Fungo Carla Castro

7/23/2019 Fungo Carla Castro

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MINISTRIO DA EDUCAO

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZNIA

CARACTERIZAO MORFOLGICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE

Rhizoctonia solani Kuhn.

CARLA VANESSA BORGES CASTRO

Belm-PA2007


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MINISTRIO DA EDUCAO





Dissertao, apresentada Universidade Federal Rural da

Amaznia, como parte das exigncias do curso de

Mestrado em Agronomia, rea de concentrao Biologia

Vegetal Tropical, para obteno do ttulo de Mestre.

Orientador: ProfoDr. Vicente Savonitti Miranda

Co-Orientadores: Ms. Luis Sebastio Poltronieri

ProfoDr. Paulo Srgio Torres Brioso

Belm-PA2007


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Castro, Carla Vanessa Borges Castro

Caracterizao morfolgica e molecular de isolados de Rhizoctoniasolani Kuhn / Carla Vanessa Borges Castro. Belm, 2007.

67 f: il.

Dissertao (Mestrado em Agronomia) Universidade Federal Ruralda Amaznia, Belm, 2007.

1.Rhizoctonia solani 2. Caracterizao Morfolgica 3. VariabilidadeGentica 4. Marcadores RAPD I. Ttulo

CDD- 589.22


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MINISTRIO DA EDUCAO





Dissertao, apresentada Universidade Federal Rural da

Amaznia, como parte das exigncias do curso deMestrado em Agronomia, rea de concentrao Biologia

Vegetal Tropical, para obteno do ttulo de Mestre.

Aprovada em 13 de abril de 2007.

BANCA EXAMINADORA:

_____________________________________________________Bilogo Profo. Dr. Vicente Savonitti Miranda

(Orientador)

Universidade Federal Rural da Amaznia (UFRA)

_____________________________________________________Engo Agrnomo Msc. Luiz Sebastio Poltronirei

(Co-Orientador)Embrapa Amaznia Oriental

_____________________________________________________EngoAgrnomo Profo. Dr. Paulo Srgio Torres Brioso

(Co-Orientador)Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ)

_____________________________________________________Engo. Agrnomo Dr. Rafael Moyss Alves

Embrapa Amaznia Oriental

_____________________________________________________Engo. Agrnomo PhD. Clber Novais Bastos

CEPLAC/ ERJOH

_____________________________________________________

Eng

o

. Agrnomo Reitor Dr. Marco Aurlio Leite NunesUniversidade Federal Rural da Amaznia (UFRA)


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i

Agradeo a Deus, pela vida.

Aos meus pais Sandra Borges Castro e Josaf Elias Castro, os grandesresponsveis pela minha formao, pelo amor e carinho constantes, pela alegria,compreenso e incentivo durante toda a minha vida.

DEDICO

A minha irm Rbia Castro, ao meu querido filho que amo muito, CauVincius Castro Leite,

pelo apoio, carinho, amor e torcida para o meu sucesso.

OFEREO.


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ii

AGRADECIMENTOS

Agradeo a todos aqueles que tornaram possvel a realizao deste trabalho e de formaespecial:

Deus, pela vida e por nos conceder esta oportunidade de avano, possibilitando o nossoaprimoramento profissional.

Universidade Federal Rural da Amaznia (UFRA), pela oportunidade da realizao docurso.

Embrapa Amaznia Oriental e Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, pelaestrutura e oportunidade concedida na obteno de novos conhecimentos.

A CAPES pelo auxlio financeiro, mediante a concesso de bolsa de Mestrado.

Ao Professor Dr.Vicente Savonitti Miranda, pela orientao, por ter me apoiado nosmomentos mais difceis, pela confiana e pela valiosa amizade.

Ao Professor Dr. Paulo Srgio Torres Brioso, pelo apoio indispensvel nodesenvolvimento desta dissertao, pela ateno e pacincia constantes e a quem tenho

profundo agradecimento e admirao.

Ao Ms. Luiz Sebastio Poltronieri, pelas sugestes, apoio e ensinamentos, pelo exemploprofissional.

Ao Reitor Dr. Marco Aurlio Leite Nunes (UFRA), ao Dr. Clber Novais Bastos (CEPLAC), Dr. Rafael Moyss Alves (EMBRAPA) e ao Dr. Paulo Srgio Albuquerque(CEPLAC), pelas valiosas consideraes feitas nesta dissertao.

Ao Coordenador do curso de Mestrado em Agronomia da UFRA, Professor Dr. AntonioRodrigues Fernandes pela sincera dedicao ao curso.

A todos os professores do curso de Ps-graduao da UFRA, pelos valiosos ensinamentos.

A Enia Carvalho, pelo otimismo e ensinamentos em todas as etapas conduzidas no

Laboratrio de Fitopatologia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ).A pesquisadora, da Embrapa Amaznia Oriental, Dra. Socorro Padilha, pelo fornecimentodos dados sobre Gentica Molecular.

Aos grandes amigos Fernanda Moura, Nadilma Liberato e, em especial Jessivaldo Galvopela valiosa amizade, carinho, incentivos dados nos momentos difceis e valiosassugestes e sempre ser um amigo importante.

A minha grande amiga de curso Iulla Naiff, pelos incentivos, apoio nos momentos difceise pela agradvel convivncia na Embrapa Amaznia Oriental.


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D. Regina Gomes, ex-secretria do curso de Ps-graduao em Agronomia pelo prontoatendimento e incentivos.

iii

Aos tcnicos do Laboratrio da Embrapa Amaznia Oriental, em especial a D. Carmem

Costeira, Raimundo Nonato e Jos Souza, pelo apoio, auxlio e dedicao.

Aos meus amigos estagirios, bolsistas do Laboratrio de Fitopatologia e Genticamolecular da EMBRAPA: Ana Carla, Tatiana, Davi e Isaas, pelo companheirismo ealegrias compartilhadas que resultaram num reforo de nossa amizade.

Em especial, grande amiga de Laboratrio de Gentica da Embrapa Amaznia Oriental,Sivaney Ferreira que esteve ao meu lado, principalmente nas interpretaes de resultadose pela valiosa amizade.

A todos os colegas de curso, pela troca de experincia e momentos de descontrao.

minha me, minha irm e Amanda pela acolhida e por terem sido me de meu filhoCau Vincius nas horas que no pude estar presente.

minhas tias e primas: Aninha, Suely, Solange, Dayanna e Danielle, pelos grandesincentivos e apoio. E ao meu afilhado Ryan pelo carinho.

A todos que contriburam, direta e indiretamente, para realizao deste trabalho.


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iv

Em ti, S N OR, confio; nunca me deixes

confundido. Livra-me pela tua justia. SL 31:1


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v

BIOGRAFIA DO AUTOR

Carla Vanessa Borges Castro, filha de Josaf Elias Castro e Sandra Borges Castro,

nascida na cidade de Belm, estado do Par no dia 18 de Julho de 1980.

No ano de 2004, recebeu o diploma de Engenheira Agrnoma pala Universidade

Federal Rural da Amaznia.

Em 2005, iniciou o curso de ps-graduao em nvel de Mestrado em Agronomia, rea

de concentrao Biologia Vegetal Tropical para obteno do ttulo de Mestre.


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vi

SUMRIO

LISTA DE TABELAS viii

LISTA DE FIGURAS ix

LISTA DE ABREVIATURAS xi

RESUMO 15

ABSTRACT 16

1- INTRODUO 17

2- REVISO DA LITERATURA 192. 1 -Rhizoctoniaspp. 19

2. 2 Sintomatologia 22

2. 2. 1 Queima de folhas 22

2. 2. 2 Podrides de Estacas 22

2.2.3 Tombamento de mudas 22

2. 3- Caracterizaes da doena em algumas culturas

2. 3. 1- Pimenta do Reino

2.3.2- Amendoim

2.3.3- Gramneas

2.3.4- Eucalipto

2.3.4.1 Ocorrncia e distribuio geogrfica do patgeno

3.3.5- Feijo

2.3 - Mtodos de Controle

2.4 - VARIABILIDADE GENTICA VIA RAPD (Random Amplified Polymorphic

DNA)

2.5 - MEDIDAS PARA ESTIMAR A DIVERSIDADE

3 - MATERIAL E MTODOS

3.1 - Material Biolgico

3.2- Meios de cultura

3.2.1- Meio Batata Dextrose Agar (BDA)

3.2.2- Meio BD lquido

3.2.3- Cultivo do Fungo

3. 3- Isolamento e Repicagem do patgeno

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3. 4 Teste de patogenicidade

3.4.1- Isolamento

3. 5- Obteno do miclio para a extrao do DNA genmico

3. 6- Extrao do DNA dos isolados fngicos

3. 7- Quantificao e diluio do DNA genmico

3. 8- Reao de RAPD

3. 9- Amplificao do DNA RAPD

3.10- Preparo do gel 1,5%

3.11- Aplicao das amostras no gel de agarose

3. 12- Anlise dos produtos e Visualizao

3. 13- Anlise computacional dos dados4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 Crescimento micelial do patgeno

4.2 Teste de patogenicidade

4.3 Variabilidade Gentica

5- CONCLUSES

6- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

CONSIDERAES FINAIS

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viiiLISTA DE TABELAS

Tabela 1 Relao dos 13 isolados de R. solaniobtidos de diferentes plantas, para

estudos da variabilidade gentica por meio de marcadores RAPD. 31

Tabela 2 Composio do meio de cultura BDA (Batata- Destrose Agar). 32

Tabela 3 Composio do meio de cultura BD lquido. 32

Tabela 4Relao dos 22 isolados de R. solani de culturas diferentes, para estudos

referentes ao crescimento micelial, patogenicidade, clorao das colnias,

presena e/ou ausncia de microesclerdios. 33

Tabela 5 Relao dos 13 isolados de R. solani,e 1 isolado de alternaria sp. com

suas respectivas identificaes,para as reaes RAPD. 37

Tabela 6 Resumo da anlise de varincia para o crescimento micelial de

Rhizoctonia solani, oriundo de diferentes culturas 250C por 3 dias. 42

Tabela 7 Crescimento micelial em dimetro de Rhizoctonia solani oriundo de

diferentes culturas 250C por 3 dias, representados com seus respectivos

grupos. 43


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ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Ataque do patgeno causando podrido radicular e ataque nas folhas na

cultura do feijo (Phaseolus vulgarisL.). 25

Figura 2 Repicagem deRhizoctonia solani em meio de cultura BDA. 34

Figura 3 Folhas destacadas com pequenos ferimentos na superfcie foliar, para as

inoculaes com os respectivos isolados. A e B - correspondem folhas de

citrus (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e Basto do Imperador (Etlingera

elatior(Jach) R. M. Sim), com discos de 0,5 cm de dimetro com miclio

do fungo, respectivamente. 35

Figura 4 Folhas destacadas e inoculadas com discos de miclio, colocadas dentro

de sacos plsticos transparentes e umedecidas para formao de uma

cmara mida. 36

Figura 5 Esquema da reao em cadeia da polimerase (PCR). 39

Figura 6 Aplicaes das amostras de DNA no gel de agarose. 40Figura 7 Crescimento micelial e colorao das colnias de R. solanioriundas de

diferentes culturas 250C durante 10 dias. A: isolado chama (Cayaponia

espelina (Manso) Cogn), B: isolado basto do imperador (Etlingera

Elatior (Jach) R. M. Sim) e C: isolado teca (Tectona grandis L. F). 44

Figura 8 Formao de microesclerdios deRhizoctonia solaniobtidos em meio de

cultura BDA. Temperatura de 250C e umidade relativa em torno de 80%,

durante 3 a 4 dias. 45Figura 9 Sintomas tpicos de queima foliar induzida por R. solani,observados em

folhas de citrus (Citrus sinensis (L.) Osbeck), aps 3 a 4 dias de

inoculao. Temperatura de 240C e umidade relativa em torno de 80%. 46

Figura 10 Perodo de incubao (dias) nas plantas, at o aparecimento dos sintomas

em folhas destacadas, com ferimentos e sem ferimentos, inoculadas com

Rhizoctonia solani em condies laboratoriais. Temperatura de 240C e

umidade relativa em torno de 80%. 47

Figura 11 Eletroforese em gel de agarose, mostrando o polimorfismo deRhizoctonia


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solani,pela tcnica de RAPD com oprimersOPA 2. 48

Figura 12 Matriz de similaridade gentica estimada pelo ndice de Jaccard, para

todos os isolados analisados deRhizoctonia solani. 49

Figura 13 Dendrograma gerado pelo mtodo de anlise UPGMA para o coeficiente

deJaccard, a partir das 17 bandas polimrficas geradas pelo RAPD, dos

13 isolados deRhizoctonia solani e 1 isolado de alternariasp. 51


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xi

LISTA DE ABREVIATURAS

ADE: gua Destilada Esterelizada

BDA: Batata-Destrose-Agar

BD: Batata- Destrose

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

PCR: Polymerase Chain Reaction anlise pela reao em cadeia da polimerase

SJ: Coeficiente deJaccard

Embrapa: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

OPA: Operon Technologies

UV: Luz ultravioleta

NTSYS: Numerical Taxonomy and Multivariante Analysis System, verso 2, 02

UPGMA: Unweighted Pair Group Mean Average

NaOH: Hipoclorito de Sdio


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RESUMO

Rhizoctonia solani um fungo cosmopolita, com vasto nmero de hospedeiros, e causaimportantes doenas na maioria das plantas cultivadas em todo o mundo. uma espciecomplexa, com muitos bitipos que diferem quanto patogenicidade, aos hospedeiros, distribuio na natureza e aparncia em meio de cultura. Em virtude da variabilidadeexistente nos sintomas produzidos por esse patgeno, o objetivo do presente trabalho foicaracterizar morfologicamente 22 isolados e geneticamente 13 isolados deRhizoctonia solanide diferentes culturasprocedentes do Estado do Par, Japo e Estados Unidos e 1 isolado dealternaria sp. Os experimentos foram conduzidos no Laboratrio Oficial de DiagnsticoFitossanitrio vinculado a rea de Fitopatologia, do Departamento de Entomologia eFitopatologia, do Instituto de Biologia, da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro(UFRRJ) e na Embrapa Amaznia Oriental. Os parmetros morfolgicos analisados foram o

crescimento micelial, presencia e/ou ausncia de microesclerdios, a patogenicidade ecolorao dos isolados. No estudo para caracterizao gentica foi utilizado marcadoresmoleculares do tipo RAPD. A partir de fragmentos de tecido foliar lesionado foi realizado atcnica do isolamento indireto em meio de cultura BDA para se obter colnias do fungo. Comrelao ao crescimento micelial entre os isolados houve efeito significativo ao nvel de 5% de

probabilidade pelo teste F, entre os 22 isolados, sendo que variaram entre 2,14 e 7,88 cm dedimetro a 250C aps 3 dias de crescimento. A formao de microesclerdios foi somenteobservada nos isolados brasileiros, fato no encontrado nos isolados referentes aos do Japo eEstados Unidos. Os isolados mostraram-se patognicos quando inoculadas em folhas sadias.A anlise molecular, o DNA extrado dos isolados com oprimerOPA2 permitiu visualizar 17

bandas polimrficas com tamanhos que variavam entre 800 a 1800 pb, gerando 100% depolimorfismo entre os 14 isolados estudados. A similaridade entre as amostras, estimada pelocoeficiente dejaccard, foi de 21,71%, sendo gerado pelo mtodo UPGMA, um dendrogramaque permitiu agrupar os isolados em 7 grupos principais. Com base nas avaliaes realizadasconcluiu-se que h uma grande variabilidade morfolgica e gentica entre os isolados de R.solani analisados.

Palavras - chave:Rhizoctonia solani, Caractersticas Morfolgica, Variabilidade GenticaMarcadores RAPD.


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ABSTRACT

Rhizoctonia solaniis a cosmopolitan fungus, with vast number of hosts, and cause important

diseases in the majority of the plants cultivated in the whole world. It is a complex specie,with many biotypes that they differ how much to the pathogenicity, the hosts, the distributionin the nature and the appearance in culture medium. In virtue of the existing variability in thesymptoms produced for this pathogen, the objective of the present work was to characterizemorphologically 22 and genetically 13 Rhizoctonia solani isolates of different cultures fromthe State of Par, Japan and United States and 1 Alternaria sp isolate. The experiments had

been lead in the Official Laboratory of Disease Control Diagnosis entailed to the FitopatologyArea, of the Entomology and Fitopatology Department, Institute of Biology, FederalUniversity of Rio de Janeiro (UFRRJ) and in the Embrapa Eastern Amazonia. The analyzedmorphologic parameters had been the micelial growth, presence and/or absence ofmicrosclerotia, the pathogenicity and coloration of the isolates ones. In the study for genetic

characterization it was used marking molecular RAPD. From fragments of damaged leaftissue, the technique of the indirect isolation in BDA culture medium was carried through toget fungus colonies. With relation to the micelial growth between the isolates it hadsignificant effect to the level of 5% of probability for test F, between the 22 isolates, beingthat they had varied between 2,14 and 7,88 cm of diameter 250C after 3 days of growth. Theformation of microsclerotia only was observed in the Brazilian isolates, fact not found in theisolates referring to Japan and United States. The DNA extracted from the isolates used in theRAPD test with the starter OPA2 allowed to visualize 17 polymorphic bands with sizes

between 800 to 1800 pb, generating 100% of polymorphism among the 14 isolates studied.The similarity among the samples, esteem for thejaccard coefficient, it wasof 21,71%, beingit generated for method UPGMA, a dendrogram that allowed to group the isolates in 7 maingroups. On the basis of the carried through evaluations concluded that it has a greatmorphologic and genetic variability among theR. solani isolates analyzed.

Keywords: Rhizoctonia solani, morphological characteristic, genetic variability, RAPDmarkers.


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1- INTRODUO

O Brasil um dos pases mais rico do mundo em diversidade biolgica de plantas,

animais e microrganismos, alm de possuir invejvel acervo de recursos naturais edficos,

climticos, hdricos e de revestimento florstico. verdadeiramente esplendoroso o manancial

de recursos genticos autctones existentes no Brasil, capaz de assegurar o uso sustentvel do

capital bitico e abitico de forma vantajosa, com o emprego consciente do capital intelectual

(MORALES; VALOIS, 2000).

Os recursos genticos so considerados como conjunto de amostras populacionais

de vegetais, animais e microrganismos, com objetivo de tornar disponveis caracteres

genticos teis, com valor atual e potencial (ARAGN, 1997).A demanda na agropecuria por recursos genticos necessita cada vez mais da

utilizao de mtodos e processos biotecnolgicos para alcanar o seu sucesso (MORALES;

VALOIS, 2000).

De uma maneira geral, a variabilidade gentica obtida de forma mais expressiva

nos centros de origem e de diversidade das espcies, ou mesmo em linhagens preliminares ou

avanadas, ou em cultivares elites ou primitivas. Para a satisfao dessa demanda

imprescindvel que os bancos de germoplasma sejam bem caracterizados e avaliados, tantoem termos de caracteres qualitativos quanto quantitativos. A caracterizao de colees de

germoplasma pode ser realizada atravs de marcadores moleculares que permitem a deteco

de polimorfismo em nvel de DNA (SAIKI et al., 1988).

Pode-se afirmar que a biotecnologia uma ferramenta que no somente aumenta a

eficincia nos organismos utilizados, mas, principalmente, oferece novas possibilidades para

uma melhor explorao dos recursos oferecidos pela biodiversidade, transformando-se assim

em alternativas para o desenvolvimento sustentvel (MORALES; VALOIS, 2000).A diversidade biolgica ou biodiversidade freqentemente relacionada com a

diversidade de espcies, embora apresente um profundo relacionamento ecolgico e

evolucionrio (FALK, 1990). De fato, biodiversidade a variabilidade apresentada pelos

organismos vivos, dentro de espcies, entre espcies e ecossistemas (UNEP, 1992).

Conseqentemente, a variao que ocorre sob trs enfoques: genes, espcies e ecossistemas

(McNEELY et al., 1990). Assim, diversidade gentica o somatrio da informao gentica

existente nos organismos que constituem a flora, a fauna e a microbiota que, se

adequadamente identificada e capturada, passa a constituir os recursos genticos, fonte da

variao gentica disponvel ou variabilidade gentica (MORALES; VALOIS, 2000).


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A variabilidade gentica poder transformar-se em fonte de recursos estratgicos

necessrios para o sucesso dos programas de desenvolvimento e com grande demanda

internacional. Entretanto, seu valor apresenta-se aparentemente reprimido pelo

desconhecimento de suas perspectivas socioeconmicas para o agronegcio. Assim, embora

seja imperativo identificar a diversidade gentica disponvel e amostr-la com o intuito de

conserv-la, ao mesmo tempo preciso, caracteriz-la, avali-la e torn-la disponvel.

(McNEELY et al., 1990).

Tcnicas biotecnolgicas como Randon Amplified PolimorphicDNA (RAPD), ou

seja, Polimorphic DNA Amplificado Aleatoriamente constituem instrumentos para

caracterizar e avaliar o germoplasma mais rapidamente e com maior eficincia. considerada

uma das tcnicas que vem sendo mais utilizada na caracterizao das espcies eucariotas eprocariotas, tendo sido desenvolvida por Williams et al. (1990). Essa tcnica uma das

variantes da tcnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) que utiliza um nico iniciador

(primer) composto por dez pares de bases de seqncias nucleotdicas arbitrrias, tendo,

portanto, sua seqncia alvo desconhecida (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998), ao

contrrio das outras que requerem informaes prvias de seqncia de DNA alvo, para a

amplificao.

Sua utilizao possibilitou a deteco de vrios polimorfismos em diferentespopulaes e/ou indivduos atravs da presena ou ausncia dos produtos de amplificao

(WILLIAMS et al., 1990; FAIRBANKS et al., 1991). Essa tcnica devido a sua relativa

simplicidade, rapidez e baixo custo, tm atrado muitos pesquisadores e considerada a mais

empregada com o intuito de estudar a diversidade gentica de vrios fungos (FERREIRA e

GRATTAPAGLIA, 1998).

A caracterizao por meio de marcadores moleculares, combinada obtida por

descritores morfolgicos e agronmicos, parece mais apropriada para o estudo de diversidadeem bancos e colees de germoplasma. Mesmo assim, em alguns casos, podem ocorrer

discrepncias, sugerindo que padres evolutivos morfolgicos e moleculares sejam distintos.

Em colees de germoplasma, essa tcnica quantifica e visualiza a diversidade, identifica

gentipos desejveis e grupos de similaridade que possam se constituir duplicatas e, ainda,

otimiza seus manejos pela identificao dos caracteres mais informativos para serem

empregados na caracterizao e melhoramento gentico (CRUZ et al., 2004A).

Anlises genmica tm sido muito utilizadas para estudos com fungos, como por

exemplo, emRhizoctonia solani,com a finalidade de avaliar a variabilidade gentica entre e

dentro de populaes, de modo a fornecer subsdios aos programas de melhoramento. Esse


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fungo representa um grupo economicamente importante e geneticamente diverso de

patgenos de solo que ocorrem em vrias espcies de plantas em todo o mundo (VILGALYS;

CUBETA, 1994).

Com base no exposto, este trabalho teve como objetivos:

Caracterizar morfologicamente 22 isolados de Rhizoctonia solani, atravs do

crescimento micelial in vitro, presencia e/ou ausncia de microesclerdios, teste de

patogenicidade e colorao dos isolados e;

Avaliar variabilidade gentica de 13 isolados de Rhizoctonia solani e 1 isolado de

alternaria sp., utilizando-se marcadores moleculares RAPD (Random Amplified

Pholymorphic DNA).

2- REVISO DA LITERATURA

2.1-Rhizoctoniasp.

O gnero Rhizoctonia foi descrito pela primeira vez pelo micologista francs De

Candolle, em 1815, como sendo um fungo no esporulante que ataca, preferencialmente,

razes e que produz filamentos de hifas a partir de esclerdios (SNEH et al., 1991). O qual classificado como Mitosporic Fungi, Hyphomycetes, forma ordem Agonomycetales por no

produzir esporos em sua fase assexuada. Outra classificao considerando Agonomycetes

como forma-classe e Mycelia Sterilia como forma-ordem (PEREIRA, 1997).

O miclio caracterizado pela ramificao em ngulo reto com septao

imediatamente e aps o ramo, constrio na base da ramificao e septo doliporo. A fase

sexuada deste fungo Thanatephorus cucumeris, classificado no reino Fungi, filo

Basidiomycota, ordem Ceratobasidiales, Ceratobasidiaceae (BUTLER; BOLKAN, 1973,ANDERSON, 1982; ADAMS, 1988).

Segundo Botellho et al. (2001),Rhizoctonia solani um fungo cosmopolita, com vasto

nmero de hospedeiros, e causa importantes doenas na maioria das plantas cultivadas em

todo o mundo. uma espcie complexa, com muitos bitipos que diferem quanto

patogenicidade, aos hospedeiros, distribuio na natureza e aparncia em meio de cultura.

Relatos sobre isolados deRhizoctonia,fitopatognicos ou saprofticos, no descritos em nvel

especfico, so comuns na literatura devido s dificuldades na identificao impostas por

limitaes morfolgicas e taxonmicas do gnero, tais como:


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(i) Ausncia de esporos assexuais,

(ii) Instabilidade na morfologia de culturas e esclerdios, em funo de variaes nas

condies de cultivo (PARMETER; WHITNEY, 1970),

(iii) Ampla variabilidade morfolgica, sendo que h espcies constitudas por

diferentes grupos de isolados com afinidade para efetuar anastomose de hifas entre si

(OGOSHI, 1987),

(iv) Necessidade de mtodos especficos para se induzir estruturas basidiais in vitro

(CARLING; SUMMER, 1992),

(v) Desconhecimentos dos teleomorfos para algumas espcies anamrficas

(STALPERS; ANDERSEN, 1996).

O fungo sobrevive saprofiticamente no solo, infectando plantas nativas, ou em estdiode dormncia, como miclio e esclerdios. Esses propgulos so detectados no solo com

relativa facilidade, porm de difcil quantificao. Geralmente, encontram-se nas camadas

superficiais do perfil do solo, principalmente nos primeiros 10 cm, devido dependncia de

oxignio (CARDOSO, 1994).

Os sintomas apresentados pela espcie de Rhizoctonia solanivariam extensamente e

so confundidos facilmente com os sintomas das doenas produzidas por outros patgenos.

Atuam em regies de temperaturas elevadas e chuvas freqentes acompanhadas de altaumidade (95%), que o tornam de primordial importncia dentre os fatores limitantes ao

cultivo de vrias culturas, cuja maioria so plantas cultivadas, como beterraba, pepino,

cenoura, berinjela, melo, tomate, melancia, repolho, alface, feijo, soja, figo, algodo, feijo-

caupi e arroz, alm de plantas nativas (MATZ, 1917, MATZ, 1921, ATKINS e LEWIS 1952,

ZAUMEYER e THOMAZ 1957, Instituto Interamericano de Cincias Agrcolas 1962,

DANIELS 1963, FLENTJE et al.1963 a, LUKE et al.1974, Cooperacin..1978).

Este fungo representa um grupo economicamente importante e geneticamente diversode patgenos de solo que ocorrem em espcies de plantas em todo o mundo (VILGALYS;

CUBETA, 1994).

O critrio de classificao deRhizoctoniaspp. est baseado na citomorfologia da hifa,

morfologia da cultura, morfologia do teleomorfo, e o padro de anastomose ou no de hifas

(SNEH et al., 1991). Embora Rhizoctonia solani seja um organismo muito importante, no

Brasil informaes sobre caractersticas dos isolados deR. solaniassociados a vrias culturas

so escassas. Caracterizado por ser extremamente polfago e apresentar grande capacidade

saproftica no solo, podem invadir as razes das plantas, causando uma podrido levando at a

morte. Os esclerdios, abundantemente produzidos na natureza, quando a uma fase de alta


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umidade segue-se um perodo seco (NEWMAN LUZ, 1978), e o miclio do fungo constituem

o inculo primrio (GALINDO et al. 1983) que so disseminados localmente pelo vento,

chuva e a movimentao do ser humano, animais e implementos agrcolas (WEBER, 1939;

ONESIROSAN, 1975). Sementes infectadas tambm so importantes fontes de inculo

primrio (ONESIROSAN, 1975).

O fungo sobrevive como esclerdios ou hifas espessadas nas plantas. Os esclerdios

so responsveis, tambm, por focos secundrios de infeco (WEBER 1939;

ONESIROSAN, 1975), ou podem permanecer no solo, servindo de inculo primrio para

culturas subseqentes (CARDOSO, 1981). Sobrevive de um ano para o outro em plantas e

em restos de cultura. A penetrao desse fungo se d atravs das paredes celulares da

epiderme da raiz ou hipoctilo com a subseqente invaso, pelo miclio dos tecidos da planta,que acabam por serem degradados pela ao de enzimas ou toxinas (KRUGNER, 1980).

A tendncia atual para classificao dos diversos isolados do R. solani atravs da

reao de anastomose de hifas. Essa reao tem explicaes na taxonomia em virtude da

possibilidade de divises sub-especficas (PARMETER JUNIOR et al.,1969; SHERWOOD,

1969; PARMETER JUNIOR e WHITNEY, 1970).

A taxonomia deste fungo ainda no foi totalmente elucidada, devido diversidade

ultra-estrutural da espcie, atribuindo-se esta variao a inconsistncia na caracterizao doestgio assexuado do fungo, as dificuldades na produo de esporulao sexuada em

condies controladas e sua deteco na natureza (CARDOSO 1981).

Marcadores moleculares e bioqumicos complementam a identificao e a

caracterizao de isolados de Rhizoctonia (HALL, 1973; SNEH et al., 1991; VILGALYS e

CUBETA, 1994). Vrios estudos demonstraram o potencial da eletroforese de protenas e

isoenzimas na caracterizao de grupos de anastomose emRhizoctonia spp. (REYNOLDS et

al., 1983; LIU et al., 1990; LIU & SINCLAIR, 1992; LIU e SINCLAIR, 1993; LIU et al.,1993).


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2. 2 - Sintomatologia

2. 2. 1 Queima de folhas

A queima de folhas em jardim clonal e no campo tem como sintomas uma colorao

cinza nas reas queimadas, ataque em reboleira, desfolha precoce tendo algumas folhas

dependuradas nas hifas, e morte. Esses sintomas so precedidos pelo desenvolvimento de

miclio epiftico ascendente nas hastes, galhos e ramos. Outro fato importante que esses

rgos atacados ficam repletos de esclerdios, os quais so as estrutura de resistncia do

patgeno (REZENDE e FERREIRA, 1992; FERREIRA, 1991).

2. 2. 2 Podrides de Estacas

A podrido de tem como sintomas as leses escuras que geralmente progridem da base

para o pice da estaca, e em alguns casos podem existir leses intercalares, ou seja, leses

delimitadas acima e abaixo por tecidos sadios (FERREIRA, 1989).

2.2.3 Tombamento de mudas

O tombamento de mudas est mais associado a plantios realizados por sementes doque por estacas. Comumente essa doena se manifesta em pr e ps-emergncia. No

tombamento em pr-emergncia, as mudas aparecem mortas com folhagens murchas ou secas,

dependendo do estdio em que so observadas. Outros sintomas so as leses que anelam a

haste das mudas e possuem colorao variando de marrom-arroxeadas a marrom-escuras. Nas

sementeiras a doena ocorre na forma de reboleira e atinge o nvel do coleto. Um sintoma

facilmente observado a olho n o anelamento que ocorre na proximidade do coleto,

especialmente nas mudas mais desenvolvidas que possuem leses mais escuras na haste(FERREIRA, 1989).


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2. 3- Caracterizaes da doena em algumas culturas

2. 3. 1- Pimenta do Reino

Segundo Duarte e Albuquerque (2005), a doena afeta plantas de pimenteira-do-reino

em viveiros ou jardim clonal. Distingue-se da queima-do-fio por causar sintomas em

reboleiras e por no formar fios de miclio por meio dos quais as folhas se prendem aos

ramos. A doena inicia a partir de leses diminutas de cor parda envolvidas por um halo de

cor prpura. Com a evoluo parte da folha ou toda a folha torna-se necrosada. Na face

inferior observam-se hifas entrelaadas formando uma tnue teia. Quando folhas secas se

desprendem, ficam aderidas s folhas sadias pela ao do orvalho ou de chuva, iniciando

novas infeces. Nas hastes causa leses e queima dos tecidos. Se as inflorescncias e espigas

so atingidas ocorre queima e queda de flores e frutos.

2.3.2- Amendoim

Rhizoctonia solaniKuhn causa no amendoim, morte de sementes, damping-off de pr

e ps-emergncia, podrides de razes e de vagens e queima de folhas em plantas adultas. No

Estado de So Paulo tem sido mais frequentemente relatada como damping-off, podrides de

vagens e de ginforos. Devido a sua alta freqncia e s condies favorveis em So Paulo,

pode-se afirmar que constitui um dos mais srios problemas. (BARRETO E SCALOPPI,

1999). Os sintomas so:

Manifesta-se na forma de damping-off de pr ou ps-emergncia, ocasionando o

tombamento.

As hastes prximas do solo podem ser atacadas pelo fungo, que causa leses

circulares, marrons e podem matar o ramo.

R. solanipode infectar ainda os ginforos, impedindo a formao de vagens.

Se a infeco mais tardia, o fungo causa podrido das vagens, evidente s prximo

da colheita.

Esta podrido se manifesta por uma mancha parda a preta, tomando parcial ou

totalmente a casca da vagem.

Em muitos casos, a vagem fica chocha ou com sementes mal formadas, menores,

enrugadas e desbotadas (BARRETO E SCALOPPI, 1999).


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2.3.3- Gramneas

De acordo com Verzignassi e Fernandes (2001), o Brasil tem ntida vocao para a

pecuria e j conta com cerca de 100 milhes de hectares de pastagens cultivadas compostas,principalmente, por gramneas do gnero Brachiaria, especialmente B. decumbens e B.

brizantha. Estes extensos monocultivos representam um risco ao equilbrio do ecossistema,

facilitando a propagao de pragas e doenas.

Mais recentemente, e em reas com precipitao anual superior a 1.800 mm (norte de

Mato Grosso, Rondnia e Acre) foram constatados danos severos em Brachiaria spp.

causados porR. solani. No Estado do Par, em 2001, foi constatada a morte deB. brizantha

cv. Marandu causada pelos fungos Pythium perillumassociado aR. solani, atingindo cerca de60 mil hectares. R. solani foi tambm detectado causando damping-off em plntulas de

Stylosanthes scabraem Mato Grosso do Sul (VERZIGNASSI E FERNANDES, 2001).

2.3.4- Eucalipto

2.3.4.1 Ocorrncia e distribuio geogrfica do patgeno

Em Kerella, ndia, Rhizoctonia solani Khn, foi relatada como um dos principais

patgenos em viveiros florestais (SILVEIRA, 1996). Na maioria das regies brasileira a

mesma espcie predomina emEucalyptus spp.,causando queima de folhas em jardim clonal e

no campo, mela de estacas e tombamento de mudas (SANTOS et al., 1996; REZENDE e

FERREIRA, 1992; FERREIRA 1991; CARVALHO et al., 1989; ALFENAS et al., 1988).

Embora, outras espcies j tenham sido relatadas (SILVEIRA, 1996; FERREIRA et al.,

1995).

A queima de folhas foi relada pela primeira vez no Brasil por ALFENAS et al. (1988),

em jardim clonal na regio de Belo Oriente, Minas Gerais.

Em 1989, CARVALHO et al. (1989) e VITTI et al. (1989), relataram como

Rhizoctonia sendo um dos patgenos mais associados com a queda na porcentagem de

enraizamento de estacas de eucalipto em casas de vegetao, devido podrido de estacas.

Conforme FERREIRA (1991), houve nesse ano uma severa queima de folhas em

plantas hbridas entre Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, causadas por linhagens

esclerodiais deR. solaniem jardim clonal e no campo, na regio do Vale do Rio Jari, estado

do Par.


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REZENDE e FERREIRA (1992) descreveram a ocorrncia de queima de folhas, em

jardim clonal e em plantaes comerciais no Sul da Bahia, ocasionando desfolha precoce de

rvores em reboleira de at 0,3 ha, e em algumas rvores a queima atingiu at mais de quatro

metros de altura. Novamente, SANTOS et al. (1996), relataram queima de folhas no

municpio de Benevides, estado do Par, em E. urophylla x E. grandis, procedncia Jari e

Albas.

Rhizoctonia, mesmo no setor floresta, possui uma ampla gama de hospedeiro, onde

causadora de podrido de razes, leses em hastes, tombamento de mudas, manchas foliares,

mela e queima de folhas (FERREIRA, 1989; CARVALHO et al., 1989; ALFENAS et al.,

1988; CARVALHO et al., 1987).

3.3.5- Feijo

A doena Rizoctoniose e/ou podrido-radicular, mela ou murcha da teia miclica de

Rhizoctonia (Rhizoctonia solaniKhn) em feijoeiro (Phaseolus vulgarisL.) sendo uma das

doenas radiculares mais comuns e de maior nocividade no Brasil (CARDOSO, 1990). Os

danos que a doena causa a planta so: tombamento da cultura, cancro do talo, podrido

radicular (Figura 1A), podrido da vagem, ataque das folhas (Figura 1B) e atraso naemergncia e desenvolvimento da planta.

A B

Figura 1: Ataque do patgeno causando podrido radicular e ataque nas folhas na cultura do

feijo (Phaseolus vulgarisL.).


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2.3 - Mtodos de Controle

O controle inclui o emprego de semente de boa qualidade, o tratamento da semente

com fungicidas e prticas culturais, como a rotao de culturas com espcies resistentes

(gramneas), a eliminao de restos culturais e a diminuio da profundidade de semeadura

para permitir a emergncia mais rpida das plntulas (VIEIRA; RAVA, 2000). difcil e at

mesmo anti-econmico, inviabilizando por exemplo o plantio da cultura do feijo,

principalmente em reas sob piv central. O sistema radicular e a parte area da espcie so

atacados pelo fungo, formando leses que restringem o desenvolvimento das mesmas ou

causam a sua morte (CARDOSO, 1990).

Uma das alternativas de controle para o patgeno seria o aproveitamento dasupressividade natural a esse patgeno que ocorre em alguns solos. O potencial supressivo a

vrios patgenos de solo, reduzindo a manifestao de doenas mesmo sob alta densidade de

inculo e condies propcias ao desenvolvimento da doena, acontece em vrios solos

(COOK; BAKER, 1983).

Alguns fatores fsico-qumicos do solo, como o pH, atuam na supressividade de alguns

solos a certos patgenos radiculares. Porm, quando se trata do mesmo ou de outro patgeno

em solos diferentes, este carter modificado (WHIPPS, 1997). O pH uma caractersticaqumica muito varivel e que se modifica em funo de prticas como a calagem e aplicao

de adubos acidificantes, os quais podem causar a perda ou a diminuio da supressividade

natural de um solo.

Segundo Chet e Baker (1980), ao alterarem o pH inicial de um solo de 8,1 para 5,7 e

6,5, observaram uma menor incidncia de tombamento causado porR. solaniem plntulas de

alfafa, beterraba e rabanete. Alm disso, constataram que o fungo teve um melhor

crescimento em meio de cultura com pH variando de 6,5 a 7,5. Baixos valores de pH tambminibiram a ocorrncia do patgeno em trigo e em centeio causado por Gaeumannomyces

graminis, principalmente quando se utilizou uma adubao amoniacal (MARSCHNER,

1986). O controle de diversas doenas causadas por patgenos de solo, tais como Sclerotium

rolfsii,Rhizoctonia solani e Plasmodiophora brassicaetem sido satisfatrio com a aplicao

de corretivos (PUNJA, 1989; citado por ZAMBOLIM e VENTURA, 1993). Altos nveis de

alumnio trocvel tambm esto relacionados com a supressividade natural de alguns solos a

R. solani(KOBAYASHI; KO, 1985).

A presena de microrganismos antagnicos e competidores aos patgenos de solo

permitem uma boa sanidade do sistema radicular das plantas ou a manuteno da populao


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destes em nveis no prejudiciais ao hospedeiro, em funo de um tamponamento microbiano

(HOMECHIN, 1991). Muitos microrganismos so isolados e relacionados com a

supressividade de alguns solos (WHIPPS, 1997). Contudo, um solo biologicamente

supressivo provavelmente no poder ser explicado em termos de um nico antagonista

(REIS,1991).

2.4 - VARIABILIDADE GENTICA VIA RAPD (Random Amplified PolymorphicDNA)

A caracterizao molecular tem sido realizada com vrios objetivos, dentre eles tm-

se a quantificao da diversidade e a determinao da estrutura genmica. A interpretao da

diversidade feita por meio de uma medida de dissimilaridade, quase sempre visualizada pormtodos de agrupamento. J os nveis de variao gentica podem ser obtidos por vrios

procedimentos, como pela anlise de varincia molecular. Marcadores moleculares permitem

acessar o gentipo e a variabilidade do DNA das plantas e microorganismos, para

identificarem polimorfismo e associar os genes de efeito maior (MILACH, 1998).

Tem-se observado o avano de vrias tcnicas que permitem identificar

variabilidade em nvel de DNA. Pode-se verificar atravs do estudo de DNA, a existncia de

um grande nmero de marcadores genticos polimrficos, os quais so amplamente utilizadosna identificao de paternidade, no mapeamento gentico e nos estudos evolucionrios

(BECCKMANN, 1989; GIBSON e SMITH, 1989; WILLIAMS et al.,1990).

Aps o desenvolvimento da reao em cadeia da polimerase (PCR) por SAIKI et al.

(1988), muitos estudos ao nvel de marcadores moleculares tornaram-se possveis ou

simplificados. A reao envolve um processo cclico, no qual a enzima DNA-polimerase

permite que o DNA de uma regio selecionada do genoma seja amplificado vrias vezes, para

qual so fornecidos os iniciadores (primers oligonucleotdeos especficos).Ento, o ciclo se repete e em cada ciclo o nmero de cpias da seqncia alvo

duplicado, resultando numa amplificao exponencial (LANDDERGREN, 1993; ALBERT,

1997; SOUTO et al., 2000).

A tcnica RAPD foi descrita, inicialmente, por dois grupos de pesquisadores:

Williams et al. (1990), que a denominaram deRandom Amplified PolymorphicDNA (RAPD)

e por Welsh e McClelland (1990), com o nome de Arbitrarily Primed Polymerase Chain

Reaction (AP-PCR) (citados por MILACH, 1998). Embora as verses sejam distintas nos

detalhes tcnicos, so iguais no fundamento, pois se baseiam na amplificao de fragmentos

de DNA por PCR (Polymerase Chain Reaction), seguida da separao desses fragmentos por


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eletroforese em meio semi-slido e visualizao, com o auxlio da colorao em brometo de

etdio e exposio em luz ultravioleta (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998; MILACH,

1998).

Segundo Borm e Miranda (2005), esta tcnica (PCR) consiste em extrair o DNA

dos indivduos a serem analisados e submet-lo s reaes de amplificao, utilizando-se um

iniciador de polimerizao do DNA diferente de cada vez. Um produto de amplificao

gerado para cada regio cromossmica flanqueada por um par de stios de iniciao,

distanciada no mximo 5 kb (quilo bases nucleotdicas) uma da outra e na orientao

apropriada. Indivduos geneticamente distintos produzem diferentes padres de fragmentos

amplificados. O processo de amplificao de fragmentos consiste na desnaturao do DNA -

molde, na hibridizao do iniciador com a fita simples do DNA, com base na homologia deseqncia e na polimerizao da seqncia complementar ao DNA - molde. Esse ciclo de

separao da fitas da hlice dupla, hibridizao e polimerizao so repetidos inmeras vezes

com o objetivo de amplificar a seqncia reconhecida pelos iniciadores no genoma. Aps a

amplificao, os fragmentos so separados por eletroforese em gel de agarose. Para

observao das bandas de DNA, o gel corado com brometo de etdio e elas so visualizadas

sob luz ultravioleta.

No caso do RAPD, o DNA a ser amplificado desnaturado pelo aquecimento daamostra (a 940 C). Na presena da DNA polimerase e de dNTPs, os iniciadores se hibridizam

(a 550C) com seqncias especficas do DNA- molde, dando incio sntese (a 750C) do

novo DNA. O primeiro ciclo caracterizado por um produto de comprimento indeterminado,

que se acumula em progresso aritmtica. Entretanto, a partir do segundo ciclo so produzidos

segmentos curtos, que se acumulam exponencialmente a cada ciclo sucessivo de amplificao,

resultando em milhes de fragmentos aps 20 a 40 ciclos (BORM e MIRANDA, 2005).

Diversas tcnicas esto disponveis para a deteco da variabilidade gentica naseqncia do DNA, indicando polimorfismos existentes. GODOY (2005) diz que a utilizao

de tcnicas moleculares permite a identificao de pontos de referncia do DNA,

denominados de marcadores genticos.

Os distintos tipos de marcadores moleculares hoje disponveis diferenciam-se pela

tecnologia utilizada para revelar a variabilidade em nvel de DNA, e assim variam quanto

habilidade de detectar diferenas entre indivduos. (POLASTRE, 2002). Segundo MILACH

(1997), as metodologias para identificar os principais tipos de marcadores moleculares podem

ser classificadas em dois grupos: por hibridizao ou por amplificao de DNA.

Entre os identificados por hibridizao esto os marcadores RFLP (Polimorfismo de


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Comprimento dos Fragmentos de Restrio) e Minissatlites ou Locos VNTR (em ingls

Variable Number of Tandem Repeats"). Dentre os revelados por amplificao incluem o

marcador do tipo: RAPD (Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso), Microssatlites e

AFLP (Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados).

A classe de marcadores identificados por amplificao de DNA com variaes na

PCR, em comparao com as tcnicas que envolvem a hibridizao de DNA, geralmente, de

custo relativamente menor, mais fcil e de menor tempo para a obteno dos resultados

(MILACH, 1998; FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).

Williams et al. (1990) e Welsh e Mcclelland (1990) propuseram uma outra tcnica

para obteno de polimorfismos de DNA, baseada na amplificao de seqncias de DNA ao

acaso pela reao em cadeia de polimerase (PCR) com primers arbitrrios, denominada deRAPD. O polimorfismo detectado pela presena de um fragmento especfico amplificado

em um indivduo comparado com a ausncia do mesmo em outro indivduo (WILLIAMS et

al., 1990; FAIRKANKS et al., 1991). Como os stios de ligao do iniciador esto

distribudos ao acaso pelo genoma, polimorfismos nestes stios resultam em diferentes

produtos de amplificao (BARDAKCI e SKIBINSKI, 1994).

A natureza molecular do polimorfismo RAPD no inteiramente conhecida.

Entretanto, evidencias experimentais indicam que diferenas de apenas um par de base(mutaes de ponto) so suficientes para causar a no complementaridade do iniciador

(seqenciador) de iniciao e assim impedir a amplificao de um segmento com o stio

(WILLIAMS et al.,1990). Outras fontes de polimorfismo podem incluir delees de stios de

iniciao ou insero que colocam dois stios de iniciao adjacentes a uma distncia acima

daquela que a DNA polimerase capaz de percorrer. Assim, o polimorfismo gentico

detectado pelos marcadores RAPD tem natureza binria, isto , o segmento amplificado

(banda no gel) est presente ou ausente (POLASTRE, 2002).Pela tcnica de RAPD, a deteco de vrios polimorfismos simples, fcil, rpida e

necessita de pequenas quantidades de DNA genmico (HU e QUIROS, 1991; WILLIAMSet

al., 1990). Essa tcnica tornou-se amplamente utilizada para a identificao de marcadores

genticos associados a determinados fentipos para estudos de variabilidade gentica, assim

como para a identificao de organismos e na resoluo de grupos taxonmicos (ROSATOet

al., 2002).

Sua rapidez uma das vantagens na caracterizao de recursos biolgicos quando

comparada com as anlises de isoenzimas ou RFLP (ANDERSEN e FAIRBANKS, 1991). A

no discriminao dos heterozigotos uma das desvantagens dessa tcnica. Como os


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marcadores RAPD se comportam como marcadores genticos dominantes, no so possveis

distinguir se a presena de uma banda gerada pela amplificao de um loco homozigoto ou

heterozigoto (WILLIAMS et al., 1990).

A diversidade gentica a poro hereditria de uma variao possvel de ser

observada e mensurada (MORALES; VALOIS, 2000). Segundo esses autores, pode ser

empregado como termo alternativo para representar a variao gentica, indicando o

somatrio da informao gentica conhecida e potencial. Logo, quantifica o nmero de

gentipos possveis de ser detectado em uma populao ou em qualquer hierarquia. Assim

sendo, a caracterizao com o uso de marcadores moleculares tem sido til, em virtude da

diversidade, em nvel molecular, ser bem maior que a morfolgica (MHLEN, 1999).

2.5 - MEDIDAS PARA ESTIMAR A DIVERSIDADE

H duas maneiras bsicas para se inferir a diversidade gentica: uma de natureza

quantitativa e outra preditiva (CRUZ e CARNEIRO, 2003). Segundo esses autores, dentre os

mtodos quantitativos tm-se as anlises dialticas, mas, a aplicao no apropriada, por ser

extremamente trabalhosa e de alto custo. J os mtodos preditivos so viveis e tomam por

base as diferenas morfolgicas, agronmicas e moleculares, quantificando-as por algumamedida de dissimilaridade que expressa o grau de diversidade gentica entre os gentipos.

Assim, trs medidas de dissimilaridades podem ser aplicadas para representar a diversidade

em colees de germoplasma, que se diferenciam com o tipo de varivel obtida, ou seja, se

quantitativas, binrias ou multicategricas (CRUZ e CARNEIRO, 2003). Porm,

independente da varivel, essas medidas so freqentemente interpretadas e visualizadas por

tcnicas multivariadas.

Para dados moleculares, onde se obtm uma matriz composta por dados binrios,representados pelo nmero 0 (ausncia) e 1 (presena de bandas), aplicam-se vrios ndices de

similaridades que variam de 0 a 1, sendo as dissimilaridades obtidas de seus complementos

(CRUZ et al., 2004; CRUZ e CARNEIRO, 2003). As propriedades matemticas e genticas

dos coeficientes de dissimilaridades, obtidos de freqncias allicas, e dos de similaridades,

gerados de dados binrios, empregados em marcadores moleculares, foram amplamente

discutidas por REIF et al. (2005). Segundo esses autores, quando os dados so obtidos por

marcadores que geram alelos no informativos ou so organizados em uma matriz binria,

eles permitem a anlise apenas pelo uso de coeficientes de similaridade e destacaram trs

deles como os mais importantes: o de coincidncia simples (SSM), o de Jaccard(SJ) e o de


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Dice(SD), sendo que os dois ltimos no contabilizam valores nulos (00). Relataram, ainda,

que complementos aritmticos desses coeficientes representam dissimilaridades (d = 1 - S), as

quais tm propriedades de distncias e que a dissimilaridade obtida pelo complemento

aritmtica do coeficiente de Dice (dD) tambm pode ser denominada de distncia de Nei-Li.

3 - MATERIAL E MTODOS

3.1 - Material Biolgico

O trabalho foi desenvolvido no Laboratrio Oficial de Diagnstico Fitossanitrio

vinculado a rea de Fitopatologia, do Departamento de Entomologia e Fitopatologia, doInstituto de Biologia, da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ) e na

Embrapa Amaznia Oriental (Belm/ PA).

Foram fornecidos pelo Laboratrio da UFRRJ 1 isolado de alternariasp. e 2 isolados

deRhizoctonia solanido grupo de anastomose: AG4 e AG7, provenientes de solos do Japo e

Estados Unidos, respectivamente e 11 isolados deR. solani, todos provenientes da parte area

foliar de diferentes culturas (Tabela 1)pertencentes micoteca da Embrapa (12721S e

483016, com altitude de 10,8m). O clima local, segundo a classificao de Koppen,

corresponde ao tipo quente e mido (Afi), caracterizado por uma estao chuvosa com

precipitao mdia de 2.740 mm, temperatura mdia de 260C e umidade relativa do ar

prxima de 80%.

TABELA 1: Relao dos 13 isolados deR. solaniobtidos de diferentes plantas, para estudos

da variabilidade gentica por meio de marcadores RAPD.

CULTURAS NOME CIENTFICOACCIA Accia farnesiana(L.) Willd.

BASTO DO IMPERADOR Etlingera elatior (Jach) R. M. Sim

CAF Coffea arbicaL.

CITRUS Citrus sinensis(L.) Osbeck

CUPUAU Theobroma grandiflorum(Willd. ex Spreng.)

CHAMA Cayaponia espelina (Manso) Cogn.

MELANCIA Citrullus vulgaris Schrad

MILHO Zea mays L


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NIM Azadirachta indica A. Juss

PUERRIA Puerria phaseoloides(Roxb.) Benth

RCULA Euruca sativa (L.) Cav.

AG4 _______

AG7 _______

3.2- Meios de cultura

3.2.1- Meio Batata Dextrose Agar (BDA).

TABELA 2. Composio do meio de cultura BDA (Batata- Destrose - Agar).

Composio do meio de cultura Quantidade

Batata 100 g

Agar 15 g

H2O Destilada 200 ml

A batata foi cozida por 30 minutos em 200 mL de gua e filtrada em gaze sendo

adicionado o Agar. O pH foi ajustado para 6,8 com NaOH 1 N, seguido de autoclavagem a1200C durante 20 minutos.

3.2.2- Meio BD lquido.

TABELA 3. Composio do meio de cultura BD lquido.Composio do meio de cultura Quantidade

Batata 100 g

H2O Destilada 200 ml

3.2.3- Cultivo do Fungo

Os isolados foram cultivados em meio batata-dextrose-gar (BDA), a 250C, e

posteriormente repicados para meio lquido (MILLS et al., 1994) e mantidos sob agitao no

escuro, durante 7 dias. Aps isto, o miclio de cada isolado foi filtrado sob vcuo e recolhido

para placas de Petriesterilizadas e liofilizados.


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NIM Azadirachta indica A. Juss

PEPINO Cucumis sativus L.

PUERRIA Puerria phaseoloides(Roxb.) Benth

REPOLHO Brassica oleracea

RCULA Euruca sativa (L.) Cav.

SOJA Glycine max(L.) Merr.

SORRISO DE MARIA Astertradescantii L.

TECA Tectona grandis L. F.

URUCUM Bixa orellanaL.

PIMENTA DO REINO Piper nigrumL.

Cada isolado deR. solanifoi semeado em 3 placas de Petri contendo meio BDA. As

placas foram mantidas em incubadora a uma temperatura constante de 250C no escuro.

O crescimento micelial foi avaliado em intervalos de 24 horas, pela medio do

dimetro da colnia em dois sentidos diametralmente opostos, com auxlio de uma rgua

milimetrada.

Figura 2:Repicagem deRhizoctonia solani em meio de cultura BDA. Universidade Federal

Rural do Rio de Janeiro, 2007.

Os dados obtidos, com relao ao crescimento do miclio, foram submetidos anlise

estatstica utilizando o programa SISVAR, sendo a mdia dos tratamentos comparados pelo

teste de Scott-Knot a 5% de probabilidade.


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3. 4 - Teste de patogenicidade

3.4.1- Isolamento

No teste de patogenicidade dos isolados fitopatognico, avaliou-se a presena ou

ausncia de sintomas. Foram utilizadas folhas sadias destacadas de 22 plantas (Tabela 4),

coletadas no campo e desinfetadas superficialmente com gua e sabo.

Placas de Petricom 9 cm de dimetros contendo meio BDA, foram retirados pequenos

discos de miclio de 0,5 cm de dimetro, dos diferentes isolados fngicos, colnias puras e

depositados sobre as folhas, previamente desinfetadas e ferida com auxlio de uma agulha

esterilizada, em pontos eqidistantes. Para tratamento controle (testemunha) foram utilizados

discos de BDA, porm sem o inoculo, e depositados na superfcie foliar conforme ilustra a

Figura 3.

A B

Figura 3:Folhas destacadas com pequenos ferimentos na superfcie foliar, para as inoculaes

com os respectivos isolados. A e B - correspondem folhas de citrus (Citrus sinensis (L.)

Osbeck) e Basto do Imperador (Etlingera elatior(Jach) R. M. Sim), com discos de 0,5 cm dedimetro com miclio do fungo, respectivamente. Embrapa Amaznia Oriental, Belm PA,

2007.

Em seguida, as folhas inoculadas e testemunha (Figura 4) foram colocadas em

temperatura de 240C dentro de sacos plsticos transparentes e umedecidas com ADE para

formar uma cmara mida, para posterior anlise. E com a base do pecolo envolvido por

algodo hidratado com gua.

Diariamente foram feitas observaes para registrar o perodo de incubao,

caracterizado pelo espao de tempo decorrido entre a inoculao e o aparecimento dos


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sintomas.

Figura 4:Folhas destacadas e inoculadas com discos de miclio, colocadas dentro de sacos

plsticos transparentes e umedecidas para formao de uma cmara mida. Embrapa

Amaznia Oriental, Belm PA, 2007.

3. 5- Obteno do miclio para a extrao do DNA genmico

Aps 4 dias de crescimento do fungoRhizoctonia solani em placa depetri, trs discos

de miclio, de cada isolado, com aproximadamente 0,5 cm de dimetro, foram transferidospara frascos deErlenmeyers de 250 ml contendo 100 ml do meio lquido BD, a fim de obter-

se o miclio do fungo. Em seguida, os Erlenmeyers foram colocados em um agitador

horizontal com velocidade mxima de 143 rpm a uma temperatura que variava de 240a 270C

por um tempo de 72 horas. Aps quatro dias, o miclio foi coletado, coado em papel de filtro

e colocado na bomba a vcuo.

As reaes foram desenvolvidas de acordo com protocolo de Williams et. al. (1990).

3. 6- Extrao do DNA dos isolados fngicos

Para extrao do DNA dos 14 isolados, conforme apresenta a Tabela 5, sendo que um

isolado de alternariasp, utilizou-se o produto DNAzol. O DNA genmico foi extrado de 50

mg de miclio, previamente macerado em nitrognio lquido, utilizando-se o protocolo de

extrao de Williams et al.(1990), com pequenas modificaes.


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TABELA 5. Relao dos 13 isolados de R. solani, e 1 isolado de alternaria sp com suas

respectivas identificaes,para as reaes RAPD.

CULTURAS Identificaes dos Isolados/ RAPD

CHAMA R1

RCULA R2

BASTO DO IMPERADOR R3

CUPUAU R4

MELANCIA R5

PUERRIA R6

AG7 R7

AG4 R8

NIM R9

CITROS R10

Alternariasp. A11

MILHO R12

ACCIA R13

CAF R14

Aps a formao de um p, foi adicionado 600 L do produto DNAzol. e o macerado

foi transferido imediatamente para um tudo de eppendorfde 1,5 ml.

Em seguida foi levado ao Fisher Vortex Genie 2, por 5 minutos, e adicionou-se 600

L de um solvente orgnico CIA (Clorofrmio- lcool Isoamlico - 24:1), sendo

homogeneizado e centrifugado durante 10 minutos numa velocidade mxima de 12.000 rpm,

para a separao das fases orgnicas e aquosas. E novamente os tubos foram colocados ao

Fisher vortex Genie 2, durante 5 minutos.A fase aquosa foi transferida cuidadosamente para um novo tubo (500 L), de modo

que as duas fases formadas no fossem novamente misturadas. O sobrenadante foi transferido,

e o DNA foi precipitado com etanol absoluto gelado a uma temperatura de 4 0C (450 L).

Foram agitadas as amostras para formar uma emulso homognea, invertendo os tubos de seis

a oito vezes e deixando-os em repouso em temperatura ambiente por cinco minutos.

Os tubos foram novamente centrifugados em uma microcentrfuga com a velocidade

mxima de 12.000 rpm durante cinco minutos, para que o DNA fosse precipitado, formando opellet. Posteriormente, fez-se a lavagem dos pellets com o mix concentrado: 1 volume de


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DNAzol + 0,75 volume de etanol absoluto. Em seguida, adicionou-se 600 L deste mix nas

amostras e o pellet foi ressuspendido com o auxlio da ponteira. Foi realizada uma ltima

centrifugao de cinco minutos a 12.000 rpm. Retirou-se cuidadosamente todo o etanol e os

pellets foram colocados para secar por aproximadamente uma hora a 370C em banho maria

(DAIGGER. DRY BATH). Em seguida, foram adicionados 30 L de gua ultra-pura para

posterior quantificao.

As amostras de DNA quantificadas foram armazenadas em um freezer (-200C) para

uso nas reaes de RAPD.

3. 7- Quantificao e diluio do DNA genmico

Os DNAs extrados foram submetidos eletroforese horizontal e quantificados em gel

de agarose a 1%, visualizado em luz ultravioleta, a partir da comparao de concentraes

crescentes de DNA lambda (20, 50, 100 e 200 ng/L). Utilizou-se 5 L de DNA,

adicionando-se 2 L de tampo de carregamento e 4 L de gua destilada e autoclavada.

Aps a quantificao, os DNAs foram diludos a partir da amostra total com gua

destilada e autoclavada na concentrao de trabalho, 5 ng/L. As alquotas foram

armazenadas a 20 C.A diluio do DNA foi realizada considerando-se a frmula C .V = C1 .V1 , onde:

C = a concentrao lida de DNA na quantificao;

V = o volume desejado a ser pipetado do DNA concentrado;

C1 = a concentrao de trabalho correspondente a 5 ng/ L;

V1 = o volume final correspondente a 500 L .

3. 8- Reao de RAPD

O protocolo utilizado foi o descrito por Williams et al. (1990) com pequenas

modificaes. As reaes de amplificao foram realizadas em um volume final de 13 L

contendo gua destilada autoclavada, tampo para PCR (20 mM de Tris HCl pH 8,0 e 50 mM

de KCl), 2 mM de MgCl2, 1 mM dNTP, BSA purificada (2,5 ng/ml), primer arbitrrio 1,3

mM, 1 U.I. de Taq polimerasee 15 ng de DNA genmico.


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3. 9- Amplificao do DNA RAPD

A amplificao foi baseada em mtodo descrito por Williams et al. (1990), usando um

primerde dez pares de bases nucleotdicas, da marca Operon Technologies Inc., Alameda,

CA, EUA (OPA2 e OPA3), em tubos de 0,2 ml.

As amplificaes foram realizadas em termociclador PCR Express HyBAID, sendo

executados 40 ciclos de 920 C a 1 minuto (desnaturao das fitas de DNA), 360 C a 1 minuto

(anelamento do iniciador), 720C a 2 minutos (extenso e polimerizao pela enzima Taq

DNA-polimerase), seguido de um ciclo final a 720C por 10 minutos, para a completa extenso

dos produtos amplificados. A Figura 5 ilustra esquematicamente uma reao de PCR utilizada

na obteno de marcadores RAPD.

Figura 5:Esquema da reao em cadeia da polimerase (PCR).


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3.10- Preparo do gel 1,5%

Foram utilizados 1,5 g de agarose ultrapura em 100 mL de TAE 1X. Ferveu-se a

suspenso em forno de microondas at que as partculas de agarose em suspenso ficassem

invisveis (cerca de trs a quatro minutos). A completa dissoluo de agarose foi alcanada

agitando-se gentilmente o frasco em intervalos regulares durante o processo de fervura. Aps

a completa dissoluo da agarose, a mistura foi colocada sob gua para resfriamento at

atingir uma temperatura entre 400C a 600C e ento acrescentado 15 L de brometo de etdio

(mg/ml).

Aps o preparo, a soluo foi vertida no suporte de gel, e em seguida, foram colocados

dois pentes (cada um com 8 dentes) sendo um em uma das extremidades e o outro a cerca dedez centmetros de distncia, formando poos ou canais onde foram aplicadas as amostras.

3.11- Aplicao das amostras no gel de agarose

As reaes amplificadas foram retiradas do termociclador e carregadas com 1,5L de

tampo de carregamento 6x (azul de bromofenol). Foi aplicada em cada poo uma alquota

de 13 L de cada amostra e 12 L de DNA padro (Ladder).Aps esta etapa o gel foi submerso na soluo tampo colocado no tanque de aparato

de eletroforese. O tampo de eletroforese teve a mesma composio do tampo utilizado na

confeco do gel. O tempo de corrida foi estimado em duas horas e trinta minutos at que a

soluo corante atingisse a regio prxima da borda inferior do gel (Figura 6). Aplicou-se

durante a corrida, uma voltagem constante de 80 V.

Figura 6:Aplicaes das amostras de DNA no gel de agarose. Universidade Federal Rural do

Rio de Janeiro, 2007.


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3. 12- Anlise dos produtos e Visualizao

Para separao dos produtos amplificados foi utilizada a eletroforese horizontal, em

gel de agarose a 1,5 %, preparado em TAE 1X, corado com 0,5L-1de brometo de etdio para

visualizao do DNA sob luz ultravioleta (UV). Onde os produtos de amplificao foram

separados sob uma voltagem constante de 80 Volts durante duas horas e trinta minutos. O

DNA padro, com fragmentos de tamanhos conhecidos utilizado foi oLadder1 kb.

Aps a eletroforese, as bandas foram visualizadas, com deteco em luz UV e os

resultados foram fotografados por uma cmera acoplada a um sistema computadorizado

denominado ALPHA INNOTECH CORPORATION/ALFHA DIGI DOCTM, para posterior

anlise.

3. 13- Anlise computacional dos dados

A anlise dos marcadores RAPD polimrficos foi realizada em planilha no programa

Microsoft Excel utilizando a relao indivduo e primer com suas respectivas massas

moleculares com o intuito de gerar dados para uma matriz de similaridade a qual fornece as

informaes necessrias para os resultados finais. Os valores da planilha foram dados deacordo com a presena e ausncia de bandas.

Quando um marcador est presente em um indivduo, fornecido ao mesmo, na

planilha, o nmero 1 (um), caso contrrio, ou seja, na ausncia da banda, fornecido o

nmero zero (0) e no caso de dvidas em relao ao fragmento fornecemos o nmero 9

(nove). Em seguida, a matriz foi gerada utilizando o programa NTSYS (Numerical Taxonomy

and Multivariante Analysis System,verso 2.02), desenvolvido por Rohlf (1994).

A similaridade entre as amostras foi analisada atravs dos coeficientes de Jaccard(Sneath e Sokal, 1973). Representado na seguinte forma:

Jaccard: Sj = . a .

a+b+c

em que:

a= nmero de casos em que a banda est presente nos dois gentipos, simultaneamente;

b= nmero de casos em que a banda est presente somente no gentipo i;

c= nmero de casos em que a banda est presente somente no gentipo j.A partir da matriz, os clusters (dendrograma) foram gerados pelo mtodo UPGMA


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(Unweighted Pair Group Mean Average), que um mtodo de mdia aritmtica no

ponderada, onde foi expresso na forma de dendrograma.

4 - RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 - Crescimento micelial do patgeno

Houve variao na velocidade do crescimento micelial dos 22 isolados de R. solani,

em funo do meio utilizado (BDA) e das prprias caractersticas morfolgicas.

Os resultados das anlises de varincia que esto apresentados na Tabela 6, indicam

efeitos significativos ao nvel de 5% de probabilidade pelo teste F, entre os tratamentos emrelao ao crescimento micelial do fungo.

TABELA 6. Resumo da anlise de varincia para o crescimento micelial de Rhizoctonia

solani, oriundo de diferentes culturas 250C por 3 dias.

C.V. G.L. S.Q. Q.M. F

Tratamentos 22 178, 6846 7,7689 10,34 *

Resduo 2 0,1495 0,0747Total

CV (%)

Mdia

71

17,11

5,07

213,4109 0,7517

*Significativo ao nvel de 5% de probabilidade pelo teste F.

As mdias do crescimento micelial permitiu a diviso dos isolados do patgeno em 4

grupos. O grupo 1 esto representados pela letra A, Grupo 2 representados pela letra B, grupo3 representados pela letra C e grupo 4 representados pela letra D, conforme ilustra a Tabela 7.

Os isolados deR. solanidas culturas basto do imperador, brachiaria, citros, melancia

e rcula apresentaram maior crescimento micelial, com dimetros mdios de 7,88 cm; 7,39

cm; 7,35 cm; 7,11 cm e 6,97 cm, respectivamente, temperatura de 250C durante 3 dias de

incubao, os quais no diferiram significativamente entre si, enquanto que os menores

crescimentos foram observados nos isolados de chama, caf, e soja, cujos dimetros mdios

do miclio foram respectivamente de 2,93 cm; 2,49 cm e 2,14 cm. Os isolados das demais

culturas estudadas apresentaram crescimento intermedirio.


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Apesar dos isolados sorriso de maria,pertencente a famlia Asteraceae e basto do

imperador, da famlia Zingiberaceae, serem plantas ornamentais, apresentaram crescimento

micelial in vitro diferentes entre si, onde o isolado sorriso de maria apresentou um

crescimento micelial menor com 5,13 cm de dimetro, que o isolado basto do imperador com

7,88 cm de dimetro, fato este que possa ser explicado em funo da temperatura (25 0C)

estabelecida e do perodo de incubao (3 dias).

No trabalho de Mafia et al. (2005), observou-se tendncia de maior crescimento

micelial deRhizoctonia solani, a 280C, evidenciado pelo maior dimetro mdio das colnias e

pelas maiores taxas de crescimento mdio. Nessa temperatura, a colnia teve, em mdia, 8,4

cm de dimetro aps 72 horas de incubao e, portanto, taxa de crescimento equivalente a 2,8

cm.dia-1.

TABELA 7. Crescimento micelial em dimetro de Rhizoctonia solanioriundo de diferentes

culturas 250C por 3 dias, representados com seus respectivos grupos.

Tratamentos Dimetro do miclio (cm)

Basto do Imperador 7,88 ABrachiaria 7,39 ACitros 7,35 A Grupo 1

Melancia 7,11 ARcula 6,97 ATeca 6,40 BPuerria 6,17 BMilho 5,85 BCaupi 5,78 B Grupo 2Urucum 5,77 BAccia 5,26 BSorriso de Maria 5,13 B

Nim 4,55 CPimenta do reino 4,31 C

AG4 4,31 CCupuau 4,27 C Grupo 3Jambu 4,09 CPepino 4,05 CAG7 3,85 CRepolho 3,84 CMaracuj 3,73 CChama 2,93 DCaf 2,49 D Grupo 4Soja 2,14 DMdias seguidas por letras distintas entre si diferenciam os tratamentos, ao nvel de 5% de

probabilidade pelo Teste de Scott-Knott.


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No estudo de Nechet e Halfeld-Vieira (2006) comRhizoctonia solaniem feijo-caupi,

verificou-se que a taxa de crescimento micelial variou de 2,1 5,3 cm.dia -1para os isolados

de mata so de 2,7 5,8 cm.dia-1para os isolados de cerrado.

Com relao colorao das colnias (Figura 7A, 7B e 7C), observou-se que os

isolados de chama, rcula, AG7, AG4, puerria, citros, soja, braquiria, feijo - caupi, pepino,

accia, repolho e jambu, apresentaram colnias de colorao marrom claro (Figura 7 A),

enquanto que a colnia do isolado basto do imperador apresentou colorao marrom-

alaranjado (Figura 7 B).

Por sua vez, foi observado nos isolados cupuau, melancia, nim, urucum, alternria

sp., milho, teca e caf, apresentaram colnias de colorao marrom escuro e anis

concntricos bem visveis conforme ilustra a Figura 7 C.

Figura 7. Crescimento micelial e colorao das colnias de R. solanioriundas de diferentes

culturas 250C durante 10 dias. A: isolado chama (Cayaponia espelina (Manso) Cogn), B:

isolado basto do imperador (Etlingera Elatior (Jach) R. M. Sim) e C: isolado teca (Tectona

grandis L. F). Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2007.

A formao de microesclerdios somente foi observada no perodo de 3 a 4 dias, numa

temperatura em torno de 250C, nos isolados brasileiros: isolado de melancia, nim, soja,

repolho, jambu e teca, conforme ilustra a Figura 8. Fato no encontrado nos isolados

referentes aos isolados do Japo (AG4) e Estados Unidos (AG7) com relao mesma

temperatura.


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Figura 8. Formao de microesclerdios de Rhizoctonia solaniobtidos em meio de cultura

BDA. Temperatura de 250C e umidade relativa em torno de 80%, durante 3 a 4 dias.

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2007.

Resultado similar foi obtido por Silveira et al. (2000) os quais observaram que

nenhum dos isolados microesclerodiais brasileiros, foi morfologicamente idnticos aos

representantes japoneses deRhizoctonia solani do grupo de anastomose AG1-IB, e ausentes

de microesclerdios.Por outro lado, no estudo realizado por Nechet e Halfeld-Vieira (2006), foi verificada

a formao de microesclerdios em isolados de Rhizoctonia solaniem feijo-caupi, fato que

no foi observado neste trabalho com a respectiva cultura.

4.2 - Teste de patogenicidade

Os 22 isolados deRhizoctonia solani obtidos a partir da parte area de plantas de accia,basto do imperador, brachiaria, caf, caupi, citrus, cupuau, chama, jambu, maracuj,

melancia, milho, nim, pepino, puerria, repolho, rcula, soja, sorriso de maria, teca, urucum e

pimenta do reino mostraram patognicos devido presena de sintomas (queima foliar)

observados num perodo que variaram entre 3 a 4 dias aps a inoculao do fungo em folhas

com ferimentos artificiais.

Inicialmente observaram-se leses amareladas que evoluram para manchas de

colorao marrom clara seguido de marrom escuro, conforme ilustra a Figura 9. E

conseqentemente houve uma reduo da rea fotossinttica com a evoluo dos sintomas nas

folhas.


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Figura 9. Sintomas tpicos de queima foliar induzida por R. solani,observados em folhas de

citrus (Citrus sinensis (L.) Osbeck), aps 3 a 4 dias de inoculao. Temperatura de 240C e

umidade relativa em torno de 80%. Embrapa Amaznia Oriental, Belm- PA, 2007.

Aps 8 dias de inoculao, uma temperatura de 240C e umidade relativa em torno de

80%, observaram-se a formao de microesclerdios na superfcie das folhas com ferimentosartificiais, inoculadas com discos micelial. No entanto, em folhas destacadas na ausncia de

ferimento apresentaram os sintomas tpicos da doena somente aps 10 e 11 dias de

inoculao conforme ilustra a Figura 10.


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0123456789

1011

12

Perodod

e

incubao

(dias)

COM FERIMENTO SEM FERIMENTO

Mtodo de inoculao

Figura 10: Perodo de incubao (dias) nas plantas, at o aparecimento dos sintomas em

folhas destacadas, com ferimentos e sem ferimentos, inoculadas com Rhizoctonia solani em

condies laboratoriais. Temperatura de 240C e umidade relativa em torno de 80%.

Relatos semelhantes foram obtidos tambm por Ogoshi (1987); Pascual et al.,(2000),

ondeR. solani associada a doenas com sintoma de queima foliar em diversas culturas, comofeijo, milho, sorgo, algodo, soja e arroz, podem pertencer ao grupo de anastomose AGI-IA

ou AGI-IB, aps 7 dias de inoculao do patgeno.

No Brasil, isolados de Rhizoctonia spp. binucleados j haviam sido relatados

associados a podrido do hipoctilo na soja descrito por Fenille et al., (2002), necrose em

eucalipto estudado por Silveira et al., (2002) e podrido do colo e/ou radicular no feijoeiro

conforme estudos feito por Ceresini e Souza, (1997). Resultado similar tambm foi obtido por

Silveira et al., (2000), onde eles citaram que o isolado de Rhizoctonia solani (RH-21), o

causador da mela do feijoeiro (Phaseolus vulgarisL.), obtido de Linhares-ES, classificado no

grupo brasileiro deR. solani"AG1-IB similar".

Segundo Mafia et al. (2005), estudando a queima foliar e tombamento de mudas em

plantas medicinais da famlia Labiatae, causadas porRhizoctonia solani AG1- 1B confirmou-

se que com a reproduo dos sintomas da doena por inoculao artificial nas mudas e o

reisolamento indireto, em meio de cultura batata dextrose gar (BDA), do mesmo fungo a

partir de tecidos doentes confirmou-seRhizoctonia solani, como agente etiolgico da doena,

conforme observado no presente trabalho.


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4.3 - Variabilidade Gentica

O procedimento seguido na execuo deste trabalho permitiu detectar que as extraes

de DNA genmico possibilitaram a obteno de DNA em concentraes que variaram de 10

ng/L a 50 ng/L.

Os resultados obtidos podem ser observados na Figura 11 (RAPD). Obteve-se um total

de 17 fragmentos RAPD, com tamanhos variando de 800 a 1800 pb (pares de bases

nucleotdicas), amplificados pelos 2 primersutilizados (OPA2 e OPA3) da Operon, gerando

100% de polimorfismo dos 14 isolados, sendo que o OPA2 amplificou nove (9) bandas e o

OPA3, oito (8) bandas polimrficas.

M R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 A11 R12 R13 R14 R15

Figura 11: Eletroforese em gel de agarose, mostrando o polimorfismo de Rhizoctonia solani,

pela tcnica de RAPD com oprimersOPA 2. M corresponde ao marcador Ladder 1 kb, e osgentipos analisados so: R1 - chama (Cayaponia espelina (Manso) Cogn.), R2rcula

(Euruca sativa (L.) Cav.), R3- basto do imperador (Etlingera elatior (Jach) R. M. Sim), R4

cupuau (Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.), R5 melancia (Citrullus vulgaris

Schrad), R6 puerria (Puerria phaseoloides(Roxb.) Benth), R7- AG7, R8- AG4, R9 nim

(Azadirachta indicaA. Juss), R10 citrus (Citrus sinensis(L.) Osbeck, A11 alternriaspp,

R12 milho (Zea mays L.), R13 accia (Accia farnesiana (L.) Willd.), R14 caf (Coffea

arbicaL.), R15- controle negativo (sem DNA).


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As estimativas de similaridade genticas, entre os isolados, obtidas a partir do

coeficiente de Jaccard esto presentes na Figura 12, onde a similaridade gentica mdia

encontrada entre os isolados deR. solani foi de 21,71%.

A maior similaridade gentica foi obtida entre as culturas R7 referente ao isolado de

melancia e R8, isolado nim com ndice igual a 1,00. A segunda maior similaridade foi de

75%, entre R5 (isolado deR. solani do grupo de anastomose AG7) e R6 (isolado do grupo de

anastomose AG4).

Grande parte das amostras apresentou pouca ou nenhuma similaridade entre os

isolados.

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14

R1 1,00

R2 0,50 1,00

R3 0,13 0,20 1,00

R4 0,13 0,00 0,00 1,00

R5 0,50 0,50 0,00 0,20 1,00

R6 0,43 0,40 0,00 0,17 0,75 1,00

R7 0,14 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00

R8 0,14 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 1,00

R9 0,00 0,00 0,00 0,17 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00

R10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00

R11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00

R12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00 1,00

R13 0,13 0,00 0,00 0,50 0,20 0,40 0,00 0,00 0,17 0,00 0,00 0,00 1,00

R14 0,20 0,29 0,29 0,00 0,13 0,25 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 0,13 1,00

Figura 12: Matriz de similaridade gentica estimada pelo ndice de Jaccard, para todos os

isolados analisados deRhizoctonia solani.

Na Figura 13, encontra-se o dendrograma gerado pelo mtodo UPGMA, atravs do

programa NTSYS-pc, 2.02. A partir da mdia encontrada, a clusterizao (Figura 13)

provocou a separao dos isolados em sete (7) grupos principais.

A maior similaridade gentica encontrada entre os isolados foi R7 (AG7) e R8 (AG4)com 100%. A segunda maior similaridade foi R5, isolado melancia e R6, isolado puerria


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com 75% enquanto R11, isolado de alternriasp. ficou completamente isolado dos demais

isolados com nenhuma de similaridade gentica fato explicado por pertencer a um grupo

taxonamente distintos.

Quatro grupos foram formados por duplas, os isolados R10, isolado citrus e R12,

isolado milho com 50% de similaridade, R7 isolado de R. solani do grupo de anastomose

(AG7) e R8 do grupo (AG4) com 100% de similaridade. O isolado R13, isolado accia e R4

isolado cupuau com 50%. E o isolado de R3 isolado basto do imperador e R14, isolado caf

com 29% de similaridade gentica, conforme ilustra a Figura 13.

Apenas um grupo apresentou maior nmero de isolados, sendo constitudo por R1

isolado chama, R2 isolado rcula, R5 isolado melancia e R6 isolado puerria com 46% de

similaridade. E dividiu-se em dois subgrupos, R5 isolado melancia e R6 isolado puerria comsimilaridade gentica de 75%, e R1 isolado chama e R2 isolado rcula com 48% de

similaridade gentica (Figura 13).


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Figura 13: Dendrograma gerado pelo mtodo de anlise UPGMA para o coeficiente de

Jaccard, a partir das 17 bandas polimrficas geradas pelo RAPD, dos 13 isolados de

Rhizoctonia solani e 1 isolado de alternriasp.

Os isolados brasileiros (R1, R2, R3, R4, R5, R6, R9, R10, R11, R12, R13, R14),

apresentaram diferena no padro de polimorfismo comparados com isolado japons (R8) e

isolado procedente aos Estados Unidos (R7), uma explicao para esta diferena seria o fato

do isolamento reprodutivo (origem geogrfica) ser mais pronunciado entre populaes de R.

solaniAG4 e AG7, que um patgeno estritamente do solo, do que entre populaes de R.

solanibrasileiro, patgeno proveniente de parte area foliar das culturas.

Sartorato, Nechet e Vieira (2006), estudando 23 isolados de Rhizoctonia solani em

feijo caupi, nos ecossistemas de mata e cerrado, atravs do mtodo RAPD, observaram que


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os isolados coletados no cerrado so mais divergentes entre si que os isolados coletados no

ecossistema de mata.

A existncia da divergncia gentica entre isolados/populaes do fungo Rhizoctonia

solani j foi observada pelos autores LIU e SINCLAIR (1992) e GOMES et al. (2003). Esses

autores afirmaram que o fungo altamente varivel, o que explica a divergncia encontrada

entre os isolados conforme mostra este trabalho. Variaes quanto s exigncias para

crescimento micelial in vitro dos isolados, decorrentes do isolamento, entre os isolados

brasileiros, japons e dos Estados Unidos, podem explicar as variaes obtidas nos padres de

polimorfismo dos isolados. Literatura precedente tambm confirma haver abundante

variabilidade gentica na populao mundial de Rhizoctonia solanido grupo de anastomese

AG1 e AG4 (REYNOLDS et al., 1983; VILGALYS, 1988; LIU e SINCLAIR, 1993;VILGALYS e GONZALES, 1990).

Desta forma, estes resultados mostram que o uso de marcadores RAPD, pode ser de

grande utilidade para a identificao e diferenciao de importantes fungos fitopatognicos,

como referido nos trabalhos de SREENIVASAPRASAD et al.(1993, 1994); CORREL et al.

(1993); CROUS et al. (1993); SHERRIFF et al. (1994); VASCONCELOS et al. (1994);

SHERRIFF et al.(1995) e VIEIRA (1996).


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5- CONCLUSES

Com os resultados obtidos no presente trabalho pode-se concluir que:

1. A anlise de varincia mostrou diferena significativa no crescimento micelial dos

22 isolados estudados.

2. Os isolados de R. solani mostraram-se patognicos as plantas testadas, causando

sintomas tpicos de queima das folhas nas plantas.

3. O uso da tcnica RAPD permite determinar a variabilidade gentica entre os 13

isolados deR. solani provenientes do Estado do Par (Brasil), Estados Unidos e Japo.

4. De acordo com o perfil polimrfico dos isolados de R. solani, foi observada a

formao de sete grupos genotpicos.

5. Os parmetros utilizados para estudos de variabilidade gentica de R. solani, como

caractersticas morfolgicas e molecular podem ser utilizados na diferenciao fisiolgica do

fungo.


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6- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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