Fyziologická podstata přezimování hmyzuaneb

Jak zajistit přežití při poklesu tělní teploty

Vladimír Košťál

Oddělení ekofyziologie Entomologický ústavBiologické centrum AV ČRČeské Budějovice

kostal@entu.cas.cz

Kryobiologie hmyzu

1736 (Reaumur) první zmínky o schopnosti hmyzu přežít za podnulových teplot1901 (Bachmetjev) podchlazení hmyzího organismu1930 – 1975 (Salt) zakladatel oboru1957 (Chino, Salt) hromadění glycerolu1977, 78 (Duman) "anti-freeze proteins" a "protein ice nucleators"

1991 INSECTS AT LOW TEMPERATURE (1st edition)Eds. Richard E. Lee, David L. DenlingerChapman and Hall, New York, 513 p.

2009 (?) INSECTS AT LOW TEMPERATURE (2nd edition)

Definice oboru:

Vědní obor, který se zabývá poškozujícími účinky nízkých teplot na hmyzí organismus a adaptivními a aklimatizačními změnami, které umožňují tomuto poškození předejít, tolerovat jej nebo jej napravit.

Rychlost procesu (vývoj, růst, ...)100 %

Tělní teplota [°C]

optimum

spodní teplotn

ípráhteplota krystalizace

tělních tekutin

bod podchlazení"supercooling point"

Definice nízkých teplot:

Teploty pod prahem pro vývoj, růst a aktivitu organismu

0°C

Oblast nízkých teplot začíná pro různé druhy hmyzua v různých situacích za různých hodnot teploty:

• tropické druhy: ca. 10 - 15°C• neaklimované temperátní druhy: ca. 5 - 15°C• aklimované temperátní a polární druhy: až -0.6°C

podc

hlaz

ený

stav

prom

rzlý

sta

v 20 – 30°C

Strategie přežívání

• Podchlazení - udržet vodu v kapalném stavu

• Promrznutí - dovolit regulovanou tvorbu ledových krystalů

• Dehydratace – předejít mrznutí ztrátou vody

• Migrace

• Rychlá chladová aklimace (RCH)

• Regulace

• Aktivita - tepelně pufrované prostředí

Aktivita

• Kolonie chvostokoků Ceratophysella sigillata migrují po sněhu v lednu (Švýcarsko, 600 m n.m.), během migrace se rozmnožují, živí se na nárůstech řas na odumřelém dřevě (v létě upadají do dormantního stavu).

• Larvální vývoj brouka z čeledi Catopidae (západní a střední Evropa), probíhá v zimě, v opadance. Imaga vstupují v létě do aestivace a kladou na podzim.

Boreus Chionea

• Imaga srpice Boreus a více druhů much se páří v zimě nad sněhem, někdy jsou imaga bezkřídlá.

• adaptivní výhodou přesunu aktivní fáze do období nízkých teplot je patrně využití volné niky s nižším tlakem parazitů a predátorů a s dostatkem potravy

Catops

Ceratophysella Triphleba

sníženíteploty

mimobuněčné tělní tekutiny

rozp. látky

buňky a"lumeny"

vytvoření ledových krystalků v tělních tekutináchvede k osmotickému odsávání vody z buněka tím k jejich dehydrataci a smršťování

Bod tání

Bodpodchlazení

Podchlazení vs. Promrznutí

základní předpoklady:

• mít malé rozměry vodních kompartmentů• zabránit heterogenní nukleaci ledu

základní předpoklady:

• zajistit tvorbu ledu v extracelulárních prostorech • mít schopnost přežít dehydrataci buněk

Podchlazení vs. Promrznutí

• voda zůstává v kapalném stavu • voda v extracelulárních prostorech se mění na led• dochází k silné dehydrataci buněk

• aerobní metabolismus se zpomaluje, nikoli však zastavuje

• led brání difůzi kyslíku, anaerobní metabolismus buněk je minimální až nulový = kryobióza

• jsou udržovány transmembránové elektrochemické potenciály

• transmembránové elektrochemické potenciály zcela disipují

• hrozí ztráty vody • voda je "konzervována" v ledových krystalech

• relativně aktivní metabolismus:

- vyžaduje přísun energie - vyžaduje koordinaci - je náchylný k poškození

• metabolismus v hluboké supresi:

- umožňuje šetřit energií - nevyžaduje koordinaci - je odolný vůči poškození

Mechanismy přežití: Komplexnost aklimačních změn

ENVIRONMENTAL FACTORSshort days

decreasing temperatureperception

gene expression

hormonal milieu

developmental mode

behaviour

energy reserves

water balance

ion homeostasis

ice nucleators & AFPs

membrane lipids

antioxidants

metabolism

anaerobic pathways

chaperonins

cryoprotectants

protein activities

Mechanismy přežití: Sezónnost, vstup do dormance (diapauzy)

molecular model

DBT

SGG CK2

CRY

PDF

central pacemakerbiological clockscircadian oscillator

fly CNS: Drosophila melanogaster

:

Mechanismy přežití: Prevence ztrát vody (především při podchlazení)

Množství a složení kutikulárních lipidů býváodlišné u nediapauzních a diapauzních stádií

kukly Pieris rapae crucivora (bělásek řepový)bílé sloupce: nediapauzníčerné sloupce: diapauzní

• diapauzní kukly P. rapae mají několikrát silnější vrstvu uhlovodíků na povrchu kutikuly: nediapauzní kukly: tloušťka 11 nm diapauzní kukly: tloušťka 195 nm

• mění se i kvantitativní zastoupení jednotlivých uhlovodíků: diapauzní kukly: 29:0

29:1 31:1

Snižuje se podíl osmoticky aktivní,tzv. "volné" vody

• akumulací hydrofilních polymerů - glykogen (sval, tukové těleso) - hexamerní proteiny (hemolymfa) - LEA proteiny

• akumulací osmolytů

- volné aminokyseliny (prolin) - cukry (trehalóza, glukóza, ...) - polyoly (glycerol, sorbitol, ...)

Voda v hemolymfě slouží jako pufrační zásoba

Může se vytvářet pufrační (?) zásoba vody v zadním střevě (rektum)

Metabolická suprese vede k zpomalenífrekvence dýchání a tedy i k nižšímrespiračním ztrátám vody

Kaneko and Katagiri, 2004Naturwissenschaften 91,320-323

Mechanismy přežití: Iontová homeostáza

• hmyz, přezimující v podchlazeném stavu udržuje iontovou homeostázu

0 10 20 30 40 50 60

0

25

50

75

100

Time of exposure to -5 C [days]

Chi

lling

inju

ryan

d m

orta

lity

[%]

d.wa

d.ca

nd.wa

0 10 20 30 40 50 600

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

0

10

20

30

nd.wad.wa

d.ca

Time of exposure to -5 C [days]

Equ

ilibr

ium

pot

entia

l [m

V]

ENa

EK

Kostal et al., 2004J. Exp. Biol. 207, 1509-1521

0 24 48 72 96 120 144 168

0

25

50

75

100C

hilli

ng-i

njur

yan

d m

orta

lity

[%]

Time of exposure to +5C [hours]

warm accl.

cold accl. 1 2 3 4 5 6 7

-70-60-50-40-30-20-10

010203040506070

ENa

EK

warm accl.

cold accl.

Time of exposure to +5 C [days]

Equ

ilibr

ium

pot

entia

ls

[mV

]

Kostal et al., 2006Comp. Biochem. Physiol. B143, 171-179

• chladová aklimace tropického hmyzu vede také ke zvýšení schopnosti udržovat iontovou homeostázu

Pyrrhocoris apterus

Nauphoeta cinerea

• hmyz, přezimující v promrzlém stavu rychle ztrácí elektrochemické potenciály, ale je schopen opět je rychle generovat po "roztání"

Xylophagus cincta

Kristiansen and Zachariassen, 2001J. Insect Physiol. 47, 585-592

Mechanismy přežití: Metabolismus (aerobióza v podchlazeném stavu)

• aerobní metabolismus podchlazeného hmyzu je v hluboké supresi (diapauzou a teplotou), ale stále funkční

• vytvářená energie se spotřebovává patrně především při generování transmembránových potenciálů, popřípadě při biosyntéze a transportu kryoprotektantů

Glycogen

Glucose-1-P

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Fructose-1,6-bis-P

6-P-Glucono- lactone

Glucose

Fructose

RiboseRibulose

TCA cycle

GPase (a+b)

G6P-DH AR NADPH

PDH NAD+

ATP

PFK-1

NADPH NADP+

NADH

NAD+ CO2

AR NADPH

PDH NAD+

nediapauzní (aktivní) jedinci:• glykolýza/-oxidace TCA energie

diapauzní jedinci za nízkých teplot:• aktivizace glykogen fosforylázy za teplot pod 5°C

KR NADPH

• vyšší aktivita glukózo-6P-dehydrogenázy

• vyšší produkce NADPH

• vyšší aktivita aldózo reduktázy

• specifická aktivita ketózo reduktázy

• inhibice aktivity fosfofruktokinázy

• zablokování toku uhlíku k TCA• aktivizace pentózového cyklu

• biosyntéza ribitolu a sorbitolu

R I B I T O L

S O

R B

I T O

L

• zpomalení katabolické aktivity polyol dehydrogenázy při nedostatku NAD+

Kostal et al., 2004J. Insect Physiol. 50, 303-313

Pyrrhocoris apterusakumulaceribitolu a sorbitolu

Mechanismy přežití: Biosyntéza a akumulace kryoprotektantů• vysoké koncentrace (> 1 mol.L-1) - koligativní deprese bodu tání - snížení bodu podchlazení - oddálení promrznutí

Ips acuminatus

Gehrken, 1985J. Insect Physiol. 31, 909-916

1 mol = -1.86°K

• nízké koncentrace ( ca. 0.1 mol.L-1) - zanedbatelný koligativní efekt - přesto zezónní průběh akumulace dobře koreluje s chladovou odolností

250 ug 500 ug

2 uL

diapauseadult

(pre-acclimated)

conc.: 2.5 83.1 mmol.L-1

SCP: constant -18.0°C

survival at -14°C/3 d:

13.3 41.5 %

Kostal et al., 2001Comp. Biochem. Physiol. B130, 365-374

preferenční vytěsnění kryoprotektantů (disacharidy oranžově a prolin černě)z domény proteinu vede k preferenční hydrataci proteinu (N) a stabilizaci jeho funkční konformace hydratačním obalem

Gekko and Timasheff, 1981Biochemistry 20, 4667-4676

Mechanismy přežití: Syntéza "Antifreeze Proteins" (AFPs)

• poprvé objeveny u antarktických ryb (DeVries, 1971)• později nalezeny rovněž u hmyzu (Duman, 1977)• v současnosti prokázány u ca. 50-ti druhů hmyzu, roztočů, pavouků a stonožek

• funkční podstata spočívá patrně v nevazebné interakci (adsorpci) repetitivních sekvencí proteinu na povrch ledového mikrokrystalu, a tím v zabránění připojování se dalších molekul vody,

oddálení krystalizace stabilizace metastabilního podchlazeného stavu

počítačová simulace funkce AFP I proteinu

http://vidar.chemistry.duq.edu/faculty/madura/research/index.html

Kristiansen and Zachariassen, 2001

Mechanismy přežití: Syntéza "Protein Ice Nucleators" (PINs)

LÉTO ZIMA

podchlazení zmrznutí

intra-celulární a intra-luminární nukleátory

sezónně syntetizované nukleátory v hemolymfě

• poprvé objeveny u epifytických bakterií (Maki et al., 1974)• později nalezeny rovněž u hmyzu (Duman, 1978)

kooperativní agregaceINAs zvyšuje nukleačníaktivitu

scanning tunneling mikrofoto

• druhy hmyzu, které spoléhají na strategii promrznutí, je aktivně syntetizují a ukládají v hemolymfě před příchodem chladného období • při poklesu teploty nehluboko pod 0°C promrzají

Yeung et al., 1991J. Vac. Sci. Technol. B9, 1197-1201

Zachariassen, 1980J. Comp. Physiol. 140, 227-234

• funkční podstata spočívá patrně ve vytváření "matrice", neboli katalytického povrchu, který je vhodný pro uspořádávání molekul vody do krystalové mřížky ledu

Mechanismy přežití: Změny ve složení biologických membrán

• membrány podchlazeného hmyzu musí zůstat ve funkční, "tekuté" fázi

desaturacemastných kyselin

"tekutá" fáze

"gelová" fáze

pokle

s te

plo

ty

• vložení dvojné vazby (desaturace) do řetězce mastné kyseliny vede ke snížení teploty přechodu z tekuté do gelové fáze membrány, která je z takových molekul složena

PE

_688

,4P

E_6

90,4

PE

_714

,4P

E_7

16,4

PE

_718

,4P

E_7

30,4

PE

_732

,4P

E_7

40,4

PE

_742

,4P

E_7

44,4

PE

_756

,4P

E_7

58,4

PE

_760

,4P

E_7

64,4

PE

_766

,4P

C_7

30,5

PC

_732

,5P

C_7

46,5

PC

_752

,5P

C_7

54,5

PC

_756

,5P

C_7

58,5

PC

_772

,5P

C_7

74,5

PC

_778

,5P

C_7

80,5

PC

_782

,5P

C_7

84,5

PC

_786

,5P

C_8

04,6

PC

_806

,6P

C_7

60,5

Pro

port

ion

of li

pid

0

2

4

6

8

10

12

152025

PE PC

Pro

po

rtio

n

46

48

50

52

54

surv

-5

surv

-7

surv

38,5

Su

rviv

al

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

• změny v molekulárním složení membrán jsou velmi komplexní a dosud jen z menší části je umíme adaptivně vysvětlovat

Kostal et al., unpublished data

Drosophila melanogaster acclimated at:

Mechanismy přežití: Změny ve složení biologických membrán

• membrány promrzajícího hmyzu musí vydržet elastické šoky spojené s dehydratací a musí odolat vzájemnému fůzování při těsném přiblížení po dehydrataci

• membrány přecházejí do fázového stavu gelu a mohou vzájemně fůzovat

• disacharidy udržují fázi membrán tekutou a brání jejich fůzi

- trehalóza + trehalóza

"water replacement"hypothesis

Crowe et al., 1987Biochem. J. 242, 1-10

Chymomyza costataPL composition

Kostal et al., 2003Comp. Biochem. Physiol. B135, 407-419

Bry

an

t et

al., 2

00

1S

eed

Sci

. R

es.

11

, 1

7-2

5

Mechanismy přežití: Integrovaná aktivace ochranných systémů

• vývojové signály: hormony, mitogeny

• environmentální signály: délka dne • přímé faktory prostředí: teplota , (kyslík )

• transkripční faktory: FoxO-P FoxO

• aberantní proteiny • teplotní sensory Hik33 (?)

• sensory kyslíku NADPH oxidáza (?)

HSF trimerizace Rer Rer-P HIF-1α + 1 dimerizace

• aktivace přepisu genů:

desaturázy MK erythropoietin

VEGF

enzymy glykolýzy (anaerobní)

p21 proliferace antioxidanty (SOD, CAT) šaperony (HSPs) metallothioneiny antimikrobiální proteiny apoptóza metabolické enzymy

p21 proliferace šaperony (HSPs)

aktivita:metabolické enzymy enzymy biosyntézykryoprotektantů

sinice

savci

Závěry

Chladová odolnost hmyzu:

• vynikající "výkony" (hluboké podchlazení, přežití promrznutí, přežití při -192°C, ...)

• různé strategie (aktivita, podchlazení, promrznutí, ...)

• minimálně dvoustupňová aklimatizace (změna vývojového programu chladová aklimace) • četné mechanismy fungující jako komplex (kryoprotektanty, AFPs, PINs, membrány, ...)

• integrace na molekulární a buněčné úrovni (evoluční konzervace principů)

• aplikace (skladování a kryoprezervace, předpovědi mortality nebo změn areálů)

Oddělení ekofyziologieEntomologický ústavBiologické centrum AV ČRBranišovská 31, 370 05 České Budějovice

kostal@entu.cas.cz387 775 324http://www.entu.cas.cz/kostal/