werden (1).

Zur Bestimmung des Bindegewebeanteils in einem Fleisehprodukt wird vor allem die quantitative Bestimmung des 4-Hydroxyprolins herangezogen. Im Kollagen, das den Hauptbestandteil der Sehnen und Bindegewebe ansmacht, ist der Anteil an 4-Hydroxyprolin bei den verschiedenen S~ugetierarten reeht konstant. Die Genauig- keit der Bestimmung des Bindegewebeanteils h£ngt damit wesentlich yon der Ge- nauigkeit der Bestimmung des 4-Hydroxyprolins ab (2).

An Farbreaktionen zur Bestimmung yon Hydroxyprolin stehen die Reaktionen mit Ninhydrin, mit Naphtochinon-4-Sulfons£ure, mit Isatin sowie die Oxydation zu Pyrrol und nachfolgende Farbentwieklnng mit p-Dimethylaminobenzaldehyd zur Verfiigung. Die ersten drei Reaktionen sind weitgehend unspezifiseh und werden yon allen Aminos~uren in mehr oder weniger grol3er Intensit~t gegeben. Zur quanti- tativen Bestimmung des 4-Hydroxyprolins in einem Hydrolysengemiseh einer oder mehrerer Eiweit~k6rper k6nnen sie daher nur nach vorheriger chromatographiseher Fraktioniernng der Aminos/iureanteile herangezogen werden. F/ir eine direkto Bestimmung in einem Hydrolysengemisch erscheint daher nur die letztere Methode der Oxydation zu Pyrrol und Bestimmung mit p-Dimethylaminobenzaldehyd als geeignet (3).

Wie die grol3e Zahl yon Modifikationen zur Ausffihrung dieser Reaktion zeigt, ist die Methode reeht stSranffillig, vor allem der Schritt der Oxydation, aber aueh die

* Herrn Prof. Dr. L]coPoLD S ~ I D zu seinem 70. Geburtstag gewidme~. 15 Z. Lebensmitt.-Untersuch., Band 139

202 H. B~om~, I. POYER, I-I. LORENZ lind A. SCHINZEL:

anschlieBende Farbentwick lung . Fi i r unsere Zwecke schien die Vorschrift yon STEG~ANN (4) am besten geeignet.~ Das Siydroxyprol in wird in schwach saurem Milieu (pSI 6,0) mi t Chloramin T zu Pyrro l oxydier t u n d anschlieBend die Fa rbe mi t Dimethy laminobenza ldehyd un te r s tand~rdis ier ten Bedingungen ent- wickelt.

Arbeitsweise

l~eagentien 1. tIydrolysegemisch: In 60 ml konz. Salzs~ure (q 1,19) werden 5 g krist. Zinn(II)-chlorid

(SnCI~) gel6st und 40 ml Wasser zugegeben. 2. Aeetat-Citratpuffer (pH 6): 50,0 g Citronens~ure (C6tts07" H20) werden in ca. 500 ml

Wasser gel5st und sodann 120 g Natriumacetat krist, sowie 12 ml Eisessig und 34 g Natrinm- hydroxyd zugegeben. Nach dem L6sen aller Substanzen wird auf 1000 ml aufgefiillt und der pH-Wert elektrometrisch kontrolliert. Zur Auibewahrung werden vorteilhaft einige Tropfen Toluol zugesetzt.

3. 0,05 m Chloramin-LSsung: 2,82 g Chloramin T pro anal. werden in 40 ml k~ltem dest. Wasser gelSst, 60 ml ~_thylenglykolmonomethylather sowie 100 ml Acetat-Citratpuffer (pH 6) zugegeben und gut durehgemischt. Die L6sung wird t~glieh frisch bereitet.

4. 4 m-Perchlors~ure: 160 ml Perchlors~ure (60 % Merck) werden mit 210 mlWasser verdiinnt. 5. p-Dimethylaminobenzaldehyd-LSsung: 10 g p-Dimethylaminobenzaldehyd pro anal. werden

in 100 ml Athylenglykolmonomethyli~ther gelSst. 6. 4-Hydroxyprolin-Stamml5sung: 0,I00 g 24 Std bei 105°C getrocknetes 4-Hydroxyprolin

werden in 1000 ml 0,001 n-S~lzs~ure gelSst. Zum Gebrauch wird die Stamml5sung mit Wasser entsprechend verdfinnt.

Zur Ausffihrung der Messungen diente ein Zeiss-Spektralphotometer PMQ 2.

Au/stellung der Eichkurve Von der Hydroxyprolin-StammlSsung, die in 1 ml jeweils 0,1 nag 4-Hydroxyprolin enth~lt,

werden 10 ml auf 100 ml verdfinnt. Von dieser retd. Stamm!6sung pipettiert man in 7 MeBkSlb- ehen yon 100 m] Inhalt jeweils 10,0; 15,0; 20,0; 25,0; 30,0; 35,0 und 40,0 ml L6sung und fiillt mit Wasser auf 100 ml auf. In eine Reihe yon Reagenzgl~sern werden jeweils 5 ml der oben be- schriebenen Gebrauchsverdfinnung pipettiert, sowie in ein RShrchen als Blindwert 5 ml dest. Wasser. Die L6sungen entsprechen dann Gehalten yon jewefls 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5 und 20,0 ~g 4-Hydroxyprolin in 5 ml LSsung. Jedes R6hrchen versetzt man mit 2,5 ml der frisch bereiteten Chloraminl6sung, mischt sorgf~ltig und l~l~t genau 20 rain bei Zimmertemperatur stehen. Nach Ablauf dieser Zeit werden je 5 ml der 4 m-Perchlors~ure zugegeben, gut gemischt und genau 8 rain bei Zimmertemperatur gehalten. Naeh Ablauf dieser Zeit versetzt man mit 2,5 ml p-Dimethylaminobenzaldehyd-LSsung, mischt kr~ftig durch und bringt die RShrchen auf 15 min in ein Wasserbad yon 60 4- 1 ° C. Das Einhalten sowohl yon Temperatur als auch Zeit ist ffir eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse von grSBter Wichtigkeit. Anschliel~end wird 3 min im kalten Wasser gekiihlt und dann bei einer Schichtdicke yon 2 cm und einer Wellen- lange yon 560 m~ photometriert. Aus den erhaltenen Werten kann man entweder in fiblicher Weise die Eichkurve zeichnen oder mittels der Regressionsrechnung die Eichgerade berechnen und daraus die Eiehgleichung erstellen (siehe unten).

Vorbereitung des Untersuchungsmaterials Zur Untersuchung yon Fleischerzeugnissen und Wursl~waren werden zur Erziehng einer

homogenen Probe jewefls mindestens 200--250 g des Untersuchungsmaterials mehrmals durch die feinste Scheibe eines Fleisehwolfes gedreht. Von dem so erhaltenen, homogenen Material werden 5 g genau abgewogen und dann nach Zusatz yon 15 m] Hydrolysengemisch 7 Std lang am Rfickflul3kfihler gekocht. Nach dem Abkiihlen wird mit Natronlauge und Natriumcarbonat- 16sung auf pH 8 eingestellt; die Kontrolle kaim leicht durch Tfipfeln mit entsprechendem Indi- katorpapier erfolgen. Man fiihrt dann einschlieBlich des ausfallenden Zinnhydroxyds quantitativ in einen 100 ml-Mel]kolben fiber, l~Bt stehen bis sich das Zinnhydroxyd ~bgesetzt hat und fiillt zur Marke auf. 5 ml des Filtrats werden im Mel~kolben auf 200 ml verdfinnt. Von dieser so ver- dlinnten L6sung pipettiert man jeweils 2 ml in eine Eprouve~te, versetzt mlt 3 ml Wasser und und f~hrt dann fort, wie oben ffir reine 4-Itydroxyprolinl6sungen besehrieben.

Genauigkeit der Bestimmung yon 4-Hydroxyprolin in Fleiseh- und Wurstwaren 203

Berechnung

Unter den angegebenen Versuehsbedingungen erfolgt die Umreehmmg der der Eiehkurve entnommenen 4-Hydroxyprolinwerte (liP) auf den Gehalt im Untersuehungsmaterial naeh folgender Formel:

1. mg tIP/100 g ~ [zg HP gef × Verd. Faktor × 100 Einw. in g × 1000

Da BindegewebseiweiI3 im Durchsehnitt 12,5% liydroxyprolin in seinem Aminosgureantefl enth~lt, ist dieser Wert mit 8 zu muttiplizieren, um auf BindegewebseiweiB umzurechnen. Der BindegewebseiweiBantefl in Prozenten des vorhandenen Eiweii3es (Ew.) ergibt sieh dann naeh:

2. % BindegewebseiweiB = m g HP/100 g × 8 × 100 % Ges. Ew. × 1000

Zur Bestimmung des Gesamtstiekstoffes diente die Standardme~hode nach KJV, LDAHL naoh Verasehung mit konz. Sehwefels~ure und Zugabe yon Kupfersulfat und Wasserstoffperoxyd. Zur Umrechnung auf Eiweil3 diente der :Faktor yon 6,25 fiir Gesamteiwei]~ bzw. yon 5,55 £fir BindegewebseiweilL

Zur Berechnung des Fehlers der Einzelbestimmung bei reinen liydroxyprolin-LSsungen wurden aus den erhaltenen MeBwerten in fiblicher Weise die Eichgeraden bereehnet (5, 6).

Zeiehnet man in fibticher Weise die Eiehkurve einer lYlel~reihe, so zeigt sich, dal] bei Werten yon fiber 15 ~g 4-Hydroxyprolin/ml das Gesetz yon Lambert-Deer nicht mehr exakt erffillt ist, die Kurve biegt gegen die Abszisse ab.

Ffir exakte Bestimmungen erscheint es daher richtig, die Kon- zentrationen der zu messenden LSsungen so zu w/~hlen, dal3 man noch im linearen Tell der Eiehkurve (fSrderliehem Bereieh) ar- beitet. Aus diesem Grunde wurde auch der Berechnung der Eich- geraden und der Standardabweichungen nur der Bereich yon 0--15 [zg Hydroxyprolin/ml zugrunde gelegt.

Entsprechende Bereehnungen warden fiber insgesamt 10 ~el~reihen mit zusammen 126 Einzelmessungen im Bereieh 0--15 ~g 4-Hydroxyprolin pro ml durchgefiihrt, eine Zusammen- fassung aller Werte ergab ffir die Eichgerade k ---- 0,0301, b 0,0151, sz : 0,00873 [Bereehnung naeh BAV~VL~N (7)]. Die Eieh- gleiehung lautet also im vorliegenden Falle:

E - - 0,0151 e 0,0301 ---- E • 33,22 - - 0,502

/ /

/ 1,o " / E

10 30/ag/ml 50 h-Hydroxyproiin

Abb. 1. Eichkurve zur Be- stimmung yon d-Hydroxy- prolin, gemessene Eich- kurve, - - - - theoretiseher Verlauf bei exakter Lineari-

t~t

Nachweisgrenze

Zur Bewertung des Veffahrens ist noeh die Berechnung der Nachweisgrenze erforderlich. Nach K~s~R u. SP~KK]~R (8) ist die Nachweisgrenze bei einer geforderten statistischen Sicherheit yon 99,7%, gegeben dutch: ENg ~ E~ -~ 3. ~/2-. sB, wobei ENg die Extinktion an der Nachweis- grenze, E-B den ~ittelwert der Extinktionen der Blindwerte and s~ die Standardabweichung der Blindworte bezeichnet.

Eine Berechnung der Standardabweichung der Blindwerte aus verschiedenen Untersuehungs- reihen ergab ffir sB : 0,00139 and daraus ffir ENg = 0,02103. Mit Hilfe dieses Wertes errechnet sich aus der Eiehgleichung eine Nachweisgrenze yon 0,2 [zg 4-Hydroxyprolin/ml. Betont sei an dieser Stelle, da]] es sich bei diesem Wert nur um eine statistische Zahl handelt, der Fehler an der ~achweisgrenze liegt in der GrSBenordnung yon 33 %. Um also unter den gegebenen Bedingungen der Analysenvorsehrift im fSrderliehen Bereich der Eichkurve zu arbeiten, miissen die Konzen- trationen dee 4-Hydroxyprolins im Bereieh yon 2,--15 {zg/ml liegen.

Pri~/ung der (7enauigkeit bei Fleisch. u. Wurstwaren

Die bisherigen Ausffihrungen beziehen sieh aussehlieB]ieh auf die Bes~immung des 4-Hydro- xyprolins in reinen w~Brigen LSsungen; auf die Ergebnisse, wie sie bei der praktisohen Unter- suehung yon Fleisch- and Wurstwaren anfallen, sind sie nieht ohne n~here Prfifung iibertragbar. 15"

204 H. B~,~cGEg u. a. : Bestimmung yon 4-Hydroxyprolin in Fleisch- und Wurstwaren

Zur Pr/ifung der in der Praxis der Untersuchung yon Wurst- und Fleischwaren erzielbaren Ge- nauigkeit wurden verschiedene Wiirste nach der oben beschriebenen Methodik auf ihren Binde- gewebsgehalt untersucht.

Jeweils 500 g der zu untersuchenden Wurst wurden mehmals dutch die feinste Scheibe des Fleischwolfes getrieben und yon der so erhaltenen homogenen Masse ffir die Einzelbestimmung genau 5,00 g abgewogen. In jeder dieser Einzelproben wurde eine eigene Bestimmung des Gehaltes an 4-I-Iydroxyprolin durchgefiihrt. Ein typisches Ergebnis einer solchen Untersuchungsreihe spiegelt folgende Zahlenreihe wider (jeweils 5,0 g Wurst) :

•'255/••268/••26•/••248/••243/••249/••248/••252•••253•••252/••25••••248/••25•/••247/••249• 0,246/0,248/0,260/0,260/0,264.

Aus diesen Werten errechnet sich eine mittlere Extinktion yon E : 0,2525 mit einer Standard- abweichung S~ : 0,0066, entsprechend einer relativen Standardabweichung yon 2,61% . Daraus ergibt sich ein Gehalt yon 7,89 ~g 4-Hydroxyprolin/ml und nach Gleichung 1 ein Gehalt yon 314,85 q- 8,22 mg 4-Hydroxyprolin pro 100 g Untersuchungsmaterial.

Fiir die untersuchten vier Wurstsorten mit je 20 Einzelanalysen wurden die folgenden rela- riven Standardabweichungen, jeweils fiir eine Einzelanalyse, ermittelt: 4,40 °/o, 3,88 %, 2,61 °/o und 1,76 °/o.

In die Berechnung des Bindegewebsanteils geht nach Gleichung 2 auch der Wert fiir die GesamteiweiBbestimmung nach KJV.LDI~L ein. Die Genauigkeit und Grenzen dieser seit Jahr- zehnten geiibten Bestimmungsmethode sind an sich hinreichend bekannt, nichtsdestoweniger wur- den sie fiir den vorliegenden Fall bei den gegebenen Versuchsbedingungen und dem Untersuchungs- material nochmals bestimmt. Eine Pr/ifung an mehreren Untersuchungsreihen, auf deren Wieder- gabe hier verzichtet werden soll, ergab eine relative Standardabweichung yon 0,45% . Da sieh die Summenstandardabweichung aus den einzelnen Standardabweichungen gem/£B dem Fehler- fortpflanzungsgesetz nach der Formeh s 2 : s~-k s ,2~ s3~A - . . . . . . errechnet, kann der Fehler der GesamteiweiBbestimmung bei der Bereehnung des Bindegewebsanteils im Verg]eich zum Fehler der 4-Hydroxyprolinbestimmung vernachl~ssigt werden. F/Jr das oben berechnete Beispiel ergibt sieh gem~B Formel 2 ein Bindegewebsantefl yon 28,89 :k 0,75 %.

Im Routinebetrieb werden naturgem/iB aus Zeitmangel keine Untersuehungsreihen yon jeweils 20 Einzelbestimmungen durehgef/ihrt, auch mfissen die eingesetzten Probenmengen im ~ll- gemeinen kleiner sein, so dab sieh Inhomogenit/~ten im Untersuchungsmaterial starker auswirken werden. Eine exakte Berechnung aller dieser Faktoren ist nieht m6glich, die hSchste, bei unseren Untersuehungen gefundene relative Standardabweichung ffir die Einzelbestimmung lag bei =t=4,4% d. h. bei Ber/icksichtigung einer statistisehen Sieherheit yon 95% entsprechend 2 • s er- gibt sich in diesem Falle ein Fehlerbereich yon =k9% relativ, bei Ber/icksichtigung einer 99%-igen statistischen Sicherheit ein Fehlerbereieh von =t=11,3% relativ.

Zusammen]assung Nach unseren Un te r suchungen u n d Berechnungen des Bindegewebsantei ls

einer Fleischware oder einer Wurs t k a n n dieser mit te ls der angegebenen Methodik der 4-I - Iydroxyprol inbest immung mi t einer re la t iven Genauigkei t yon =k9% bei einer s tat is t ischen Sicherheit yon 95%, yon q-11,3% bei einer s ta t is t ischen Sicherheit yon 99%, jeweils ffir eine E inze lbes t immung, bes t immt werden.

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