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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica. Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República. 3 de mayo de 2013. Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. - PowerPoint PPT Presentation
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1
Fundamentos de Fundamentos de Espectrometría de MasaEspectrometría de Masa
BiológicaBiológica
Matías MöllerMatías Möller
Lab. Fisicoquímica BiológicaLab. Fisicoquímica BiológicaInstituto de Química BiológicaInstituto de Química BiológicaFacultad de CienciasFacultad de CienciasUniversidad de la RepúblicaUniversidad de la República
3 de mayo de 20133 de mayo de 2013
2
Bibliografía recomendada:
Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15.
J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.
Introduction to proteomics, Liebler, 2002.
3
1- Generalidades1- Generalidades
2- MALDI-TOF2- MALDI-TOF
3- ESI-Q3- ESI-Q
4- Peptide Mass Fingerprinting y4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MStandem MS
Espectrometría de masa
4
1- Generalidades1- Generalidades
Espectrometría de masa
5
Técnica que permite laTécnica que permite laseparación y determinación de separación y determinación de
la relación masa/carga de la relación masa/carga de iones gaseososiones gaseosos
Espectrometría de masa
6
Espectrometría de masa
Espectrometría Espectrometría ≠ Espectroscopía≠ Espectroscopía(Medición de un rango) (implica absorción o
emisión de energía radiante)
7
Espectrometría de masa
Determinación de masa y/o composición:
Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares
Polisacáridos, oligosacáridos
Lípidos Lipidoma
Fragmentos de ácidos nucleicos
Técnica muy sensible:puede analizar g-ng (y menos) de material
Espectrometría de masa de Espectrometría de masa de BiomoléculasBiomoléculas
8
Espectrometría de masa
Determinación de masa y/o composición
Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de
péptidos
Modificaciones postraduccionales
Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínasInteracción con compuestos de bajo PM
Plegamiento
Niveles de expresión/modificación posttraduccional
Espectrometría de masa de ProteínasEspectrometría de masa de Proteínas
9
Gel 2D de hígado humano
http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/
10
Espectrometría de masa
cyt C ~ 12000 Da
11
Espectrometría de masa
Espectrometría de masa biológicaEspectrometría de masa biológica
Lisozima
12
Los Iones son importantes
Espectrometría de masa
[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-
De la unión de iones especialmente a moléculas quecontienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da)
[M+H]+ o [M-H]-
De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos,fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+)
En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones cambios en m/z:
[M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)
13
Espectrometría de masa
PMPM(péptido)(péptido) = 1162 Da = 1162 Da
Modo positivo Modo negativo
m = +1 +23 +39 -1
14
Espectrómetro de masa
Espectrometría de masa
Entrada:Entrada:Volatilización/Volatilización/
IonizaciónIonización
AltoAltoVacíoVacío
AnalizadorAnalizadorde masasde masas DetectorDetector
MuestraMuestra
MALDIESI
TOFCuadrupolo
Tampa de IonesFTICR
Sector Magnético
15
¿Cómo volatilizar una proteína?
Espectrometría de masa
Premio Nobel de Química 2002
Fenn (1988)- ESI: Electrospray IonizationTanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization
Sin Premio:Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI(como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)
16
Espectrómetros de masa
(configuraciones para grandes biomoléculas)
Espectrometría de masa
MALDI-TOFMALDI-TOF:: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight
ESI-QESI-Q:: ElectroSpray Ionization-Quadrupole
ESI-ITESI-IT:: ElectroSpray Ionization-Ion Trap
FT-MSFT-MS: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance
17
2- MALDI-TOF2- MALDI-TOF
Espectrometría de masa
18
Ionización por MALDI:
Espectrometría de masa
(Matrix assisted Laser desorption/ionization)
Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbeenergía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra:
La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevandola proteína cargada hacia la entrada del analizador.
El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+.
Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador medianteun campo eléctrico
19
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Matriz
20
MALDI
Espectrometría de masa
Desorción/Ionización por LaserAsistida por Matriz
21
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdoa su “tiempo de vuelo”(t).
t (m/z)1/2
las partículas con menor m/z llegan antes al detector
No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)
22
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte unaenergía cinética:
Ek = zeEsdonde s es la distancia de la región de la fuente. Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek,
½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½
t = D/v = (m/2zeEs)½D
m/z = 2eEs(t/D)2
23
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½
t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2
Fuente
Sin E, iones a la deriva
Detector
Fig. Separación por TOF
+ + +
E+ -
ss DD
+
24
Tubo de vuelo
Detector
4-25 kV
Espectrometría de masa
Carlos Cerveñansky
25
Tubo de vuelo
Detector
4-25 kV
Espectrometría de masa
Carlos Cerveñansky
26
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
27
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF
28
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
29
1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0
Mass (m/z)
0
3222.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
ns
ity
Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]
1672.917
Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)
1672.92
1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0
Mass (m/z)
0
1.6E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
ns
ity
Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]
1672.918
Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)
Resolución en MALDI-TOF
Carlos Cerveñansky
30
Los Isótopos son importantesLos Isótopos son importantes
Espectrometría de masa
Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos
Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu),se basa en una escala relativa al 12
6C = 12 amu
1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10-24 g
Abundancia isotópica:
1212CC 12.000012.0000 98.90 %98.90 %1313CC 13.003413.0034 1.10 %1.10 %
31
ElementoElemento MasaMasa %%1H 1.0078 99.9852H 2.0141 0.015
12C 12.0000 98.9013C 13.0034 1.1014N 14.0031 99.63415N 15.0001 0.36616O 15.9949 99.76217O 16.9991 0.03818O 17.9992 0.20031P 30.9738 100.0032S 31.9721 95.0233S 32.9715 0.7534S 33.9679 4.2136S 35.9671 0.02
79Br 78.9183 50.6981Br 80.9163 49.31
Carlos Cerveñansky
32Carlos Cerveñansky
33
100
5725 5729 5733 5737 5741 5745Mass (m/z)
0
2093
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
% In
ten
sity
Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005]
2xC13
C12
C13
Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 l de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)
Carlos Cerveñansky
34
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
35
3- ESI-MS3- ESI-MS
Espectrometría de masa
36
ESI-Q
Espectrometría de masa
ElectroSpray Ionization - Quadrupole
Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2
(gas secante).
El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarsey las proteínas cargadas viajan hacia el analizador
El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo
37
Espectrometría de masa
ESI
N2
38
ESI
Espectrometría de masa
39
ESI-Q
Espectrometría de masa
Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones deun pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados.
Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar la m/z y realizar un barrido espectral
Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven deelectrodos del filtro de masas
Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienenmuy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000
40
ESI-Q
Espectrometría de masa
41
ESI-Q
Espectrometría de masa
42
ESI-Q
Espectrometría de masa
43
ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
10+9+
11+
13+
12+
14+
10+9+
11+
44
ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
10+9+
11+
13+
12+
14+
10+9+
11+
45
ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1) n = (x2-1)/(x1-x2)
n = (1084.1-1) / 72.1 = 15M = (1156.2 x 15) -15 = 17328
n+
(n+1)+
46
ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
Mioglobina de caballo
47
ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
Bajo PM
Alto PM
48
ESI-MS
Espectrometría de masa
49
Espectrometría de masa
Comparación ESI-MS y MALDI-TOFComparación ESI-MS y MALDI-TOF
Cyt C
50
Comparación
Espectrometría de masa
MALDI-TOFMALDI-TOF ESI-(Q3 o IT)ESI-(Q3 o IT)Cargas/ion Pocas, en general
1Muchas
Rango de m/z 50000 3000
Rango de masas
200.000 70.000
Interacciones no covalentes
No Si
MS/MS limitado, PSD Si, CID
Acoplar LC No Si
Tolerancia a contaminantes
Si No
51