Gdaski Uniwersytet Medyczny

Karolina Gob

Indukcja tolerancji immunologicznej

w przeszczepie wysp trzustkowych

ROZPRAWA NA STOPIE DOKTORA NAUK MEDYCZNYCH

Gdask 2015

Prac wykonano w Katedrze Chirurgii Uniwersytetu Chicago we

wsppracy z Pracowni Immunoregulacji i Terapii Komrkowych

Katedry Medycyny Rodzinnej Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego

oraz firm CEllT spk z o.o. pod kierownictwem:

- Dr hab. n. med. Natalii Marek-Trzonkowskiej Promotora pracy - Dr hab. med. Piotra Witkowskiego Kopromotora pracy

Praca zostaa sfinansowana z funduszu Narodowego Centrum Bada i

Rozwoju (Projekt STRATEGMED1/233368/1/NCBR/2014) oraz ze

rodkw Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji

numer DEC-2011/01/NZ3/00262 i ze rodkw Ministerstwa Nauki i

Szkolnictwa Wyszego przyznanych na realizacj grantu Iuventus Plus nr

IP2011 033771

Pragn serdecznie podzikowa:

Promotorowi - Dr hab. n. med. Natalii Marek-Trzonkowskiej z Pracowni

Immunoregulacji i Terapii Komrkowych Katedry Medycyny Rodzinnej

Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego za wdroenie w wiat komrek T

regulatorowych, opiek merytoryczn od samych pocztkw realizacji bada,

ktrych wyniki zostay przedstawione w publikacjach zawartych w niniejszej

rozprawie oraz za wsparcie, serdeczno, cierpliwo oraz za powicony czas i

nieocenion pomoc ju przy samym otwarciu przewodu doktorskiego i skadaniu

pracy do recenzji.

Kopromotorowi - Dr hab. med. Piotrowi Witkowskiemu Dyrektorowi

Programu Przeszczepiania Wysp Trzustkowych w Katedrze Chirurgii

Uniwersytetu w Chicago za umoliwienie realizacji bada naukowych w ramach

zatrudnienia w zespole, ktrego jest dyrektorem, opiek merytoryczn, motywacj

do rozwoju naukowego, udzielone zaufanie, szczeglnie przy kierowaniu

izolacjami wysp trzustkowych oraz pomoc i wsparcie przy pojawiajcych si

problemach.

Pracownikom Pracowni Immunoregulacji i Terapii Komrkowych Katedry

Medycyny Rodzinnej oraz Zakadu Immunologii Klinicznej i Transplantologii

Katedry Immunologii Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego za owocn

wspprac, yczliwo, niezwykle cenn wymian myli i spostrzee, a w

szczeglnoci:

Kierownikowi Zakadu Immunologii Klinicznej i Transplantologii: Prof. dr. hab. med. Piotrowi Trzonkowskiemu za naukowe wsparcie,

wskazwki i uwagi dotyczce planowania dowiadcze i interpretacji

wynikw.

Dr n. biol. Adamowi Krzystyniakowi za pomoc w realizacji bada, owocne dyskusje dotyczce wynikw i podczas przygotowywania

publikacji prezentowanych w niniejszej rozprawie.

Koleankom i Kolegom z Zespou Izolacji i Transplantacji Wysp

Trzustkowych Katedry Chirurgii Uniwersytetu w Chicago za owocn wspprac, wszechstronn pomoc i rady w trakcie wykonywania bada i

stworzenie przyjaznej, rodzinnej atmosfery pracy.

Rodzinie i osobom bliskim za wyrozumiao wzgldem mojego

powicania codziennego czasu pracy oraz wiar we mnie i upewnianie, e to,

nad czym naukowo pracuj ma sens i due znaczenie.

5 Spis treci

SPIS TRECI

WYKAZ STOSOWANYCH SKRTW ............................................................. 6

WYKAZ PRAC WCHODZCYCH W SKAD ROZPRAWY DOKTORSKIEJ .......................................................................................................................................... 8

1. WPROWADZENIE ..................................................................................... 10 1.1. TRZUSTKA I FUNKCJA WYSP TRZUSTKOWYCH ..................................................... 10 1.2. CUKRZYCA TYPU 1 .................................................................................................... 10 1.3. PRZESZCZEP TRZUSTKI W CUKRZYCY TYPU 1 ...................................................... 11 1.4. PRZESZCZEP WYSP TRZUSTKOWYCH JAKO ALTERNATYWNA METODA TERAPII

CUKRZYCY TYPU 1 ................................................................................................................. 12 1.4.1. Historia i obecny status przeszczepu wysp trzustkowych .......... 12 1.4.2. Metoda izolacji wysp trzustkowych ...................................................... 14 1.4.3. Czynniki wpywajce na powodzenie izolacji i przeszczepu

wysp trzustkowych ............................................................................................................ 16 1.4.4. W kierunku nowych metod indukcji tolerancji immunologicznej

w przeszczepie wysp trzustkowych ........................................................................... 24

2. CELE PRACY ............................................................................................... 32

3. NAJWANIEJSZE SPOSTRZEENIA Z PREZENTOWANYCH PRAC WCHODZCYCH W SKAD ROZPRAWY DOKTORSKIEJ.............................. 33

3.1. WZROST DAWCY TRZUSTKI JAKO DODATKOWY CZYNNIK PRZY WYBORZE ODPOWIEDNIEGO DAWCY, WPYWAJACY NA POWODZENIE IZOLACJI WYSP

TRZUSTKOWYCH. ................................................................................................................... 33 3.2. KOMRKI T REGULATOROWE JAK NARZDZIE TERAPEUTYCZNE DO INDUKCJI

TOLERANCJI IMMUNOLOGICZNEJ W PRZESZCZEPIE WYSP TRZUSTKOWYCH ................ 36 3.3. OPTYMALIZACJA EKSPANSJI KOMREK T REGULATOROWYCH POPRZEZ DOBR

ODPOWIEDNIEJ POYWKI HODOWLANEGO ....................................................................... 38 3.4. KRIOPREZERWACJA KOMREK T REGULATOROWYCH NA SKAL KLINICZN

PROBLEMY I WYZWANIA ...................................................................................................... 42 3.5. WPYW WYBRANYCH LEKW IMMUNOSUPRESYJNYCH NA KOMRKI T

REGULATOROWE ................................................................................................................... 47 3.6. METODA LOKALNEJ IMMUNOPROTEKCJI WYSP TRZUSTKOWYCH

Z WYKORZYSTANIEM KOMREK T REGULATOROWYCH I JEJ OPTYMALIZACJA ............ 50

4. WNIOSKI ..................................................................................................... 56

5. WYKAZ CYTOWANEGO PIMIENNICTWA ....................................... 57

6. STRESZCZENIA PRAC / ABSTRACTS .................................................. 78

Karolina Gob 6

WYKAZ STOSOWANYCH SKRTW

AMP adenozynomonofosforan

APC Antigen Presenting Cell / komrka prezentujca antygen

ATG Anti-Thymocyte Globulin / globulina antytymocytarna

BMI Body Mass Index / wskanik masy ciaa

CCL22 Chemokine (C-C motif) ligand 22 / chemokina 22 typu C-C

CCR5 Chemokine (C-C motif) receptor 5 / receptor 5 chemokin typu C-C

CITR Collaborative Islet Transplant Registry / Centralny Rejestr

Przeszczepu Wysp

CFSE Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester / ester sukcynoimidu

dioctanu karboksyfluoresceiny

CsA Cyclosporine A / cyklosporyna A

CTLA-4 Cytotoxic T Cell Antigen 4 / antygen 4 zwizany

z cytotoksycznymi limfocytami T

CXCL8 C-X-C Chemokine Ligand 8 / chemokina 8 typu C-X-C

CXCL12 C-X-C Chemokine Ligand 12 / chemokina 12 typu C-X-C

FBS Fetal Bovine Serum / bydlca surowica podowa

GvHD Graft versus Host Disease / choroba przeszczep przeciwko

gospodarzowi

GLP Good Laboratory Practice / dobra praktyka produkcyjna

HbA1C glikowana hemoglobina

HS Human Serum / surowica ludzka

HSC Hematopietic Stem Cell / hemapoetyczna komrka macierzysta

IBD Inflammatory Bowel Diseases / nieswoiste zapalenia jelit

IDO Indoleamine 2,3-dioxygenase / 2,3- dioksygenaza indoloaminy

IDS Islet Donor Score / punktowa ocena dawcy trzustki

IEQ Islet Equivalents / ekwiwalent wysp trzustkowych IFN- Interferon gamma

IL-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-35 Interleukina odpowiednio: -1,

-1, -2, -3, -4, -10, -35

IPEX Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked

syndrome / sprzony z chromosomem X zesp dysregualcji

immunologicznej, poliendokrynopatii i enteropatii

JDRF Juvenile Diabetes Research Foundation / Fundacja na rzecz Bada

nad Cukrzyc Modziecz

LAG3 Lymphocyte-Activation gene 3 / gen 3 aktywacji limfocytw

LFA-1 Lymphocyte Function-Associated Antigen 1 / antygen 1 zwizany z

funkcj limfocytw

MHC Major Histocompatibility Complex / gwny ukad zgodnoci

tkankowej

MMF Mycophenolate Mofetil / mykofenolan mofetylu

MSC Mesenchymal Stem Cell / mezenchymalna komrka macierzysta

7 Skrty

mTOR Mammalian Target of Rapamycin / ssaczy cel rapamycyny

NK Natural Killer cell / komrka naturalny zabjca

NOD Non-Obese Diabetic mice / myszy zapadajce na cukrzyc pomimo braku otyoci; zwierzcy model cukrzycy typu 1

PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells / jednojdrzaste komrki

krwi obwodowej

TCR T Cell Receptor / receptor limfocytw T TGF- Transforming Growth Factor beta / transformujcy czynnik

wzrostu beta

TNF- Tumor Necrosis Factor alpha / czynnik martwicy nowotworw

alfa

TSDR Treg-specific-demethylated region / demetylowany region

specyficzny dla komrek Treg

UNOS United Network for Organ Sharing / Sie Wspdzielenia Organw

do Transplantacji sie zarzdzajca systemem transplantacji

organw w Stanach Zjednoczonych

Karolina Gob 8

WYKAZ PRAC WCHODZCYCH W SKAD ROZPRAWY

DOKTORSKIEJ

1. Wang LJ., Cochet O., Wang XJ., Krzystyniak A., Misawa R., Golab K.,

Tibudan M., Grose R., Savari O., Millis JM., Witkowski P. Donor height in

combination with islet donor score improves pancreas donor selection for

pancreatic islet isolation and transplantation. Transplant Proc. 2014, 46, 6,

1972-1974.

Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 0,984

Punktacja ministerstwa: 15,000

2. Krzystyniak A., Gob K., Witkowski P., Trzonkowski P. Islet cell transplant and the incorporation of Tregs. Curr Opin Organ Transplant. 2014, 19, 6,

610-615.

Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 2,379

Punktacja ministerstwa: 25,000

3. Gob K., Krzystyniak A., Marek-Trzonkowska N., Misawa R., Wang LJ., Wang X., Cochet O., Tibudan M., Langa P., Millis JM., Trzonkowski P.,

Witkowski P. (2013) Impact of culture medium on CD4+CD25

highCD127

lo/neg

Treg expansion for the purpose of clinical application. Int.

Immunopharmacol. 2013, 16, 3, 358-363.

Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 2,711

Punktacja ministerstwa: 30,000

4. Golab K., Leveson-Gower D., Wang XJ., Grzanka J., Marek-Trzonkowska N., Krzystyniak A., Millis JM., Trzonkowski P., Witkowski P. Challenges in

cryopreservation of regulatory T cells (Tregs) for clinical therapeutic

applications. Int Immunopharmacol. 2013, 16, 3, 371-375.

Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 2,711

Punktacja ministerstwa: 30,000

5. Wang XJ., Leveson-Gower D., Golab K., Wang LJ., Marek-Trzonkowska N., Krzystyniak A., Wardowska A., Millis JM. Trzonkowski P., Witkowski P.

Influence of pharmacological immunomodulatory agents on

CD4(+)CD25(high)FoxP3(+) T regulatory cells in humans. Int

Immunopharmacol. 2013, 16, 3, 364-370.

9 Wykaz prac wchodzcych w skad rozprawy doktorskiej

Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 2,711

Punktacja ministerstwa: 30,000

6. Marek N., Krzystyniak A., Ergenc I., Cochet O., Misawa R., Wang LJ., Gob K, Wang X., Kilimnik G., Hara M., Kizilel S., Trzonkowski P., Millis JM.,

Witkowski P. Coating human pancreatic islets with

CD4(+)CD25(high)CD127(-) regulatory T cells as a novel approach for the

local immunoprotection. Ann Surg. 2011 254, 3, 512-518.

Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 7,188

Punktacja ministerstwa: 50,000

7. Gob K., Kizilel S., Bal T., Hara M., Zielinski M., Grose R., Savari O., Wang XJ., Wang LJ., Tibudan M., Krzystyniak A., Marek-Trzonkowska N., Millis

JM., Trzonkowski P., Witkowski P. Improved coating of pancreatic islets

with regulatory T cells to create local immunosuppression by using

the biotin-polyethylene glycol-succinimidyl valeric acid ester

molecule. Transplant Proc. 2014, 46, 6, 1967-1971.

Czasopismo umieszczone na Licie Filadelfijskiej, wskanik IF: 0,984

Punktacja ministerstwa: 15,000

Karolina Gob 10

1. WPROWADZENIE

1.1. Trzustka i funkcja wysp trzustkowych

Trzustka jest organem, ktry spenia funkcje gruczou

zewntrzwydzielniczego oraz wewntrzwydzielniczego (dokrewnego). Jako

gruczo zewntrzwydzielniczy produkuje sok trzustkowy, zawierajcy enzymy

trawice biaka, kolagen i rozkadajce kwasy nukleinowe. W trzustce

produkowane s take hormony, std funkcja trzustki jako gruczou

dokrewnego. Hormony te wytwarzane s przez komrki zgromadzone w

skupiskach, umiejscowione nieregularnie wrd tkanki o funkcjach

zewntrzwydzielniczych. Nazywane s one wyspami trzustkowymi lub od

nazwiska ich odkrywcy wyspami Langerhansa. Wyspy trzustkowe skadaj si

w 60% z komrek , produkujcych insulin, w 20% z komrek ,

produkujcych glukagon, w 5% z komrek , produkujcych somatostatyn oraz

w mniej ni 5% z komrek F, wytwarzajcych polipeptyd trzustkowy.

Pojedyncze wyspy trzustkowe oplecione s sieci naczy krwiononych,

doprowadzajcych skadniki odywcze do komrek i odprowadzajcych

wytwarzane hormony. Wyspy trzustkowe posiadaj ponadto wasne unerwienie.

Funkcjonuj one zatem jako mikro-narzdy.

Istotn funkcj, jak peni wyspy trzustkowe jest utrzymanie

odpowiedniego poziomu glukozy we krwi (glikemii). Komrki oraz reaguj

na stenie glukozy i wydzielaj odpowiednie iloci insuliny oraz glukagonu,

aby utrzyma stan normoglikemii, wynoszcy u zdrowego czowieka na czczo

70-99 mg/dl. Gdy funkcja komrek jest upoledzona, nie dochodzi do

wytwarzania odpowiedniej iloci insuliny. W efekcie glukoza nie dociera do

komrek i pozostaje we krwi, gdzie jej stenie ronie (hiperglikemia).

Przewleka hiperglikemia prowadzi nastpnie do uszkodzenia lub zaburzenia

czynnoci wielu narzdw, w tym nerek, serca, naczy krwiononych i oczu.

1.2. Cukrzyca typu 1

Cukrzyca jest chorob, ktrej gwnym objawem jest hiperglikemia . Ze

wzgldu na etiopatogenez oraz przebieg choroby, mona wyrni jej kilka

typw. Jednym z nich jest cukrzyca typu 1, w ktrej dochodzi do niszczenia

przez ukad immunologiczny chorego komrek , i w konsekwencji do deficytu

insuliny. W tej sytuacji koniecznoci dla chorego staje si dostarczanie

egzogennej insuliny w postaci wstrzykni podskrnych. Std te ten typ

cukrzycy okrela si mianem insulinozalenej. Chorzy musz ponadto

wielokrotnie w cigu dnia kontrolowa poziom glukozy we krwi w celu

dostosowania dawek insuliny do pory dnia oraz iloci i jakoci spoywanych

pokarmw. Pomimo tego, u duej grupy chorych nie jest moliwe sterowanie

11 Wprowadzenie

odpowiednim steniem glukozy we krwi tak, jak jest to w przypadku obecnoci

w organizmie prawidowo funkcjonujcych wysp trzustkowych. Cz

pacjentw, stosujcych terapi insulinow cierpi na napady hipoglikemii. Chory

moe nie by wiadomy, e poziom glukozy w jego krwi spad poniej 50 mg/dl,

natomiast sytuacja taka stanowi realne zagroenie dla jego zdrowia i ycia.

Podczas napadu hipoglikemii moe doj do zaburze wiadomych reakcji,

braku kontaktu z otoczeniem, jak rwnie cakowitej utraty wiadomoci. W

skrajnych przypadkach, gdy do zdarze takich dochodzi w nocy, podczas snu,

moe doj do zgonu chorego, tzw. dead-in-bed (mier w ku) [1].

Jedynymi do tej pory istniejcymi metodami, ktre mog zastpi funkcj

komrek na okres kilku lat i zwolni chorych od obowizku codziennej

poday egzogennej insuliny oraz uchroni przed niewiadomymi napadami

hipoglikemii jest przeszczep trzustki lub wysp trzustkowych.

1.3. Przeszczep trzustki w cukrzycy typu 1

Pierwszy przeszczep trzustki wykonano w roku 1966 i od tego czasu

operacji takich przeprowadzono ponad 42 000 na caym wiecie [2].

Standardowo, przeszczep trzustki wykonuje si u pacjentw chorych na

cukrzyc typu 1 w trzech rnych przypadkach. W okoo 70% s to osoby, ktre

poddawane s rwnoczesnej transplantacji nerki i trzustki. W zwizku

z przeszczepem nerki i tak wymagany jest u nich zabieg operacyjny oraz

konieczno zastosowania immunosupresji. Kolejn grup chorych stanowi ci,

u ktrych przeszczep trzustki wykonywany jest po przeszczepie nerki, np. od

yjcego dawcy. Podobnie jak w powyszej grupie, pacjenci tacy stosuj ju leki

immunosupresyjne i nie jest konieczna dodatkowa indukja tolerancji przed

przeszczepem trzustki [3]. Transplantacj samej trzustki bez uprzedniej lub

rwnoczesnej transplantacji nerki wykonuje si rzadko, jedynie u chorych

cierpicych z powodu niekontrolowanych epizodw hipoglikemii, ale tylko u

okoo 5% pacjentw z tej grupy [4]. Liczba zgonw w pierwszym roku po

przeszczepie trzustki, stanowi mniej ni 5% wszystkich przypadkw. Dziki

poprawie technik chirurgicznych i terapii immunosupresyjnej, przecitnie po 5

latach do 71% przeszczepw nadal spenia swoje funkcje [2].

Pomimo ulepsze w transplantacji trzustki, zabieg ten wci jest

skomplikowany pod wzgldem chirurgicznym i charakteryzuje si znacznym

ryzykiem komplikacji i powika oraz czsto koniecznoci ponownej operacji

w przypadku ich wystpienia. Dodatkowo, pacjenci po przeszczepie trzustki

wymagaj doywotniego przyjmowania lekw immunosupresyjnych,

zwikszajcych ryzyko nowotworzenia, wtrnych zakae czy zaburze ze

strony ukadu neurologicznego i pokarmowego. Co wicej, leki te nie zawsze

Karolina Gob 12

skutkuj, dlatego nawet pomimo ich stosowania moe doj do odrzucenia

przeszczepu, a wtedy koniecznoci staje si ponowny zabieg operacyjny [5].

1.4. Przeszczep wysp trzustkowych jako alternatywna metoda terapii

cukrzycy typu 1

1.4.1. Historia i obecny status przeszczepu wysp trzustkowych

Pomysy terapii cukrzycy typu 1 wyizolowanymi fragmentami trzustki,

ktre produkowayby w organimie chorego insulin pojawiy si ju pod koniec

lat 90-tych XIX wieku. W 1894 roku, brytyjski lekarz Watson Williams

wszczepi pod skr 15-latka, u ktrego wystpoway objawy ketoacydozy,

fragmenty z trzustki owcy. Kondycja chopca na kilka dni si poprawia, ale

ksenotransplant zosta odrzucony, a chopiec zmar wskutek infekcji i postpo-

wania choroby [6]. W 1924 roku z kolei, w czasopimie Lancet pojawio si

doniesienie o transplantacji fragmentw ludzkiej trzustki [7].

Krtko po tym, jak potwierdzono, e to wanie wyspy Langerhansa s tymi,

w ktrych produkowana jest insulina, rozpoczto prby ich izolacji. Jednym z

pionierw tej technologii by polski lekarz patolog Profesor Moskalewski,

ktry w roku 1965, zaraz po doniesieniu o prbach dysekcji wysp trzustkowych

ssakw [8], opracowa metod enzymatycznej izolacji wysp trzustkowych z

trzustki winki morskiej [9]. Metod t rozwin Paul Lacy i jako pierwszy

dokona zakoczonego sukcesem przeszczepu wysp trzustkowych u szczura [10]

[11], nastpnie u map [12], co stopniowo przyczynio si do ugruntowania

potencjalnej skutecznoci izolacji i przeszczepiania wysp trzustkowych.

Metody opracowane przez Lacyego zostay zaadaptowane klinicznie przez

zesp Uniwersytetu w Minesocie i zaowocoway w 1977 roku pierwszym

raportem o przeszczepie wysp trzustkowych u czowieka przy jednoczesnej

poday azatiopryny i kortykosteroidw jako immunosupresji [13]. Pierwsze

doniesienie z kolei o tym, e pacjent cierpicy na cukrzyc typu 1 nie wymaga

terapii egzogenn insulin po przeszczepie wysp trzustkowych pochodzi z roku

1980 [14]. Pomimo pierwszych nielicznych sukcesw uzyskania inuslino-

niezalenoci po przeszczepie wysp trzustkowych, raport Midzynarodowego

Rejestru Przeszczepw Wysp z 1999 roku podawa, e spord 267 trans-

plantacji przeprowadzonych od roku 1990, mniej ni 10% biorcw uzyskao

insulinoniezaleno trwajc duej ni 1 rok [15].

Przeom nastpi w 2000 roku po opublikowaniu przez grup z Edmonton

raportu, w ktrym siedmiu pacjentw w okresie do roku po przeszczepie wysp

trzustkowych nie wymagao podawania insuliny [16]. Rnice pomidzy

poprzednimi metodami izolacji i przeszczepu wysp trzustkowych, a opisanymi

wedug tzw. Protokou Edmonton polegay gwnie na zastosowaniu wikszej

iloci wyizolowanych wysp (pochodzcych od rnych dawcw i podanych w 2-

13 Wprowadzenie

3 odlegych w czasie infuzjach) oraz zmianie protokou terapii immuno-

supresyjnej i rezygnacji z dziaajcych diabetogennie glikokortykoidw na rzecz

daklizumabu (monoklonalne przeciwciao anty-CD25), nowo wprowadzonego

do transplantacji sirolimusu (rapamycyna, inhibitor kinazy mTOR) oraz niskich

dawek takrolimusu (inhibiotr kalcyneuryny) [16].

Pomimo znaczego ulepszenia metody transplantacji wysp trzustkowych,

dugofalowe obserwacje wykazay, e wci mniej ni 10% spord 65

pacjentw, ktrzy otrzymali przeszczepy wysp trzustkowych w orodku

Edmonton utrzymao insulinoniezaleno przez 5 lat po ostatnim przeszczepie.

Jednake, u 80% pacjentw odnotowano obecno C-peptydu, wiadczc o

produkcji endogennej insuliny, a tym samym o zachowaniu funkcji pewnej iloci

przeszczepionych wysp, co z kolei przyczynia si do lepszej kontroli poziomu

glukozy we krwi i wyeliminowania napadw hipoglikemii [17]. Podobne wyniki

uzyskao 9 midzynarodowych orodkw badawczych, ktre wsplnie

stosoway Protok Edmonton. To znaczy, tylko 14% pacjentw spord 36

po przeszczepie wysp trzustkowych pozostao insulinoniezalenych w 2 lata po

przeszczepie, ale u wikszoci pacjentw odnotowano obecno C-peptydu i

obnienie poziomu glikowanej hemoglobiny (HbA1C), co wiadczy o poprawie

kontroli glikemii po przeszczepie wysp [18].

W 1999 roku przy wsparciu JDRF (Juvenile Diabetes Research Foundation)

zawizano Centralny Rejestr Przeszczepu Wysp (CITR; Collaborative Islet

Transplant Registry) w celu oceny oraz monitorowania bezpieczestwa i

rezultatw przeszczepw wysp trzustkowych. Najnowszy, smy raport tego

rejestru podsumowuje wyniki zebrane po przeprowadzeniu transplantacji u 864

pacjentw (686 pacjentw po transplantacji samych wysp i 178 z rwnoczesnym

przeszczepem nerki) w latach 1999-2012 w 37 centrach ze Stanw

Zjednoczonych, Australii i Europy.

W grupie faworyzowanej (pacjenci powyej 35 lat, z poziomem HbA1c

Karolina Gob 14

izolacji i transplantacji wysp trzustkowych oraz protokoy terapii immuno-

supresyjnej w ostatnich latach zostay znacznie udoskonalone.

1.4.2. Metoda izolacji wysp trzustkowych

Izolacja wysp trzustkowych to skomplikowany proces, wymagajcy

jednoczesnej pracy kilku technikw, ktry moe trwa nawet do 10 godzin.

Musi on si odbywa w specjalnych warunkach, zapewniajcych sterylno tak,

aby przygotowane wyspy, ktre maj trafi do pacjenta byy wolne od obecnoci

bakterii czy te bakteryjnej endotoksyny. Dlatego te izolacje wysp

trzustkowych odbywaj si w tzw. czystych laboratoriach (clean room), w

ktrych liczba zanieczyszcze, takich jak py, kurz, bakterie, spory bakteryjne

jest cile limitowana i systematycznie kontrolowana.

Sam proces izolacji wysp trzustkowych rozpoczyna si, gdy trzustka trafia

do laboratorium; przy czym laboratorium naley przed kad izolacj

odpowiednio przygotowa oraz sporzdzi wiee odczynniki, ktre bd

uywane podczas izolacji tak, aby sam proces przeprowadzi moliwie w jak

najkrtszym czasie. Jest to wane ze wzgldu na tzw. czas zimnego

niedokrwienia pobieranej trzustki (cold ischemia time). Powinien on by

moliwie jak najkrtszy, aby wyspy trzustkowe nie zostay nadtrawione przez

wydostajce si z komrek egzokrynnych enzymy trawienne lub zniszczone

wskutek braku odpowiedniej wymiany gazowej w niedokrwionym organie.

Podczas pierwszego etapu po transferze trzustki do czystego laboratorium,

organ jest oczyszczany z pozostaoci tkanki tuszczowej, naczy krwiononych,

czasami rwnie fragmentu dwunastnicy i ledziony. Nastpnie wykonuje si

kaniulacj przewodu trzustkowego jako przygotowanie do kolejnego etapu, czyli

perfuzji. Perfuzja polega na pompowaniu pod kontrolowanym cinieniem

enzymu kolagenazy przez przewd trzustkowy w celu wstpnego uwolnienia

wysp trzustkowych z tkanki rdpcherzykowej. Po tym etapie trzustka jest cita

na fragmenty o wielkoci okoo 1-2 cm, ktre trafiaj do tzw. komory

Ricordiego (Ricordi chamber), w ktrej nastpuje dynamiczny przepyw

enzymu kolagenazy w obiegu zamknitym. Naley podkreli, e dopiero na

tym etapie enzym jest podgrzewany do temperatury 36,6oC i tym samym ulega

aktywacji; uprzednie etapy wykonywane s w kontrolowanej niskiej

temperaturze tak, aby nie doszo do nadtrawienia wysp trzustkowych. W

komorze Ricordiego dochodzi do trawienia mechanicznego i enzymatycznego.

Podczas tego etapu co 1-2 minuty monitoruje si stopie trawienia, pobiera

prbki i pod mikroskopem, po wybarwieniu roztworem ditizonu (barwicym na

czerwono insulin), obserwuje si ilo uwolnionych wysp oraz ich jako. Na

tej podstawie decyduje si, w ktrym momencie przerwa trawienie. Okrelenie

odpowiedniego momentu, w ktrym naley to zrobi jest niezwykle wane

zbyt szybko przerwane trawienie bdzie skutkowa uzyskaniem wysp

trzustkowych nieoczyszczonych z tkanki egzogennej, a co za tym idzie zbyt

15 Wprowadzenie

du iloci tkanki, ktra nie moe zosta bezpiecznie przeszczepiona. Z kolei

zbyt pne przerwanie trawienia spowoduje nadtrawienie wysp trzustkowych, co

diametralnie wpywa na pogorszenie ich jakoci, a tym samym moe

dyskwalifikowa wyspy do przeszczepu. W momencie zatrzymania trawienia,

obniona zostaje temperatura w komorze Ricordiego, a strawiona tkanka jest

zbierana do duej objtoci poywki hodowlanej zawierajcej surowic, aby

zneutralizowa dziaanie enzymu. Kolejnym etapem jest oczyszczenie wysp

trzustkowych poprzez wirowanie w cigym gradiencie ste. Ten etap ma na

celu odseparowanie wysp trzustkowych od tkanki o funkcjach

zewntrzwydzielniczych. Uprzednio, zebrana podczas trawienia tkanka jest

kilkukrotnie pukana w celu usunicia pozostaoci kolagenazy. Podczas

wirowania w gradiencie zbierane s frakcje, ktre rni si midzy sob

czystoci, tj. proporcj wysp do tkanki egzokrynnej. Nastpnie szacuje si

procentow zawarto wysp trzustkowych w kadej z frakcji, a po zwirowaniu

ocenia si wielko uzyskanej tkanki w kadej z nich. Po ocenie, poszczeglne

frakcje czy si w nastpujce klasy czystoci: o wysokiej czystoci (> 59%

wysp trzustkowych), redniej czystoci (> 59-40% wysp trzustkowych) oraz

niskiej czystoci (39-31% wysp trzustkowych). Z kadej z klas czystoci

pobierane s prbki i obliczana jest ilo wysp wyraona przez tzw. ekwiwalent

wysp trzustkowych (islet equivalent quantity; IEQ). Na podstawie uzyskanego

IEQ, jakoci wyizolowanych wysp i iloci tkanki widocznej po zwirowaniu i

usuniciu nadsczu z kadej z frakcji ocenia si, czy wyspy mog zosta

przeszczepione danemu pacjentowi. Jako minimum zwykle przeszczepia si

5000 IEQ na kg masy ciaa pacjenta, ktre po zwirowaniu i usuniciu nadsczu

zajmuj objto nie wiksz ni 10 ml. Wyspy umieszcza si nastpnie w

poywce hodowlanej do czasu przygotowania pacjenta do przeszczepu i

rozpoczcia terapii immunosupresyjnej. Ze wzgldu na jako i przeywalno

wysp, istotnym elementem ich hodowli s czste zmiany poywki hodowlanej

(minimum co 12 h), majce na celu usunicie metabolitw uwolnianych podczas

procesu izolacji przez poddane stresowi wyspy.

W dniu przeszczepu, poszczeglne klasy czystoci wysp trzustkowych

zostaj kilkukrotnie przepukane. Zaznaczy trzeba, e unika si wirowania

wysp w celu zmniejszenia ryzyka ich uszkodzenia, a przy kadym etapie

pukania czeka si, a tkanka samoistnie ulegnie sedymentacji i dopiero wtedy

usuwa si nadscz. Kada z klas czystoci zostaje poddana badaniom

mikrobiologicznym na obecno bakterii Gram +/-. Nastpnie przygotowywany

jest produkt kocowy, ktry ma zosta podany pacjentowi. W tym celu wyspy z

poszczeglnych klas czystoci s zawieszane w 100 ml poywki do

transplantacji zawierajcej serum. Przed poczeniem, dokonuje si decyzji, jak

przygotowa produkt do transplantacji. Zwykle, wyspy podaje si w jednym

worku infuzyjnym. Jednak, gdy objto wysp o niskiej klasie czystoci jest

znaczna, nie czy si klas razem i przygotowywuje do infuzji w osobnych

Karolina Gob 16

workach. Pacjentowi podaje si w takim wypadku najpierw wyspy o wysokiej

klasie czystoci, a nastpnie o niskiej, monitorujc przy tym cinienie w yle

wrotnej, przez ktr wyspy s podawane. W przypadku, gdy cinienie ulegnie

znacznemu podwyszeniu, mona przerwa infuzj. Przygotowanie wysp

trzustkowych w dwch rnych workach infuzyjnych, gdy objto danej klasy

jest dua ma tak zalet, e zapewnia podanie przynajmniej czci produktu,

jeeli dojdzie do podniesienia cinienia w yle wrotnej.

Nastpnie pobiera si prbki do oceny jakoci produktu kocowego i jego

ewentualnej kwalifikacji do przeszczepu. Badania te obejmuj okrelenie

ywotnoci wysp trzustkowych, IEQ, zawartoci endotoksyny, sterylno

produktu (barwienie Gram +/-). Kocowy produkt zawierajcy wyspy

trzustkowe zawieszone w poywce suplementowanej heparyn, obliczon na

podstawie masy ciaa pacjenta, podawany jest przez y wrotn do wtroby

przez cewnik pod kontrol radiologiczn. Zabieg wykonywany jest w

znieczuleniu miejscowym.

1.4.3. Czynniki wpywajce na powodzenie izolacji i przeszczepu wysp

trzustkowych

Do powodzenia izolacji wysp trzustkowych i sukcesu klinicznego

przeszczepu wysp przyczynia si wiele czynnikw. Kady z etapw, poczwszy

od wyboru odpowiedniego dawcy trzustki, przez sposb pobrania organu i jego

transportu do laboratorium, izolacj wysp trzustkowych oraz ich hodowl przed

transplantacj jest niezywkle wany. Co wicej, aby w organizmie biorcy,

wyspy mogy spenia w peni swoj funkcj i skutecznie regulowa poziom

glukozy we krwi, przeszczepiona musi zosta ich odpowiednia liczba, ktra

najczciej wyraa si poprzez ilo IEQ podanych na kilogram masy ciaa

pacjenta. Do tego z kolei, aby przeszczepione wyspy mogy podj funkcj w

organizmie dawcy, konieczna jest skuteczna terapia immunosupresyjna, ktra

zapobiegnie odrzucaniu przeszczepu.

1.4.3.1. Ocena dawcy i jakoci trzustki

Ewaluacja i wybr odpowiedniego dawcy trzustki jest wany ze wzgldu na

fakt, e pozwala jeszcze przed pobraniem organu oceni, czy izolacja wysp z

trzustki od danego dawcy ma szans da odpowiedni ilo wysp do

przeszczepu, a tym samym unikn wydatkowania czasu, materiaw i rodkw

finansowych na nieskuteczn izolacj. Od samych pocztkw izolacji wysp

trzustkowych prbowano okreli parametry zarwno dotyczce dawcy, jak i

jakoci organu, ktre mogyby pomc w ocenie czy dany organ bdzie si

nadawa do izolacji wysp czy nie. Do najczstszych kryteriw branych pod

17 Wprowadzenie

uwag mona zaliczy: wiek dawcy, wskanik masy ciaa (BMI Body Mass

Index), przyczyn mierci, histori leczenia, dawk przyjtych lekw

wazopresyjnych, wyniki laboratoryjne okrelajce poziom kreatyniny,

bilirubiny, lipazy, amylazy, HbA1c, wstpny czas zimnego niedokrwienia

organu, wielko trzustki, zawarto tkanki tuszczowej, urazy organu, jako

pobrania oraz metod prezerwacji podczas transportu organu. W rnych

orodkach badano wpyw jednego lub kilku z tych czynnikw na powodzenie

izolacji wysp trzustkowych [2126], ale wnioski z tych bada s niejednokrotnie

sprzeczne, co moe by spowodowane ma iloci przenalizowanych izolacji w

pojedynczym orodku.

Orodek Edmonton w 2005 roku opracowa algorytm punktowy, ktry

pozwala na efektywn ocen czy izolacja wysp od danego dawcy ma szans na

powodzenie czy nie [27]. Wedug tego systemu branych jest pod uwag wiele

czynnikw i parametrw dawcy jak i organu, i przyznawane s punkty, zgodnie

z wag ich wpywu na powodzenie izolacji wysp. Trzustka od potencjalnego

dawcy oceniana jest w skali od 0 do 100. Grupa z Edmonton zaproponowaa, e

w przypadku wartoci >80 szansa na efektywn izolacj wysp wynosi ponad

50%. Natomiast, gdy dawca i organ oceniany jest na >90, szansa na izolacj, w

ktrej uzyska si znaczca ilo wysp dobrej jakoci, nadajcych si do

przeszczepu wynosi 100% [27].

System ten nadal jest walidowany w innych orodkach i oceniana jest jego

przydatno [2830].

1.4.3.2. Proces izolacji

Jak opisano powyej, proces izolacji wysp trzustkowych jest zoony i

kady z etapw jest istotny, aby mona byo uzyska wyspy w iloci i jakoci,

pozwalajcej na przeszczep.

Sam etap, w ktrym trzustka jest transportowana do laboratorium odgrywa

wan rol. Saba penetracja tlenu do tkanki naraa wyspy trzustkowe na

hipoksj i moe skutkowa zredukowan przeywalnoci izolowanych wysp.

Dlatego te opracowano metod konserwacji trzustki na granicy dwch pynw

roztworu UW (University of Wisconsin solution) oraz perfluorokarbonu, ktry

wspomaga transport tlenu do organu [31]. Wci jednak trwaj badania nad

ulepszeniem metody transportu, poprzez na przykad wykorzystanie urzdze do

wymiany gazowej [32] czy zastosowanie innych zwiazkw wspomagajcych

wymian tlenow [33].

Wybr waciwego enzymu trawicego podczas izolacji wysp trzustkowych

ma rwnie ogromne znaczenie. Enzym o zmniejszonej aktywnoci nie pozwoli

na uwolnienie wysp z tkanki zewntrzwydzielniczej, a zbyt dua aktywno

doprowadzi do fragmentacji izolowanych wysp. W rnych orodkach uywane

Karolina Gob 18

s rne enzymy: kolagenaza NB1 (Serva), Liberaza MTF (Roche), kolagenaza

CIzyme (VitaCyte) [3439], a kluczow rol odgrywa tu po prostu dowiad-

czenie danego orodka w uyciu poszczeglnego z enzymw.

Kolejny niezwykle istotny etap izolacji to wirowanie w gradiencie cigym,

aby oczyci wyspy trzustkowe z tkanki egzokrynnej. Stosowane s dwa rodzaje

gradientw: sporzdzony z roztworu UW i Biocollu o gstoci 1,1 g/ml

(Biochrom AG) lub w oparciu o uycie roztworu jodiksanolu (OptiPrep,

SigmaAldrich). Oba daj podobne wyniki, jeeli chodzi o ilo oczyszczonych

wysp, ale wykazano, e ten ostatni redukuje ilo uwalnianych cytokin i

chemokin, wpywajc na ywotno wyizolowanych wysp [4042].

1.4.3.3. Miejsce przeszczepu

Obecnie infuzji wysp trzustkowych dokonuje si zwykle przez y wrotn

do wtroby. Miejsce to, pomimo, e jest uwaane za optymalne, posiada swoje

wady. Wyspy trzustkowe naraone s tam na natychmiastow reakcj zapaln

poprzez kontakt ze skadnikami krwi. Szacuje si, e w wyniku tej reakcji

dochodzi do zniszczenia znacznej iloci przeszczepionych wysp w zaledwie

kilka godzin po przeszczepie [43]. Efekt ten mgby zosta wyeliminowany,

gdyby wyspy przeszczepiono w miejsce, gdzie nie ma bezporedniego kontaktu

z krwi. Alternatywne miejsca infuzji takie jak: ledziona, torebka nerki,

trzustka, jama otrzewnowa, grasica, szpik kostny, przestrze rdminiowa [44-

49] byy testowane z rnym rezultatem. Kade z tych miejsc posiada swoje

wady i zalety [50]. Najwikszym problemem we wszystkich tych potencjalnych

miejscach infuzji wysp trzustkowych jest stworzenie rodowiska, ktre

sprzyjaoby waskularyzacji wysp, a ktre jednoczenie byoby immunologicznie

uprzywilejowane [51]. Dlatego te badania pre-kliniczne i kliniczne nad

poszukiwaniem alternatywnych miejsc przeszczepu powinny by nadal

prowadzone, aby udao si okresli to najbardziej optymalne.

1.4.3.4. Wzbudzenie tolerancji i immunosupresja

Przeszczepione wyspy trzustkowe naraone s w organizmie biorcy na atak

ze strony niespecyficznej odpowiedzi immunologicznej, a take obecnej

wczeniej odpowiedzi autoimmunologicznej oraz indukowanej pojawieniem si

przeszczepu odpowiedzi allogenicznej. Dlatego te, zastosowanie odpo-

wiedniego protokou immunosupresji, ktry pozwoli na utrzymanie przeszczepu

i podjcie przez wyspy trzustkowe funkcji jest szczeglnie skomplikowanym

zagadnieniem. Dodatkowo, niektre z lekw immunosupresyjnych upoledzaj

funkcj komrek i maj dziaanie diabetogenne [52]. Duym przeomem w

immunosupresji podczas przeszczepu wysp trzustkowych bya rezygnacja ze

19 Wprowadzenie

szkodliwych steroidw wg protokou Edmonton na rzecz, daklizumabu,

sirolimusu oraz maych dawek takrolimusu [53]. Jednak, protok ten nie

pozwala wci na osignicie dugotrwaej insulinoniezalenosci przez

pacjentw po przeszczepie [17]. Dlatego te na przestrzeni ostatnich lat

poszukuje si i testuje nowe rodki biologiczne oraz strategie immunologiczne,

ktre pozwol na popraw wynikw transplantacji wysp trzustkowych.

W celu zapewnienia przeywalnoci i podjcia funkcji przez przeszczepione

wyspy trzustkowe stosuje si m.in. przeciwciaa monoklonalne, blokery

sygnaw ko-stymulacji, terapi antagonistami dla receptorw cytokin,

enkapsulacj, terapie komrkowe, regulujce odpowied immunologiczn, jak

rwnie leki hamujce aktywacj i/lub proliferacj limfocytw T [54].

Wspczenie stosowane strategie zapobiegajce odrzuceniu przeszczepu wysp

trzustkowych cz najczciej kilka terapii, majcych na celu wzbudzenie

tolerancji immunologicznej (np. globulina antytymocytarna, przeciwciao anty-

CD52 alemtuzumab, przeciwciao anty-CD3), zahamowanie odpowiedzi

zapalnej (np. przeciwciao anty-TNF-, blokery receptorw dla chemokiny

CXCL8), utrzymanie stanu immunosupresji (np. inhibitory kalcyneuryny,

blokery sygnaw kostymulacji, inhibitory szlaku kinazy mTOR (mammalian

target of rapamycin), MMF (mykofenolan mofetylu)).

Przeciwciao anty-CD25 wie si z podjednost receptora dla IL-2 na

aktywowanych limfocytach i hamuje w ten sposb ich dalsz proliferacj [55].

Na rynek wypuszczono dwa leki bdce monoklonalnymi przeciwciaami anty-

CD25: daklizumab (Zenapax, Roche) i basiliximab (Simulect, Novartis);

obecnie Zenapax jest wycofany z obrotu na obszarze Unii Europejskiej. Sukces

protokou Edmonton polegajcy na uzyskaniu przez pacjentw po przeszczepie

wysp trzustkowych insulinoniezalenoci, to w gwnej mierze zmiana immuno-

supresji z diabetogennych steroidw wanie na daklizumab w poczeniu z

tacrolimusem i sirolimusem [53]. Jednake, po 5 latach od transplantacji

wikszo pacjentw ponownie wymagaa podawania egzogennej insuliny, co

wiadczy o utracie funkcji przeszczepu [18]. Przeciwciao anty-CD25 dziaa na

limfocyty o wysokiej ekspresji receptora dla IL-2, czyli rwnie na limfocyty T

regulatorowe [56], a tym samym przyczynia si do blokowania naturalnych

mechanizmw regulacji odpowiedzi immunologicznej. Dodatkowo zaobserwo-

wano, e zastosowanie daklizumabu prowadzi do limfopenii z podwyszon

produkcj cytokin IL-7 i IL-15, ktre z kolei stymuluj proliferacj auto- i allo-

reaktywnych limfocytw T CD8+. W sytuacji, kiedy lek jednoczenie hamuje

proliferacj komrek Treg, zaczyna brakowa naturalnego mechanizmu

kontrolujcego dziaanie limfocytw T CD8+ [57,58]. W zwizku z powyszym

oraz z faktem, e w 2009 roku daklizumab zosta wycofany z rynku,

prowadzone s badania innych terapii immunosupresyjnych w przeszczepie

wysp trzustkowych.

Karolina Gob 20

Globulina antytymocytarna (ATG anti-thymocyte globulin) to

oczyszczona frakcja przeciwcia IgG z pozyskiwana surowicy zwierzt (krlika lub konia) immunizowanych ludzkimi limfocytami T lub tymocytami [59].

Dziaa ona na antygeny znajdujce si na powierzchni limfocytw T i prowadzi do ich niszczenia poprzez rne mechanizmy: aktywacj dopeniacza,

cytotoksyczno zalen od przeciwcia, indukcj apoptozy czy te wywoujc

zmiany w ekspresji receptorw chemokin na powierzchni limfocytw [60,61].

Globulina antytymocytarna jest dostpna jako lek immunosupresyjny od ponad

25 lat. Jednak zainteresowanie jej zastosowaniem w terapii indukcji tolerancji

wzroso w ostatnich latach, szczeglnie po odkryciu, e ma ona wpyw na

podwyszenie odsetka limfocytw T regulatorowych, ktre posiadaj

waciwoci immunosupresyjne [62,63]. Badania kliniczne, w ktrych

zastosowano ATG oraz daklizumab do indukcji tolerancji u biorcw wysp

trzustkowych wykazay, e wczenie tych lekw do protokou pozwala na

osignicie insulinoniezalenoci ju po jednej infuzji wysp nawet u 100%

pacjentw [64]. Podobne wyniki, przeprowadzone jednak na mniejszej grupie

pacjentw uzyskaa grupa, ktra w swoim protokole immunosupresji

zastosowaa ATG, inhibitor TNF- i IL-1 jako terapi hamujc odpowied

zapaln oraz MMF [40]. Dodatkowo, ATG jest obecnie testowana u pacjentw z

nowo zdiagnozowan cukrzyc typu 1 jako terapia zapobiegajca postpowi

choroby (ClinicalTrials.gov, NCT00515099) w ramach II fazy bada

klinicznych.

Przeciwciao anty-CD52 (alemtuzumab, Campath-1) CD52 jest antygenem wystpujcym na powierzchni wszystkich limfocytw [65]. W

zwizku z tym, alemtuzumab znalaz szerokie zastosowanie zarwno w terapii

biaaczek limfocytarnych i prolimfocytarnych, w chorobach o podou

autoimmunologicznym stwardnieniu rozsianym, reumatoidalnym zapaleniu

staww, jak i w transplantacji nerek. W transplantacji wysp trzustkowych

alemtuzumab wraz z takrolimusem i MMF by testowany przez grup Edmonton

po wycofaniu z rynku uywanego wczeniej do indukcji tolerancji w tym

orodku daklizumabu. Grupa ta odnotowaa wzrost odsetka pacjentw

insulinoniezalenych 5 lat po przeszczepie i osiagna podobne wyniki, jak w

przypadku transplantacji caej trzustki [66].

Przeciwciao anty-CD3 dziaa w sposb dwufazowy. W fazie pierwszej

prowadzi do spadku liczby limfocytw T, wykazujc dziaanie

immunosupresyjne, a nastpnie indukuje powstawanie komrek Treg, ktre

poprzez produkcj antyzapalnej IL-10 i TGF-b przeciwdziaaj reakcji zapalnej i

autoimmunologicznej. Badania pre-kliniczne na zwierztach wykazay, e

terapia anty-CD3 ma korzystne dziaanie w mysich modelach allo-transplantacji

oraz cukrzycy typu 1 [67,68]. Grupa z Uniwersytetu w Minesocie testowaa

przeciwciao anty-CD3 (teplizumab) w zestawieniu z sirolimusem i nisk dawk

takrolimusu w transplantacji wysp trzustkowych. Czterech z szeciu

przeszczepionych pacjentw nie wymagao podawania insuliny po przeszczepie.

21 Wprowadzenie

U czterech pacjentw insulinoniezalenych zanotowano istotny spadek liczby

komrek T CD4+ z rwnoczesnym wzrostem odsetka limfocytw Treg, co

sugeruje, e doszo do rozwoju rodowiska tolerogennego [69]. Nowsze badania,

w ktrych testowano teplizumab w poczeniu z przeciwciaami przeciwko

limfocytom T oraz inhibitorem TNF- pokazay potencjaln skuteczno takiej

terapii w przeszczepie wysp trzustkowych (uzyskanie insulinoniezalenoci)

[70]. Jak kada terapia immunosupresyjna, tak i zastosowanie przeciwciaa anty-

CD3 wie si z wystpowaniem efektw ubocznych, z ktrych najczciej

wystpujce to gorczka, ble gowy i mini, wysypka oraz wymioty.

Inhibitory TNF- TNF- jest cytokin, ktra peni wan funkcj w

procesach zapalnych i odpowiedzi immunologicznej poprzez m.in. indukcj

syntezy innych cytokin, produkcj przeciwcia przez limfocyty B, stymulacj

produkcji biaek ostrej fazy w wtrobie, indukcj apoptozy komrek

nowotworowych [71]. TNF- ma ponadto negatywny wpyw na funkcjonowanie

komrek , a efekt ten moe zosta zatrzymany poprzez zastosowanie inhibitora

TNF- [72]. Uudowodniono rwnie, e terapia przeciwciaami anty-TNF-

prowadzi do wzrostu odsetka komrek Treg we krwi obwodowej [73]. W

praktyce klinicznej stosowane s obecnie dwa leki hamujce dziaanie TNF-, tj.

etanercept oraz infliksymab. Etanercept by testowany w poczeniu z innymi

lekami jako terapia immunosupresyjna w przeszczepie wysp trzustkowych m.in.

na Uniwersytecie w Miami, w Minesocie i na Uniwersytecie Illinois [7476].

Pierwszym orodkiem, ktry osign obiecujce wyniki bya grupa w

Minesocie. Do indukcji tolerancji zastosowali oni etanercept poczony z

daklizumabem i ATG. Przeszczep otrzymao omiu pacjentw i aden z nich nie

wymaga podawania insuliny rok po przeszczepie wysp trzustkowych i nie

stwierdzono u nich niekontrolowanych napadw hipoglikemii [77].

Inhibitor IL-1 (anakinra) anakinra jest rekombinowanym biakiem,

antagonist ludzkiego receptora IL-1. Interleukina-1 jest cytokin prozapaln,

stymulujc odpowied immunologiczn. Co wicej, IL-1 niekorzystnie wpywa

na funkcj, proliferacj i ywotno komrek [78]. Badania kliniczne, w

ktrych wykorzystano blokery IL-1 i TNF- przy jednoczesnej terapii

takrolimusem i MMF w poczeniu z indukcj opart o zastosowanie ATG w

przeszczepie wysp trzustkowcyh, pokazay obiecujce wyniki [40]. Dodatkowo,

grupa ta, podczas oczyszczania wysp podczas wirowania w gradiencie cigym

wykorzystaa jodiksanol, ktry, jak ju wczeniej wspomniano, redukuje ilo

wydzielanych cytokin przez wyspy trzustkowe. Praca ta zatem wskazuje na

wany problem odpowiedzi zapalnej w odrzucaniu przeszczepu wysp

trzustkowych. Ograniczeniem w interpretacji tych wynikw jest maa liczba

pacjentw (n=3) poddanych transplantacji.

Inhibitor szlaku CXCL8 (reparixin) interleukina 8 (CXCL8) jest

chemokin, ktra czy si z receptorami CXCR1 i CXCR2 [79]. Wykazano, e

u biorcw wysp trzustkowych IL-8 odgrywa istotn rol w rekrutacji

Karolina Gob 22

neutrofilw oraz komrek NK (Natural Killer cells) do miejsca przeszczepu, co

nastpnie prowadzi do rozwoju odpowiedzi zapalnej. Na mysim modelu

syngenicznego oraz allogenicznego przeszczepu wysp trzustkowych

udowodniono, e blokada receptorw CXCR1 i CXCR2 wpywa na

przeywalno przeszczepu [80]. Inhibitor receptorw CXCR1/2 znany jest jako

lek reparixin (Dompe). Wyniki fazy II bada klinicznych, w ktrych testowano

wyej wymieniony lek w przeszczepie wysp trzustkowych (ClinicalTrials.gov,

NCT01220856) cznie z ATG, metylprednizolonem, MMF, takrolimusem i

rapamycyn wykazay, e pacjenci leczeni zgodnie z tym protokoem maj

lepsz kontrol glikemii, wyszy poziom C-peptydu i jednoczenie wymagaj

niszych dawek insuliny w porwnaniu z grup konroln [80]. Obecnie trwa III

faza bada klinicznych (ClinicalTrials.gov, NCT01817959), majca na celu

potwierdzenie koyci wynikajcych ze stosowania reparixinu w przeszczepie

wysp trzustkowych, w ktre zaangaowanych jest kilka instytucji na wiecie,

m.in. Uniwersytet w Chicago, Uniwersytet w Uppsali oraz Instytut San Raffaele

w Mediolanie.

Inhibitory kalcyneuryny (takrolimus, cyklosporyna) kalcyneuryna jest biakiem, uczestniczcym w szlaku aktywacji limfocytw T. Funkcja tego biaka

zostaa zidentyfikowana po odkryciu mechanizmw dziaania dwch lekw

immunosupresyjnych: cyklosporyny A (CsA) oraz takrolimusu (FK506) [81].

Leki te hamuj aktywacj i dalsz proliferacj limfocytw T poprzez inhibicj

syntezy m.in. IL-2, IL-3, IL-4, IFN- w tych komrkach [82,83]. Cyklosporyna

A bya testowana u osb z nowo zdiagnozowan cukrzyc typu 1.

Zaobserwowano, e proces niszczenia komrek by hamowany u pacjentw

poddanych terapii cyklosporyn, a pacjenci wymagali niszych dawek

egzogennej insuliny. Niemniej jednak efekt ten by krtkotrway, a lek

wykazywa silne dziaanie nefrotoksyczne [52,84].

Z kolei takrolimus w poczeniu z sirolimusem by stosowany np. we

wspomnianym wczeniej Protokole Edmonton [53]. Wykazano jednak

pniej, ze takrolimus ma dziaanie toksyczne wzgldem komrek oraz

podobnie do cyklosporyny, upoledza funkcj nerek [85]. Dodatkowo, hamuje

proces rewaskularyzacji wyizolowanych wysp trzustkowych [86]. Niemniej

jednak na podstawie sidmego raportu CIT, ktry podsumowuje wyniki

przeszczepw wysp trzustkowych, przy ktrych stosowano ATG, etanercept

oraz sirolimus i takrolimus, stwierdzono, e takrolimus i sirolimus podawane w

niskiej dawce, nie s toksyczne dla wysp trzustkowych [87].

Sirolimus (rapamycyna, inhibitor kinazy mTOR) rapamycyna jako

inhibitor kinazy mTOR hamuje aktywacj i proliferacj limfocytw T poprzez

blokowanie szlaku sygnalizacji zalenego od IL-2 [88]. W wikszoci proto-

kow immunosupresyjnych w przeszczepie wysp trzustkowych wykorzystuje

si sirolimus w poczeniu z takrolimusem lub MMF [66]. Z jednej strony,

rapamycyna korzystnie wpywa na funkcj limfocytw T regulatorowych [89-

92], a tym samym wspomaga naturalne mechanizmy immunosupresji w

23 Wprowadzenie

organizmie pacjenta, ale z drugiej strony upoledza funkcjonowanie wysp

trzustkowych, ich regeneracj i re-waskularyzacj [93-95]. Naley rwnie

doda, e z zastosowaniem rapamycyny wie si wiele efektw ubocznych

takich jak: leukopenia, trombocytopenia, anemia, hypercholesterolemia,

niestrawno, wystpowanie biegunek, wysypki skrnej, aft w jamie ustnej czy

zaburzenia cyklu menstruacyjnego u kobiet [18,94,96]. Terapia immuno-

supresyjna rapamycyn w przeszczepie wysp trzustkowych moe zatem

przynosi zarwno korzyci, jak i wywoywa skutki negatywne, a efekt ten

moe by rny w zalenoci od pacjenta. Z tego wzgldu rozwizaniem moe

tu by opracowanie terapii immunosupresyjnej, ktra bdzie dostosowana do

konkretnego, indywidualnego pacjenta [93].

Mykofenolan mofetylu (MMF, CellCept) w zwizku z wyej opisanymi faktami dotyczcymi toksycznoci wzgldem komrek oraz efektami

ubocznymi terapii takrolimusem i sirolimusem jako lekw do utrzymania stanu

immunosupresji, coraz czciej zamiast takiej terapii, stosuje si MMF. Lek ten

jest stosowany sam lub w poczeniu z niskimi dawkami takrolimusu czy

sirolimusu [50]. MMF blokuje szlak syntezy nukleotydw guaninowych,

hamujc w ten sposb syntez DNA. Komrkami szczeglnie wraliwymi na

MMF s limfocyty.[97]. Zastpienie takrolimusu przez MMF eliminuje efekt

niszczenia wysp, co jest szczeglnie wane w przypadku transplantacji maej

iloci IEQ na kg masy ciaa pacjenta. Dodatkowo MMF, w przeciwiestwie do

takrolimusu nie wykazuje efektw nefrotoksycznych. Skuteczno MMF przy

transplantacji minimalnej iloci wysp na kg masy ciaa potwierdziy badania

przeprowadzone na Uniwersytecie w Minesocie. Omiu pacjentw, u ktrych w

ramach protokou immunosupresyjnego w przeszczepie wysp trzustkowych

zastosowano ATG w poczeniu z daklizumabem i etanerceptem do indukcji

tolerancji i MMF wraz z sirolimusem do utrzymania immunosupresji nie

wymagao podawania insuliny i nie zaobserwowano u nich napadw

hipoglikemii. Piciu pacjentw z tej grupy pozostao insulinoniezalenych duej

ni rok po przeszczepie [77]. Negatywnym aspektem stosowania MMF w

przeszczepie wysp trzustkowych moe by fakt, e zwizek ten, jak

udowodniono, ma hamujcy wpyw na neogenez wysp przez blokowanie

proliferacji komrek prekursorowych [98].

Blokery kostymulacji aby naiwny limfocyt T zosta zaktywowany w

wyniku kontaktu ze swoistym antygenem prezentowanym w kontekcie MHC

(gwny ukad zgodnoci tkankowej Major Histocompatibility Complex)

niezbdne s dwa sygnay: pochodzcy z rozpoznania antygenu przez receptor

TCR (receptor limfocytw T T Cell Receptor) oraz drugi, pochodzcy z

receptorw ko-stymulacyjnych. Do przekazania sygnau kostymulacyjnego

niezbdna jest interakcja pomidzy receptorem CD28 na powierzchni limfocyta

T, a receptorem CD80 (B7.1) lub CD86 (B7.2) na powierzchni komrki

prezentujcej antygen (APC Antigen Presenting Cell) [99]. Limfocyty, po

Karolina Gob 24

pierwszym zetkniciu ze swoistym antygenem nabywaj take ekspresj

receptora CTLA-4 (antygen 4 zwizany z cytotoksycznymi limfocytami T

cytotoxic T cell antygen). Poczenie CTLA-4 z receptorem CD80 lub CD86 na

komrce APC prowadzi do zahamowania aktywnoci limfocyta, przy czym

ekspresja CTLA-4 jest proporcjonalna do siy sygnau z TCR [100]. Blokada

kostymulacji, prowadzca do zahamowania aktywacji i proliferacji limfocytw

stanowi atrakcyjn strategi immunosupresyjn. W transplantacji wysp trzustkowych prbowano wczy 3 rne blokery kostymulacji do protokow immunosupresyjnych: abatacept (biako fuzyjne bdce poczeniem fragmentu Fc ludzkiej immunoglobuliny IgG1 i zewntrzkomrkowej domeny CTLA-4), belatacept (druga generacja biaka fuzyjnego Fc IgG1 i CTLA-4) oraz efalizumab przeciwciao monoklonalne anty-LFA-1 (antygen 1 zwizany z funkcj limfocytw Lymphocyte Function-Associated Antigen 1) blokujce bezporedni kontakt komrek APC i limfocytw T podczas prezentacji antygenu [50,66]. Uniwersytet w San Francisco zanotowa obiecujce wyniki przeszczepu wysp trzustkowych stosujc belatacept lub efalizumab wraz z ATG i MMF lub sirolimusem. Wszyscy pacjenci (n=5), ktrym podawano immunosupresj opart o belatacept uzyskali insulinoniezaleno po jednym przeszczepie wysp. U jednego z pacjentw po 305 dniach od transplantacji, trzeba byo zastosowa insulin w obnionych dawkach, ale po drugim przeszczepie wysp trzustkowych uzyska ponownie insulinoniezaleno. Pacjenci po terapii efalizumabem (n=5) rwnie nie wymagali poday egzogennej insuliny przez ponad rok po przeszczepie, ale u dwch z nich do osigniecia tego rezultatu konieczne byy dwie transplantacje wysp. Dodatkowo, u adnego z pacjentw, ani po terapii belataceptem, ani efalizumabem nie zaobserwowano efektw ubocznych [101]. Efalizumab zosta wycofany z uytku klinicznego z powodu zanotowania przypadku postpujcej wieloogniskowej leukoencefalopatii po terapii tym lekiem, wic dugofalowe skutki stosowania nie s znane [66]. Jeeli chodzi o belatacept, to niedawno ukoczono badania kliniczne w ramach CIT (CIT-04), w ktrych zastosowano ten lek wraz z basiliximabem i MMF (ClinicalTrials.gov; NCT00468403). Wyniki tych bada nie zostay jeszcze podane.

1.4.4. W kierunku nowych metod indukcji tolerancji immunologicznej

w przeszczepie wysp trzustkowych

Jak opisano powyej, w transplantacji wysp trzustkowych obecnie testuje si wiele rnych terapii i kombinacji lekw chemicznych i biologicznych w celu zapewnienia ochrony przeszczepu. adna z tych terapii jednak nie jest stuprocentowo skuteczna. Co wicej, stosowaniu wielu lekw wie si z wystpowaniem szeregu skutkw ubocznych. Komplikacje wynikajce z terapii immunosupresyjnej i jej niecakowita skuteczno s wanymi czynnikami,

25 Wprowadzenie

ktre nie pozwalaj na stosowanie przeszczepu wysp trzustkowych jako

rytynowej metody leczenia okrelonej grupy pacjentw z cukrzyc typu 1.

Dlatego te wci trwaj poszukiwania innych strategii, ktre zapewni ochron

przeszczepionych wysp trzustkowych na poziomie allo- i autogenicznym.

1.4.4.1. Enkapsulacja wysp trzustkowych

Jedn ze strategii ochrony przeszczepianych wysp trzustkowych przed

atakiem ze strony ukadu immunologicznego biorcy jest mechaniczna izolacja.

Pojedyncze wyspy trzustkowe mog by opaszczone rnego rodzaju

materiaami zarwno syntetycznymi, jak i biologicznymi (mikroenkapsulacja)

lub przeszczepiane wyspy mog by razem umieszczone w sztucznym

urzdzeniu (makroenkapsulacja) [50]. Enkapsulacja ma na celu stworzenie

bariery nieprzepuszczalnej dla przeciwcia i komrek, aby ochroni przeszczep

przed atakiem ze strony ukadu immunologicznego, a jednoczenie umoliwi

przepyw maych czsteczek takich jak insulina i glukoza, aby przeszczepione

wyspy miay zapewnion odpowiedni wymian tlenow i dostp do skadnikw

odywczych. Przy wyborze odpowiedniego materiau do enkapsulacji naley

wzi pod uwag zrealizowanie powyszych celw, a przy tym naley rwnie

rozway takie czynniki jak: miejsce transplantacji, metod enkapsulacji,

zachowanie funkcji wysp, wytrzymao materiau, jego czysto oraz powta-

rzalno metody [102]. Dlatego te testowano rne materiay pochodzenia

biologicznego, jak: kolagen, hialuronian, fibryna, alginian, agaroza i chitosan

oraz syntetycznego, jak: kwas poliakrylamidowy, tlenek polietylenu, alkohol

poliwinylowy, polifosfazeny, polipeptydy i ich pochodne [103] na rnych

modelach zwierzcych, m.in. na myszach NOD (Non-Obese Diabetic mice),

szczurach Wistar i Lewis, psach, koniach i ssakach naczelnych. Cz metod

enkapsulacji testowanych z sukcesem na gryzoniach okazao si by

nieskutecznych w badaniach na wikszych zwierztach [104]. Midzy innymi

dlatego te bada klinicznych wykorzystujcych metod enkapsulacji

przeszczepianych wysp przeprowadzono niewiele. Pierwsz prb

przeszczepienia wysp trzustkowych opaszczonych otoczk alginianow

przeprowadzono w 1994 roku. Pacjentowi podano wyspy w dwch infuzjach

(pierwsza: 10 000 IEQ/kg, druga po p roku: 5 000 IEQ/kg). Po drugiej dawce

wysp pacjent wymaga podawania jedynie 1-2 jednostek insuliny dziennie

(przed transplantacj uywa 40-50 jednostek), a po 9 miesicach osign

insulinoniezaleno [105]. Ograniczeniem w interpretacji, czy przeszczepione

wyspy trzustkowe nie zostay odrzucone dziki enkapsulacji jest fakt, e pacjent

otrzymywa ju leki immunosupresyjne w zwizku z wczeniejszym

przeszczepem nerki. W 1994 roku przeprowadzono jeszcze jedno badanie

kliniczne, w ktrym podskrnie przeszczepiono wyspy trzustkowe po uprzedniej

makroenkapsulacji, tj. po zamkniciu wysp w specjalnym urzdzeniu

Karolina Gob 26

zbudowanym z wknika. Z powodu maej iloci przeszczepionych wysp (150-

200 IEQ) nie uzyskano znacznej poprawy metabolizmu glukozy u adnego z

pacjentw, ale po usuniciu urzdzenia od pacjentw, udowodniono, e wyspy zachoway ywotno i funkcj [106]. Kilka lat pniej przeprowadzono pierwsze badania kliniczne, w ktrym czowiekowi podano podskrnie wiskie wyspy trzustkowe zamknite wraz z komrkami Sertoliego w urzdzeniu wykonanym z kolagenu. U adnego z pacjentw (n=12) nie zaobserwowano komplikacji wynikajcych z ksenotransplanatcji. U poowy pacjentw zanotowano obnienie zapotrzebowania na egzogenn insulin po przeszczepie, utrzymujc si do 4 lat, a dwch pacjentw uzyskao insulinoniezaleno na kilka miesicy. Co wicej, kiedy po 3 latach u jednego z pacjentw poddanych terapii skontrolowano przeszczepione urzdzenie, stwierdzono w nim nadal obecno funkcjonalnych komrek [107]. Przeszczep opaszczonych obcogatunkowych wysp testowano jeszcze kilkukrotnie gwnie w badaniach klinicznych przeprowadzonych przez firm Living Cell Technologies Ltd. Spotkay si one jednak z krytyk, szczeglnie z powodu braku wynikw wskazujcych na produkowanie insuliny przez przeszczepione do jamy otrzewnej wyspy trzustkowe wyizolowane od win [103]. Wyniki bada z ostatnich lat, w ktrych przeszczepiano ludzkie wyspy po enkapsulacji nie daj rwnie zbyt zachcajcych wynikw, ale wskazuj na bezpieczestwo tej metody oraz, e opaszczanie ma potencja blokowania niszczenia przeszczepu przez ukad immunologiczny biorcy. W 2006 roku opublikowano rezultaty badania, w ktrym dwch chorych z cukrzyc typu 1 otrzymao wyspy poddane mikroenkapsulacji z zastosowaniem mikrosfer alginianowych. W obu

przypadkach zanotowano obnienie poziomu glukozy na czczo i redukcj zapotrzebowania na egzogenn insulin. aden z pacjentw nie uzyska jednak insulinoniezalenoci [108]. Rezultaty kolejnego badania, w ktrym 4 chorych otrzymao wyspy opaszczone alginianem baru byy jeszcze mniej satysfakcjonujce. U adnego z pacjentw nie zaobserwowano poprawy metabolizmu glukozy, jak rwnie nie wykryto C-peptydu, ktry wskazywaby na podjcie funkcji przez przeszczepione wyspy. Po 16 miesicach wykryto, e wyspy opaszczone alginianem zostay w organizmie pacjentw otoczone tkank wknist i ulegy nekrozie [109]. Nowsze wyniki bada z dootrzewnow transplantacj wysp mikroenkapsulowanych w algninianie sodu potwierdzaj, e metoda ta jest bezpieczna i skutecznie chroni przed rozwojem specyficznych

przeciwcia przeciwko przeszczepowi. U biorcw (n=4) stwierdzono obecno C-peptydu, spadek poziomu glukozy na czczo i HbA1c oraz redukcj zapotrzebowania na egzogenn insulin. Jeden z pacjentw uzyska okresow insulinoniezaleno [110].

Wyniki przeprowadzonych bada daj nadziej, e enkapsulacja moe by potencjaln metod ochrony przeszczepianych wysp przed odrzuceniem bez koniecznoci przyjmowania lekw immunosupresyjnych. Jednake, badania te rni si znacznie, jeeli chodzi o metod enkapsulacji, ilo przeszczepionych

27 Wprowadzenie

wysp oraz stan pacjentw. Dlatego trudno wycigna jednoznaczne wnioski, czy

metoda ta ma rzeczywicie szans zastpi dotychczasowe terapie

immunosupresyjne stosowane w przeszczepie wysp trzustkowych.

1.4.4.2. Immunomodulacja w oparciu o komrki macierzyste

Komrki macierzyste s komrkami o zdolnociach do samoodnawiania si

przez podziay komrkowe i rnicowania si w dojrzae, wyspecjalizowane

komrki [111]. W terapii cukrzycy typu 1 ich potencja moe znale

zastosowanie w strategiach regeneracji komrek . Dodatkowo udowodniono, e

niektre rodzaje komrek macierzystych posiadaj waciwoci

immunomodulacyjne, co moe by wykorzystane z kolei do hamowania

destrukcji komrek i do indukcji rodowiska tolerogennego w przeszczepie

wysp trzustkowych [112114]. Co wicej, komrki macierzyste wspomagaj

rewaskularyzacj i proces angiogenezy, co byoby dodatkowym atutem ich

zastosowania w transplantacji wysp trzustkowych [115]. W terapii cukrzycy

typu 1 prbowano uy autologicznych hematopoetycznych komrek

macierzystych (HSCs Hematopoietic Stem Cells). Celem tej terapii nie bya

regeneracja wysp trzustkowych, lecz odnowienie ukadu immunologicznego

pacjentw. Chorzy zakwalifikowani do leczenia otrzymywali najpierw leki

mobilizujce HSCs ze szpiku do krwi obwodowej. Nastpnie komrki te byy

kolekcjonowane podczas leukaferezy i mroone. W kolejnym etapie pacjenci

otrzymywali chemioterapi niemieloablacyjn, ktrej zadaniem byo zniszczenie

autoreaktywnych limfocytw, po czym podawano im wasne, uprzednio zebrane

i zamroone HSCs w celu regeneracji ukadu immunologicznego [116,117]. Po

takiej terapii okoo 66% pacjentw uzyskao okresow insulinoniezaleno,

ktra trwaa nawet 4 lata. Wyniki rnych orodkw, w ktrych prowadzona jest

ta terapia wskazuj, e przeszczep autologicznych HSCs chroni komrki

trzustki przed reakcj autoimmunologiczn (podwyszony poziom C-peptydu,

nisze wartoci HbA1c i spadek zapotrzebowania na egzogenn insulin w

porwnaniu z wynikami sprzed terapii) [116-118]. Niemniej jednak, metoda ta

nie jest skuteczna u wszystkich chorych, a leki immunosupresyjne stosowane

podczas chemioterapii stanowi realne zagroenie dla ycia pacjenta (1

przypadek miertelny), poza tym mog prowadzi do trwaej niepodnoci.

W transplantacji wysp trzustkowych zastosowano natomiast allogeniczne

HSCs do wzbudzenia chimeryzmu mieszanego, czyli sytuacji, w ktrej w szpiku

kostnym i krwi obwodowej biorcy obecne s zarwno jego wasne komrki, jak

rwnie komrki pochodzce od dawcy [119]. Celem takiego dziaania jest

indukcja tolerancji immunologicznej [120]. Badania kliniczne przeprowadzone

w orodku w Miami, w USA, gdzie biorcy wysp trzustkowych otrzymali

allogeniczne HSCs wraz z terapi immunosupresyjn opart o alemtuzumab nie

potwierdziy jednak skutecznoci tego podejcia. Nie uzyskano bowiem

Karolina Gob 28

chimeryzmu hematopoetycznego, a tym samym nie udao si zapobiec

odrzuceniu przeszczepu [121]. Obecnie prowadzi si szereg bada pre-

klinicznych na modelach zwierzcych w celu wytworzenia chimeryzmu mieszanego, a tym samym stworzenia rodowiska tolerogennego w organizmie

biorcy. Stosowane obecnie strategie, poza komrkami macierzystymi biorcy

wczaj do protokou terapii rwnie leki takie, jak np. przeciwciao monoklonalne anty-CD154 lub anty-CD3/CD8, co ma na celu uzyskanie

wikszego i bardziej i trwaego chimeryzmu mieszanego [122]. Mwic o komrkach macierzytych w terapii cukrzcy naley rwnie

wspomnie o mezenchymalnych komrkach macierzystych (MSCs Mesen-

chymal Stem Cells), ktre posiadaj funkcje pro-angiogenne i

immunomodulacyjne, predysponujce je do zastosowania take w przeszczepie

wysp trzustkowych. MSCs maj zdolno hamowania proliferacji limfocytw T

i B oraz komrek NK; wpywaj na aktywno komrek dendrytycznych oraz

indukuj proliferacj limfocytw T regulatorowych [114, 123]. Dodatkowo,

komrki te wydzielaj cytokiny przeciwzapalne i o dziaaniu

immunosupresyjnym, oraz produkuj czynniki pro-angiogenne [124126]. Maj

one zatem zdolno hamowania reakcji zapalnej, sprzyjaj regeneracji komrek

, inhibicji odpowiedzi immunologicznej zarwno o podou allo-, jak i

autogenicznym, a badania prekliniczne na modelach zwierzcych potwierdziy,

e terapia MSCs poprawia skuteczno przeszczepu wysp trzustkowych [122].

Obecnie prowadzone s badania kliniczne majce na celu potwierdzenie

bezpieczestwa ko-transplantacji wysp trzustkowych z MSCs jako terapii

cukrzycy typu 1 (ClinicalTrials.gov; NCT00646724).

Najnowsze wyniki bada dotyczcych waciwoci immunomodulacyjnych i

regeneracyjnych komrek macierzystych skaniaj ku optymistycznemu

postrzeganiu wykorzystania tego typu terapii w przeszczepie wysp

trzustkowych. Koniecznym jest jednak potwierdzenie bezpieczestwa takiego

leczenia, ewentualnych skutkw ubocznych, okrelenie skutecznej dawki i

opracowanie jednoznacznych, efektywnych protokow izolacji i namnaania

komrek macierzystych.

1.4.4.3. Indukcja tolerancji przez komrki T regulatorowe (Tregs)

Komrki T regulatorowe (Tregs T regulatory cells) stanowi wany

komponent ukadu odpornociowego, ktry nie bierze bezporednio udziau w

ochronie organizmu przed potencjalnie szkodliwymi czynnikami obcymi, ale

ktry chroni przed rozwojem nadmiernej reakcji immunologicznej, mogcej

doprowadzi do zniszczenia wasnych tkanek organizmu [127130]. Dlatego te

ich obecnoc i wzmoona aktywno jest podana w chorobach o podou

autoimmunologicznym, jak rwnie u biorcw narzdw, poniewa hamuj one

zarwno reakcje auto- jak i allogeniczne, indukujc tolerancj wasnych i

obcych tkanek [131].

29 Wprowadzenie

Pierwsze spekulacje na temat istnienia limfocytw supresorowych, ktre

poprzez inhibicj aktywnoci limfocytw efektorowych reguluj odpowied

immunologiczn, pojawiy si we wczesnych latach 70. XX wieku [132-134].

Jednak w zwizku z tym, e nie dao si scharakteryzowa i okreli ich

specyficznych markerw, hipotez o istnieniu limfocytw supresorowych

podawano przez lata w wtpliwo [135]. Dopiero w poowie lat 90. XX wieku

Sakaguchi potwierdzi, e grupa komrek o fenotypie CD4+CD25+ peni wan

rol w immunoregulacji, a ich usunicie prowadzi do rozwoju schorze

autoimmunologicznych [136]. Co wicej, odkrycie markera transkrypcyjnego

FoxP3, specyficznego dla komrek Treg ugruntowao pogld o komrkach T

regulatorowych [137139]. Poziom ekspresji FoxP3 w komrkach Treg koreluje

z ich supresyjn aktywnoci [140], a brak tego markera jest opdowiedzialny za

rozwj wielonarzdowych schorze autoimmunologicznych, co wida wyranie

w przypadku szczepu myszy scurfy oraz u osb ze sprzonym z chromosomem

X zespoem dysregualcji immunologicznej, poliendokrynopatii i enteropatii

(IPEX Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked

Syndrome) [141143].

Komrki T regulatorowe stanowi kilka procent, zwykle mniej ni 10%

wszystkich limfocytw T CD4+ we krwi obwodowej [144] Komrki Treg s

populacj heterognn. Mona wrd nich wyrni: naturalne komrki Treg

(nTregs) i indukowane (iTregs). Pierwsze z nich s generowane w grasicy

nTregs [145], a drugie w obwodowych narzdach limfatycznych pod wpywem

kontaktu z antygenem prezentowanym przez komrki APC w odpowiednim

rodowisku cytokinowym [146]. Rni si one rwnie pod wzgldem

ekspresji markerw powierzchniowych. nTregs posiadaj ekspresj czynnika

transkrypcyjnego Helios i FoxP3 oraz wysok ekspresj czsteczki CD25,

podczas gdy iTregs s Helios negatywne [131]. Niedawno wykazano rwnie

rnice epigenetyczne w obrbie genu FoxP3 pomidzy dwoma typami komrek

Treg. Okrelono mianowicie, e nTregs wyrnia staa demetylacja

specyficznego regionu w obrbie locus genu foxp3 nazywanego TSDR (Treg-

specific-demethylated region) [147,148]. Obecnie trwaj badania nad

okreleniem dokadnych mechanizmw dziaania supresyjnego obydwu

populacji komrek Treg. Wiadomo, e obie populacje mog hamowa

aktywno efektorowych limfocytw T CD4+, T CD8+, B, komrek NK,

komrek dendrytycznych, makrofagw i neutrofilw [149,150]. Znanych jest

kilka mechanizmw supresorowych komrek Treg i prawdopodobnie s one

konsekwencj heterogennoci komorek, na ktre dziaaj limfocyty Treg, [151].

Mona do nich zaliczy: kompetytywn blokad sygnau kostymulacji przez

wizanie CTLA-4 do CD80 i 86, a nastpnie modulacj funkcji komrek

dendrytycznych poprzez interakcj CTLA-4-CD80/CD86, wydzielanie cytokin

immunosupresyjnych: IL-10, IL-35, syntez TGF- (zarwno w formie

sekrecyjnej, jak i zwizanej z bon komrkow), wydzielanie granzymu i

Karolina Gob 30

perforyny, inhibicj proliferacji limfocytw T poprzez bezporedni transfer

cyklicznego AMP (adenozynomonofosforan) do wntrza aktywowanych

limfocytw T CD4+ i T CD8+, konkurencj o IL-2 (mitogen limfocytw T),

indukcj IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) w komrkach APC, produkcj

biaka LAG3 (lymphocyte-activation gene 3), ktre hamuje proliferacj i

aktywacj limfocytw T w podobny sposb do CTLA-4 [150152].

Rola komrek Treg w tolerancji immunologicznej przeszczepw

allogenicznych staa si przedmiotem wielu bada [153155]. Wyniki uzyskane

na modelach zwierzcych wskazuj, e komrki Treg indukuj allotolerancj i w konsekwencji hamuj odrzucanie przeszczepu [156,157]. Skuteczno i

moliwo szerokiego zastosowania terapii komrkami Treg udowodniono

rwnie na modelach zwierzcych choroby przeszczep przeciw gospodarzowi

GvHD (Graft versus Host Disease) [158162] oraz schorze

autoimmunologicznych [163166]. W cigu ostatnich kilku lat bezpieczestwo

terapii komrkami Treg potwierdzono w kilku badaniach klinicznych, z czego

badania naszego zespou byy pierwszymi badaniami na wiecie, w ktrych

komrki Treg uyto z powodzeniem najpierw w terapii GvHD, a nastpnie w cukrzycy typu 1 [167169].

Badania na modelach zwierzcych udowodniy, e komrki Treg peni

wan rol w patogenezie cukrzycy typu 1. Usunicie komrek Treg u myszy

NOD powoduje gwatowny rozwj cukrzycy o podou autoimmunologicznym.

Z kolei podanie komrek Treg pozwala na zahamowanie postpu choroby [170

172]. Jednak informacje dotyczce roli komrek Treg w patogenezie cukrzycy

typu 1 u ludzi s niejednoznaczne. Cz opublikowanych do tej pory prac

wskazuje, e liczba tych komrek u chorych na cukrzyc typu 1 jest obniona,

cze, e jest podwyszona, a jeszcze inne donosz, e jest taka sama jak u osb

zdrowych, Sprzeczne s rwnie informacje na temat funkcjonalnoci komrek

Treg u tej grupy pacjentw [173]. Nie da si jednak tych wynikw obiektywnie

porwna, gdy rni si one pod wzgldem markerw, ktre brane byy pod

uwag w celu identyfikacji komrek Treg, a przede wszystkim badano chorych

w rnym czasie od pierwszej manifestacji cukrzycy, co niewtpliwie ma wpyw

na stan aktywacji i wyczerpania ukadu immunologicznego oraz samych

komrek Treg. Dodatkowo, wikszo bada dotyczyo limfocytw Treg we

krwi obwodowej, natomiast istotne z punktu widzenia patogenezy cukrzycy

zmiany mog dotyczy komrek Treg obecnych w wzach chonnych trzustki

[173,174]. Istnieje take pogld, e funkcja i liczba komrek Treg nie ulega

zmianie w cukrzycy typu 1, lecz problem stanowi komrki efektorowe, ktre

ulegaj hiperaktywacji i s odporne na mechanizmy supresorowe komrek Treg

[175,176]. Niemniej jednak, pierwsze badanie kliniczne z zastosowaniem

komrek Treg u dzieci ze wieo zdiagnozowan cukrzyc typu 1, ktre

przeprowadzi nasz zesp badawczy wskazuj, e terapia limfocytami Treg

chroni komrki b przed zniszczeniem na przestrzeni lat i znacznie poprawia

31 Wprowadzenie

kontrol glikemii [177,178]. Obecnie trwaj take badania kliniczne, w ktrych

komrki Treg podawane s dorosym (ClinicalTrials.gov; NCT01210664).

Badania prekliniczne i kliniczne dotyczce zastosowania komrek Treg w

przeszczepach allogenicznych i w schorzeniach o podou auto-immunologicznym pozwalaj stwierdzi, e terapia ta moe przynie

szczeglne korzyci w transplantacji wysp trzustkowych. Wynika to z faktu, e

komrki Treg maj zdolno hamowania nie tylko odpowiedzi na allogeniczny

przeszczep, jakim s wyspy pochodzce od dawcy, ale maj te zdolno

hamowania mechanizmw, ktre wczeniej doprowadziy do zniszczenia

wasnych komrek b pacjenta. Pierwsze badania prekliniczne na

humanizowanych modelach mysich przeszczepu wysp trzustkowych

udowodniy, e ludzkie komrki Treg mog by skutecznym narzdziem w

indukcji tolerancji immunologicznej i przyczyni si do eliminacji lub

zmniejszenia dawki stosowanych do tej pory lekw immunosupresyjnych, ktre,

jak to zostao omwione powyej, powoduj szereg skutkw ubocznych

[179,180]. Majc na wzgldzie obecny stan wiedzy i prace przygotowawcze

wielu zespow, naley si spodziewa, e pierwsze badania kliniczne, w

ktrych komrki Treg zostan podane pacjentom po przeszczepie wysp

trzustkowych zostan wkrtce zainicjowane. Aby zwikszy szans powodzenia

takiej terapii, obie metody, zarwno izolacji i transplantacji wysp trzustkowych,

jak i ekspansji komorek Treg wymagaj optymalizacji do warunkw klinicznych

i okrelenia czynnikw, ktre mog poprawi ich skuteczno.

Karolina Gob 32

2. CELE PRACY

Celem pracy byo opracowanie i optymalizacja nowej terapii

komrkowej w cukrzycy typu 1 w oparciu o przeszczep wysp trzustkowych z zastosowaniem komrek T regulatorowych do indukcji tolerancji immunologicznej.

Zadanie to realizowano poprzez:

optymalizacj wyboru dawcy trzustki w celu poprawy wydajnoci izolacji wysp trzustkowych - okrelenie nowego czynnika selekcji dawcy

modyfikacj protokou ekspansji komrek Treg zgodn z warunkami dobrej praktyki laboratoryjnej (Good Laboratory Practice; GLP) - dobr

poywki hodowlanej

dobr metody krioprezerwacji komrek Treg, ktra mogaby zosta wykorzystana do celw klinicznych

analiz wpywu wybranych lekw immunosupresyjnych stosowanych w przeszczepie wysp trzustkowych na komrki Treg

opracowanie metody lokalnej immunoprotekcji wysp trzustkowych z wykorzystaniem komrek Treg

Najwaniejsze spostrzeenia z prezentowanych prac 33

3. NAJWANIEJSZE SPOSTRZEENIA Z PREZENTOWANYCH PRAC WCHODZCYCH W SKAD ROZPRAWY DOKTORSKIEJ

3.1. Wzrost dawcy trzustki jako dodatkowy czynnik przy wyborze

odpowiedniego dawcy, wpywajacy na powodzenie izolacji wysp trzustkowych

Wang LJ., Cochet O., Wang XJ., Krzystyniak A., Misawa R., Golab K., Tibudan M.,

Grose R., Savari O., Millis JM., Witkowski P. Donor height in combination with islet

donor score improves pancreas donor selection for pancreatic islet isolation and

transplantation. Transplant Proc. 2014, 46, 6, 1972-1974.

Na powodzenie izolacji i transplantacji wysp trzustkowych wpywa szereg

czynnikw i kady etap, zarwno izolacji, jak i transplantacji ma tu znaczenie.

Ju sam wybr odpowiedniego organu, z ktrego zostan wyizolowane wyspy jest niezmiernie wany. Pozwala bowiem unikn nieskutecznych izolacji,

zakoczonych uzyskaniem niewystarczajcej iloci wysp dobrej jakoci, nie

pozwalajcych na transplantacj, a tym samym zaoszczdzi nakady finansowe,

materiay i czas.

Od pocztku ery izolacji ludzkich wysp trzustkowych prbowano okreli

czynniki wpywajce na jej powodzenie, a zwaszcza parametry, ktre

pozwoliyby oceni czy uycie danego organu moe da podan ilo wysp

dobrej jakoci [24,30,181185]. W 2005 roku orodek w Edmonton

zaproponowa kompleksowy system punktowej oceny potencjalnego dawcy

IDS (Islet Donor Score), majcy na celu popraw selekcji organw, ktre mog

zapewni izolacj trzustkow zakoczon sukcesem [27]. System ten bierze pod

uwag wiele czynnikw i przyznaje punkty w zalenoci od wagi znaczenia

danego czynnika. S to midzy innymi: wiek, BMI, wyniki bada

morfologicznych krwi, historia leczenia, przyczyna mierci dawcy, metoda

pobrania organu oraz czas zimnego niedokrwienia [27].

Nasz zesp badawczy zaproponowa dodanie wzrostu dawcy jako

niezalenego czynnika, ktry wraz z analiz IDS pozwoli na wybr

odpowiedniego dawcy trzustki, aby zapewni skuteczn izolacj wysp.

Przeanalizowalismy 22 izolacje wysp trzustkowych dokonane w naszym

orodku w latach 2011-2012. Parametry dawcy zostay zebrane na podstawie

danych umieszczonych w sieci UNOS (United Network for Organ Sharing).

Wyniki IDS zostay zanalizowane wedug tabeli udostpnionej przez Zesp

Izolacji Wysp Trzustkowych z Uniwersytetu Alberta, Edmonton, Kanada.

Karolina Gob 34

Tabela 1. Punktowa ocena dawcy trzustki IDS (Islet Donor Score) na podstawie

systemu opracowanego przez zesp z Uniwersytetu Alberta, Edmonton, Kanada [27].

PARAMETR PUNKTY

(max) PUNKTY W ZALENOCI OD PARAMETRU

Wiek (lata) 20 65

15 15 15 20 10 5

BMI (kg/m2) 15

35

5 10 12 15 12

Czas zimnego

niedokrwienia -

CIT (godziny)

15

< 3 3 - 8 8.1 - 12 > 12

12.5 15 10 5

Wyniki badania

krwi* 5

w normie

markery specyficzne

poza

norm**

inne markery

poza

norm***

markery

specyficzne

i inne markery

poza norm

5 2 4 0

Historia leczenia 5 brak

zatrzymanie

akcji serca

naduywanie

alkoholu

nadcinienie

ttnicze

5 -15 3 -10

Pobyt w szpitalu

(dni) 5

< 2 2-4 5 - 7 >8 dni

5 3 2 0

Leki

wazopresyjne

(liczba uytych) 5

0 1 2 3

5 3 0 -5

Przyczyna zgonu 20

anoksja

(niedotlenienie krwi)

obraenia

ciaa z

urazami jamy

brzusznej

obraenia

ciaa bez

urazw jamy

brzusznej

zdarzenie

naczyniowo-mzgowe

0 8 10 20

Zesp pobierajcy organ

10

wasny inny ni

wasny

10 5

Suma (OCENA) 100

* wartoci prawidowe wedug lokalnych standardw ** markery specyficzne to: poziom glukozy, amylazy, lipazy. Wartoci poza norm w

stanie Illinois, USA: glukoza >200 mg/dl (lub >11,1 mmol/l); amylaza >200 U/l; lipaza

>190 U/l

*** inne markery to: AST (aminotransferaza asparaginowa), ALT (aminotransferaza

alaninowa), kreatynina, BUN (azot mocznika we krwi Blood Urea Nitrogen). Wartoci

Najwaniejsze spostrzeenia z prezentowanych prac

35

poza norm w stanie Illinois, USA: AST >40 IU/l; ALT >50 IU/l; kreatynina

>1.38 mg/dl; BUN >24 mg/l.

Na podstawie 22 przeprowadzonych przez nas izolacji zestawilimy

informacje dotyczce iloci uzyskanych wysp wyraone przez IEQ z wag trzustki, faktem czy wyspy zostay zakwalifikowane do przeszczepu w oparciu o IDS, jak rwnie wczylimy do analizy wzrost kadego dawcy trzustki. Do okrelenia zalenoci pomidzy wymienionymi danymi w analizie statystycznej posuono si wspczynnikiem korelacji Pearsona.

Podczas wszystkich izolacji wysp trzustkowych, do ktrych uyto trzustek od dawcw z IDS wikszym ni 80 uzyskano wicej ni 300 000 IEQ. 80% (4/5) wysp trzustkowych wyizolowanych od tych dawcw zostao przeszczepionych. Wszyscy dawcy w tej grupie charakteryzowali si wzrostem 179 3 cm. Gdy IDS byo mniejsze ni 80, tylko w 17% przypadkw (3/17) udao si uzyska wicej ni 300 000 IEQ. Wszystkie trzy izolacje zakoczone zostay transplantacj. W tych trzech przypadkach, pomimo IDS 175 cm. Analiza statystyczna zebranych przez nas danych pozwolia stwierdzi, ze wzrost dawcy jest niezalenym parametrem, ktry koreluje z wag trzustki, IDS oraz uzyskan iloci wysp wyraon w IEQ przed- oraz po oczyszczeniu wysp na gradiencie ciagym.

Tabela 2. Analiza korelacji pomidzy wzrostem dawcy a: IEQ przed- (Pre-IEQ) i po oczyszczaniu wysp w gradiencie (Post-IEQ), IDS i wag trzustki (n=22).

Wzrost

dawcy

Pre-IEQ Post-IEQ IDS Waga trzustki

r 0,5486 0,5534 0,5919 0,4882

P 0,0082 0,0093 0,0037 0,02121

Skrty: IEQ islet equivalent, ekwiwalent wysp trzustkowych; IDS Islet Donor Score, punktowa ocena dawcy trzustki. rdo: 1) Wang LJ., Cochet O., Wang XJ., Krzystyniak A., Misawa R., Golab K., Tibudan M.,

Grose R., Savari O., Millis JM., Witkowski P. Donor height in combination with islet

donor score improves pancreas donor selection for pancreatic islet isolation and

transplantation. Transplant Proc. 2014, 46, 6, 1972-1974.

W parametrach branych pod uwag w IDS w przypadku BMI dawcy mona przyzna 15 punktw ze 100, gdy jest ono w zakresie 30,1-35 [27]. Jednak, na podstawie BMI nie da si jednoznacznie przewidzie wagi trzustki i iloci wysp trzustkowych, ktre bdzie mona z niej wyizolowa. Trzustka u dawcw z BMI w takim zakresie moe bowiem zawiera tkank tluszczow, nie zawierajc wikszej iloci wysp. Aby zwikszy przewidywalno wagi trzustki od danego dawcy, a tym samym ilo wysp trzustkowych w organie zaproponowalimy dodanie wzrostu jako kolejnego parametru przy ocenie potencjalnych dawcw trzustki. System IDS pozwala stwierdzi, e przy punktacji wikszej ni 80

Karolina Gob 36

szanse na transplantacj wysp trzustkowych po izolacji wynosz 50% [27]. W

naszym orodku otrzymywalimy podobne wyniki, gdy sam IDS by brany pod

uwag. Jednak, w niniejszej pracy udowodnilimy, e wzrost dawcy jako

niezaleny parametr jest skorelowany z wag trzustki oraz iloci ekwiwalentw

wysp trzustkowych uzyskanych podczas izolacji. Co wicej, gdy brany jest pod

uwag wzrost dawcy (179 3 cm) wraz z IDS, czstotliwo transplantacji po

izolacji wysp trzustkowych wzrasta do 80%. Nasza anzaliza wskazuje, e wzrost

dawcy powinien by brany pod uwag podczas oceny dawcy trzustki wedug

IDS, aby zapewni optymaln selekcj organu, ktra zapewni izolacj wysp

trzustkowych zakoczon transplantacj.

3.2. Komrki T regulatorowe jak narzdzie terapeutyczne do indukcji

tolerancji immunologicznej w przeszczepie wysp trzustkowych

Krzystyniak A., Gob K., Witkowski P., Trzonkowski P. Islet cell transplant and the

incorporation of Tregs. Curr Opin Organ Transplant. 2014, 19, 6, 610-615.

Transplantacja wysp trzustkowych moe by skuteczn metod terapii

cukrzycy typu 1, szczeglnie u pacjentw, u ktrych cukrzycy towarzysz

napady niewiadomej hipoglikemii. Pomimo ulepsze w samej metodzie izolacji

wysp oraz przeomu jaki nastapi po opublikowaniu protokou Edmonton, ktry

zakada wyeliminowanie diabetogennych steroidw jako lekw immuno-

supresyjnych przy transplantacji wysp trzustkowych [53], wci nie jest to

metoda w peni skuteczna, a gwny problem stanowi konieczno stosowania

doywotniej immunosupresji, czsto zwizanej, jak to opisano powyej, z

wieloma skutkami ubocznymi.

W naszej pracy sprbowalimy okreli potencja i szanse terapii

komrkami Treg do zapobiegania odrzucania przeszczepu wysp trzustkowych

na podstawie wynikw dotychczas przeprowadzonych bada preklinicznych i

wiedzy dotyczcej komrek Treg. Zidentyfikowalimy take problemy, ktre

mog by zwizane z tak terapi i podjelimy prb przedstawienia moliwych

rozwiza.

Jednym z problemw do rozwaenia podczas transplantacji wysp

trzustkowych z jednoczesn infuzj komrek Treg jest miejsce podania zarwno

wysp, jak i komrek Treg. Podane doylnie limfocyty Treg mog mie

ograniczon zdolno migracji do miejsca przeszczepu, a nastpnie do wzw

chonnych, co z kolei, jak udowodniono, jest warunkiem koniecznym, aby

mogy one skutecznie hamowa odpowied komrek T efektorowych [186].

Jeeli chodzi o wyspy trzustkowe, to w miejscach przeszczepu, gdzie dochodzi

do bezporedniego kontaktu wysp z krwi, naraone s one na atak ze strony

odpowiedzi nieswoistej i ukadu dopeniacza [187], z czego ostatni nie jest w

peni hamowany przez komrki Treg. Rozwizaniem moe by tu jednoczesny

przeszczep wysp trzustkowych i komrek Treg w miejsca, gdzie nie ma

bezporedniego kontaktu z krwi obwodow, takie jak: szpik kostny, minie

Najwaniejsze spostrzeenia z prezentowanych prac

37

szkieletowe, trzustka, torebka nerki. W przypadku jednoczesnego podania

komrek Treg i wysp trzustkowych w wyej wymienione miejsca problem

stanowi moe akumulacja insuliny, ktra wpywa negatywnie na sekrecj IL-10

przez komrki Treg [188], co jest z kolei jednym z wanych mechanizmw

supresorowych tych komrek. Potencjalnie, podawanie egzogennej insuliny

pacjentowi w pierwszych dniach po transplantacji, mogoby zahamowa

produkcj insuliny przez przeszczepione komrki , a komrki Treg do czasu

odstawienie insulinoterapii mogyby znajdowa si ju w wzach chonnych i

rozpocz dziaanie supresorowe. Innym rozwizaniem zapewniajcym

podan migracj limfocytw Treg, moe by stymulacja tej migracji przez

zastosowanie chemokin, np. CCL22 (Chemokine (C-C motif) Ligand 22;

chemokina 22 typu C-C). Badania na transgenicznych modelach mysich

charakteryzujcych si ekspresj genu CCL22 w wyspach trzustkowych

wykazay, e moe to by skuteczna metoda hamujca rozwj cukrzycy [189]

oraz zapewniajca ochron przeszczepionych wysp [190]. Klinicznie, wyspy

trzustkowe mogyby by opaszczone polimerami zawierajcymi chemokiny lub

przeszczepiane jednoczenie z mikrosferami, ktre maj zdolno uwalniania

chemokin. Metoda enkapsulacji wysp trzustkowych z zastosowaniem CCL22

lub/i CXCL12 (C-X-C Chemokine Ligand 22; chemokina 22 typu C-X-C) jest

obecnie optymalizowana przez naszy zesp badawczy. Indukcja migracji

komrek Treg do miejsca przeszczepu mogaby rwnie pozwoli na

ograniczenie liczby komrek Treg potrzebnych do skutecznego hamowania

odrzucania przeszczepu, gdy daaby moliwo, aby wicej limfocytw Treg

podjeo funkcj supresorow po migracji do przeszczepu, a nastpnie do

lokalnych wzw chonnych.

Wiele nowych publikacji podaje, e antygenowo specyficzne limfocyty Treg

s skuteczniejsze w hamowaniu reakcji immunologicznej ni komrki

poliklonalne [191193]. Zastosowanie antygenowo-specyficznych limfocytw

Treg mogoby rwnie zminimalizowa ilo tych komrek potrzebnych do

indukcji tolerancji immunologicznej. Jednake, w wypadku przeszczepu wysp

trzustkowych, koniecznym byoby wygenerowanie limfocytw Treg

specyficznych pod wzgldem antygenw dawcy, jak i specyficznych antygenw

komrek b, ktre s rozpoznawane przez ukad immunologiczny chorego w

procesie patogenezy cukrzycy typu 1.

Innym problemem moe by