Gaschromatographie mit Massendetektion GC-MS · Definition der Gaschromatographie, Theorie der Chromatographie (kinetische Theorie, Theorie der Böden, dynamische Theorie), Definition

Praktikum Instrumentelle Analytik Seite 1

Gaschromatographie mit Massendetektion GC-MS

1 Lernziele Aufbau und Bedienung eines Gaschromatographen, Detektorarten und Einsatzmöglichkeiten, Ursachen

der Retention in der GC, Charakterisierung der Retention über Retentionsindices, Charakterisierung der

Polarität stationärer Phasen über Index-Differenzen, Unterschied zwischen apolaren und polaren

stationären Phasen, Temperaturgradient, Optimierungsparameter in der Kapillar-GC,

massenspektrometrische Detektion mit EI+-Ionisation, Identifizierung von Substanzen durch MS,

Interpretation einfacher Massenspektren, Quantifizierung durch Standardaddition, Anwendung eines

internen Standards


Inhalt

1 Lernziele ........................................................................................................................................... 1

2 Vorausgesetzte Grundkenntnisse .................................................................................................... 3

3 Theoretische Grundlagen ................................................................................................................. 3

3.1 Retention in Relation zur chemischen Struktur der Probe und der stationären Phase ........... 4

3.2 Grundlagen der massenspektrometrischen Detektion ............................................................ 4

3.3 Ionisationsmethoden ............................................................................................................... 4

3.3.1 Elektronen(stoß)-Ionisation ................................................................................................. 4

3.3.2 Chemische Ionisation .......................................................................................................... 4

3.4 Wichtige Fragmentierungsreaktionen organischer Ionen ........................................................ 5

3.4.1 C-C Bindungsspaltung in gesättigten Kohlenwasserstoffen:............................................... 5

3.4.2 Allylische Spaltung:.............................................................................................................. 6

3.4.3 Benzylische Spaltung: ......................................................................................................... 6

3.4.4 α-Spaltung in Carbonylverbindungen: ................................................................................. 7

3.4.5 α-Spaltung bei Halogenverbindungen: ................................................................................ 7

3.4.6 Retro-Diels-Alder-Spaltung: ................................................................................................. 7

3.4.7 Oniumfolgewanderung (sekundäre Fragmentierung): ......................................................... 7

3.4.8 McLafferty-Umlagerung: ...................................................................................................... 8

4 Analyse umweltrelevanter Phenole .................................................................................................. 8

5 Gaschromatographie (GC-MS) Versuch 2: ...................................................................................... 9

5.1 Analytik von Phenolen nach der internen Standard-Methode ................................................. 9

5.2 Messziele und Arbeitsvorschriften ........................................................................................... 9

5.3 Datenauswertung und Analysenreinschrift zu Messziel 1: .................................................... 10

5.4 Datenauswertung und Analysenreinschrift zu Messziel 2: .................................................... 10

6 Datenblatt für GC-MS-Messungen ................................................................................................. 11


2 Vorausgesetzte Grundkenntnisse Definition der Gaschromatographie, Theorie der Chromatographie (kinetische Theorie, Theorie der

Böden, dynamische Theorie), Definition und Berechnung chromatographischer Kenngrößen, Aufbau

eines GC-Systems, Detektionsmöglichkeiten in der GC, stationäre Phasen in der GC, gepackte GC-

Säulen, offene Kapillarsäulen, Temperatureinfluss auf die Retention in der GC, Beeinflussung der

Auflösung chromatographischer Peaks, Datenanalyse (Berechnung von Mittelwert,

Standardabweichung und Vertrauensbereich), -Spaltung als Fragmentierungsreaktion von

Halogenverbindungen

Vorzubereitende Fragen:

Für GC-MS:

Wie funktioniert die Elektronenstoßionisation? Schreiben Sie die allgemeine Reaktionsgleichung auf!

Warum fragmentieren Ionen üblicherweise nach Elektronenstoßionisation? Warum fragmentieren Ionen

kaum nach chemischer Ionisation?

Wie wird die Masse der Ionen bestimmt? Wie werden die gebildeten Ionen detektiert?

Was kann man aus dem Fragmentierungsmuster aussagen? Wie wird die Fragmentierung zur

Identifizierung verwendet?

Zeichnen Sie die Strukturformel von 2-Chlorphenol, 2,4-Dinitrophenol und 2,4-Dimethylphenol!

Welche Probenvorbereitungsmethode kann man zur Isolierung und Anreicherung von Phenolen aus

wässrigen Lösungen anwenden? Geben Sie ein Beispiel für ein Trennsystem!

Warum wird in der GC für die Quantifizierung ein interner Standard verwendet?

Skizzieren Sie einen Kalibriergraphen für Standardaddition (inkl. Achsenbeschriftungen) und zeichnen

Sie den Analysenwert im Graphen ein!

Was sind die Vorteile (mind. 2) der Standardadditionsmethode gegenüber der Methode des externen

Standards?

Was sind die Nachteile (mind. 2) der Standardadditionsmethode gegenüber der Methode des externen

Standards?

3 Theoretische Grundlagen


3.1 Retention in Relation zur chemischen Struktur der Probe und der stationären Phase

Es gibt eine Vielzahl chemisch unterschiedlicher stationärer Phasen, die einen breiten Polaritätsbereich

abdecken (z.B. Squalan bis Polyethylenglycol). Für die Praxis hat sich jedoch gezeigt, dass die meisten

Trennungen auf unpolaren Polymethylsiloxanphasen mit unterschiedlichem Phenylgruppengehalt

durchgeführt werden können. Die Polarität nimmt dabei mit steigendem Phenylgehalt zu. Weitere

chemische Gruppen können zusätzlich eingefügt sein (z.B.: Cyanopropylgruppen wie bei der

vorliegenden Trennsäule). Als gängige polare stationäre Phasen sind Polyethylenglycolphasen im

Einsatz. Oft ist es auch von Interesse, das Retentionsverhalten chemischer Verbindungen in

Abhängigkeit von deren Struktur und der Art der verwendeten stationären Phase zu verstehen und zu

interpretieren.

3.2 Grundlagen der massenspektrometrischen Detektion

3.3 Ionisationsmethoden

3.3.1 Elektronen(stoß)-Ionisation

Elektronen werden aus einem Wolfram- oder Rheniumfilament emittiert und im elektrischen Feld (ca.

70 eV) beschleunigt.

Etwa jedes tausendste Molekül wird ionisiert.

Die kinetische Energie des Elektrons e- reicht aus, bei einem Zusammenstoß mit einem

Substanzmolekül ein weiteres Elektron herauszuschlagen. Es entsteht dadurch ein radikalisches

Molekülion M+.

e2MeM Stoß

Die geringe Masse und die hohe Energie der beschleunigten Elektronen führen zu hoher Rotations- und

Schwingungsanregung der Molekülion-Radikale. Die Radikalionen zerbrechen in Einzelfragmente, den

so genannten Fragmentionen.

Vorteile:

Fragmentierungsreaktionen können wichtige Daten zur Struktur der Substanz liefern.

Ionisation ist technisch einfach durchführbar und erzeugt einen recht starken Ionenstrom.

Nachteile:

Fragmentierung kann manchmal so stark sein, dass eine Zuordnung zum Molmassenpeak (M+.) nicht

mehr möglich ist.

Überführung in Gasphase zuvor notwendig (Probleme bei thermisch instabilen Proben)

3.3.2 Chemische Ionisation

Zur Ionisation wird ein Reaktionsgas, z. B. Methan, verwendet, welches dem Trägergas, z. B. Helium,

zu X% beigemischt wird. Dieses wird durch Elektronenstoß ionisiert.


Die gasförmigen Analytmoleküle werden dann durch Zusammenstoß mit den im Überschuss

vorliegenden Reaktionsgasionen ionisiert. Mit Methan als Reaktionsgas laufen folgende Reaktionen ab:

daneben auch

53523 HC,HC,CH etc.:

Mögliche Reaktionen mit dem Analyten sind Protonenübertragungen in der Gasphase:

Dabei erhöht sich die Masse des Analyten um 1 bei den ersten zwei Reaktionen und erniedrigt sich um

1 bei der letzten Reaktion.

Vorteile:

Milde Ionisation, da energetische Anregung über indirekten Weg gemindert

kaum Fragmentierung

Nachteile:

größerer technischer Aufwand, da Druck in der Ionisationskammer höher ist als im Massenspektrometer

(ca. 1 Torr notwendig, um eine ausreichende Anzahl von Zusammenstößen zu erzeugen).

Kein Molpeak wird erhalten, entweder (M+1)+ oder (M-1)--Peak.

3.4 Wichtige Fragmentierungsreaktionen organischer Ionen

3.4.1 C-C Bindungsspaltung in gesättigten Kohlenwasserstoffen:

Die Carbeniumionen zeigen dieselbe Stabilitätsabstufung wie in Lösung, nämlich

tertiär > sekundär > primär. Infolgedessen ist eine Verzweigungsstelle in einem längeren Paraffin meist

mit Sicherheit zu erkennen.

Folgende Spaltung tritt nur als sekundärer Prozess auf:

C1 C2 C2C1+

+°

°

6252

42252

425

HCXXHHC

HCXHXHHC

CHXHXHCH

25243

3544

HHCCHCH

CHCHCHCH

eCHeCH 244


3.4.2 Allylische Spaltung:

Die allylische Spaltung wird begünstigt, da die dabei entstehenden Allylkationen durch Mesomerie

stabilisiert werden.

3.4.3 Benzylische Spaltung:

-Spaltung an einem Kohlenstoffatom, das mit einem Heteroatom mit verfügbarem freiem

Elektronenpaar substituiert ist:

+ +C1 C2 C3 C1 C2 C3

+ °

+ °C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3 C4

+C3C2C1

°+

m/z 91

CH2 C CH2 + + +

Tropylium-Ion

+

m/z 65

- °H3C

C2H2-


3.4.4 α-Spaltung in Carbonylverbindungen:

3.4.5 α-Spaltung bei Halogenverbindungen:

3.4.6 Retro-Diels-Alder-Spaltung:

3.4.7 Oniumfolgewanderung (sekundäre Fragmentierung):

+

C

R

R R

X|

-RCR R

X|

+C

X

R R

+ °

°

°

C RR

O+

R C O+

C OR +

°R-

C X

+

C + X

°

°

+ ° °+

+

O,S,NHX=

C

H

C X C

R

-RC

H

C X C+ C

C

HX

C

+°

°


3.4.8 McLafferty-Umlagerung:

4 Analyse umweltrelevanter Phenole Phenol (Carbolsäure) kommt natürlich z.B. in Kiefern und im Steinkohlenteer vor. Als Nebenprodukt fällt

es in Kokereien und Braunkohleschwelereien an, es ist ein luftverunreinigender Stoff und wirkt

cancerogen auf die Haut und die Atemorgane, chronische Vergiftungen zeigen sich durch

Nierenschäden. Phenol ist der Grundstoff für die substituierten Phenole. Typische Beispiele sind

Nitrophenole, Chlorphenole und Pentachlorphenol PCP. Die Strukturen von Phenol und einigen

substituierten Phenolen sind dargestellt.

In der Industrie sind Phenole vorrangig im Altöl, in Farben und Lacken, in Gießereien, in der

Holzverarbeitung, in der Kunststoffherstellung und in Schädlingsbekämpfungsmitteln zu finden. Die drei

Nitrophenole (2-Nitrophenol, 3-Nitrophenol und 4-Nitrophenol) sind giftig, wenn sie durch Einatmung

oder Hautkontakt in den Organismus gelangen. Zwei- und dreifach nitrierte Phenole sind zudem

explosionsgefährlich (Handling dieser Komponenten nur im feuchten Zustand!). 2,4,6-Trinitrophenol,

Trivialname Pikrinsäure, ist ein sehr potenter Sprengstoff und zudem eine starke Säure. (Warum?)

Chlorphenole sind in ihrer cancerogenen Wirkung meist nicht so stark wie natives Phenol. Werden aber

höher chlorierte Phenole erhitzt, können sich unter HCl-Abspaltung hochgefährliche, mehrfach

chlorierte Dioxine und Dibenzofurane bilden. Einfache Chlorphenole sind schwer in Wasser und leicht

in Alkohol löslich und reichern sich dadurch in Fettgeweben an. Die biologische Abbaubarkeit ist sehr

schlecht. Chlorphenole entstehen z.B. als Zwischenprodukt bei der Arzneimittelherstellung.

Pentachlorphenol (PCP) ist hochtoxisch für Mikroorganismen, Pflanzen, Insekten, Weichtiere und

Fische. Nachdem sein toxisches Potential auf Menschen längere Zeit bestritten worden war und dieses

Toxin in fungizid wirkenden Holzlasuren selbst in hohen Konzentrationen frei verkäuflich gewesen war,

besteht mittlerweile ein totales Umgangsverbot für PCP. Viele Phenole sind stark gewässerschädigend

und beeinträchtigen schon in geringen Konzentrationen den Geschmack von Wasser und Fischen.

Chlorhaltige Reinigungsmittel, bzw. Fungizide können durch Schimmelpilze in Trichloranisol umgesetzt

werden, das schon in Spuren dafür sorgt, dass Wein „korkt“ und ungenießbar wird (Adaptiert aus:

Wasser-Wissen, Institut für Umweltverfahrenstechnik, Universität Bremen, www.wasser-wissen.de).

HX

R + R +X

H

X= CH2,O,S

° °+X

H

°

+

+

R X

H

°

+


Phenol, 2-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 2-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, 2,4-

Dimethylphenol

Der Nachweis von Phenolen in Böden, Oberflächengewässern und Abwässern erfordert neben

zuverlässigen Extraktionsmethoden auch effektive Anreicherungs- und clean-up-Verfahren zur

Abtrennung der reichlich vorhandenen Störsubstanzen. Wichtig für eine genügend genaue und auch

rechtlich abgesicherte Identifizierung mittels GC sind mehrere Aspekte: Einsatz spezifischer Detektoren

(welche?) und optimierter Temperaturprogramme, Verwendung von Surrogat-Standards

(Modellsubstanz, die stellvertretend für alle Analyten der Probe vor der Aufarbeitung zugesetzt wird) zur

Kontrolle der Quantifizierung und Verbesserung der Identifizierung, Absicherung der Analyse auf einer

zweiten Säule unterschiedlicher Polarität, zusätzliche Verifizierung mit massenspektrometrischer

Detektion. Im Rahmen dieser Aufgabe sollen einige Phenole qualitativ und quantitativ analysiert werden.

In der Wasser- und Bodenanalytik hat sich zur Probenvorbereitung die Festphasenextraktion

durchgesetzt. Ihr Vorteil ist die Vielzahl der nutzbaren Wechselwirkungen, der geringe

Lösungsmittelverbrauch und der relativ geringe Zeitaufwand. Für Phenole hat sich die Verwendung

einer Octyl-Umkehrphase (RP C8-Phase) als Festphase der GC-Analytik bewährt.

5 Gaschromatographie (GC-MS) Versuch 2:

5.1 Analytik von Phenolen nach der internen Standard-Methode

Laborplatzliste und Chemikalien

Apparatur

Gaschromatograph Thermo Scientific Focus GC, massenselektiver Detektor Thermo Scientific DSQ II,

Kapillarsäule: Varian DB-624 analog, mittelpolare Phase (3,5% Cyanopropyl-, 3,5% Phenyl-, 93 %

Methylpolysiloxan, L=30 m; I.D.= 320 m, Filmdicke = 0.25 m)

Chemikalien

Phenollösungen, bestehend aus Phenol, 2-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 4-Nitrophenol, 2,4,6-

Trichlorphenol, 2,4-Dimethylphenol (interner Standard I.S.), je 10-40 mg in 100-400 mL Acetonitril (100-

400 mg/L)

5.2 Messziele und Arbeitsvorschriften

Messziel 1: Qualitative Analyse einer Phenol-Mischung

1 µL einer Mischung aus 5 Phenolen plus internem Standard (je ca. 100-400 mg/L in Acetonitril –

Mischung wird bereitgestellt) werden in ein Vial mit Durchstech-Septum gegeben und automatisch

injiziert (splitless mode) und mit folgendem Temperaturgradienten getrennt: 2 min auf 77 °C, auf 79 °C

mit 1°C/min, auf 260°C mit 50°C/min, 260°C für 2 min. Trägergas ist He mit 54 kPa; Injektor-

OH OH

Cl

OH

CH3

CH3

OH

NO2

NO2

OH

NO2

OH

Cl

Cl


Temperatur: 240°C, Detektor-Temperatur: 240 °C, Interface-Temperatur: 260°C, Scanbereich 45-400

Da.

Die Einzelsubstanzen werden über Datenbankvergleich und manuelle Massenspektren-Interpretationen

zugeordnet. Die jeweiligen Retentionszeiten werden ermittelt.

Messziel 2: Quantitative Analyse von 2,4-Dichlorphenol

Das in der Probe enthaltene 2,4-Dichlorphenol wird quantitativ nach der internen Standard- Methode

analysiert. Dazu werden 0.20-mL-Aliquote der Probe in ein 1.5-mL GC-Vial pipettiert und mit 0,10 mL

des internen Standards (Stammlösung 100 µg/L 2,4-Dimethylphenol) sowie variablen Volumina des 100

µg/mL 2,4-Dichlorphenol-Standards versetzt. Mit Acetonitril wird auf ein Gesamtvolumen von je 1,00 ml

aufgefüllt. Die Endkonzentrationen von 2,4-Dichlorphenol bezogen auf das Gesamtvolumen (1 mL)

sollen 0,0, 10,0, 20,0, 30 µg/mL betragen.

Jede Standardmischung wird dreifach (20 µg/L Mischung vierfach) im SIM-Modus (welche m/z-Werte?)

analysiert. Sonstige Bedingungen wie oben.

5.3 Datenauswertung und Analysenreinschrift zu Messziel 1:

Qualitative Analyse einer Phenol-Mischung

Beispielchromatogramm der Probe und 6-Phenol-Standard mit Peakidentifizierung und Angabe der

experimentellen Bedingungen erstellen. Tabellieren Sie die Retentionszeiten der einzelnen Substanzen

in der Standardmischung und in der Probe! Ordnen Sie den erhaltenen Massenspektren die jeweiligen

Substanzen zu und geben Sie die erhaltene Spektren-Übereinstimmung in die Tabelle ein! Erstellen Sie

Beispielspektren der sechs Phenole.

Tabelle:

Substanz tR der Standards tR der Probe Spektrum Nr. Spektrum-Match m/z für SIM

Entnehmen Sie aus den Massenspektren die m/z-Werte der Einzelsubstanzen, die für eine quantitative

Bestimmung im SIM-Modus für dieses Experiment geeignet wären! Begründen Sie die Auswahl!

Schlagen Sie für die drei intensivsten Fragmentionen im Massenspektrum von 2,4-Dichlorphenol

entsprechende Fragmentierungsreaktionen vor! Begründen Sie diese.

Ergebnis der qualitativen Analyse: Die Probe enthält …

5.4 Datenauswertung und Analysenreinschrift zu Messziel 2:

Quantitative Analyse von 2,4-Dichlorphenol

Warum werden alle Peakflächen auf die Peakfläche des internen Standards normiert (Anorm =

AProbe/AI.S.)? Auftragung der Kalibriergeraden Peakfläche Anorm = b . conc. [µg/mL] + a. Die

Konzentration der Probe ergibt sich grafisch nach Lotfällung zu X-Achse. Berechnen Sie die genaue

Konzentration aus der aktuellen Geradengleichung (b, a, R2, sy).

Tabelle:

File Konzentration der

Standards [mg/l]

normierte Peakfläche

AProbe/AI.S.

gemessene

Peakfläche AProbe

gemessene

Peakfläche AI.S.


Angabe der Analysenfunktion: Wie wird aus dem Messwert der Analysenwert erhalten? Wichtig: Hier

sind auch aliquoter Teil, Verdünnungs- bzw. Aufkonzentrierungsschritte zu berücksichtigen!

Ergebnis der quantitativen Analyse von 2,4-Dichlorphenol in Standardform:

Die Probe enthält: ……..µg/mL 2,4-Dichlorphenol

Anzugeben ist die Konzentration von 2,4-Dichlorphenol in der Probe in [µg/mL] ± T (P%, sy, sx^, N).

6 Datenblatt für GC-MS-Messungen

Datum:

Operator:

Gruppe: Seite:

Geräte:

Säule:

Injektor (°C):

Detektor (°C): Trägergas: Druck (kPa): Fluss (total):

Fluss (Septum):

Gradient:

Injektionsmodus: Injektion (µL):

Filename Probe MS-Bedingungen Bemerkungen


Documents

Gaschromatographie mit Massendetektion GC-MS · Definition der Gaschromatographie, Theorie der Chromatographie (kinetische Theorie, Theorie der Böden, dynamische Theorie), Definition