Upload
zuhal
View
246
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
1/25
Epigenetik modifikasyonlarla
alma yntemleri
www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.110.tt0110b
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
2/25
Epigenetik modifikasyonlarlaalma yntemleri
DNA metilasyonu bislfitdizileme
Histon modifikasyonu kromatinimmunopresipitasyonu (ChIP)
DNA adenosin metilasyon tayini (DamID)
siRNA retimi derindizileme
TTCGCCGACTAA TTCGCCGAuTAA
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
3/25
Bislfit uygulamassitosin ve metilsitosini ayrr
Bislfit
uygulamas
TTCGCCGACTAA
Uygulamayok
TTCGCCGACTAA
TTCGCCGAuTAA
Metil-sitosin
DNAyabislfituygulandnda,metillenmemisitosinlerurasilednr.Metilsitosinetkilenmez.
O N
NH2
N
~
O N
NH2
N
~
CH3
sitosin 5-metilsitosin
O N
NH2
N
~
CH3
O N
O
N
~urasil 5-metilsitosin
Bislfituygulamas
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
4/25
Bislfit uygulamassitosin ve metilsitosini ayrr
Bislfituygulamas
TTCGCCGACTAA
Uygulamayok
TTCGCCGACTAA
TTCGCCGAuTAA
TTCGCCGACTAA TTCGCCGATTAA
Metil-sitosin
BislfituygulamasndansonraC lerT olarak
okunur veuygulamal veuygulamaszrneklerdefarkldrlar.
Bunakarnmetil-C iseaynirnekteC olarak
okunur.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
5/25
Kromatin immnopresipitasyonu(ChiP)
DNA nnhistonaaprazbalan
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
6/25
DNA nnhistonaaprazbalan
DNAyufakparalaraayr ve modifiyehistonazgnantikorekle,affinitesaflatrmasile
antikorvebalhistonkompleksiniayr.
Kromatin immnopresipitasyonu(ChiP)
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
7/25
DNA nnhistonaaprazbalan
aprazbalantyyoket, DNAysaflatrvePCR,dizileme veyamikroarrayileanalizyap.
Kromatin immnopresipitasyonu(ChiP)
DNAyufakparalaraayr ve modifiyehistonazgnantikorekle,affinitesaflatrmasileantikorvebalhistonkompleksiniayr.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
8/25
DNA adenin metilasyonu ID(DamID)
Dammetilaz(E.Coliden)
lgilenilenprotein
(rn. LHP1)
Birfsyonproteini Dam veilgilenilenbirprotein
Fsyonproteinikromatininseilenblgesine(rn.H3K27me3) balanrve GATCblgesiyaknndaki metiller.adeninleri
Dam biradeninemetiltransferaz veGATC dizizgllvardr.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
9/25
Metilasyon metilasyona duyarlenzimlerle tanmlanabilir.
Balanmablgesi
yaknndakiyer
RNOLUUR
GATC
DpnIIrestriksiyonendonukleazsindirimi
(metilasyonduyarl)
GATC GATC
PCRamplifikasyonu
GATCGATC
RN YOK
Balanmablgesi
yaknndaolamayan
yer
GATC
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
10/25
Derin dizilemegelecek generasyonDNA dizileme yntemleri
Klasik DNAdizileme Bir
seferdebirmolekldizilenir.
GelecekgenerasyonDNA dizileme one
milyonlarca moleklbirseferdedizilenir.
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright 2005. Margulies, M., et al., ( 2005)
Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
11/25
Klasik DNA dizileme
Fluorescently-labeledddNTPs
Primer 5CCGGTTAATemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT
G
T
A
C
Base
DrtstandartdNTPs
+
+
+ DNA Polimeraz
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
12/25
Klasik DNA dizileme
Primer 5CCGGTTAATemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT
Primer 5CCGGTTAATTemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT
Primer 5CCGGTTAATTCTemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATTT
DNA polimeraz etiketlenmemidNTPlere veyaetiketliddNPTlerebalanr,sonutaetiketlifarklboyutta moleklleroluur.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
13/25
Klasik DNA dizileme
Detektr
Laser
DNA
molekllerielektroforezile
ayrlr.
TTCGCCGACTAA
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
14/25
Gelecek generasyon dizilemeyntemleri: Pyrodizileme
PyrodizilemedeetiketlinuklotidlerveddNTPlerkullanlmaz.
Pyrophosphatenukleotideklenmesiileaa karvesubstrat...
Primer 5CCGGTTAATemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT
Primer 5CCGGTTAATTemplate strand 3GGCCAATTAAGCGGCTGATT
T
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
15/25
Pyrodizileme - Kimya
PYROPOSFAT
+ Adenosin5posfatsulfat ATP
....veya ATP
sufurilaz, ATPOluturur....
ATP Sulfurilaz
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
16/25
Pyrodizileme - Kimya
+PYROFOSFAT
Adenosin5fosfatsulfat ATP
ATP luciferaztarafndankuyarmntetikler.
+
ATP
Luciferin
LUCIFERAEZ
Ikoluumu
ATP Sulfurilaz
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
17/25
Pyrodizileme - Kimya
T
T
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
18/25
Pyrodizileme datadeerlendirilmesi
dTTP
dTTP
Reaksiyonyok
5CCGGTTAA
3GGCCAATTGAGC....
5CCGGTTAAT
3GGCCAATTACGA...
PPi ATP
dNTPseklenirve
eklenmekoluumuileizlenir.
BRNCDNG
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
19/25
Pyrosequencing datadeerlendirilmesi
dCTP
dCTP
5CCGGTTAAC
3GGCCAATTGAGC....
5CCGGTTAAT
3GGCCAATTACGA...
KNC DN
PPi ATP
NoReaction
dNTPseklenirve
eklenmekoluumuileizlenir.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
20/25
Pyrodizileme datadeerlendirilmesi
dTTP dGTP dCTP dATP dTTP dGTP dCTP dATP
TIME
AG
AC
Herbirnoktadan
koluumu(flowgram) DNAdizileriniaklar.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
21/25
A pyrodizileme flowgram
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE copyright 2005. Margulies, M., et al., ( 2005)
Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
22/25
Dier gelecek generasyondizileme yntemleri
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Biotechnology Copyright 2008.
Shendure, J., and Ji, H. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotech. 26: 1135-1145.
highthroughput, vemassiveparallelismyntemler igcn vekimyasalkullanmnazaltmaktadrlar.
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
23/25
Gelecek generasyon dizileme ile ,epigenetik modifikasyonlar da tmgenom dzeyinde incelenebirler:
EPGENOMK
KasschauKD, Fahlgren N, Chapman EJ, Sullivan CM, Cumbie JS, et al. 2007 Genome-Wide Profiling and Analysis ofArabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57.
Zhang, X., Clarenz, O., Cokus, S., Bernatavichute, Y.V., Pellegrini, M., Goodrich, J., Jacobsen, S.E. (2007) Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27
trimethylation inArabidopsis. PLoS Biol. 5: e129.
AbundanceofsiRNAs
GREEN =H3K27me3PURPLE =
methylcytosine
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
24/25
Zilbermanandhenikoff(2007) Development134, 3959
8/6/2019 geliim genetii 30.05.2011 (Epigenetik modifikasyonlarla alma metodlar)
25/25
Epigenetik/Epigenomik
http://www.nature.com/jid/journal/v125/n2/extref/5603467x1.jpg
ChIP-chip